UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIÇOSA JOÃO PAULO DA SILVA. ANÁLISE TEMPORAL DA VARIABILIDADE E ESTRUTURA GENÉTICA DE Oxalis yellow vein virus (OxYVV)

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIÇOSA JOÃO PAULO DA SILVA ANÁLISE TEMPORAL DA VARIABILIDADE E ESTRUTURA GENÉTICA DE Oxalis yellow vein virus (OxYVV) VIÇOSA MINAS GERAIS BRASIL 2017

2 JOÃO PAULO DA SILVA ANÁLISE TEMPORAL DA VARIABILIDADE E ESTRUTURA GENÉTICA DE Oxalis yellow vein virus (OxYVV) Trabalho de conclusão de curso apresentado à Universidade Federal de Viçosa, como parte das exigências para obtenção do título de Engenheiro Agrônomo. Modalidade: Científico. Orientador: Francisco Murilo Zerbini Co-orientadores: César Augusto Diniz Xavier e Osvaldo Francisco Lino Sande VIÇOSA MINAS GERAIS - BRASIL 2017 ii

3 JOÃO PAULO DA SILVA ANÁLISE TEMPORAL DA VARIABILIDADE E ESTRUTURA GENÉTICA DE Oxalis yellow vein virus (OxYVV) Trabalho de conclusão de curso apresentado à Universidade Federal de Viçosa, como parte das exigências para obtenção do título de Engenheiro Agrônomo. Modalidade: Científico. APROVADA: 14 de novembro de 2017 Prof. Affonso Henrique Lima Zuin Dr a Fabiana Silva de Souza M.Sc. Osvaldo Francisco Lino Sande Prof. Francisco Murilo Zerbini (Orientador) (UFV) iii

4 Diante da vastidão do tempo e da imensidão do universo, é um imenso prazer para mim dividir um planeta e uma época com você. (Carl Sagan, Cosmos) iv

5 AGRADECIMENTOS Agradeço a minha mãe Geni Maria, mulher de fibra, apaixonada pela vida e pelos seus três filhos. Lutadora que sempre foi, nunca se deixou vencer por maior que fosse o obstáculo. Ao meu irmão José Mário, que sempre foi nossa referência. À minha irmã Ana Carolina, sempre sorridente e feliz, grande companheira de estrada. Ao meu sobrinho Luiz Filipe. Agradeço pelo apoio, pelo carinho, pelo zelo, pela inspiração, pelos conselhos e pelos valores que construímos juntos. Sem eles, esse sonho não seria possível e nem teria sentido. Aos meus amigos Olímpio do Lago Padilha e Maria José Ferreira da Silva, pela amizade e por todo apoio, meu eterno muito obrigado. Ao professor Francisco Murilo Zerbini, pela orientação, pelos ensinamentos, pela amizade, e por ter me acolhido no Laboratório de Virologia Vegetal, do qual fiz minha segunda casa. Aos amigos do Laboratório de Virologia Vegetal: Tássia, Sílvia, Ayane, Baltazar, Rafaela, João Paulo, Roberta Wesley, Ana Carolina, Carol, Angélica, Gloria, Hermano, Joseane, Igor, Márcio, Alison, Daniel, Larissa, Talita, Fernandinha, Flávia, Rafael, André, Luan, Diogo, Ruither, Geana, Joaquim, Patrícia, Roberto, Laíse e Murilo. E especialmente a César, Osvaldo, Camila, Vítor, Robert, Daniele Barros, Jorge e Antônio Wilson, pelos ensinamentos, parcerias e amizade. À Marina Cardoso por todo apoio, carinho e compreensão. Aos meus velhos companheiros de estrada Fabrício Rodrigues, Ivan Marota, Tiago Teixeira, Pão Com Ovo e Emerson. Aos amigos da Cabana Tiririca, Calambau, Maurício, Joaquim, Pardal, Ângela, Sandra, Dora. Aos amigos da Cachaçaria Libertas: Eder, Jaime, Marcelo, Edna. Aos amigos da CEDAF: Marcos Santana, Luiz, Pedrinho e Josemar. v

6 Sumário RESUMO... vii ABSTRACT... ix INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA...1 MATERIAL E MÉTODOS...5 Coleta de amostras... 5 Clonagem e sequenciamento dos genomas virais... 6 Montagem e comparação de sequências... 6 Alinhamentos múltiplos e análises filogenéticas... 7 Determinação da variabilidade e estrutura genética da população viral... 7 Análise de recombinação... 7 Análise de seleção... 8 RESULTADOS...9 Uma estirpe de OxYVV infectando Sida acuta no Brasil... 9 Evidência de coexistência de três subpopulações distintas do OxYVV na área amostrada Variabilidade genética de OxYVV Seleção negativa atuando sobre os genes CP e Rep do OxYVV Prevalência temporal da subpopulação I DISCUSSÃO...21 CONCLUSÕES...24 LITERATURA CITADA...25 vi

