AVALIAÇÃO CITO/GENOTÓXICA DE Costus spiralis (Jacq.) Roscoe ATRAVÉS DO TESTE DE Allium cepa

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1 AVALIAÇÃO CITO/GENOTÓXICA DE Costus spiralis (Jacq.) Roscoe ATRAVÉS DO TESTE DE Allium cepa Wendel Cruvinel de Sousa¹ Elisa Flávia Luiz Cardoso Bailão² 1 Graduando em Ciências Biológicas Modalidade Licenciatura, Bolsista do Programa Institucional de Bolsas de Iniciação Científica - Ações Afirmativas do CNPq, Universidade Estadual de Goiás, Câmpus de Iporá, Iporá, Goiás, Brasil. wendelcruvinel@gmail.com 2 Docente, Câmpus Henrique Santillo, Universidade Estadual de Goiás, Anápolis, Goiás, Brasil. 1. INTRODUÇÃO O Cerrado é considerado por sua formação geográfica e fitofisionômica como área savânica. Este bioma representa aproximadamente 22% do território brasileiro, está distribuído entre 15 Estados e é o segundo maior bioma da América do Sul (BRASIL, 2014). O Cerrado é considerando como um dos hotspots mundiais devido a sua abundância de espécies, consideradas endêmicas. Estima-se que este bioma abrigue espécies de plantas (BRASIL, 2014; BRASIL, 2006). Segundo a Conservação Internacional do Brasil (2014), mais de destas espécies nativas do Cerrado já foram catalogadas. Acredita-se que algumas espécies do Cerrado não serão catalogadas, visto que este bioma vem sendo destruído devido à crescente expansão das fronteiras agropecuária e agrícola, uma vez que o bioma apresenta condições geográficas ideais para ambas as intervenções (CAMARGO, SOUZA, COSTA; 2014). Porém, por possuir uma vasta variedade de plantas com propriedades terapêuticas sobre inúmeras doenças humanas, o Cerrado desperta o interesse de pesquisadores de todo o mundo (SOUZA; FELFILI, 2006). O difícil acesso ao atendimento médico e o alto valor comercial dos medicamentos industrializados levam a população a utilizar plantas com

2 propriedades terapêuticas devido ao seu baixo custo, fácil acesso e sua influência cultural (PILLA; AMOROZO; FURLAN, 2006). Costus spiralis, conhecida como cana-de-macaco ou cana-do-brejo, é uma planta originária da América do Sul e é encontrada na Amazônia, no Cerrado e na Mata Atlântica (MAAS e MAAS, 2014). Ela é pertencente à família Costaceae e é popularmente usada para o tratamento de infecções urinárias, cálculos renais, infecções de garganta, câncer de próstata, hipertensão arterial, diarreia, hepatite, sífilis, gonorreia e diabetes mellitus (SILVEIRA e RIEDER, 2009; DI STASI e HIRUMA-LIMA, 2002; PILLA; AMOROZO; FURLAN, 2006). Trabalhos anteriores apontaram que a fração aquosa de C. spiralis diminui a contratilidade do miocárdio de mamíferos (BRITTO, 2011), apresenta efeito biocida sobre larvas do inseto Spodoptera frugiperda (SILVEIRA; RIEDER, 2009), a principal praga da cultura do milho no Brasil, e inibe a proliferação de Vibrio cholerae, Bacillus substilis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa e Asperigillus ochraceous in vitro (PÉREZ et al., 2008; HABSAH et al., 2000; BRITTO, 2011). Devido à aplicação de C. spiralis no tratamento de doenças pela população e pela possibilidade de desenvolvimento de futuras drogas utilizando princípios ativos extraídos dessa planta, faz-se necessária a investigação da atividade cito/genotóxica de C. spiralis. Pesquisas destinadas à investigação da cito/genotoxicidade de diferentes compostos visam avaliar o efeito de substâncias sobre o DNA de organismos vivos, como alterações genéticas e cromossômicas (VARANDA, 2006). Uma das formas de se fazer essa avaliação é utilizando o teste de Allium cepa, validado pela Organização Mundial de Saúde e pelo Programa Internacional de Segurança Química (VIEIRA, et al, 2009). 2. OBJETIVOS 2.1. Objetivo geral Avaliar o potencial cito/genotóxico do extrato aquoso de folhas ou de colmos da planta Costus spiralis Objetivos específicos Coletar e secar amostras de folhas e de colmos de C. spiralis; Obter os extratos aquosos de folhas ou de colmos das amostras coletadas; Realizar o teste de Allium cepa com os extratos aquosos obtidos;

