XVII CONGRESSO DE PÓS-GRADUAÇÃO DA UFLA I ENCONTRO DE ENGENHARIA DE SISTEMAS IV WORKSHOP DE LASER E ÓPTICA NA AGRICULTURA 27 a 31 de outubro de 2008

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1 IDENTIFICAÇÃO, AVALIAÇÃO E CORRELAÇÃO DA ATIVIDADE LIPOLÍTICA DE FUNGOS ISOLADOS DE AMBIENTE CAVERNÍCOLA COM O INTERESSE BIOTECNOLÓGICO PARA TRATAMENTO DE RESÍDUOS MICHELLE FERREIRA TERRA 1 ; BÁRBARA VITORINO LAURENTE 2 ; DAIANI MARIA DA SILVA 3 ; RODRIGO LOPES FERREIRA 4 LUIS ROBERTO BATISTA 5 RESUMO As lipases microbianas têm despertado grande interesse como alternativa ao tratamento convencional de despejos industriais. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivos avaliar, qualitativamente, a produção de lipases e identificar até o nível de espécies os fungos filamentosos isolados de ambiente cavernícola visando o potencial biotecnológico para tratamento de resíduo. Foram testados 50 isolados quanto à atividade lipolítica, e a atividade enzimática foi expressa como índice enzimático, mediante a relação do diâmetro médio do halo de degradação e o diâmetro da colônia. Os fungos foram, posteriormente, identificados em dois gêneros fúngicos: Aspergillus e Penicillium, e nas seguintes espécies: Aspergillus versicolor, Aspergillus japonicus, Aspergillus lanosus, Aspergillus sclerotiorum, Aspergillus ochraceus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus awamorii, Aspergillus oryzae, Aspergillus auricomus e Penicillium citrinum. Dos 50 isolados testados 36 demostraram ser produtores de lipases e as espécies Aspergillus versicolor e Aspergillus auricomus mostraram ser promissoras para estudos futuros visando o potencial de produção de lipases de interesse para a biocatálise ambiental. Palavras-chave: lipases, fungos filamentosos, tratamento de resíduos. INTRODUÇÃO As enzimas são proteínas que apresentam atividade catalítica, ou seja, exercem a função de acelerar ou mesmo possibilitar reações entre componentes químicos. Apesar de ocorrerem amplamente em plantas e animais, as de origem microbiana representam as melhores fontes em decorrência de sua ampla variedade catalítica, além de serem obtidas em elevadas quantidades, com custo reduzido e apresentando grande homogeneidade e qualidade (Nascimento, 2005). De acordo com Mendes et al. (2005) os lipídeos contidos em águas residuárias provenientes de indústrias do setor agroindustrial e doméstico, além de representarem uma perda industrial importante, interferem negativamente nos Sistemas de Tratamento de Efluentes. Processos alternativos vêm sendo utilizados na redução da concentração de lipídeos contidos nesses efluentes por meio de ação de enzimas, particularmente lipases. As lipases (triacilglicerol acil hidrolases, E.C ) compreendem um grupo de enzimas hidrolíticas que atuam na interface orgânica-aquosa, catalisando a hidrólise de ligações éster-carboxílicas, presentes em acilgliceróis. Apresentam uma importância particular, pelo fato de hidrolisarem especificamente óleos e gorduras, o que pode ser de grande interesse para o tratamento de efluentes com alto teor de gordura. As principais fontes de geração de lipídeos são indústrias de óleos comestíveis, sorvetes, laticínios, curtumes, matadouros e os efluentes domésticos e de restaurantes, principalmente de fast food. As lipases são comumente encontradas na natureza, podendo ser obtidas a partir de fontes animais, vegetais e microbianas. Suas características diferem em função de sua origem e das formas empregadas para a sua obtenção (LEAL, 2000). Do ponto de vista econômico e industrial, os microrganismos são preferíveis as lipases de fontes animais e plantas, devido ao 575