7 RESUMO O gênero Begomovirus (família Geminiviridae) é composto por vírus que infectam plantas dicotiledôneas, possuem um ou dois componentes genômicos de DNA circular fita simples encapsidados em uma partícula icosaédrica geminada, e são transmitidos por diversas espécies do complexo Bemisia tabaci. Atualmente, os begomovírus constituem um dos mais importantes grupos de vírus de plantas, causando doenças em diversas culturas de importância econômica em todo o mundo. Com o advento de técnicas de amplificação de DNA não enviesadas, como por exemplo amplificação por círculo rolante (rolling circle amplification - RCA), uma grande diversidade de espécies de begomovírus têm sido amostradas em hospedeiros não-cultivados, especialmente das famílias Malvaceae e Fabaceae, constituindo um grande reservatório de diversidade viral. Populações de begomovírus apresentam alta variabilidade genética, especialmente aquelas associadas a plantas não-cultivadas. Estudar a estrutura e variabilidade genética de populações de begomovírus em plantas não-cultivadas faz-se necessário, visto o potencial risco de saltos de hospedeiros e posterior ocorrência de epidemias em plantas cultivadas. Estudos sobre a variabilidade e estrutura genética de populações de begomovírus em plantas não-cultivadas têm sido conduzidos no Brasil, entretanto, estes normalmente amostram grandes áreas em um único ponto no tempo. Portanto pouco se sabe sobre a dinâmica evolutiva temporal destas populações em áreas pequenas. Para preencher esta lacuna, o objetivo deste trabalho foi avaliar a variabilidade e estrutura genética de uma população de Oxalis yellow vein virus (OxYVV) em plantas de Sida acuta (família Malvaceae) em uma área pequena ao longo de quatro anos. Amostras de Sida acuta foram coletadas no período de 2011 a 2014, em uma área de aproximadamente 0,1 hectare no município de Viçosa, MG. A partir destas amostras, o DNA total foi extraído e utilizado como molde para RCA, seguido pela digestão com enzimas de restrição, clonagem e sequenciamento de genomas completos do vírus. Análises de subdivisão demonstraram que a população é subdividida em três subpopulações. vii

8 Entretanto, não houve estruturação temporal das subpopulações, havendo a tendência de predominância de apenas uma subpopulação ao longo do tempo. Palavras-chave: Oxalis yellow vein virus, begomovírus, variabilidade genética, estrutura genética temporal, Sida acuta viii

9 ABSTRACT The genus Begomovirus (family Geminiviridae) is composed of viruses that infect dicotyledonous plants, have a genome comprised of one or two single-strand circular DNA (ssdna) molecules encapsidated in twinned icosahedral particles, and are transmitted by insects of the Bemisia tabaci cryptic species complex. Begomoviruses are one of the most economically important groups of plant viruses causing diseases in several economically important crops around the world. With the advent of techniques for the unbiased amplification of circular DNA genomes, such as rolling circle amplification (RCA), a large diversity of begomoviruses has been sampled in non-cultivated hosts, especially in the Malvaceae and Fabaceae families, constituting a large reservoir of viral diversity. Begomovirus populations have a high degree of genetic variability, especially those associated with non-cultivated plants. Studying the structure and genetic variability of begomovirus populations in non-cultivated plants is necessary, considering the potential risk of host jumps and subsequent epidemics in crop plants. Studies on the variability and genetic structure of begomovirus populations in noncultivated plants have been conducted in Brazil, however they sampled large areas at a single point in time. Thus, little is known about the temporal evolutionary dynamics of these populations in small areas. To fill this gap, the objective of this work was to evaluate the variability and genetic structure of a population of Oxalis yellow vein virus (OxYVV) in plants of Sida acuta (Malvaceae family) in a small area over a period of four years. Samples of Sida acuta were collected from 2011 to 2016 in an area of approximately 0.1 ha in the municipality of Viçosa, MG. From these samples, total DNA was extracted and used as template for RCA, followed by restriction enzyme digestion, cloning and sequencing of complete viral genomes. Subdivision analyses show that the population is subdivided into three subpopulations. However, there was no temporal structure of the subpopulations, with a trend of predominance of only one subpopulation over time. ix

10 Keywords: Oxalis yellow vein virus, begomovirus, genetic variability, temporal genetic structure, Sida acuta x

11 INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA A família Geminiviridae é composta por vírus que possuem um ou dois componentes genômicos de DNA circular de fita simples, encapsidados por uma única proteína estrutural formando uma partícula icosaédrica geminada (Zerbini et al., 2017). Baseado na organização genômica, gama de hospedeiros, tipo de inseto vetor e relacionamento filogenético, a família Geminiviridae é dividida em nove gêneros: Becurtovirus, Begomovirus, Capulavirus, Curtovirus, Grablovirus, Eragrovirus, Mastrevirus, Topocuvirus e Turncurtovirus (Zerbini et al., 2017). O gênero Begomovirus é composto por espécies virais com genoma mono ou bissegmentado, que infectam plantas dicotiledôneas e são transmitidos pelo complexo de espécies crípticas Bemisia tabaci (Brown et al., 2015; Zerbini et al., 2017). Este grupo de vírus constitui um dos mais importantes agentes causadores de doenças em plantas, provocando perdas significativas em culturas de importância econômica como o tomateiro, feijoeiro, algodoeiro e mandioca, sobretudo em regiões de clima tropical e subtropical (Polston e Anderson, 1997; Moriones e Navas-Castillo, 2000; Morales e Anderson, 2001; Legg e Fauquet, 2004; Inoue-Nagata et al., 2016). O Brasil é considerado um centro de diversidade genética de begomovírus, com relatos de detecções, desde a década de 1950, em malváceas e leguminosas (Costa e Alves, 1950; Costa e Bennett, 1950). As mais importantes doenças causadas por begomovírus no Brasil são o mosaico dourado do feijoeiro, causado pelo Bean golden mosaic virus (BGMV) e o mosaico e enrugamento das folhas em tomateiro, causados por um complexo de espécies de begomovírus (Inoue-Nagata et al., 2016). Atualmente, 16 espécies de begomovírus são descritas infectando tomateiro no Brasil (Castillo-Urquiza et al., 2008; Fernandes et al., 2008; Albuquerque et al., 2012), entretanto há uma grande variação na distribuição e predominância, com apenas algumas espécies estando amplamente disseminadas no campo (Rocha et al., 2013). A predominância 1

