Análise da Influência do ph e da Temperatura no Processo de Fermentação de Caldo de Cana Gabriela Bonassa 1*, Joel G. Teleken 2, Lara T. Schneider 3, Carlos de Jesus de Oliveira 3. (1) Graduando de Tecnologia em Biocombustíveis. Universidade Federal do Paraná UFPR, Setor Palotina. Rua Pioneiro, n. 2153 Jardim Dallas Palotina Paraná CEP: 85950-000 Brasil Tel: +55 (44) 3211-8500. E-mail: gabrielabonassa@gmail.com (2) Docente Tecnologia em Biocombustíveis. Universidade Federal do Paraná UFPR, Setor Palotina- PR. (3) Graduando de Tecnologia em Biocombustíveis. Universidade Federal do Paraná UFPR, Setor Palotina-PR. Resumo: Entre as diversas fontes de energias renováveis no Brasil, destaca-se o bioetanol a advindo da cana-deaçúcar. A indústria do álcool cresceu nos anos 70, com o Proálcool, em um momento que quando o mundo se via em risco quanto ao desabastecimento energético e com os altos preços do petróleo. Desde então, o etanol tem importância para o mercado interno e externo, obtido principalmente por meio através de processos fermentativos. Neste processo, as leveduras consomem o açúcar do mosto, liberando álcool e CO 2. A cinética do processo de fermentação é influenciada por algumas variáveis, como ph, temperatura, concentração de substrato, teor alcoólico, minerais, nutrição, que afetam o tempo de fermentação, concentração final de produto e microrganismo. Neste contexto, o presente trabalho visou avaliar a influência do ph e da temperatura, sobre o processo de fermentação alcoólica, buscando maior concentração de produto em menor tempo. Com concentração de açúcares iniciais de 96,2 g,l -1, temperatura de 29 e 34 ºC, ph s 4 e 6, a concentração de bioetanol foi maior, no ensaio que utilizava 34 ºC e ph 4, na quantia de 28,75 g.l -1. Palavras Chave: Energias Renováveis; Bioetanol; Fermentação Alcoólica; Temperatura; ph. INTRODUÇÃO O cultivo da cana-de-açúcar está entre uma das mais antigas atividades agroeconômicas no Brasil. A principal utilização da cana é para a produção de etanol e açúcar. O Brasil contempla 36% da produção de etanol mundial, possuindo capacidade de extensão da cultura (MAGALHÃES, 2005). Desde os tempos do Brasil colônia, destacava-se no cenário sócio-econômico, a importância da exploração da cultura canavieira, que atualmente ganha importância também em aspectos econômicos e ambientais, uma vez que o etanol é uma fonte renovável de energia e integra a matriz energética nacional (ROS, 2004). Existem três vias de obtenção do bioetanol: destilatória, sintética e fermentativa, sendo a terceira a mais importante, em virtude das matérias-primas fermentescíveis brasileiras (LIMA et al. Segundo Amorim (2005), há vários fatores envolvidos no processo fermentativo, como o microrganismo utilizado e a forma de conduzir o processo, os quais devem proporcionar baixa inibição em relação ao produto desejado, não serem patogênicos, utilizar meio de cultura de baixo custo e rápida conversão dos açúcares em etanol. Fatores físicos (temperatura, pressão osmótica), químicos (ph, oxigenação, nutrientes, inibidores) e microbiológicos (espécie, linhagem e concentração da levedura, contaminação bacteriana) afetam o rendimento da fermentação e a eficiência da conversão de açúcar em etanol (LIMA et al. Durante a fermentação a levedura pode estar exposta a vários fatores 181
estressantes (físicos, químicos e microbiológicos), sendo os mais frequentes os altos teores alcoólicos, temperatura - elevada, acidez elevada do meio, presença de sulfito, contaminação bacteriana e contaminação por leveduras, exceto a Saccharomyces cerevisiae, os quais afetam diretamente o rendimento da produção de etanol (BASSO, 1991). As leveduras são mesófilas, sendo temperaturas entre 26 e 35 ºC favoráveis para produção de etanol. A velocidade de conversão de açúcares em etanol aumenta conforme aumenta a temperatura do mosto, porém, deve-se ter cuidado, pois pode também propiciar o desenvolvimento de contaminação bacteriana (LIMA et al. A temperatura em que o meio se encontra, é um dos fatores que mais afetam a atividade dos microrganismos, tendo influência significativa no metabolismo, no