3 Avaliar micro e macroscopicamente as raízes de Allium cepa após a exposição dos bulbos aos extratos de C. spiralis. 3. METODOLOGIA 3.1. Obtenção do extrato aquoso de C. spiralis Amostra de um espécime de C. spiralis foi coletada no município de Israelândia, Goiás. A mesma foi identificada pelo Prof. Dr. Aristônio Magalhães Teles da Universidade Federal de Goiás e uma exsicata foi depositada no herbário da UEG de Anápolis sob o número Posteriormente, foram coletados folhas e colmos de C. spiralis. O material foi seco e pulverizado para a realização do teste de Allium cepa. O extrato aquoso utilizado no teste foi obtido a partir da imersão do material vegetal durante 10 min em água mineral estéril, seguido por 5 min de fervura (KELLER, et al., 2009) Teste de Allium cepa Bulbos de cebola foram expostos às infusões preparadas com o pó das folhas ou dos colmos de C. spiralis em diferentes concentrações (0,018 g/ml, 0,009 g/ml e 0,0045 g/ml). Após 24 h e 48 h, foram coletadas raízes para a avaliação microscópica das mesmas. Após 72 h, foram coletas raízes para a avaliação macroscópica. Como controle negativo, foram utilizadas cebolas expostas à água mineral estéril e como controle positivo paracetamol a 0,8 mg/ml (PINHO et al., 2009). Os dados obtidos de seis indivíduos por condição foram comparados utilizando-se o teste de t Avaliação macro e microscópica das raízes de cebola Para as análises macroscópicas, 10 raízes de cada bulbo foram mensuradas com auxílio de um paquímetro para avaliar o crescimento das raízes expostas aos chás e comparar com o grupo controle incubado em água. Foram avaliadas também alterações da coloração dos tecidos, encurvamento ou torção das raízes e formação de tumores (FISKEIJÖ, 1985). Para a avaliação microscópica, as raízes foram coletadas, lavadas em água deionizada e fixadas em Carnoy. O material foi hidrolisado em HCl 1 N por 10 min e lavado em água. Posteriormente, essas raízes foram colocadas sobre uma lâmina e uma gota de carmim acético 1% foi adicionada sobre a amostra. As raízes foram maceradas com o auxílio de uma agulha e de uma lâmina de bisturi enferrujada, o que provoca a liberação do mordente que realça a

4 coloração dos cromossomos (MONDIN e NETO, 2006). Uma lamínula foi colocada por cima do material e a lâmina foi observada em microscópio óptico em objetiva de 40x. 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO A partir das análises macroscópicas, foi possível observar que os extratos de folhas (Extf.) e de colmos (Extc.) de C. spiralis apresentaram efeito inibitório sobre o crescimento das raízes de A. cepa, semelhantemente ao que foi observado para o controle positivo (Tabela 1). Tabela 1. Média de crescimento de raízes expostas a diferentes substâncias por 72 h. Tratamento Crescimento Médio (cm) Cont. Negativo 3,05 + 1,12 Cont. Positivo 0,38 + 0,18* Extf. 0,018 g/ml 0,53 + 0,18* Extf. 0,009 g/ml 0,60 + 0,21* Extf. 0,0045 g/ml 0,98 + 0,36* Extc. 0,018 g/ml 0,27 + 0,09* Extc. 0,009 g/ml 0,32 + 0,09* Extc. 0,0045 g/ml 0,57 + 0,22* Extf.: extrato aquoso de folhas de C. spiralis. Extc.: extrato aquoso de colmos de C. spiralis. *: diferenças estatisticamente significativas (p < 0,05). Os meristemas das raízes das cebolas tratadas com os chás de folhas ou de colmos de C. spiralis apresentavam sinais de toxicidade, apresentando alterações na cor, marcas de necrose, encurvamento e tumores (Fig. 1).

