Incidência e aspectos clínicos da infecção congênita por citomegalovírus (CMV) na região de Ilhéus, Bahia.

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO Incidência e aspectos clínicos da infecção congênita por citomegalovírus (CMV) na região de Ilhéus, Bahia. Coordenador/E-mail: Lauro Juliano Marin/ ljmarin@uesc.br Equipe: Sandra Rocha Gadelha, Marcilio Marques Filho, Mônica Regina Raiol, Lauro Juliano Marin. Área de conhecimento/cnpq: Ciências Biológicas / Virologia Tempo de execução: 24 meses. Local de execução: Universidade Estadual de Santa Cruz e Maternidade Santa Helena. Ilhéus 16/06/2010

RESUMO O citomegalovírus (CMV) é a causa mais comum de infecção congênita em todo o mundo, com prevalência de 0,2 a 3% de todos os nascimentos, sendo maior em populações em que a soropositividade materna é elevada. Apesar da alta prevalência desta infecção, não existe qualquer informação sobre a prevalência da infecção congênita pelo CMV nesta região. Este estudo visa verificar a prevalência de infecção congênita por CMV em recém-nascidos da região de Ilhéus no período de um ano e avaliar os aspectos clínicos das crianças infectadas. A infecção congênita por CMV será determinada pela detecção do DNA viral por PCR em duas amostras de saliva dos recém-nascidos antes da terceira semana de vida. Visto que a pesquisa de CMV não está incluída nos exames laboratoriais na assistência pré-natal preconizada pelo Ministério da Saúde, a determinação dos recém-nascidos com infecção congênita logo ao nascimento será importante não só para determinar dados epidemiológicos desta infecção nesta região, como ajudará na diminuição de um sério problema de saúde pública, pois permitirá o acompanhamento dos recém-nascidos infectados sintomáticos ao nascer bem como daqueles assintomáticos ao nascimento que podem vir a desenvolver sintomas tardios com seqüelas irreversíveis. Estes recémnascidos terão acompanhamento clínico por uma equipe médica e laboratorial por meio de exames complementares e terão tratamento específico, sendo assim, beneficiados pelo diagnóstico precoce. 2

INTRODUÇÃO O citomegalovírus (CMV), também conhecido como Herpesvírus humano tipo 5 (HHV-5), é pertencente à família Herpesviridae, assim como o vírus varicela-zoster, o vírus Epstein-Barr, o HHV-8 (vírus associado ao Sarcoma de Kaposi). Seu genoma é constituído de DNA que se encontra no interior de uma capsídeo protéico icosaédrico, o qual é rodeado por uma camada amorfa de proteínas, chamada de tegumento e envolvido por uma camada lipídica ou envelope, onde se encontram as glicoproteínas de superfícies virais (LIBMAN et al., 1995; VERONESI et al., 1997; COUTO et al., 2003; TRABULSI et al., 2005; JUNQUEIRA et al., 2008). É um membro da subfamília Betaherpesvirinae por apresentar características biológicas comuns entre os vírus desta subfamília como tropismo por glândulas salivares, replicação lenta em cultura celular e ser espécie-específico, tendo o homem como o único reservatório (MOCARSKI et al., 2002). Uma característica peculiar desse vírus é a sua capacidade de latência. Assim, após uma infecção primária, geralmente assintomática, o vírus não é eliminado do organismo e, como outros herpesvírus, permanece de forma latente, e sua viremia se mantém em níveis reduzidos. Em diferentes circunstâncias, com a baixa do sistema imunológico ele pode reativar como, por exemplo, em casos de gestação, AIDS, uso de drogas imunossupressoras geralmente utilizadas nos transplantes, ou qualquer outro fator que altere o sistema imunitário, vindo a causar diversas doenças como pneumonia, esofagite, encefalite, hepatite, pancreatite, gastrite, enterocolite, retinite entre outras (ALFORD et al., 1990; BROWN et al., 1998; COUTO et al., 2003; TRABULSI et al., 2005; JUNQUEIRA et al., 2008). 3

