HISTÓRICO. Tecnologia DNA recombinante. Watson & Crick. Ian Wilmut clonagem de mamífero (1997) Estrutura do química do DNA (1953)

Transcrição

1 Engenharia Genética

2 Conteúdo 1. DNA recombinante 2. Enzimas de restrição 3. Vetores de clonagem - Plasmídios - Bacteriófagos - Cosmídeos 4. Etapas de clonagem molecular 5. Aplicações

3 Watson & Crick Estrutura do química do DNA (1953) HISTÓRICO Tecnologia DNA recombinante Insulina recombinante (1978) Ian Wilmut clonagem de mamífero (1997) Nature, 25 - Abr

4 HISTÓRICO PGH Conhecer genoma H. sapiens ( ) Transgenia ( ) Prática clínica Testes genéticos ( )

5 O que é um DNA recombinante? - É uma molécula de DNA formada pela ligação de duas moléculas de origens diferentes (Ex. DNA de planta ligado a um plasmídio)

6 ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

7 Descritas em 1970, W. Alber H. Smith D. Nathans Uma enzima de restrição ou endonuclease de restrição é um tipo de nuclease que cliva fita dupla de DNA sempre que identificar uma seqüência particular de nucleotídios que seja o sítio de restrição da enzima;

8 ENZIMA DE RESTRIÇÃO

9 Enzimas de Restrição - Sítio de reconhecimento seqüência palindrômicas ARARA ARARA OMO OMO ANA ANA - Reconhecem de 4 a 8 pb - Cortes com extremidades abruptas / coesivas - Clonagem molecular - ~ enzimas diferentes

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11 ENZIMAS DE RESTRIÇÃO Tipos de cortes: - Produção de terminais coesivos (adesivos, protuberantes) - Produção de terminais abruptos (ou cegos)

12 ENZIMAS DE RESTRIÇÃO NarI ~~~~~~ 181 ACCATATGCG GTGTGAAATA CCGCACAGAT GCGTAAGGAG AAAATACCGC ATCAGGCGCC TGGTATACGC CACACTTTAT GGCGTGTCTA CGCATTCCTC TTTTATGGCG TAGTCCGCGG 241 ATTCGCCATT CAGGCTGCGC AACTGTTGGG AAGGGCGATC GGTGCGGGCC TCTTCGCTAT TAAGCGGTAA GTCCGACGCG TTGACAACCC TTCCCGCTAG CCACGCCCGG AGAAGCGATA 301 TACGCCAGCT GGCGAAAGGG GGATGTGCTG CAAGGCGATT AAGTTGGGTA ACGCCAGGGT ATGCGGTCGA CCGCTTTCCC CCTACACGAC GTTCCGCTAA TTCAACCCAT TGCGGTCCCA HindIII PstI ~~~~~~~ ~~~~~~ 361 TTTCCCAGTC ACGACGTTGT AAAACGACGG CCAGTGCCAA GCTTGCATGC CTGCAGGTCG AAAGGGTCAG TGCTGCAACA TTTTGCTGCC GGTCACGGTT CGAACGTACG GACGTCCAGC XbaI BamHI KpnI EcoRI ~~~~~~~~~~~~~ ~~~~~~~ ~~~~~~~ 421 ACTCTAGAGG ATCCCCGGGT ACCGAGCTCG AATTCGTAAT CATGGTCATA GCTGTTTCCT TGAGATCTCC TAGGGGCCCA TGGCTCGAGC TTAAGCATTA GTACCAGTAT CGACAAAGGA

13 ENZIMAS DE RESTRIÇÃO EcoRI 37 0 C, 1 hora, com tampão adequado

14 TIPOS DE VETORES

15 PLASMÍDEOS Sequências circulares de DNA. Reproduzem-se de forma autônoma; Encontram-se no citoplasma de certas bactérias. Elementos genéticos extracromossômico.