crescimento, na viabilidade celular e na capacidade fermentativa (BATISTA, A faixa de ph mais adequada para a fermentação alcoólica está entre 4 e 5, sendo que os mostos industriais geralmente possuem ph entre 4,5 e 5,5, sendo características das leveduras industriais adaptação até faixas de ph entre 5,2 e 6,8. Meios mais ácidos são menos sujeitos a contaminação bacteriana, resultando em maior rendimento alcoólico (LIMA et al. 2001), porém quando os valores de ph são muito baixos, ocasionam perda de alguns nutrientes, como nitrogênio e potássio, resultando no aumento da sensibilidade ao etanol e ácidos orgânicos (GOMES, 1988). Considerando a faixa de temperatura e ph em que os microrganismos consomem a sacarose do mosto, convertendo em etanol, este trabalho teve como objetivo avaliar a influência dos ph 4 e 6, e temperaturas 30 e 34 ºC ±1 sob o consumo de sólidos solúveis, que teve valor inicial de 96,2 g.l -1 e produção de etanol, objetivando-se buscar o meio que proporciona maior concentração de etanol, em menor tempo. MATERIAIS E MÉTODOS 182 Extração do caldo e preparo do mosto O caldo de cana utilizado para condução da fermentação alcoólica foi obtido junto à moenda, na etapa de moagem da cana-de-açúcar. Este foi filtrado com auxílio de peneiras granulométricas (66 e 106 μm) para remoção de impurezas grosseiras, restos de bagaço e sujeiras. Após o processo de extração, ajustou-se p caldo ph, concentração de sólidos solúveis e temperatura conforme o planejamento apresentado na Tabela 1, de forma que este ficasse apto a nutrição e desenvolvimento dos microrganimos, bem como acúmulo do produto desejado. Tabela 1. Planejamento experimental Ensaio T (ºC) ph S (g.l -1 ) 1 29 (±1) 4 96,2 2 34 (±1) 4 96,2 3 29 (±1) 6 96,2 4 34 (±1) 6 96,2 Utilizando-se um refratômetro, mediu-se a quantidade inicial de sólidos solúveis e por meio de diluição com água destilada, adequava-se o mesmo aos valores desejados. Através da Equação 1, determinava-se a quantia de água a ser adicionada: C1 V1 C2 V 2 (Equação 1) Onde: C 1 : concentração inicial de sólidos solúveis; V 1 : volume inicial de caldo; C 2 : concentração desejada; V 2 : volume desejado. A correção de ph foi realizada medindo-se o valor inicial com phmetro de bancada e adequando-o conforme os valores do planejamento, com auxílio de H 2 SO 4 0,1 mol.l -1, e NaOH 0,1 mol.l -1. Após as correções, o caldo preparado foi distribuído em 12 erlenmeyers e os mesmos, eram levados ao banho-maria, que estava com a temperatura controlada conforme o planejamento apresentado na Tabela 1. Processo Fermentativo Com o caldo corrigido conforme as necessidades dos microrganismos em relação a ph e temperatura adicionavam-se os microrganismos responsáveis pela conversão da sacarose em etanol, na
ph III Encontro Paranaense de Engenharia e Ciência quantidade de 0,1 g.l -1 por recipiente, de levedura Saccharomyces cerevisiae comercial e assim iniciava-se a fermentação alcoólica. Análise da cinética do processo No decorrer do processo de fermentação alcoólica, fez-se acompanhamento do comportamento de algumas variáveis em intervalo de 2 horas, durante as 6 primeiras horas e posteriormente, em intervalos de 4 horas até que fosse observada a atenuação do processo fermentativo, ou seja, até que o consumo de substrato pelos microrganismos e produção de produto, estivessem estabilizados. Analisou-se o ph (com auxílio de phmetro), consumo do substrato (com auxílio de refratômetro) e calculou-se do teor de etanol em ºGL, utilizando a Equação 2 (CARVALHO et al. 2008). ( Bi Bf ) 4 E (Equação 2) 7,4 Onde: E é a graduação alcoólica em ºGL; B i é o Brix Inicial; B f é o Brix Final. Uma vez que a graduação Gay Lussac representa a porcentagem em volume de etanol presente em uma mistura álcool/água, realizou-se os cálculos estequiométricos necessários para transformar para g.l -1. RESULTADOS E DISCUSSÃO Conforme as diferentes condições de temperatura e ph utilizadas para o processo fermentativo, com concentração de açúcares fixa de 96,2 g.l -1, o resultado dos testes quanto ao tempo de fermentação, consumo do substrato e produção de bioetanol, são apresentados na