A aquisição ou infecção primária por CMV é resultado da introdução do vírus em um hospedeiro humano. O DNA do CMV, após penetrar no citoplasma da célula hospedeira, entra no seu núcleo e começa o processo de replicação, tendo como conseqüência a liberação de novos vírus no sangue e em outros fluidos corporais (JUNQUEIRA et al., 2008). Infecções recorrentes por CMV podem ser causadas pela reativação do vírus causador da infecção primária ou pela reinfecção com diferentes cepas do vírus (YAMAMOTO et al., 1999). A infecção por CMV é comum em todo o mundo apresentando maior prevalência em países subdesenvolvidos e nas populações de nível sócioeconômico mais baixo (HO et al., 1990; GAYTANT et al., 2005). Estudos de soroprevalência de anticorpos anti-cmv na população mundial demonstraram que o CMV ocorre em todas as regiões do mundo, sendo inversamente proporcional ao status socioeconômico do local. Isso permite que dentro de uma mesma região haja grandes variações de prevalência (GOLD et al., 1991; JUNQUEIRA et al., 2008). O citomegalovírus humano é a causa mais comum de infecção congênita e perinatal em todo o mundo, com prevalência de 0,2 a 3% de todos os nascimentos, sendo maior em populações em que a soropositividade materna é elevada (STAGNO 1982, ALFORD et al., 1990). As fontes humanas de disseminação dos vírus incluem secreções respiratórias, saliva, sangue, urina, secreção de colo uterino, esperma, colostro e leite materno (YAMAMOTO et al., 1999). O CMV é um vírus com transmissão vertical, por via transplacentária, em qualquer estágio da gravidez ou durante a passagem pelo canal do parto. A transmissão vertical pode ocorrer se existir viremia materna, sendo mais 4

provável durante as infecções primárias (transmissão em cerca de 35% dos casos), podendo, no entanto, surgir nas reativações, ainda que mais raramente (1%). O CMV também pode ser transmitido após o parto, através da amamentação ou da saliva, que constitui a via mais comum na infância. Também é possível a transmissão por via sexual, via transfusional e através da transplantação de órgãos (PAIXÃO et al., 1996; DAVIES et al., 2001; GRAÇA et al., 2004). Vários estudos associam mãe adolescente, raça negra, atividade sexual com múltiplos parceiros, estado civil solteira, multiparidade, baixa condição socioeconômica e contato com fontes de CMV (em creches, por exemplo) com um maior risco de infecção congênita (STAGNO et al., 1986; MURPH et al., 1998; MIURA et al., 2006). Estudos têm documentado que até 90% das crianças infectadas no período intra-útero não apresentam sintomas ao nascer; porém, estudos longitudinais de crianças identificadas ao nascimento e aparentemente assintomáticas, têm mostrado que seqüelas tardias, especialmente a surdez neurossensorial progressiva e diferentes graus de acometimento neurológico podem manifestar-se meses e até mesmo anos após o nascimento (WILLIANSOM et al., 1990; WILLIANSOM et al., 1992; DAHLE et al., 2000). Uma pequena proporção (5 a 15%) apresenta sintomas perceptíveis logo ao nascer; destas, até 90% desenvolvem alterações neurológicas e surdez neurossensorial uni ou bilateral, com impacto significativo na qualidade de vida (IVARSSON et al., 1997; BOPPANA et al., 2001). A detecção do CMV até a terceira semana de vida define o diagnóstico de infecção congênita por CMV. Confirma-se o diagnóstico de doença congênita por CMV na presença de sinais e/ou sintomas sugestivos, excluídas 5

outras etiologias de infecção congênita (principalmente toxoplasmose e sífilis). Nos casos sintomáticos, em que a detectação do CMV na urina só foi possível entre a terceira semana e o primeiro ano, a doença congênita é provável. Por outro lado a ausência de virúria ao nascimento com detecção viral após a quarta semana de vida define a infecção perinatal por CMV (STAGNO et al., 1983; PANNUTI et al., 1985; MACHADO et al., 1991; ISTAS et al., 1995; DEMMLER et al., 1996; YAMAMOTO et al., 1999). O diagnóstico precoce dessa infecção torna-se importante tanto para intervenção terapêutica, minimizando morbidade e mortalidade dos RN sintomáticos, quanto para a determinação de risco de seqüelas futuras nos RN assintomáticos que é um importante problema de saúde pública (DEMMLER et al., 1991; MIURA, et al., 2006). OBJETIVOS Geral: Determinar a Incidência da infecção congênita por CMV nas crianças nascidas na Santa Casa de Misericórdia de Ilhéus, Bahia (Maternidade Santa Helena) e avaliar a evolução clínica dos recém nascidos infectados. Específicos: Determinar a Incidência da infecção congênita sintomática e assintomática por CMV. Correlacionar os fatores de risco maternos com a prevalência de infecção congênita por CMV. Acompanhamento médico e laboratorial dos recém-nascidos infectados, a fim de detectar os sintomas tardios das crianças assintomáticas ao nascimento e 6

