UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINARIA (CLÍNICA E REPRODUÇAO ANIMAL)

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINARIA (CLÍNICA E REPRODUÇAO ANIMAL) CAMILA NUNES FONSECA SITUAÇÃO ATUAL DA OCORRÊNCIA DE HEMOPARASITAS E Leishmania spp EM CÃES DE MARICÁ, REGIÃO DA BAIXADA LITORÂNEA DO ESTADO DO RJ - BRASIL NITERÓI 2008

2 CAMILA NUNES FONSECA SITUAÇÃO ATUAL DA OCORRÊNCIA DE HEMOPARASITAS E Leishmania spp EM CÃES DE MARICÁ, REGIÃO DA BAIXADA LITORÂNEA DO ESTADO DO RJ - BRASIL Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária - Clínica e Reprodução animal da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para a obtenção do Grau de Mestre. Orientadora: Prof.ª Dr.ª NÁDIA REGINA PEREIRA ALMOSNY Co-Orientador: Prof. Dr. ALOYSIO DE MELLO FIGUEIREDO CERQUEIRA Niterói 2008

3 CAMILA NUNES FONSECA SITUAÇÃO ATUAL DA OCORRÊNCIA DE HEMOPARASITAS E Leishmania spp EM CÃES DE MARICÁ, REGIÃO DA BAIXADA LITORÂNEA DO ESTADODO RJ - BRASIL Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária - Clínica e Reprodução animal da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para a obtenção do Grau de Mestre. Aprovada em Junho de 2008 BANCA EXAMINADORA Prof.ª Dr.ª Nádia Regina Pereira Almosny - Orientadora Universidade Federal Fluminense Prof. Dr. Aloysio de Mello Figueiredo Cerqueira Universidade Federal Fluminense Prof.ª Dr.ª Giane Regina Paludo - Universidade de Brasília Prof. Dr. Carlos Luiz Massard - Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro Niterói 2008

4 Dedico este trabalho aos meus pais, Maria Luiza Nunes e José Nelson Lemos Fonseca pelo constante incentivo.

5 AGRADECIMENTOS Aos meus pais pela confiança e credibilidade que em mim depositaram e pelo carinho e compreensão durante mutos anos de estudos. À minha orientadora, professora Dra. Nádia Almosny por aturar minhas cobranças e insistência e por me fazer crescer a ponto de me tornar Mestre. Ao meu co-orientador, Aloysio Cerqueira, que mesmo sabendo dos prazos me recebeu e passou todos os conhecimentos indispensáveis para a conclusão deste trabalho. Aos professores e amigos que participaram do meu aprendizado de patologia clínica. A professora Márcia pela ajuda incansável ao desenvolvimento deste trabalho e por participar como amiga e conselheira em todos os momentos. Ao professor Nayro que ampliou meus conhecimentos e me fez acreditar em meu potencial, que o profissional mais experiente possui medos e incertezas. À equipe de coordenação do Programa de Pós-Graduação. Aos meus amigos de Brasília que me deram força nos momentos difíceis e me ajudaram a acreditar e continuar. A Thamara infinitamente amiga que escutou todos meus problemas e sempre me ajudou com uma palavra de conforto. A Bárbara pelos momentos de reflexão e distração. A Cecília pela imensa preocupação e companheirismo. A Patrícia minha amiga confidente e psicóloga que tanto me ajudou a tomar decisões. À professora Doutora Lucia Helena O Dwyer da Universidade Estadual Paulista - Botucatu, que gentilmente cedeu amostra controle positivo. Ao amigo Daniel Macieira, pela realização de toda a análise estatística desta tese e pelos conselhos e dicas que me ajudaram muito para a realização deste trabalho. A Dra. Renata Ferreira, por ceder seu tempo e realizar as dosagens bioquímicas deste trabalho. Aos colegas do Laboratório de Enteropatógenos e Microbiologia de Alimentos do Instituto Biomédico da UFF pela paciência e coleguismo.

6 A Lucyene amiga que cedeu sua casa para que eu pudesse terminar a minha dissertação com tranqüilidade. E principalmente ao meu amigo e companheiro que foi a pessoa que vivenciou junto comigo todos esses momentos e me deu força para continuar nos momentos de incerteza e ajudou em todas as etapas desta dissertação. Adriano, sem você nem metade disso seria possível. Obrigada a todos vocês.