Tabela 2. Tabela 2. Variáveis respostas em relação a diferentes ph e temperatura. Ensaio tf (h) S (g.l -1 ) P (g.l -1 ) ph final 1 29,5 29 28,32 3,69 2 31 28 28,75 3,68 3 34 32 27,07 3,96 4 37 31 27,49 4,2 A partir dos resultados da Tabela 2, observou-se que os valores de ph final para ambos testes foram próximos, e a redução do ph ao longo do processo é decorrente da produção de ácidos orgânicos, como lático, acético e succínico (Figura 1). O ph mais alcalino, pode gerar alguma inibição dos microrganismos no consumo do substrato, fazendo com que aumente a fase de adaptação das leveduras ao meio, justificando o maior tempo que os ph s menos ácidos, conforme observado na Figura 1 (ensaios 3 e 4) levaram para ter atenuação no processo, uma vez que esta maior variação do valor de ph ao longo do processo, pode proporcionar estresse osmótico, linhagens selvagens de bactérias que conduzam a floculação ou meio fermentativo inadequado (SCMIDELL et al. 7 6 5 4 3 2 Figura 1. Comportamento do ph em função do tempo de fermentação. Analisando a Figura 1, é possível observar o comportamento do ph durante a realização dos diferentes experimentos, e a tendência aumentar a acidez. O ph do meio em que os microrganismos se encontravam, tem importância quanto ao desenvolvimento de fenômenos de floculação, onde as células se agrupam, ficam pesadas e sedimentam-se, seja por leveduras floculantes que se reproduziram ou por bactérias indutoras de floculação, seja pelo maior tempo de contato dos microrganismos com o mosto ou pelas más condições do meio, comprometendo a conversão de açúcares em etanol e CO 2 no interior das leveduras (CALLEJA, 1974). A floculação pode ter ocorrido nos processos de ph inicial mais alto (ensaios 3 e 4), onde o processo demorou mais para estabilizar, variando pouco a concentração de açúcares nas últimas horas e convertendo menos substrato em produto. Quando o ph 183
[P] [S] III Encontro Paranaense de Engenharia e Ciência não está tão favorável ao desenvolvimento dos microrganismos, a afinidade com o meio se torna mais lenta, o que dificulta o consumo do substrato e a conversão em etanol, podendo levar as leveduras a flocularem. Quando floculadas e ao fundo, os microrganismos perdem atividade, ou seja, não consumiram mais açúcares para conversão em etanol (CALEJJA, 1974 e LIMA, 1999). Quanto as diferentes temperaturas testadas nos processos, observa-se na Tabela 2, que o ensaio 2, com temperatura de 34 ºC, foi o que levou a maior produção de bioetanol. O aumento da temperatura de fermentação de 29 para 34 ºC, aumentou a velocidade da fermentação, porém favorece a contaminação bacteriana e a levedura fica sensível à toxidez do álcool, também podendo haver perdas por volatilização (Lima et al. Torija et al. (2003), demonstrou que o rendimento alcoólico, é maior em temperaturas mais baixas, de 15 a 20 ºC, porém isto leva a tempos extremamente longos de processo, sendo que em temperaturas que excedam 35 ºC, a viabilidade celular decresce, e até esta temperatura, a taxa inicial de fermentação é maior. A temperatura de fermentação alcoólica deve ser controlada, porque quando fora dos limites, pode ocasionar um estresse celular, promovendo declínio na viabilidade do microrganismo, no consumo de substrato e na produção do produto de interesse (WALKER, 1994). De acordo com os resultados apresentados na Tabela 2, todos os ensaios levaram a uma concentração final de etanol próxima, apresentando maior diferencial somente no tempo de condução do processo, sendo que os ensaios 1 e 2 obtiveram maior concentração de etanol final e tempos menores. Na Figura 2 e 3, é apresentado a cinética dos microrganismos quanto ao consumo de substrato e produção de etanol, em função do tempo. Nos gráficos de cinética de consumo de substrato e produção de bioetanol (figuras 120 100 80 60 40 20 0 Figura 2. Consumo do substrato (g.l -1 ) em função do tempo de fermentação. 35 30 25 20 15 10 5 0 Figura 3. Produção de bioetanol (g.l -1 ) em função do tempo de fermentação. 