acompanhar a evolução clínica das crianças sintomáticas, tratando quando necessário. JUSTIFICATIVAS - Apesar da alta prevalência, trabalhos epidemiológicos sobre o CMV ainda são escassos em nosso país e até o momento não temos qualquer informação da incidência da infecção congênita por este vírus nesta região. Este trabalho permitirá construir o perfil da infecção congênita por CMV na região de Ilhéus, sul da Bahia. - Visto que a pesquisa de CMV não está incluída nos exames laboratoriais na assistência pré-natal preconizada pelo Ministério da Saúde, este estudo contribuirá para a identificação da infecção congênita por CMV na região de Ilhéus, sul do estado da Bahia. O diagnóstico precoce das crianças com sintomas desta doença permitirá tratamento específico das mesmas, minimizando os danos causados após o nascimento e o possível desenvolvimento de seqüelas futuras como a surdez neurosensorial. - A partir das informações coletadas será possível criar medidas de educação e intervenção para diminuir os riscos de infecção materno-fetal, visto que o Ministério da Saúde não preconiza nenhuma medida de triagem e prevenção da transmissão de mãe para filho do CMV durante o pré-natal. - Os dados sobre a prevalência da infecção congênita por CMV permitirá a criação de um projeto de extensão para acompanhamento dos recém-nascidos infectados durante os primeiros anos de vida para verificação clínica e tratamento dos casos sintomáticos graves. 7

MATERIAL E MÉTODOS 1) Delineamento do estudo Trata-se de um estudo prospectivo para verificação da prevalência da infecção congênita por CMV em recém-nascidos da região de Ilhéus, atendidas na Maternidade Santa Helena no período de um ano. Nesta maternidade são realizados cerca de 250 partos por mês, aproximadamente 3.000 crianças nascem por ano. As amostras de saliva dos recém-nascidos serão coletadas durante o período em que a mãe estiver internada na Maternidade Santa Helena por alunos de iniciação científica de biomedicina e de medicina devidamente treinados para o procedimento com a supervisão da pediatra na maternidade, a qual é docente do curso de medicina, médica da Maternidade Santa Helena e também é membro do projeto. Estas amostras serão colhidas apenas após a aplicação do termo de consentimento com subseqüente aceitação dos pais ou responsáveis legais (quando menor de idade), em participar do estudo sem interferir com o horário da alta hospitalar da mãe. As amostras coletadas dos recém-nascidos serão encaminhadas no mesmo dia pelos próprios alunos de iniciação científica ao laboratório de pesquisa LAFEM da UESC para o processamento por PCR para a possível detecção do genoma viral. Das crianças em que o DNA viral for detectado pela PCR será colhida uma segunda amostra de saliva e também uma amostra de urina para a confirmação da infecção congênita. 2) População do Estudo 8

Serão incluídos neste estudo todos os recém-nascidos, de qualquer idade gestacional, da Maternidade Santa Helena em Ilhéus, Bahia. A inclusão destes recém-nascidos será feita de acordo com os seguintes critérios: 1) Concordância dos pais e ou responsáveis legais em participar juntamente com seus filhos através da obtenção do termo de consentimento livre e esclarecido. 2) Recém-nascidos com qualquer idade gestacional e características clínicas ao nascer. 3) A possibilidade de obtenção de pelo menos uma amostra de saliva do recém-nascido antes da alta hospitalar, ainda na primeira semana de vida. Neste estudo espera-se avaliar aproximadamente 1.000 recém-nascidos durante este período. 3) Aspectos Éticos O estudo foi aprovado no Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC). 4) Local do estudo O estudo será realizado na Maternidade Santa Helena, localizada na cidade de Ilhéus, na região sul da Bahia, que é a única maternidade que realiza atendimento pelo Sistema Único de Saúde em Ilhéus e das cidades circunvizinhas. Juntamente com o Hospital São José esta maternidade é mantida pela Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de Ilhéus, onde cerca de 90% dos partos é realizado pelo SUS. 5) Metodologia Laboratorial 5.1. Coleta das amostras 9