5 Fig. 1. Raízes de Allium cepa observadas após 72 h de tratamento com chá das folhas ou de colmos de C. spiralis. A: tratamento com chá das folhas de C. spiralis. B: tratamento com chá do colmo de C. spiralis. C: Controle positivo D: Controle negativo. *: alterações na cor; º: presença de encurvamento; # : presença de tumor; marcas de necrose. Os resultados obtidos a partir da avaliação macroscópica indicam que os extratos aquosos de folhas ou de colmos de C. spiralis apresentam um efeito inibitório sobre o crescimento dos meristemas radiculares de A. cepa, além de alterações na coloração e na morfologia das raízes, indicando que esses extratos podem ser tóxicos. Este efeito já foi observado para o extrato bruto etanólico das folhas de C. spicatus sob Artemia salina (BITENCOURT; ALMEIDA, 2014). Apesar disso, este extrato apresentou atividade antinociceptiva em ratos induzido por ácido-acético e formalina (SOUSA, et al., 2014). Segundo Fachinetto e colaboradores (2007), a presença de compostos químicos pode inibir ou acelerar o ciclo mitótico das células. Segundo Teixeira et al. (2003) e Brasil (2015), a presença de taninos pode ser uma das principais causas sobre o efeito inibitório do crescimento dos meristemas de Allium cepa tratados com chá da C. spiralis. Estudos fitoquímicos utilizando as frações aquosa ou metanólica dos extratos de Costus afer, Costus spicatus, C. spiralis, Costus igneus e Costus speciosus revelaram que essas plantas apresentam flavonóis, flavanonas, saponinas, flavonoides, xantonas, flavonas, fenóis e taninos, o que pode ser a principal causa de inibição dos meristemas radiculares (ANYASOR et al., 2010; DURAIPANDIYAN et al., 2012; BRITTO, 2011; PAES et al., 2013; UROOJ; DEVI D, 2010). Durante as análises microscópicas, foram verificadas 1000 células de cada bulbo a cada 24 h, sendo utilizados 6 bulbos por tratamento, totalizando 6000 células por tratamento no tempo de 24 h ou 48 h. Estes dados estão representados na Tabela 2, juntamente com o número total de células analisadas e o número de alterações cromossômicas. Foi possível observar diferenças estatisticamente significativas nos índices mitóticos (IM) dos organismos tratados sob as diferentes concentrações dos chás de folhas ou de colmos de C. spiralis quando comparados ao controle negativo. Apesar da redução observada no IM, a planta não deve apresentar efeito citotóxico, uma vez que a redução observada foi maior que 50% (GREENWOOD et al., 2004).

6 Tabela 2. Número total de células analisadas por tratamento, índice mitótico, número de células com alterações cromossômicas e seus respectivos tempos de exposição. Células Alterações Total de Tratamentos Grupos IM totais cromossômicas aberrações Nc Pc Mc Ac Cp CN 24h ,03+0, h ,20+0, CP Extf. 0,018 Extf. 0,009 Extf. 0,0045 Extc. 0,018 Extc. 0,009 Extc. 0, h ,55+0, h ,21+0, h ,40+0, h ,45+0,48* h ,46+0,56* h ,51+0, h ,11+0, h ,21+0, h ,00+0,51* h ,76+0,46* h ,48+0,37* h ,70+0, h ,02+0, h ,76+1, CN: Controle Negativo; CP: Controle Positivo; Extf.: Extrato aquoso de folhas de C. spiralis em suas diferentes concentrações 0,018, 0,009, 0,0045 g/ml; Extc.: Extrato aquoso de colmos de C. spiralis em suas diferentes concentrações 0,018, 0,009, 0,0045 g/ml; IM: Índice Mitótico; Nc: Necrose; Pc: Ponte cromossômica; Mc: Micronúcleo; Ac: Aderência cromossômica; Cp: Cromossomo perdido. *: diferenças estatisticamente significativas (p < 0,05). Durante as análises, foi possível observar células normais em intérfase e em diferentes fases do ciclo mitótico (Fig. 2 A-E) e alterações cromossômicas (Fig. 2 F-I). Apenas 0,081% das células analisadas apresentaram alterações cromossômicas, indicando que os extratos aquosos de folhas ou de colmos de C. spiralis não são genotóxicos.