2 e 3), a concentração de açúcares decresceu em função do consumo destes pelos microrganismos, até que chegasse a um valor e permanecesse constante, onde os fatores de conversão são baixos, devido à falta de condições (açúcares) no meio. Conforme os açúcares são consumidos, aumenta a liberação de etanol e CO 2, sendo que a velocidade de metabolização do açúcar, produção de produto e tempo de processo são dependentes das condições em que o meio se encontra (LIMA et al. Normalmente, espera-se que a fermentação alcoólica acuse esta atenuação completa (0 Brix) em um período de 24 a 36 horas (LIMA, 1999), CONCLUSÕES A viabilidade celular do processo fermentativo, foi influenciada pelo ph e pela temperatura, podendo-se observar que afetam principalmente no tempo de fermentação e não tanto na concentração final do etanol, com isso, os ensaios que levaram mais tempo (3 e 4) para ter uma concentração de etanol próxima aos demais (1 e 2), são ensaios que apresentaram um maior consumo energético, principalmente pelo fato 184
de que necessitam de controle de temperatura por mais tempo para manter o mosto nas temperaturas desejadas; Os ensaios que levaram a maior produção do produto de interesse, foram os ensaios 1 e 2, que em 29,5 h levaram a 28,32 g.l -1 de etanol e em 31 h, 28,75 g.l -1, respectivamente; Os ensaios com ph inicial de menor acidez, requerem maior tempo para estagnação do processo, uma vez que os meios tendem a se tornar mais ácidos pela liberação de alguns ácidos e ésteres, buscando tornar o meio mais apto ao consumo de açúcares e produção de etanol. Então, os meios que se demonstraram menos propícios, somente levaram mais tempo, influenciando pouco na concentração final de bioetanol. Agradecimentos Agradeço a Deus, a UFPR pelo espaço cedido para realização dos experimentos, a bolsa de Iniciação Científica UFPR/TN e a orientação do prof. Joel G. Teleken. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AMORIM, H. V. de (Org.), LEÃO, R. M. (Org.). Fermentação Alcoólica: Ciência e Tecnologia. Piracicaba: Fermentec Publicações Editora e Comércio de Livros LTDA., 1ª ed. 2005. v. 3000. 448p. BASSO, L.C. 1991. In: ALVES, D.M.G. Fatores que afetam a formação de ácidos orgânicos bem como outros parâmetros da fermentação alcoólica. (Tese de Doutorado). ESALQ. Piracicaba, p. 199, 1994. BATISTA, A.S. Saccharomices cerevisae em milho armazenado e o efeito na redução de aflatoxicoses. Tese de Mestrado. Universidade de São Paulo, Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz", Piracicaba, SP, Brasil, 2001. CALLEJA, G.B. On the nature of the forces involved in the sex-directed flocculation of a fission yeast. Can. J. of Microbiol., v.20, n.6, p.797-803, 1974. CARVALHO, W.; CANILHA, L.; ALMEIDA E SILVA, J. B. de. Cinética da fermentação e balanço de massa da produção de cachaça artesanal. Braz. J. Food Technol., VII BMCFB, 2008. GOMES, E. Efeito do tratamento ácido da levedura Saccharomyces cerevisiae na fermentação alcoólica. (Dissertação-Mestrado- Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz USP). Piracicaba, 1988, p. 206. LIMA, U. A. et al. Biotecnologia Industrial: Processos Fermentativos e Enzimáticos. São Paulo SP, Blucher, v. 3, 593p., 2001. LIMA, U. A. Aguardente: fabricacao em pequenas destilarias. 1a ed. Piracicaba: Fundacao de Estudos Agrarios Luiz de Queiroz, 1999. 187 p MAGALHÃES, P.G. 30 anos de Pro álcool no centro de debate. Jornal da Unicamp, Campinas, v. 309, p.11, 2005. ROS, B. P. Avaliação da resistência de variedades de cana-de-açúcar ao raquitismo-da-soqueira com base na taxa de colonização dos colmos por Leifsonia xyli subsp. Xyli, 2004. 70 p. Dissertação (Mestrado em ciências) Escola Superior de Agricultura Luiza de Queiroz, Universidade de São Paulo, Piracicaba, SP. SCMIDELL, W.; LIMA, U.A.; AQUARONE, E.; BORZANI, W. Biotecnologia Industrial: Engenharia Bioquímica. São Paulo - SP, Blücher, v.2, 560 p., 2001. TORIJA, M. J., ROZES, N., POBLET, M., GUILLAMON, J.M., MAS, A. Effects of Fermentation Temperature on the Strain Population of Saccharomyces cerevisiae. International Journal of Food Microbiology, 80, p. 47-53, 2003. WALKER, G. M. The roles of magnesium in botechology. In: Critical Reviews in Biotechnology, Boca Raton, v. 14, n. 4, p. 311-354, 1994. 185