Amostras de saliva dos recém-nascidos serão colhidas com swabs estéreis colocados delicadamente na face interna da bochecha dos recém nascidos durante o período de 1 minuto para a umidificação adequada dos mesmos. Posteriormente, os swabs serão transferidos para tubos plásticos estéreis contendo 1 ml de meio de transporte (MEM Earle, Cultilab). Após 60 minutos, os swabs serão retirados, desprezados e o material armazenado a 4 C até o processamento. O remanescente será estocado a 70 C no Laboratório de Farmacogenômica e Epidemiologia Molecular (LAFEM) da UESC onde as amostras serão processadas. Amostras de urina dos recém-nascidos serão coletadas com cuidados de assepsia local, em sacos coletores hipoalergênicos. Cuidado com eventual irritação cutânea da criança pelo contato com o saco coletor será tomado, bem como com a possível contaminação com mecônio. Após a coleta, as amostras de urina serão colocadas em frascos plásticos estéreis e mantidas a 4 C até o processamento, num período máximo de 24 h até a realização da técnica de PCR. O remanescente será estocado a 70 C. 5.2. Reação em cadeia pela Polimerase (PCR) A detecção do genoma viral na saliva dos recém-nascidos será realizada pela técnica de PCR em pelo menos duas amostras obtidas antes de três semanas de vida (STAGNO et al., 1983; ALFORD et al., 1990; DEMMLER, 1994). As amostras de saliva serão submetidas à PCR sem extração prévia do DNA, sendo apenas aquecidas por 6 min a 94 C. Estas amostras serão processadas pela PCR de duas etapas como previamente descrito por YAMAMOTO et al. (2001). Para a realização da primeira etapa, 5 l da saliva serão utilizadas numa mistura de reação para amplificação gênica, com o par 10

de iniciadores externos gb1319-gb1604 (CHOU; DENNISON, 1991), contendo solução tampão (50mM de KCl e 20mM de Tris HCl, ph 8,5); 1,5mM de MgCl2; 150 M de cada um dos trifosfatos de desoxinucleotídeos; 1U de Taq DNA polimerase (Invitrogen Life Technologies) e 0,3 M de cada um dos iniciadores com volume final de 50 l. A mistura será submetida a um ciclo inicial de 94 C por 2 min, 55 C por 90 seg e 72 C por 2 min, seguido por 34 ciclos de 94 C por 1 min, 55 C por 90 seg e 72 C por 2 min e uma extensão adicional de 10 min a 72 C. Uma alíquota de 1 l do produto amplificado na primeira reação será utilizada na segunda etapa de amplificação com o par de iniciadores internos gbn1-gbn2 (AQUINO & FIGUEIREDO, 2000). A mistura de reação contendo os mesmos reagentes utilizados na primeira reação será submetida a 30 ciclos de 94 C por 1 min, 55 C por 1 min e 72 C por 1 min, seguidos por uma extensão adicional de 3 minutos a 72 C. Em todas as reações serão utilizados como controles positivos à cepa de referência laboratorial AD169 e amostras de urina de crianças identificadas em estudos anteriores como tendo infecção congênita pelo CMV, confirmadas por isolamento viral em cultura de fibroblastos humanos. Amostras de água deionizada serão utilizadas como controles negativos em todas as reações. Todas as amostras com detecção do DNA viral serão repetidas pelo menos em duas ocasiões com os dois pares de iniciadores para confirmação do resultado. Para a visualização das bandas correspondentes, 10 l dos produtos amplificados serão submetidos à eletroforese em gel de agarose a 2% corado com brometo de etídio (0,5 g/ml). A eletroforese será efetuada a 150V, por 30 minutos, em solução tampão TBE (Tris 0,089 M, Borato 0,089 M, EDTA 0,01M 11