2 alto custo do seu isolamento (NASCIMENTO et al., 2004). A utilização de enzimas específicas como hidrolases, principalmente lipases, pode ser de grande interesse para correções de problemas no sistema biológico causados pelo alto teor de lipídeos. Este tipo de tratamento apresenta vantagens, tais como controle dos produtos, a não obtenção de sub-produtos tóxicos, condições moderadas de operação, redução de custos de energia, além das enzimas poderem ser reutilizadas, o que torna o processo atrativo do ponto de vista econômico e ambiental (Masse et al., 2001; Novo Nordisk, 1992). Em um futuro próximo, o tratamento de resíduos também deverá representar um campo de vasta aplicação de enzimas, seja na prevenção, limpeza ou no tratamento de filmes gordurosos (Leal, 2000). Uma tendência crescente do mercado de lipases aumenta a necessidade de encontrar, a partir da seleção de microrganismos, novas lipases com características desejáveis e interessantes. A diversidade microbiológica de ambientes cavernícolas vem sendo pouco estudada, principalmente com relação à identificação de espécies e ao potencial biotecnológico. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivos avaliar, qualitativamente, a produção de lipases e identificar até o nível de espécies os fungos filamentosos isolados de ambiente cavernícola visando o potencial biotecnológico para tratamento de despejos industriais. MATERIAL E MÉTODOS Isolamento e purificação dos fungos filamentosos Os fungos foram isolados do ambiente de cavernas da Caatinga brasileira (Região Nordeste), utilizando-se a Técnica de Sedimentação em Placas.O isolamento foi realizado a partir dos meios de cultura padronizados DRBC (Dicloram Rosa de Bengala Cloranfenicol) e DG18 (Dicloran Glicerol 18%), sendo posteriormente mantidos em temperatura ambiente. Realizou-se a purificação dos mesmos em meio de cultura padronizado MA (Extrato de Malte) e mantiveram-nos em uma BOD à 25ºC durante 7-8 dias. Teste de atividade lipolítica Para realização do teste de atividade lipolítica, 50 isolados foram inoculados no meio de cultura descrito por Sierra (1957) que contém Tween 20 como substrato. Após 5-7 dias de incubação à temperatura de 25ºC, as colônias foram avaliadas quanto à produção enzimática através da formação de uma zona de precipitados visíveis ao seu redor. As medições dos diâmetros dos halos de hidrólise e da colônia foram realizadas com régua (cm), colocada no reverso das placas de Petri. A atividade enzimática extracelular foi avaliada mediante a relação entre o diâmetro médio do halo de degradação e o diâmetro médio da colônia e expressa como índice enzimático (HANKIN & ANAGNOSTAKIS, 1975). Desse modo, quanto maior o índice maior é a atividade enzimática no meio (OLIVEIRA et al., 2006). Identificação de fungos filamentosos A partir das culturas puras os fungos foram identificados de acordo com Pitt et al. (2000), Klich (2002), Samson et al. (2000) e Pitt & Hocking (1997). Todos os isolados foram incubados em meios de cultura e temperaturas padronizados CYA Czapek Yeast Agar (K 2 HPO 4 1.0g; Concentrado Czapek 10.0ml; Extrato de Levedura, 5.0g, Agar 15.0g, Água Destilada 1Litro; Concentrado Czapek NaNO g, KCl 5.0g, MgSO 4.7H 2 O, 5.0g, FeSO 4.7H 2 O 0.1g, ZnSO 4.7H 2 O 0.1g, CuSO 4.5H 2 O 0.05g, Água Destilada 100ml) e MEA (Extrato de Malte 20.0g, Peptona 1.0g, Glucose 30.0g, Agar 20g, Água Destilada 1 Litro) a 25ºC e CYA a 37ºC e após 7 dias de incubação foram observadas as características microscópicas e macroscópicas. Os fungos pertencentes ao gênero Penicillium, além de serem isolados nos meios de cultura CYA e MEA, como descritos anteriormente, também foram incubados no meio de cultura padronizado CREA Creatine Sucrose Agar (Creatina 3.0g, 576

3 Sacarose 30g, KCl 0.5g, MgSO 4 7H 2 O 0.5g, K 2 HPO 4 3H 2 O 1.3g, FeSO 4 7H 2 O 0.01g, Bromocresol Púrpura 0.05g, Agar 15g e Água Destilada 1 Litro). RESULTADOS E DISCUSSÃO Os fungos isolados de ambientes cavernícolas identificados até o momento pertencem a dois gêneros: Aspergillus e Penicillium. A seguir, na Tabela I, mostra-se o resultado da identificação dos fungos filamentosos. TABELA I Espécies de fungos filamentosos identificados e índice enzimático. ESPÉCIES ISOLADOS IDENTIFICADAS Aspergillus japonicus ÍNDICE ENZIMÁTICO GB19 1,36 FF9 1,36 FF8 - FF10 - GSJ6 1,00 LB17A - Aspergillus lanosus GB17 1,08 GB12 1,14 GB34 - GB2 1,31 GB4 1,03 GB1 1,35 Aspergillus sclerotiorum GSJ4 - GM1 1,23 GPS3 1,36 GPS51 1,26 GPS56 1,47 GPS60 1,63 GPS11 1,06 FJ26 1,50 GB25 - GB9A - Aspergillus ochraceus GB13 - GB35 1,20 GB18 1,26 GB32 1,08 GB9 1,26 GPS10A 1,20 Aspergillus aculeatus GB16 - GB36 1,88 GB49 1,20 Aspergillus versicolor TM8 2,73 GG15 2,06 LB7 2,05 GGT5 2,00 GB39 1,2 Aspergillus foetidus FF1 - GR15 - TB1 - Aspergillus awamorii FF3-577