7 Fig. 2. Células em diferentes fases da mitose e eventuais anomalias induzidas pela exposição dos bulbos aos diferentes tratamentos e concentrações de C. spiralis. Células normais em intérfase (A), prófase (B: seta), metáfase (C: seta) anáfase (D: seta) e telófase (E: seta). F: células em necrose (seta); G: ponte cromossômica (seta); H: micronúcleo (seta); I: cromossomo perdido (seta). Os resultados obtidos a partir da avaliação microscópica, sugerem que os extratos aquosos de folhas ou de colmos de C. spiralis não apresentam efeito citotóxico (redução do IM superior a 50% com relação ao controle negativo) ou genotóxico (baixo número de aberrações cromossômicas). Resultados similares já foram encontrados utilizando-se o extrato aquoso de rizoma de C. speciosus pelo teste de Allium cepa. Diferentes concentrações do extrato aquoso de rizoma de C. speciosus não apresentou efeito genotóxico e citotóxico em células de A. cepa (QARI, 2010). Já o extrato metanólico do rizoma de C. speciosus apresentou uma forte atividade citotóxica sobre Artemia salina Leach. Acredita-se que este efeito seja decorrente de metabólitos secundários tais como flavonoides e compostos fenólicos extraídos na fração metanólica deste extrato (ISLAM et al., 2010). A fração metanólica das

8 folhas de C. igneus, C. spicatus e das raízes de Costus malortieanus também apresentaram atividade citotóxica sobre células de câncer de mama do Michigan Cancer Foundation 7 (MCF-7) (DHANASEKARAN; AKSHAYA; PREETHI, 2014), sob linhagens de células cancerígenas de fibrosarcoma HT-1080 (NADUMANE, et al., 2011) e sobre células do fígado normais (WRL 68) e células cancerígenas do fígado (Hep G2) (AI-RASHIDI; SUPRI; MANSHOOR, 2011). Dessa forma, os resultados obtidos até o momento sugerem que o extrato aquoso de C. spiralis pode ser tóxico, mas não apresenta cito ou genotoxicidade. Mais estudos utilizando outros modelos celulares e a identificação dos compostos presentes no extrato aquoso de C. spiralis devem ser realizados para a utilização terapêutica segura dessa planta. 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AI-RASHIDI, W.; SUPRI, N. N. M. MANSHOOR, N. Cytotoxic activity of crude extract from Costus malortieanus (Costacear). Am-Euras. J. Toxicol. Sci., v. 3, ed. 2, p , ANYASOR et al. Phytochemical constituents and antioxidant activities of aqueous and methanol stem extracts of Costus afer Ker Gawl. (Costaceae). African J. Biotechnology v. 9, n. 31, p , BITENCOURT, A. P. R.; ALMEIDA, S. S. M. S. Estudo fitoquímico, toxicológico e microbiológico das folhas de Costus spicatus Jacq. Biota Amazonia, v. 4, n. 4, p , BRASIL.; MINISTERIRO DA EDUCAÇÃÕ E CULTURA MEC. Estudo do Potencial Genotóxico do Extrato Hidroalcóolico Da Operculina Alata (Ham) Urban. Disponível em: < 0CARDOSO%20BEIRAO.pdf>. Acessado em: 21 de Jul BRASIL.; MINISTERIO DO MEIO AMBIENTE. O BIOMA CERRADO. Disponível em: < Acessado em: 22 de Dez ; MINISTÉRIO DO MEIO AMBIENTE. Probio. Projeto de conservação e Utilização Sustentável da Diversidade Biológica Brasileira: PROBIO: Dez anos de atuação. Brasília-DF, p , BRITTO, Raquel Moreira. Efeito da fração aquosa das folhas de Costus spiralis (Jacq.) Roscoe sobre a função contrátil do coração de mamíferos. Aracaju, CAMARGO, Flora F.; SOUZA, Thaianny R.; COSTA, Reginaldo B. Etnoecologia e etnobotânica em ambientes de Cerrado no Estado de Mato Grosso. Interações, Campo Grande, v. 15, n. 2, p , jul./dez