ph 7,5). Posteriormente, os géis serão visualizados à luz ultravioleta e fotografados em sistema Polaróide. 6) Avaliação Clínica Todas as crianças com infecção congênita por CMV, confirmada laboratorialmente, serão avaliadas pela pediatra da seguinte forma: a) Exame clínico, incluindo peso, comprimento, perímetro cefálico e torácico, avaliação da hepatimetria, tamanho do baço e fundo de olho. b) Exames complementares: hemograma com contagem de plaquetas, função hepática, bilirrubina total e frações. c) Avaliação auditiva, punção liquórica, tomografia computadorizada de crânio para avaliar comprometimento do SNC. 7) Coleta de Dados Epidemiológicos Com o objetivo de correlacionar os riscos maternos com a prevalência de infecção pelo CMV serão coletados da declaração de nascidos vivos e prontuário médico as seguintes variáveis: idade materna, raça, estado civil, número de filhos, escolaridade e uso de drogas lícitas e ilícitas. VIABILIDADE Para realização deste projeto contamos com a estrutura do Laboratório de Farmacogenômica e Epidemiologia Molecular (LAFEM), da UESC. O laboratório conta com diversos equipamentos que poderão ser utilizados na realização do estudo como capelas e fluxo laminar para os procedimentos técnicos, termociclador para PCR, cubas de eletroforese, freezer e geladeiras para estoque do material biológico e dos reagentes. Neste laboratório será realizado todo o procedimento de armazenamento do material biológico, 12

processamento deste material por PCR até a revelação com o diagnóstico da infecção congênita pelo CMV. Contamos ainda com uma equipe médica formada por uma pediatra, oftalmologista e otorrinolaringologista participante do grupo de pesquisadores para suporte clínico e tratamento das crianças infectadas sintomáticas e assintomáticas. Também participam do estudo estudantes de medicina da UESC que estarão na Maternidade Santa Helena para o esclarecimento sobre a importância do estudo bem como a supervisão da coleta do material dos recém-nascidos, além de estudantes de biomedicina já orientados e treinados para o procedimento de coleta, transporte do material biológico até o laboratório na UESC, e para o processamento destas amostras até o resultado dos testes laboratoriais. As crianças infectadas serão acompanhadas pela pediatra através de retornos médicos determinados para os recém-nascidos na maternidade Santa Helena e naqueles com sintomas graves o tratamento com uso de medicamentos específicos pode ser indicado. A metodologia empregada neste projeto inclui análises moleculares de domínio dos pesquisadores, amplamente utilizados para essa finalidade em humanos. Os primers foram identificados na literatura e sua aplicação envolve procedimentos laboratoriais de domínio da equipe e são similares a projetos que se encontram em andamento no laboratório. Há recursos humanos multidisciplinares qualificados para a abordagem teórica do problema como docentes da UESC e USP-Ribeirão Preto. Além disso, o grupo conta com bolsistas para desenvolvimento das atividades de pesquisa e iniciação científica. RESULTADOS/ PRODUTOS ESPERADOS 13

(a) Conhecimento da Incidência da Infecção Congênita por CMV. Com o levantamento a ser feito durante a realização desse projeto, poderemos verificar a prevalência da infecção congênita por CMV na região de Ilhéus, sul da Bahia. Esse conhecimento é fundamental para uma segunda etapa que se planeja como continuidade, examinar e analisar os dados clínicos destas crianças infectadas precocemente podendo com isso acompanhar e intervir de forma terapêutica nos casos sintomáticos ao nascimento bem como acompanhar os casos assintomáticos para a detecção de sintomas tardios que possam vir a surgir e que necessitam de tratamento. b) Publicações científicas e relatórios. Os resultados obtidos durante a realização deste projeto proporcionarão a publicação de artigos em revistas indexadas nacionais e internacionais. Publicações científicas sobre os dados epidemiológicos da infecção congênita pelo CMV nesta região do nordeste brasileiro ainda não foram descritas. Além de atender às demandas do CNPq e da UESC, quanto aos relatórios de acompanhamento da execução da pesquisa, serão produzidos relatórios técnico-científicos para atender a expectativas de instituições parceiras e possíveis interessados nas informações e nos conhecimentos gerados e adquiridos nessa pesquisa; (c) Consolidação da linha de pesquisa em virologia junto ao grupo de microbiologia, genética e biotecnologia e ao programa de mestrado em microbiologia da UESC: É de grande interesse para o grupo de Microbiologia, Genética e Biologia Molecular da UESC, para os cursos de Medicina, Enfermagem e Biomedicina e, especialmente para o Programa de Pósgraduação Stricto sensu, a consolidação dessa linha de pesquisa, que possibilitará a formação de profissionais críticos, capazes de aprender-a- 14