12 de poucas espécies poderia ser explicada pela diferença na adaptação ao tomateiro ou diferenças na eficiência de transmissão pelo inseto vetor (Rocha et al., 2013). Diversos trabalhos têm demonstrado a presença de begomovírus infectando outras culturas, tais como batata doce (Albuquerque et al., 2011), maracujazeiro (Ferreira et al., 2010), quiabeiro (Aranha et al., 2011), pimentão (Bezerra-Agasie et al., 2006), algodoeiro (Almeida et al., 2013) e soja (Coco et al., 2013). Entretanto, epidemias e perdas nestas culturas devido à infecção por begomovírus não têm sido observadas. Uma grande diversidade de espécies de begomovírus tem sido relatada em plantas não-cultivadas, especialmente das famílias Fabaceae e Malvaceae (Faria e Maxwell, 1999; Jovel et al., 2004; Silva et al., 2010; Silva et al., 2012; Tavares et al., 2012; Fiallo-Olivé et al., 2015; Pinto et al., 2016; Ferro et al., 2017). Acredita-se que a emergência dos begomovírus que infectam plantas cultivadas no Brasil seja resultado da transferência horizontal de vírus nativos que infectam plantas nãocultivadas pelo inseto vetor. Três observações corroboram essa hipótese. Em primeiro lugar, todas as espécies de begomovírus detectadas, até o presente, em plantas cultivadas, por exemplo, tomateiro, algodoeiro, quiabeiro, no Brasil são de ocorrência restrita ao país. Em segundo lugar, a caracterização biológica de algumas espécies (ToRMV, ToCMoV e ToYSV) confirmou que plantas não-cultivadas como Nicandra physaloides, Solanum nigrum e Datura stramonium são hospedeiras (Fernandes et al., 2006; Calegario et al., 2007; Ribeiro et al., 2007). Por último, begomovírus originalmente descritos em plantas silvestres, como o SiMoV (Fernandes et al., 1999) e o SimMV (Jovel et al., 2004), já foram relatados infectando naturalmente o tomateiro (Cotrim et al., 2007; Rocha et al., 2013). Portanto, estudos abordando a dinâmica evolutiva de populações de begomovírus em plantas não-cultivadas podem fornecer informações importantes sobre o papel epidemiológico destes hospedeiros, atuando como fonte de diversidade viral, contribuindo para emergência de novas espécies ou variantes mais agressivas em plantas cultivadas, e como hospedeiros alternativos, especialmente no período 2

13 de entressafra, contribuindo para a permanência dos vírus no campo na ausência de seu hospedeiro cultivado. Além disso, do ponto de vista ecológico, o estudo de populações virais em hospedeiros não-cultivados permite que a evolução viral seja acompanhada em ecossistemas naturais, na ausência de gargalos impostos pela ação antrópica. Populações de geminivírus, incluindo os begomovírus, possuem grau elevado de variabilidade genética, com taxas de substituição de nucleotídeos da ordem de 10-3 substituições/sítio/ano (Ge et al., 2007; Duffy et al., 2008; Duffy e Holmes, 2009), equivalente à de vírus com genoma de RNA. Eventos frequentes de recombinação (Lima et al., 2013; Lefeuvre e Moriones, 2015), a ocorrência de pseudo-recombinação entre vírus com genoma bissegmentado (Andrade et al., 2006) e altas taxas de evolução molecular (Rocha et al., 2013) contribuem para a elevada variabilidade genética dos begomovírus, aumentando seu potencial adaptativo a novas condições ambientais e a novos hospedeiros. A estrutura genética de populações refere-se à quantidade e à distribuição da variabilidade genética dentro e entre populações (García-Arenal et al., 2001). Entender a dinâmica da variabilidade de populações de vírus de plantas em hospedeiros cultivados e nãocultivados é importante, pois permite entender como estas populações evoluem, com importantes implicações no que se refere à efetividade e durabilidade de estratégias de manejo (Seal et al., 2006). Estudos sobre a variabilidade e estrutura genética de populações de begomovírus no Brasil demonstram que o grau de variabilidade genética das populações pode ser propriedade intrínseca de cada espécie viral, independentemente de o hospedeiro ser planta cultivada ou não-cultivada (Lima et al., 2013; Rocha et al., 2013; Ramos-Sobrinho et al., 2014; Mar et al., 2017). Além disso, foi demonstrado que populações de begomovírus em ambos os tipos de hospedeiros apresentam estruturação com base em origem geográfica (Rocha et al., 2013; Mar et al., 2017). 3

14 Grande parte dos trabalhos sobre dinâmica evolutiva de populações de begomovírus conduzidos no Brasil e no mundo têm amostrado grandes áreas (centenas ou milhares de quilômetros quadrados) em apenas um ponto no tempo. Estudos em áreas menores se fazem necessários, a fim de verificar se a variabilidade genética nessas condições é comparável àquela observada em grandes áreas. Isso também facilitaria estudos de coexistência de diferentes espécies e da evolução das populações virais ao longo do tempo. Assim, este trabalho teve como objetivo avaliar variabilidade e a estrutura genética de uma população de begomovírus infectando Sida acuta, um hospedeiro não-cultivado, em uma área de aproximadamente 0,1 ha, ao longo do tempo. 4

15 MATERIAL E MÉTODOS Coleta de amostras Amostras de plantas de Sida acuta apresentando sintomas típicos de infecção por begomovírus foram coletadas no município de Viçosa, Minas Gerais (Figura 1). As coletas foram realizadas em uma área de aproximadamente m 2, durante os anos de 2011, 2012, 2013 e Para cada amostra coletada foram registradas a data de coleta, coordenadas geográficas do local de coleta e imagem da amostra. As amostras coletadas foram devidamente identificadas e encontram-se armazenadas na forma de material herbarizado à temperatura ambiente, no Laboratório de Virologia Vegetal Molecular da UFV. Figura 1. Plantas de Sida acuta infectadas por Oxalis yellow vein virus (OxYVV) (A e B) e planta sadia (C). 5