7 RESUMO A expansão das áreas urbanas e as condições precárias de habitação/ saneamento estão causando uma incidência crescente de diversas enfermidades em centros urbanos e seus arredores, o que agrava os problemas de saúde pública no país. Com o intuito de se conhecer a situação de hemoparasitoses transmitidas por artrópodes na cidade de Maricá, foram avaliadas amostras de sangue de 153 cães, escolhidos aleatoriamente na campanha de vacinação realizada em Setembro de As pesquisas de hemoparasitos e Leishmaniose foram realizadas por Ensaio Imunoenzimático Indireto (ELISA) e Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Ademais, foram realizados exames hematológicos e bioquímicos séricos. Observouse que nas várias regiões estudadas foram encontrados hemoparasitos, mas a distribuição destes era variável com maior concentração nas áreas mais carentes. Apenas uma região apresentou ocorrência de animais infectados por Dirofilaria immitis. Os animais infectados em geral, apresentaram discreta anemia, trombocitopenia, eosinofilia, redução da concentração sérica de albumina e aumento de globulinas no soro. Os animais positivos para Hepatozoon spp apresentaram, além de anemia, discreta monocitose, eosinofilia e trombocitopenia. Concluiu-se que o clima favorável para a proliferação de vetores, a degradação ambiental e a precariedade urbana de várias regiões beneficiaram a disseminação destes parasitos tropicais. Palavras-chave: hemoparasitas, saúde pública, Dirofilaria immitis, Leishmania spp, alterações hematológicas, carrapatos.

8 ABSTRACT The expansion of urban areas and poor habitation/sanitation conditions are causing an increasing incidence of many diseases in these areas and surroundings, worsening public health problems in the country. In order to know the situation of arthropod-borne blood parasites diseases in Maricá city, blood samples of 153 dogs, randomly chosen in the September/2003 vaccination campaign were evaluated. Blood parasites and Leishmaniosis search were performed through Indirect Immunoenzimatic assays (ELISA) and polymerase chain reaction (PCR). In addition, complete blood counts and chemical profiles were also performed. In the various studied regions, blood parasites were found, but its distribuition was variable, with higher concentrations in more poor areas. Only one region had occurrence of animals infected with Dirofilaria immitis. Generally, infected animals had mild anemia, thrombocytopenia, eosinophilia, decreased serum albumin and increased serum globulin concentrations. Hepatozoon spp. positive animals had, in addition to anemia, a mild monocytosis, eosinophilia and thrombocytopenia. It was concluded that a favorable climate to vectors proliferation, environmental degradation and the urban precariousness of various regions improved the dissemination of these tropical parasites. Keywords: Hemoparasites, Public Health, Dirofilaria immitis, Leishmania spp, Hematological changes, ticks.

9 LISTA DE ILUSTRAÇÕES FIGURA 1 Fotografia do gel de agarose 1% mostrando os produtos correspondentes a 666 pares de bases. Símbolos: (H) água; (1,2,3,4,5,8) produto da PCR de DNA extraído de sangue de cão (animais negativos); (6,7) produto da PCR de DNA extraído de sangue de cão (animais positivos); (9) produto da PCR de DNA extraído de sangue de cão naturalmente infectado com Hepatozoon spp. (controle positivo); (M) Padrão de peso molecular 1Kb plus, f. 81 FIGURA 2 Fotomicrografia de esfregaços sangüíneos de cães positivos em análise morfológica para a pesquisa de Hemoparasitas. a Inclusão sugestiva de Ehrlichia spp. ou Anaplasma phagocitophylum (seta); b presença de microfilária; c,d Inclusão sugestiva de Hepatozoon spp. Em neutrófilo segmentado (seta); e,f Inclusões sugestivas de Babesia spp. em hemacias (setas). Coloração Giemsa. Aumento 1000X., f. 88 FIGURA 3 Fotomicrografia de esfregaços sangüíneos de cães positivos em análise morfológica para a pesquisa de Dirofilariose. a, b Microfilarias. Coloração Giemsa. Aumento 400X, f. 89 FIGURA 4 Figura 2- Kit comercial Canine Snap 4Dx. a) snap no momento em que o dispositivo é acionado; b) soro do animal a ser testado; c) conjugado utilizado para reagir com o soro do animal; d) local de aplicação da mistura (amostra do animal + conjugado); e) poço do controle positivo; f) poço positivo para Ehrlichia canis; g) poço positivo para Dirofilaria immitis; h) poço positivo para Anaplasma phagocitophylum, f. 153