aprender, isto é, produzir conhecimentos como uma forma de sua aquisição (Iniciação Científica, Mestrado). REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ALFORD C.A.; STAGNO S.; PASS R.F.; BRITT W.J. Congenital and perinatal cytomegalovirus infections. Rev Infect Dis,12 Suppl 7:S745-S753, 1990. AQUINO V. H.; FIGUEIREDO L. T. M. Cytomegalovirus infection in renal transplant recipients diagnosed by nested-pcr. Braz. J. Med and Biol. Res., v. 34, p. 93-101, 2001. BOPPANA S. B.; RIVERA L. B.; FOWLER K. B.; MACH M.; BRITT W. J. Intrauterine transmission of cytomegalovirus to infants of women with preconceptional immunity. N. Engl. J. Med., v. 344, p. 1366-1371, 2001. BROWN H.L.; ALBERNATHY M.P. Cytomegalovirus infection. Semin Perinatal, 22:260-266, 1998. COUTO C.F.C.; RODRIGUES M.V.; MELO G.E.B.A; MENEZES G.A.; LEITE J.M. Citomegalovírus e Gestação: Um Antigo Problema sem Novas Soluções. Femina, Nº. 06 Vol. 31; 509-516, 2003. DAHLE A. J.; FOWLER K. B.; WRIGHT J. D. Longitudinal investigation of hearing disorders in children with congenital cytomegalovirus. J. Am. Acad. Audiol., v. 11, p. 283-290, 2000. DAVIES E.G.; ELLIMAN D.A.C.; HART C.A.; NICOLL A.: Rudd PT (editors) Cytomegalovirus. Manual of Childhood Infections, 2nd Ed., London: Saunders, 254-255 325-3, 2001. DEMMLER G. J.; BUFFONE G. J.; SCHIMBOR C. M.; MAY R. A. Detection of cytomegalovirus in urine from newborns by using polymerase chain reaction DNA amplification. J. Infect. Dis., v. 158, p. 1177-1184, 1988. DEMMLER, G. J. Congenital cytomegalovirus infection and disease. Adv. Pediatr. Infect. Dis., v. 5, p. 52-55, 1994. DEMMLER G.J. Congenital cytomegalovirus infection and disease. Adv Pediatr Infect Dis 11: 135-162,1996. GAYTANT M. A.; GALAMA J. M. D.; SEMMEKROT B. E.; MELCHERS W. J. G.; SPRKEN J. M. M.; OOSTERNBAAN H. P.; van DOP P. A.; HUISMAN A.; 15

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CRONOGRAMA DE ATIVIDADES Ano 1 Ano 2 Trimestre Trimestre 1 2 3 4 1 2 3 4 Meta/Atividade Meta: Divulgação do projeto no hospital e X X X X convite às mães a participar do estudo Atividade: Realização de palestras no X X X X hospital Atividade: Convite às mães a participar do X X X X estudo Meta: Coleta de saliva dos RNs e dos X X X X dados das gestantes Atividade: Coleta de saliva e preparo do X X X X material Atividade: Coleta dos dados das mães nos X X X X prontuários Meta: Diagnóstico laboratorial dos RNs X X X X Atividade: Transporte e processamento X X X X das amostras Atividade: Realização do PCR para CMV X X X X Meta: Avaliação clínica dos RNs X X X X infectados Atividade: Exame clínico X X X X Atividades: Realização de exames X X X X complementares Meta: Acompanhamento dos RNs X X X X X X X X infectados Atividade: Coleta de novas amostras de X X X X X X X X saliva e urina Atividade: Realização do PCR para CMV X X X X X X Atividade: Avaliação clínica periódica X X X X X X X X Atividade: Realização de exames X X X X X X X X complementares Meta: Análise dos resultados e publicação X X X Atividade: Tabulação dos dados e X X X realização das análises estatísticas Atividade: Elaboração dos manuscritos X X X 18