16 Clonagem e sequenciamento dos genomas virais O DNA total foi extraído conforme Doyle e Doyle (1987) e utilizado para a amplificação dos genomas virais completos, utilizando-se a DNA polimerase do fago phi29 (Inoue-Nagata et al., 2004). Os produtos da amplificação foram clivados com diferentes enzimas de restrição e os produtos foram analisados em gel de agarose (0,8 %). Alíquotas da reação de clivagem que apresentaram um fragmento de aproximadamente nucleotídeos, correspondente a uma cópia do DNA-A ou DNA-B de begomovírus, foram utilizadas para ligação ao vetor pbluescript-ks+ (Stratagene), previamente clivado com a mesma enzima e defosforilado. Os plasmídeos recombinantes foram transformados em Escherichia coli pelo método do choque térmico (Sambrook e Russel, 2001), e os clones obtidos foram completamente sequenciados pela empresa Macrogen (Seul, Coreia do Sul). Montagem e comparação de sequências As sequências dos componentes genômicos foram montadas utilizando-se o programa Geneious v. 8.1 (Kearse et al., 2012), e orientadas de modo a iniciar a partir do primeiro nucleotídeo do sítio de clivagem da origem de replicação (TAATATT//AC). As sequências foram inicialmente analisadas por meio do algoritmo BLASTn (Altschul et al., 1990) a fim de determinar a espécie viral com maior identidade de sequência. A sequência com maior identidade foi obtida a partir do GenBank e utilizada para determinação do posicionamento taxonômico dos isolados, utilizando-se o programa Species Demarcation Tool v. 1.0 (Muhire et al., 2013). A busca por ORFs foi realizada com o programa ORF Finder ( 6

17 Alinhamentos múltiplos e análises filogenéticas Alinhamentos múltiplos de sequências foram preparados para o DNA-A e para sequências nucleotídicas correspondentes aos genes CP e Rep utilizando-se o algoritmo MUSCLE, implementado no programa MEGA6 (Tamura et al., 2013). Árvores filogenéticas foram construídas utilizando-se inferência Bayesiana com o programa MrBayes 3.0b4 (Ronquist e Huelsenbeck, 2003), usando os modelos selecionados com MrModeltest2.2 (Nylander, 2004) no Akaike Information Criterion (AIC). A análise foi realizada utilizando 20 milhões de gerações e as primeiras 2 milhões de gerações excluídas. As árvores filogenéticas foram visualizadas utilizando-se o programa FigTree (tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/). Determinação da variabilidade e estrutura genética da população viral Análises de polimorfismo de nucleotídeos dentro e entre subpopulações foram realizadas utilizando-se o programa DnaSP v. 5 (Rozas et al., 2003). A estimativa da variabilidade genética foi obtida com os seguintes descritores: diversidade nucleotídica (π), número de haplótipos (h) e diversidade haplotípica (Hd). A partição da variabilidade genética e inferências sobre a estrutura genética da população foram baseadas no índice de fixação F de Wright (Wright, 1951). Análise de recombinação Para investigar a ocorrência de eventos de recombinação, alinhamentos múltiplos de sequências correspondente ao DNA-A foram analisados pelos métodos Rdp, Geneconv, Bootscan, Maximum χ2, Chimaera, Siscan e 3Seq implementados no pacote RDP4 (Martin et al., 2015). Apenas eventos de recombinação detectados por pelo menos quatro desses métodos foram considerados confiáveis. 7

18 Análise de seleção Sítios sobre seleção negativa ou positiva nas regiões codificadoras correspondentes aos genes CP e Rep foram identificados utilizando-se três métodos: Single Likelihood Ancestor Counting (SLAC), Fixed Effects Likelihood (FEL) e Random Effects Likelihood (REL) (Kosakovsky-Pond e Frost, 2005), implementados no servidor DataMonkey (Pond e Frost, 2005). A relação média de substituições sinônimas por não-sinônimas (dn/ds) foi estimada com o método SLAC. 8

19 RESULTADOS Uma nova estirpe de Oxalis yellow vein virus (OxYVV) infectando Sida acuta no Brasil Aproximadamente 200 amostras foram coletadas entre os anos de 2011 e 2014, das quais 122 foram positivas para begomovírus com base no padrão de restrição. A partir das amostras positivas foram gerados 75 clones correspondentes ao componente DNA-A de begomovírus (Tabela 1). Em , nenhuma sequência disponível no GenBank apresentava identidade de sequência acima de 89 % com o vírus clonado a partir de S. acuta. Assim, com base no critério de demarcação de espécies do gênero Begomovirus adotado naquela época (Fauquet et al., 2008), o vírus foi considerado uma nova espécie, denominada Sida acuta mosaic virus (SiAMV) (Godinho, 2014). Entretanto, em 2015, um begomovírus foi descrito nos EUA infectando a planta ornamental Oxalis sp., e foi denominado Oxalis yellow vein virus (OxYVV) (Herrera et al., 2015). Comparações par-a-par indicaram que as sequências obtidas neste trabalho compartilham uma identidade mínima de 92 % com o isolado de OxYVV relatado nos EUA (Figura 1). Como a publicação de um artigo em um periódico científico indexado (Herrera et al., 2015) tem precedência sobre uma tese (Godinho, 2014), o nome Oxalis yellow vein virus foi reconhecido oficialmente pelo Comitê Internacional de Taxonomia de Vírus (ICTV). Portanto, todos os isolados de begomovírus obtidos neste trabalho devem ser considerados como pertencentes à espécie Oxalis yellow vein virus, constituindo-se numa nova estirpe do vírus, de acordo com os critérios taxonômicos recentemente revisados (Brown et al., 2015). Curiosamente, as comparações par-a-par indicaram a segregação dos isolados de OxYVV em três grupos distintos (Figura 2; Tabela 2), com isolados dentro de um mesmo grupo apresentando identidade de % e entre grupos de %. 9