9 CONSERVAÇÃO INTERNACIONAL DO BRASIL. HOTSPOT (As Regiões Biologicamente mais Ricas e Ameaçadas do Planeta). Disponível em: < Acessado em: 22 de Dez UROOJ, A.; DEVI D, V. Nutrient profile and antioxidant componentes of Costus speciosus Sm. and Costus igneus NaK. Ind. J. Natural Products Resources, v. 1, n. 1, p , DHANASEKARAN, S.; AKSHAYA, M.; PREETHI, S. In vitro anti-proliferative potential of leaves of Costus igneus. Int. J. Innovations in Engineering and Technology (IJIET), v. 4, ed. 4, DURAIPANDIYAN, V. et al. Antimicrobial Activity of Sesquiterpene Lactones Isolated From Traditional Medicinal Plant, Costus Speciosus (Koen Ex.Retz.) Sm. BMC Complementary and Alternative Medicine, DI STASI, Luiz Claudio; HIRUMA-LIMA, Clélia Akiko. Plantas medicinais na Amazônia e na Mata Atlântica. 2ªed. rev. e ampl São Paulo: UNESP, FISKEIJÖ, Geirid. The Allium test as standard in envirnmental monitoring. Hereditas, v. 102, p , FACHINETTO, Juliana M. et al. Efeito anti-proliferativo das infusões de Achyrocline satureioides DC (Asteraceae) sobre o ciclo celular de Allium cepa. Journal of Pharmacognosy, v. 17, p.49-54, GREENWOOD, Susan K. et al. A simple and more accurate estimation of cell growth suppression in the in vitro assay for chromosomal aberrations that reduces Irrelevant positive results. Environmental Molecular Mutagenesis v. 43, p , HABSAH, M. M. et al. Screening of Zingiberaceae extracts for antimicrobial and Antioxidant activities. J. Ethnopharmacol., v. 72, p , ISLAM, A. et al. In vitro antioxidant and cytotoxic potencial of Costus speciosus (Koen.) smith rhizome. International Jor. P. S. R., v. 1, n. 10, p , KELLER, Amy.C et alii. Costus spicatus tea failed to improve diabetic progression in C57BLKS/J db/db mice, a model of type 2 diabetes mellitus. J. Ethnopharmacol., 2009 Jan. 21. MONDIN, Mateus.; NETO, Americo Doocha. Citogénetica vegetal enfatizando a Família Orchidaceae. São Paulo, MAAS e MAAS, P.; MAAS, H. Costaceae in Lista de espécies da Flora do Brasil. Jardim Botânico do Rio de Janeiro. Disponível em: < Acessado em: 22 Dez

10 NADUMANE, V. K., et al. Evaluation of the anticancer potential of Costus pictus on fibrosarcoma (HT-1080) cell line. J. of Natural Pharmaceuticals, v. 2 Issue 2, p. 72, PAES, L. S. et al. Aspectos Estruturais e Fitoquímicos de partes vegetativas de Costus spicatus (Jacq.) Sw. (Costaceae). Rev. Bras. Pl. Med., Campinas, v.15, n.3, p , PILLA, Milena Curitiba.; AMOROZO, Maria Christina.; FURLAN, Antonio. Obtenção e uso das plantas medicinais no distrito de Martim Francisco, município de Mogi-Miri, SP, Brasil. Atlas, PINHO, Daiane S. et al. Avaliação da atividade mutagênica da infusão de Baccharis trimera (Less.) DC. em teste de Allium cepa e teste de aberrações cromossômicas em linfócitos humanos. Rev. Bras. Farmacogn. Braz. J. Pharmacogn, abril PÉREZ, C. et al. Antibacterial effect of Costus spiralis leaves extracton pathogenic strains of Vibrio cholerae. Rev. CENIC. Ciências Biológicas, v. 39, núm. 1, p , QARI, Sameer Hasan M. DNA-RAPD Fingerprinting and cytogenetic screening of genotoxic and antigenotoxic effects of aqueous extracts of Costus speciosus (Koen.). JKAU: Sci., v. 22, n. 1, p , SOUZA, Cynthia D., FELFILI, Jeanine M. Uso de plantas medicinais na região de Alto Paraíso de Goiás, GO, Brasil. Acta bot. bras. Dez SOUSA, D. P. et al. Phytochemical and pharmacological evaluation from leaves of Costus spicatus Swartz. (Costaceae). J. Chem. Pharm. Res., v. 6, n. 10, p. 1-8, SILVEIRA, T. T. S; RIEDER, A. Bioatividade do extrato foliar de cana-do-brejo (Costus spiralis (JACQ.) Roscoe) Em Spodoptera frugiperda (J. E. SMITH, 1797). 2ªed. jur. Cien Cárceres: UNEMAT, TEIXEIRA, R. O. et al. Assessment of two medicinal plants, Psidium guajava L. and Achillea millefolium L. in in vivo assays. Genetics Molecular Biology, v. 26, p , VARANDA, E. A. Atividade mutagênica de Plantas Medicinais. Ver. Ciênc. Farm. Básia Apl, Araraquara, v. 27; n.1, p.1-7, ago VIEIRA, A.; GUIMARÃES, M. A.; DAVID, G. Q.; KARSBURG, I. V. CAMPOS, A. N. R. Efeito genotóxico da infusão de capítulos florais de camomila. Rev. Trópica Ciências Agrárias e Biológicas. V. 3, N. 1, p. 8, 2009.