4 FF11 1,00 Aspergillus oryzae GM4 - FJ30 1,08 TB5 1,00 TM24 1,53 Aspergillus auricomus TM23 2,00 GPS54 1,58 GB30 1,67 Penicillium citrinum GB38 1,40 GPS43 1,07 TOTAL = 11 TOTAL = 50 A atividade lipolítica foi detectada em 36 (72%) isolados dos 50 que foram testados. A formação de enzimas lipolíticas pela colônia foi observada pela presença visível de precipitados devido à formação de cristais de sal de cálcio do ácido láurico liberado pela enzima ou pela presença de zonas claras ao redor da colônia devido à completa degradação de sais de ácido graxo (Figura 1). Figura 1 Presença de cristais de sal de cálcio do ácido láurico ao redor da colônia indicando a excreção de lipases. Observou-se que isolados pertencentes à mesma espécie apresentaram resultados diferentes com relação à atividade lipolítica, exceto os isolados pertencentes às espécies Aspergillus versicolor, Aspergillus auricomus e Penicillium citrinum em que foi observada secreção de lipases por todos os isolados. Com relação a espécie Aspergillus japonicus três isolados não mostraram ser produtores de lipases, sendo eles, FF8, FF10 e LB17A e os demais apresentaram resultado positivo. O único isolado pertencente à espécie Aspergillus lanosus, GB17, apresentou-se como produtor de lipase, já o pertencente à espécie Aspergillus aculeatus, GB16, e à espécie Aspergillus awamorii, FF3, demostraram não serem produtores desta enzima. Apenas um isolado (GM4) dentre os pertencentes à espécie Aspergillus oryzae não apresentou resultado positivo e, de modo contrário, apenas o isolado GB39 da espécie Aspergillus foetidus mostrou-se produtor de lipase. 578

5 Dentre os 12 isolados testados correspondentes à espécie Aspergillus sclerotiorum, apenas dois não foram produtores de enzima lipolítica e dos nove isolados testados da espécie Aspergillus ochraceus, três não apresentaram atividade produtora de lipases. A atividade enzimática, mensurada através do índice enzimático (HANKIN & ANAGNOSTAKIS, 1975), variou entre os isolados pertencentes a uma mesma espécie. E a maioria destes apresentou o valor do índice enzimático entre um e dois (Tabela I). A literatura atual registra várias metodologias para se avaliar a habilidade dos microrganismos em produzir enzimas extracelulares em meio sólido. De acordo com alguns autores (Neto & Cunha, 1987; Lin et al., 1991; Stamford et al., 1998), entre as variáveis que determinam e viabilizam a escolha do método mais apropriado de triagem microbiana incluem a relação direta entre o tamanho do halo e a capacidade degradativa dos microrganismos. LEALEM & GASHE (1994) sugerem um índice enzimático 2,0 para considerar um microrganismo como produtor potencial de enzimas em meio sólido. De acordo com estes autores, quatro (TM8, GG15, LB7, GGT5) dentre os seis isolados testados pertencentes à espécie Aspergillus versicolor e um isolado da espécie Aspergillus auricomus são potencialmente produtores de lipases, já que apresentaram índice enzimático 2,0. Isto sugere a importância de estudos futuros com estas espécies de fungos em relação ao potencial promissor de produção de enzimas lipolíticas com aplicabilidade em tratamentos de resíduos industriais. De acordo com Jung et al. (2002), para se obter maior eficiência no tratamento de efluentes de laticínios através de lodos ativados, enzimas hidrolíticas podem ser utilizadas como catalisadores da biodegradação, atuando como complemento aos tratamentos convencionais. Estas enzimas hidrolíticas possuem elevados níveis de atividade hidrolítica sobre ácidos graxos de cadeia média e longa presentes na gordura do leite, hidrolisando as gorduras a glicerol e ácidos graxos simples, facilitando a ação posterior dos microorganismos. Deve-se destacar o isolado TM8 como o melhor produtor de lipases dentre todos os 50 testados, apresentando