20 Tabela 1. Informações sobre as sequências de genomas completos de Oxalis yellow vein virus (OxYVV) obtidas neste trabalho. Amostra Ano de coleta Origem Hospedeiro Clone Enzima Isolado Subpopulação Viçosa - MG Sida acuta VIC01D-5C ClaI BR-Vic1-11 I Viçosa - MG Sida acuta VIC03D-1C ClaI BR-Vic II VIC03D-3C ClaI BR-Vic II Viçosa - MG Sida acuta VIC04D-1EV EcoRV BR-Vic III VIC04D-1C ClaI BR-Vic III VIC04D-3C ClaI BR-Vic I Viçosa - MG Sida acuta VIC05D-1C ClaI BR-Vic5-11 I Viçosa - MG Sida acuta VIC06D-2EV EcoRV BR-Vic I VIC06D-1C ClaI BR-Vic I Viçosa - MG Sida acuta VIC07D-1C ClaI BR-Vic I VIC07D-2C ClaI BR-Vic I Viçosa - MG Sida acuta VIC09D-3EV EcoRV BR-Vic I VIC09D-1C ClaI BR-Vic I Viçosa - MG Sida acuta VIC10D-3C ClaI BR-Vic10-11 I Viçosa - MG Sida acuta VIC12D-1C ClaI BR-Vic I VIC12D-2C ClaI BR-Vic I Viçosa - MG Sida acuta VIC14D-1C ClaI BR-Vic14-11 I Viçosa - MG Sida acuta VIC15D-2C ClaI BR-Vic I VIC15D-5C ClaI BR-Vic I Viçosa - MG Sida acuta VIC16D-2C ClaI BR-Vic16-11 I Viçosa - MG Sida acuta VIC18D-1EV EcoRV BR-Vic18-11 III Viçosa - MG Sida acuta VIC19D-1C ClaI BR-Vic III VIC19D-2C ClaI BR-Vic III Viçosa - MG Sida acuta VIC23D-4C ClaI BR-Vic23-11 I Viçosa - MG Sida acuta VIC24D-1C ClaI BR-Vic24-11 III Viçosa - MG Sida acuta VIC36D-1C ClaI BR-Vic36-11 III Viçosa - MG Sida acuta VIC40D-2C ClaI BR-Vic40-11 I Viçosa - MG Sida acuta VIC41D-3C ClaI BR-Vic41-11 III Viçosa - MG Sida acuta VIC45D-1EV EcoRV BR-Vic45-11 I Viçosa - MG Sida acuta VIC47D-1C ClaI BR-Vic III VIC47D-2C ClaI BR-Vic III Viçosa - MG Sida acuta VIC105-3EV EcoRV BR-Vic I Viçosa - MG Sida acuta VIC106-1EV EcoRV BR-Vic I VIC106-5EV EcoRV BR-Vic I Viçosa - MG Sida acuta VIC111-1EV EcoRV BR-Vic I VIC111-2EV EcoRV BR-Vic I Viçosa - MG Sida acuta VIC112-1EV EcoRV BR-Vic III Viçosa - MG Sida acuta VIC116-5EV EcoRV BR-Vic III Viçosa - MG Sida acuta VIC117-3EV EcoRV BR-Vic III Viçosa - MG Sida acuta VIC119-1EV EcoRV BR-Vic I Viçosa - MG Sida acuta VIC120-3EV EcoRV BR-Vic I 10

21 Viçosa - MG Sida acuta VIC123-2EV EcoRV BR-Vic I Viçosa - MG Sida acuta VIC128-4EV EcoRV BR-Vic I Viçosa - MG Sida acuta VIC131-1EV EcoRV BR-Vic I Viçosa - MG Sida acuta VIC133-6C ClaI BR-Vic I Viçosa - MG Sida acuta VIC201-1C ClaI BR-Vic III Viçosa - MG Sida acuta VIC211-2C ClaI BR-Vic I Viçosa - MG Sida acuta VIC212-1BS BssHII BR-Vic I Viçosa - MG Sida acuta VIC215-1BS BssHII BR-Vic I Viçosa - MG Sida acuta VIC218-1C ClaI BR-Vic I Viçosa - MG Sida acuta VIC220-1BS BssHII BR-Vic I Viçosa - MG Sida acuta VIC225-4BS BssHII BR-Vic I Viçosa - MG Sida acuta VIC226-1C ClaI BR-Vic I Viçosa - MG Sida acuta VIC228-1C ClaI BR-Vic I Viçosa - MG Sida acuta VIC229-2C2 ClaI BR-Vic I Viçosa - MG Sida acuta VIC231-2BS BssHII BR-Vic III Viçosa - MG Sida acuta VIC232-5BS BssHII BR-Vic I Viçosa - MG Sida acuta VIC233-1C ClaI BR-Vic I Viçosa - MG Sida acuta VIC237-1BS BssHII BR-Vic I Viçosa - MG Sida acuta VIC253-2BS BssHII BR-Vic I Viçosa - MG Sida acuta VIC256-1BS BssHII BR-Vic I Viçosa - MG Sida acuta VIC303-1BS BssHII BR-Vic I VIC303-2BS BssHII BR-Vic I Viçosa - MG Sida acuta VIC306-12BS BssHII BR-Vic I Viçosa - MG Sida acuta VIC312-2BS BssHII BR-Vic I Viçosa - MG Sida acuta VIC313-2BS BssHII BR-Vic I Viçosa - MG Sida acuta VIC317-2BS BssHII BR-Vic I Viçosa - MG Sida acuta VIC318-1BS BssHII BR-Vic I Viçosa - MG Sida acuta VIC319-2BS BssHII BR-Vic I Viçosa - MG Sida acuta VIC320-2BS BssHII BR-Vic I Viçosa - MG Sida acuta VIC321-10BS BssHII BR-Vic I Viçosa - MG Sida acuta VIC326-1BS BssHII BR-Vic I VIC326-6BS BssHII BR-Vic I Viçosa - MG Sida acuta VIC327-1BS BssHII BR-Vic I Viçosa - MG Sida acuta VIC329-4BS BssHII BR-Vic I 11