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18 CLONAGEM MOLECULAR É o isolamento e a propagação em um organismo de moléculas idênticas de DNA

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20 CONSTRUÇÃO DE UM MICRORGANISMO RECOMBINANTE 1. Obtenção do DNA a ser clonado 2. Preparação do vetor 3. Ligação do vetor com o inserto 4. Transformação da bactéria 5. Seleção dos clones recombinantes

21 1.Obtenção do DNA a ser clonado 94 0 C por 5 min PCR 94 0 C por 1 min 55 0 C por 1 min 72 0 C por 1 min 35 ciclos 72 0 C por 5 min 4 0 C

22 2. PCR Reação em cadeia da Polimerase: Permite produzir in vitro um grande número de moléculas de DNA iguais, a partir de uma pequena amostra de sangue, osso, pele, esperma,pêlos, etc. Profª Reisila Mendes

23 3.Preparação do vetor Digestão Purificação Plasmídeo Circular Plasmídeo linear Digestão com Enzimas de restrição

24 4. Ligação Extremidades coesivas DNA plasmidial - vetor Fragmento de DNA - inserto LIGASE

25 Construção do DNA Recombinante Molécula de DNA de um plasmídeo circular Molécula de DNA de um plasmídeo linear com extremidades coesivas anelamento Clivagem com enzima de restrição Ligação covalente pela DNA ligase Inserção em uma célula hospedeira Molécula de DNA plasmidial contendo o inserto

26 Clonagem Molecular

27 APLICAÇÕES

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29 ANIMAIS TRANSGÊNICOS

30 2. Animais transgênicos usados como biofábricas de determinadas substâncias de interesse médico, no estudo de novos e melhores processos para a compreensão, prevenção e tratamento das doenças cardiovasculares, autoimunes, neurológicas e outras doenças humanas. Vítor tem duplicado o gene do receptor B2 da bradicinina, uma substância associada a processos inflamatórios e hipertensivos, responsável pela proteção do coração. O porco da esquerda, transgênico, foi obtido a partir da inserção de um gene fluorescente da água-viva que lhe conferiu focinho e patas amarelos

31 Vetor de Expressão em Eucariotos VETORES PLASMIDIAIS

32 Simulador de epilepsia Simulador de obesidade Simulador de Alcaptonúria Suíno produtor de hemoglobina humana Caprino produtor de droga anticâncer

33 Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (Embrapa), a Universidade de Brasília (UnB) e o Hospital de Apoio de Brasília,produziu no leite de camundongos transgênicos o fator IX humano, uma proteína responsável pela coagulação do sangue. Cientistas criaram um porco com sangue humanos nas veias. Cientistas australianas implantaram células humanas da próstata em camundongos para estudar tratamentos contra o câncer de próstata. O procedimento ocorreu em 2006 e foi o primeiro do tipo. Pesquisadores da Argentina criaram, em 2008, uma vaca transgênica cujo leite contém a proteína humana do crescimento. A substância produzida por vacas tem sido usada em tratamentos do nanismo. Salmão transgênico cresce 10x mais rapidamente que o normal. Ratos com enzima de bactéria transformaram gordura em gás carbônico e mantiveram-se magros mesmo comendo mais.

34 PLANTAS TRANSGÊNICAS

35 Milho transgênico Bt ( Bacillus thuringiensis)resistente ao ataque de insetos; Soja transgênica Roundup-Ready da Monsanto Arroz dourado rico em betacaroteno da Ingo Potrykus Tomate longa-vida, de amadurecimento demorado

36 Plantas Transgênicas Fotografia de planta do tabaco com gene de vagalume Curiosidade: os cientistas conseguiram introduzir, na planta do tabaco, um gene de vagalume capaz de sintetizar a enzima luciferase que catalisa, nesse inseto, a degradação da luciferina (proteína que produz luz). O gene clonado em plasmídeo multiplicou-se em bactérias e, depois de purificado, foi injetado na célula de fumo. O gene modificado passou para o DNA da planta, que, quando regada com luciferina, emitia luz como o vagalume. Imagem: Autor desconhecido / GNU Free Documentation License.