índice enzimático próximo de três (2,73). Os próximos estudos visam à quantificação e caracterização da atividade lipolítica. CONCLUSÃO A partir dos resultados obtidos no presente trabalho pode-se concluir que, dos 50 fungos filamentosos isolados de ambientes cavernícolas, 36 apresentaram capacidade para produzir enzimas lipolíticas, sendo que cinco destes mostraram ser potencialmente produtores desta enzima cuja grande especificidade e capacidade de hidrolisar lipídeos a torna importante para tratamento de efluentes gordurosos. A identificação dos isolados os agrupou em 2 gêneros Aspergillus e Penicillium, e nas seguintes espécies: Aspergillus versicolor, Aspergillus japonicus, Aspergillus lanosus, Aspergillus sclerotiorum, Aspergillus ochraceus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus awamorii, Aspergillus oryzae, Aspergillus auricomus e Penicillium citrinum. As espécies Aspergillus versicolor e Aspergillus auricomus mostraram ser promissoras para estudos futuros visando o potencial de produção de lipases de interesse para a biocatálise ambiental. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS MENDES, Adriano Aguiar, CASTRO, Heizir Ferreira de, PEREIRA, Ernandes Benedito et al. Aplicação de lipases no tratamento de águas residuárias com elevados teores de lipídeos. Quím. Nova, Mar./Apr. 2005, vol.28, no.2, p ISSN MASSE, L.; KENNED, K. J.; CHOU, S. (2001). Testing of alkaline and enzymatic pretreatment for fat particles in slaughterhouses wastewater. Bioresource Technology, v. 77, n. 2, p

6 NASCIMENTO, M.G.; DALLA-VECCHIA, R.; SOLDI, V. (2004). Aplicações sintéticas de lipases imobilizadas em polímeros. Química Nova, v. 27, n. 4, p LEAL, M.C.M.R. (2000). Utilização de enzimas hidrolíticas no tratamento de resíduos da indústria de laticínios. Dissertação de Mestrado, Universidade Federal do Rio de Janeiro, COOPE/UFRJ, Rio de Janeiro, RJ, Brasil. 111p. NASCIMENTO, W. C. A. (2005). Estudos sobre a secreção de proteases por Bacillus sp. SMIA-2 e sua compatibilidade com detergentes comerciais. Tese de doutorado, Universidade Estadual do Norte Fluminense, Campos dos Goytacazes, RJ, Brasil. 96p. SIERRA, S.A. Simple method for detection of lipolytic activity of microorganisms and some observations on the influence of the contact between cells and fatty substrates. Antonie van Laeuwenhoek 23: HANKIN, L.; ANAGNOSTAKIS, S.L. The use of solid media for detection of enzymes production by fungi. Mycologia, v. 67, p , NETO, J.A.; CUNHA, B.C.A. Método rápido para a triagem de fungos amilolíticos e seus mutantes. Revista de Microbiologia, v. 18, p , LIN, J.E.; CHANG, D.C.N.; SHEN, G.J. Correlations among several screening methods used for identifying wood-decay fungi that can degrade toxic chemicals. Biotechniques, v. 5, n. 4, p , STAMFORD, T.L.M.; ARAÚJO, J.M.; STAMFORD, N.P. Atividade enzimática de microorganismos isolados do jacatupé (Pachyrhizus erosus L. Urban). Ciência e Tecnologia de Alimentos, v. 18, n. 4, p , LEALEM, F.; GASHE, B.A. Amylase production by a gram-positive bacterium isolated from fermenting tef. (Eraglostis tef.). Journal of Applied Bacteriology, v. 77, p , OLIVEIRA, Arlem Nascimento de et al. Atividade enzimática de isolados de rizóbia nativos da Amazônia Central crescendo em diferentes níveis de acidez. Ciênc. Tecnol. Aliment., Campinas, v. 26, n. 1, JUNG F., CAMMAROTA M.C., FREIRE D.M.G Impact of enzimatic pré-hidrolysis on batch activated slude systems dealing with oily wastewaters. Biotecnology Letters, v.24, pp PITT, J.I., BASILICO, J.C., ABARCA, M.L., LOPES, C. - Mycotoxins and toxigenic fungi. Revista Medical Mycology, v. 38, Supplement I, p , PITT, J.I & HOCKING, A.D. Fungi and Food Spoilage. Second edition. London: Black Academic & Professional - Chapman & Hall, 1997, 593p. NOVO NORDISK, A ação das enzimas. Boletintécnico B209C. KLICH, M. A. Biogeography of Aspergillus species in soil and litter. Mycologia, v. 94, p , SAMSON, R. A.; HOEKSTRA, E. S.; FRISVAD, J. C.; FILTENBORG, O. Introdution to food-borne fungi. 4. ed. Centraalbureau: Voor Schimmelcultures Baarn Delft,