22 Figura 2. Comparações par-a-par entre sequências de isolados de Oxalis yellow vein virus (OxYVV) obtidos neste trabalho e do isolado norte-americano da mesma espécie. Tabela 2. Relação de isolados de Oxalis yellow vein virus (OxYVV) pertencentes a cada subpopulação, por ano amostrado. Conjunto de dados Total Subpopulação I Subpopulação II Subpopulação III Total

23 Evidência de coexistência de três subpopulações distintas do OxYVV na área amostrada De acordo com a árvore filogenética baseada na sequência completa do DNA-A, é possível observar a formação de três clados bem definidos, não havendo evidência de segregação temporal dos isolados nestes clados (Figura 3). Baseado nesta análise e na comparação de sequências par-a-par, sugere-se a divisão dos isolados de OxYVV em três subpopulações, denominadas I, II e III. A subpopulação I apresenta maior número de indivíduos, seguido pela subpopulação III e por último a II, com apenas dois representantes coletados em Diferentemente, as subpopulações I e III são compostas por indivíduos coletados nos diferentes anos. Corroborando a divisão proposta, a diferenciação genética foi alta, com valor de Nst de 0,9443 entre as subpopulações I e III. Visto o pequeno número de isolados da subpopulação II, o Nst não foi calculado entre as subpopulações I-II e II-III. Também foram construídas árvores filogenéticas para os genes CP e Rep. A árvore do gene CP apresentou a mesma topologia da árvore do DNA-A, com três clados correspondentes às subpopulações I, II e III (Figura 4). Já a árvore do gene Rep apresentou uma topologia ligeiramente distinta. Embora também contenha os três clados correspondentes às subpopulações propostas, os isolados da subpopulação II formaram um clado mais próximo dos isolados da subpopulação III (Figura 5), diferentemente da árvore do gene CP. Embora não tenham sido detectados eventos de recombinação entre os isolados de OxYVV, provavelmente devido à alta identidade de sequência entre os isolados, que dificulta a detecção de blocos recombinantes pelos métodos implementados no pacote RDP, o padrão de agrupamento dos genes CP e Rep dos isolados da subpopulação II sugere fortemente uma origem recombinante para estes isolados. 13

24 Figura 3. Árvore filogenética com base na sequência de nucleotídeos do DNA-A de isolados de Oxalis yellow vein virus (OxYVV) obtidos neste trabalho. Círculos fechados presentes nos nós da árvore representam probabilidades posteriores de 0,90 a 1, e círculos abertos representam probabilidades posteriores de 0,50 a 0,89. Isolados virais pertencentes à subpopulação I estão representados em verde, à subpopulação II em vermelho, e à subpopulação III em azul. 14

25 Figura 4. Árvore filogenética baseada na sequência de nucleotídeos do gene CP de isolados de Oxalis yellow vein virus (OxYVV) obtidos neste trabalho. Círculos fechados presentes nos nós da árvore representam probabilidades posteriores de 0,90 a 1, e círculos abertos representam probabilidades posteriores de 0,50 a 0,89. Isolados virais pertencentes à subpopulação I estão representados em verde, à subpopulação II em vermelho, e à subpopulação III em azul 15

26 Figura 5. Árvore filogenética baseada na sequência de nucleotídeos do gene Rep de isolados de Oxalis yellow vein virus (OxYVV) obtidos neste trabalho. Círculos fechados presentes nos nós da árvore representam probabilidades posteriores de 0,90 a 1, e círculos abertos representam probabilidades posteriores de 0,50 a 0,89. Isolados virais pertencentes à subpopulação I estão representados em verde, à subpopulação II em vermelho, e à subpopulação III em azul. 16

27 Variabilidade genética de OxYVV Os descritores de variabilidade genética foram calculados para toda a população e para as subpopulações I e III (Tabela 3). Devido ao tamanho pequeno da subpopulação II (apenas duas sequências), os descritores de variabilidade não foram calculados para essa subpopulação. Os resultados indicam que a população de OxYVV, embora subdividida em três subpopulações, possui baixa variabilidade genética (π = ; Tabela 3). Trabalhos anteriores demonstraram que populações de alguns begomovírus provenientes de hospedeiros não-cultivados apresentam alta variabilidade genética, como por exemplo o Macroptilium yellow spot virus (MaYSV) (π = 0,0627; Ramos-Sobrinho et al., 2014). Entretanto, o Euphorbia yellow mosaic virus, que infecta a planta não-cultivada Euphorbia heterophylla, apresente variabilidade genética similar à do OxYVV (π = 0,024; Mar et al., 2017). A variabilidade genética das subpopulações I e III, quando analisada separadamente, é ainda menor comparada à variabilidade da população completa, o que está em acordo com a subdivisão proposta. Tabela 3. Variabilidade e estrutura genética da população de Oxalis yellow vein virus (OxYVV) amostrada em Viçosa, MG. Conjunto de N a H Hd π Nst dados Subpopulação , ,9443 Subpopulação ,970 0,0038 Total ,979 0,0176 a N, número de isolados; H, número de haplótipos; Hd, diversidade haplotípica; π, diversidade nucleotídica; Nst, índice de subdivisão 17