37 en baraobiologia.com Rice Alimento básico para 60% da população mundial; Dentre os grãos comestíveis, possui o código genético mais curto; Contém grandes quantidades de beta-caroteno, que é convertido no organismo em vitamina A;

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39 Desvantagens Aumento das reações alérgicas; As plantas que não sofreram modificação genética podem ser eliminadas pelo processo de seleção natural; Aumento da resistência aos pesticidas e gerando maior consumo deste tipo de produto; Matar populações benéficas como abelhas, minhocas e outros animais e espécies de plantas; Sementes estéreis - Patenteadas por grandes empresas - Agrotóxico específico

40 Legislação baraobiologia.com Decreto n 4.680, de 24 de abril de 2003 Na comercialização de alimentos e ingredientes alimentares destinados ao consumo humano ou animal que contenham ou sejam produzidos a partir de organismos geneticamente modificados, com presença acima do limite de um por cento do produto, o consumidor deverá ser informado da natureza transgênica desse produto.

41 Terapia gênica ou geneterapia: Consiste em introduzir no organismo de uma pessoa que tenha uma doença genética, células contendo o alelo normal correspondentes ao alelo causador da doença. César e Sezar

42 Revista Época,3/10/2011

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44 DNA fingerprint: impressão digital genética O resultado da eletroforese é uma imagem fotográfica semelhante a um código de barras ou impressão digital : é o DNA fingerprint. Observe a imagem! Filme de bandas de DNA Equipamento para eletroforese em gel Imagem: Mnolf / GNU Free Documentation License. Imagem: Jeffrey M. Vinocur / GNU Free Documentation License.

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48 plicações práticas de DNA gerprint A popularidade do DNA se deve, entre outros fatores, aos testes de paternidade propagados pela mídia. Teste de paternidade: compare os códigos de barra da mãe e da criança com o código de barra dos dois prováveis pais. A criança deve ter 50% do padrão de barras da mãe e 50% do padrão de barras do pai. Mãe Criança Homem A Homem B Descubra quem é o pai da criança! Fonte:

49 BIOLOGIA, 3º Ano do Ensino Médio Tecnologias de manipulação do DNA: riscos e benefícios baraobiologia.com Se você respondeu homem B, parabéns! Mãe Criança Homem A Homem B Os testes que utilizam DNA fingerprint são tão seguros que fornecem 99,9% de certeza. Observe que as três bandas de DNA de origem paterna (não encontradas na mãe) ocorrem no homem B. Para realizar o exame de DNA, basta ter qualquer amostra biológica, como pele, cabelo, sangue, sêmen, entre outras. Teste de paternidade. Identificação de pessoas em investigações policiais ou judiciais. Aconselhamento genético.

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53 5. Clonagem reprodutiva 1981 camundongos clonados de células da linhagen germinativa; 1997 ovelha Dolly; º clone de embrião humano(6 células);

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55 Clonagem terapêutica Utiliza a técnica para o tratamento de doenças as genéticas e as degenerativas como diabetes, infartos, lesões na medula espinhal, etc. César e Sezar

56 Projeto Genoma Humano baraobiologia.com O Projeto Genoma Humano (PGH) foi um dos grandes feitos da história da Genética e sua conclusão se deu em abril de Com a utilização de tecnologias muito sofisticadas, foi possível mapear o DNA humano em 99,99%. São aplicações do PGH: Identificação de genes que causam ou predispõem doenças genéticas e câncer. No aconselhamento genético, análise das chances de um casal ter filhos portadores de anomalias hereditárias. Identificação de genes que predispõem doenças metabólicas como diabetes. Produção de remédios que atuam com mais eficácia e de forma específica.

57 o genoma humano contem 3,2 bilhões de nucleotídeos Genes o tamanho médio dos genes é de bases, mas varia muito, sendo o maior deles o gene da distrofina com 2,4 milhões de pares de bases a função de cerca de 50% dos genes descobertos é desconhecida a sequência do genoma humano é 99,9% exatamente a mesma em todas as pessoas sequências repetidas que não codificam proteínas constituem mais do que 50% do genoma humano.

58 Homem (Homo sapiens) 3.2 bilhões Camundongo (M. musculus) 2.6 bilhões Hera (A. thaliana) 100 milhões Verme (C. elegans) 97 milhões Mosca das frutas (D. melanogaster) 137 milhões Levedura (S. cerevisiae) 12.1 milhões Bactéria (E. coli) 4.6 milhões Vírus da imunodeficiência Humana (HIV)

59 FIM