28 Seleção negativa atuando sobre os genes CP e Rep do OxYVV Os genes CP e Rep dos isolados de OxYVV apresentam evidência de seleção negativa, com valores médios de dn/ds < 1 (Tabela 4). O gene CP apresentou valores menores comparado ao gene Rep, exceto para a subpopulação I, onde Rep apresentou dn/ds menor que CP. Para o gene Rep, detectou-se maior número de sítios sob seleção negativa comparado ao gene CP (Tabela 4). A subpopulação I apresentou maior número de sítios sob seleção negativa comparada à subpopulação III, em ambos os genes. Evidência de seleção positiva foi obtida apenas na subpopulação I, onde três sítios foram observados sob seleção positiva pelo método REL, dois desses sítios localizados no gene CP e um no gene Rep. Prevalência temporal da subpopulação I Para verificar a dinâmica temporal da população de OxYVV, as proporções entre indivíduos de cada subpopulação, em cada ano, foram calculadas. Curiosamente, houve uma prevalência temporal da subpopulação I, em detrimento das subpopulações II e III. A subpopulação I está presente em frequência maior quando comparada às outras duas em todos os anos de coleta. A subpopulação III se apresenta em frequência menor que a I e maior que a II em 2011, essa frequência reduz 2012 e 2013 e, por fim, a subpopulação III desaparece em A subpopulação II foi encontrada apenas no primeiro ano de coleta (2011), em uma frequência muito baixa, desaparecendo nos anos subsequentes (Figura 6). 18

29 Tabela 4. Relação de substituições sinônimas e não-sinônimas para os genes CP e Rep de isolados de Oxalis yellow vein virus (OxYVV), e sítios sobre seleção positiva ou negativa, obtidas pelos três métodos utilizados (SLAC, FEL e REL). Conjunto de SLAC FEL REL ORF dn/ds dados Positiva Negativa Positiva Negativa Positiva Negativa CP Subpopulação 1 0, , & Subpopulação 3 0, , 38, 72, 73, 156, , 56 - Total 0, , 32, 38, 47, 55, 73, 154, 158, - & 161, 172, 197, 209, 210, 249, 250 REP Subpopulação 1 0, & Subpopulação 3 0, , 46, 70, 137, 144, 146, 151, 154, 202, 217, 220, 243, 251, 258, 263, 288, 314, 321, Total 0,263-70, , 46, 70, 116, 137, 144, 146, 151, 154, 157, 184, 186, 202, 220, 243, 251, 258, 259, 262, 274, 283, 288, 314, 321, 324,

30 Figura 6. Proporções relativas de isolados de Oxalis yellow vein virus (OxYVV) pertencentes a cada subpopulação, por ano de coleta. n, número de isolados amostrados em cada ano. 20

31 DISCUSSÃO Neste trabalho investigou-se a dinâmica evolutiva temporal de uma população de begomovírus em um sistema natural, com pouca influência antrópica quando comparado a agrossistemas. Foram realizadas amostragens sistemáticas ao longo de quatro anos em uma pequena área no município de Viçosa (MG), onde plantas de Sida acuta, apresentando sintomas típicos de infecção por begomovírus, foram coletadas. Embora alguns trabalhos já tenham sido realizados abordando a dinâmica evolutiva de populações de begomovírus em plantas nãocultivadas (Lima et al., 2013; Rocha et al., 2013; Ramos-Sobrinho et al., 2014; Mar et al., 2017), a dinâmica temporal não tem sido explorada, ou seja, pouco se sabe como estas populações se comportam ao longo do tempo. Os resultados demonstraram que a população de OxYVV encontra-se subdividida em três subpopulações, e que a prevalência entre elas se modificou temporalmente, com a presença no último ano de coleta apenas de umas delas, a subpopulação I. O desaparecimento de representantes das subpopulações II e III nas amostragens pode ser devido à adaptabilidade diferencial dos indivíduos dessas populações, prevalecendo apenas os indivíduos melhor adaptados. Fatores como maior eficiência de replicação, interações antagônicas entre indivíduos de subpopulações diferentes, e eficiência no processo de transmissão pelo inseto vetor poderiam explicar essa dinâmica. Ensaios biológicos devem ser realizados para testar estas hipóteses. Ao contrário do que foi observado para o Tomato severe rugose virus (ToSRV), um begomovírus amplamente disseminado em cultivos de tomateiro (Sande, 2014), não foi possível observar sinal de estrutura temporal na análise filogenética. A ausência de estruturação temporal da população de OxYVV foi confirmada por meio de análise multivariada de agrupamento (dados não apresentados). Embora o conjunto de dados de ToSRV analisado por Sande (2014) inclua isolados amostrados em uma área maior em comparação ao conjunto de 21

32 dados de OxYVV, os resultados indicaram uma estruturação clara dos isolados de ToSRV com base no ano de amostragem, com isolados amostrados em Florestal (MG), em 2008, agrupandose separadamente dos isolados coletados no mesmo local em 2014, um período de amostragem semelhante ao realizado neste trabalho. É possível que a população de OxYVV esteja evoluindo a taxas mais lentas, em função de uma maior estabilidade do ambiente onde se encontra, sofrendo pouca influência de gargalos impostos pela ação antrópica, diferentemente do que ocorre em sistemas agrícolas. Embora não tenha sido detectada estruturação baseada em tempo, os dados indicam a ocorrência de mudança na composição da população de OxYVV ao longo do tempo, com apenas uma subpopulação prevalecendo e o desaparecimento de outras duas. Apesar do número de amostras coletadas em 2011 ser praticamente o dobro do número coletado nos anos subsequentes, isso não influenciou o resultado das análises, pois comparando-se os dados de , quando o número de amostras coletadas foi semelhante, continua-se observando o declínio da subpopulação III. A incongruência observada entre as filogenias dos genes CP e Rep para os isolados da subpopulação II sugere sua origem recombinante, com um possível evento de recombinação entre parentais pertencentes às subpopulações I e III originando os isolados da subpopulação II. No entanto, nenhum evento de recombinação foi detectado pelos sete métodos implementados no programa RDP. Deve-se ter em conta que eventos de recombinação entre sequências com alta identidade (> 94 %, caso entre os isolados de OxYVV pertencentes às subpopulações I, II e III) são de difícil detecção pelo programa RDP. Portanto, considerandose a ocorrência de infecção mista entre isolados das subpopulações I e III (por exemplo, na amostra 4; Tabela 1), a possibilidade de recombinação deve ser considerada. Por outro lado, a ausência de sinal de recombinação detectável entre os isolados de OxYVV pode indicar que a dinâmica evolutiva seja guiada especialmente por processos mutacionais, com pouca ou nenhuma influência de recombinação. Essa hipótese, embora plausível, deve ser considerada 22

33 pouco provável, em vista da alta frequência de recombinação entre begomovírus (Tiendrebeogo et al., 2012; Lima et al., 2017), especialmente em populações infectando hospedeiros nãocultivados (Lima et al., 2013). 23

34 CONCLUSÕES De forma geral, a população de OxYVV, apesar de apresentar baixa variabilidade genética, apresenta alta diversidade, com a coexistência de três subpopulações mesmo em uma pequena área. A ausência de sinal temporal pode ser explicada por uma menor perturbação no ambiente não-cultivado, o que faz com que essa população evolua a taxa mais lentas quando comparada a populações virais associadas a plantas cultivadas. A mudança na composição da população ao longo do tempo, com a prevalência da subpopulação I e o desaparecimento das outras duas pode ser devida à adaptação diferencial entre os isolados das três subpopulações. Não foram detectados eventos de recombinação pelos métodos do programa RDP, embora as filogenias sugerirem que a subpopulação II seja fruto de recombinação entre indivíduos das subpopulações I e III. Este é o primeiro estudo abordando a dinâmica evolutiva temporal de uma população de begomovírus livre de ações antrópicas. Estudos adicionais sobre a dinâmica evolutiva de vírus em ecossistemas naturais devem ser conduzidos, a fim de desvendar como interagem as forças que guiam a evolução desses organismos em seu ambiente natural. 24

35 LITERATURA CITADA Albuquerque, L.C.; Inoue-Nagata, A.K.; Pinheiro, B.; Ribeiro, S.D.; Resende, R.O.; Moriones, E.; Navas-Castillo, J. A novel monopartite begomovirus infecting sweet potato in Brazil. Archives of Virology, v. 156, p , Albuquerque, L.C.; Varsani, A.; Fernandes, F.R.; Pinheiro, B.; Martin, D.P.; Ferreira, P.T.O.; Lemos, T.O.; Inoue-Nagata, A.K. Further characterization of tomato-infecting begomoviruses in Brazil. Archives of Virology, v. 157, p , Almeida, M.M.; Jain, S.; Barroso, P.A.; Hoffmann, L.V.; Lucena, M.G.; Resende, R.O.; Inoue-Nagata, A.K. Complete sequence of a new bipartite begomovirus infecting cotton plants in Brazil. Genome Announcements, v. 1, p , Altschul, S.F.; Gish, W.; Miller, W.; Myers, E.W.; Lipman, D.J. Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology, v. 215, p , Andrade, E.C.; Manhani, G.G.; Alfenas, P.F.; Calegario, R.F.; Fontes, E.P.B.; Zerbini, F.M. Tomato yellow spot virus, a tomato-infecting begomovirus from Brazil with a closer relationship to viruses from Sida sp., forms pseudorecombinants with begomoviruses from tomato but not from Sida. Journal of General Virology, v. 87, p , Aranha, S.D.; de Albuquerque, L.C.; Boiteux, L.S.; Inoue-Nagata, A.K. Detection and complete genome characterization of a begomovirus infecting okra (Abelmoschus esculentus) in Brazil. Tropical Plant Pathology, v. 36, p , Bezerra-Agasie, I.C.; Ferreira, G.B.; Ávila, A.C.; Inoue-Nagata, A.K. First report of Tomato severe rugose virus in chili pepper in Brazil. Plant Disease, v. 90, p. 114, Brown, J.K.; Zerbini, F.M.; Navas-Castillo, J.; Moriones, E.; Ramos-Sobrinho, R.; Silva, J.C.; Fiallo- Olive, E.; Briddon, R.W.; Hernandez-Zepeda, C.; Idris, A.; Malathi, V.G.; Martin, D.P.; Rivera- Bustamante, R.; Ueda, S.; Varsani, A. Revision of Begomovirus taxonomy based on pairwise sequence comparisons. Archives of Virology, v. 160, p , Calegario, R.F.; Ferreira, S.S.; Andrade, E.C.; Zerbini, F.M. Characterization of Tomato yellow spot virus (ToYSV), a novel tomato-infecting begomovirus from Brazil. Pesquisa Agropecuaria Brasileira, v. 42, p , Castillo-Urquiza, G.P.; Beserra Jr., J.E.A.; Bruckner, F.P.; Lima, A.T.M.; Varsani, A.; Alfenas-Zerbini, P.; Zerbini, F.M. Six novel begomoviruses infecting tomato and associated weeds in Southeastern Brazil. Archives of Virology, v. 153, p , Coco, D.; Calil, I.P.; Brustolini, O.J.B.; Santos, A.A.; Inoue-Nagata, A.K.; Fontes, E.P.B. Soybean chlorotic spot virus, a novel begomovirus infecting soybean in Brazil. Archives of Virology, v. 158, p , Costa, A.S.; Alves, S. Mosaico do pimentão. Bragantia, v. 10, p , Costa, A.S.; Bennett, C.W. Whitefly transmitted mosaic of Euphorbia prunifolia. Phytopathology, v. 40, p , Cotrim, M.A.; Krause-Sakate, R.; Narita, N.; Zerbini, F.M.; Pavan, M.A. Genetic diversity ot tomatoinfecting begomoviruses in Central São Paulo state (in Portuguese). Summa Phytopathologica, v. 33, p , Doyle, J.J.; Doyle, J.L. A rapid DNA isolation procedure for small amounts of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin, v. 19, p , Duffy, S.; Holmes, E.C. Validation of high rates of nucleotide substitution in geminiviruses: Phylogenetic evidence from East African cassava mosaic viruses. Journal of General Virology, v. 90, p ,

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