10 LISTA DE TABELAS TABELA 1 TABELA 2 TABELA 3 TABELA 4 Valores de referência para os parâmetros hematológicos utilizados neste estudo, f. 72 Valores de referência para os parâmetros bioquímicos utilizados neste estudo, f. 73 Dados analisados na região de Maricá separados por regiões menores, em setembro/2007, f. 80 Sensibilidade e reprodutibilidade da PCR para Hepatozoon spp utilizando amostras de sangue total e de capa leucocitária em Setembro/2007, f. 82 TABELA 5 Ocorrência de hemoparasitos e intervalos de confiança a 95% (IC 95%) dentro da amostra utilizada no presente trabalho, f. 83 TABELA 6 Freqüência de exposição de hemoparasitas e Leishmania spp. em Maricá em setembro/2007, f. 87 TABELA 7 Comparação dos resultados positivos e negativos da avaliação morfológica em esfregaço sanguíneo para o diagnóstico de Hemoparasitas em cães da região de Maricá em setembro/2007, f. 89 TABELA 8 Comparação entre avaliação morfológica e molecular dos resultados positivos e negativos de Hepatozoon spp em cães da região de Maricá em setembro/2007, f. 90 TABELA 9 Comparação entre avaliação morfológica e sorológica dos resultados positivos e negativos de Ehrlichia canis em cães da região de Maricá em setembro/2007, f. 91 TABELA 10 Comparação entre avaliação morfológica e sorológica dos resultados positivos e negativos de Dirofilaria immitis em cães da região de Maricá em setembro/2007, f. 92 TABELA 11 Presença de Hepatozoon spp nas regiões de Maricá em Setembro de 2007, f. 93 TABELA 12 Presença de Ehrlichia canis e Anaplasma phagocitophylum nas regiões de Maricá em setembro/2007, f. 94 TABELA 13 Presença de Babesia spp na de Maricá em setembro/2007, f. 95

11 TABELA 14 Presença de Dirofilaria immitis nas regiões de Maricá em setembro/2007, f. 96 TABELA 15 Soro-reatividade para o antígeno de Leishmania brasiliensis nas regiões de Maricá em setembro/2007, f. 98 TABELA 16 Soro-reatividade para antígeno de Leishmania chagasi nas regiões de Maricá em setembro/2007, f. 99 TABELA 17 Valores médios de parâmetros hematológicos de 109 animais positivos ou expostos e 39 negativos para hemoparasitas testados na região de Maricá, f. 103 TABELA 18 Valores médios de parâmetros bioquímicos de 109 animais positivos e 39 negativos para hemoparasitas na região de Maricá, f. 105 TABELA 19 Animais positivos apenas para Hepatozoon spp., em infecção associada na região de Maricá, f 106 TABELA 20 Valores médios de parâmetros hematológicos de 14 animais positivos para Hepatozoon spp. Com co-infecção e 39 negativos para hemoparasitas na região de Maricá, f. 109 TABELA 21 Valores médios de parâmetros bioquímicos de 14 animais positivos para Hepatozoon spp. Com co-infecção e 39 negativos para hemoparasitas na região de Maricá, f. 111 TABELA 22 Valores médios de parâmetros hematológicos de 2 animais positivos apenas para Hepatozoon spp. e 39 negativos para hemoparasitas na região de Maricá, f. 113 TABELA 23 Valores médios de parâmetros bioquímicos de 2 animais positivos apenas para Hepatozoon spp. e 39 negativos para hemoparasitas na região de Maricá, f. 114 TABELA 24 Valores médios de parâmetros hematológicos de 48 animais positivos ou expostos e 17 negativos para hemoparasitas na região de Bambuí, f 154 TABELA 25 Valores médios de parâmetros hematológicos de 36 animais positivos ou expostos e 12 negativos para hemoparasitas na região de Espraiado, f. 155

12 TABELA 26 Valores médios de parâmetros hematológicos de 16 animais positivos ou expostos e 6 negativos para hemoparasitas na região de São José f. 156 TABELA 27 Valores médios de parâmetros hematológicos de 9 animais positivos ou expostos e 4 negativos para hemoparasitas na região de Centro, f. 157 TABELA 28 Valores médios de parâmetros bioquímicos de 48 animais positivos ou expostos e 17 negativos para hemoparasitas na região de Bambuí, f. 158 TABELA 29 Valores médios de parâmetros bioquímicos de 36 animais positivos ou expostos e 12 negativos para hemoparasitas na região de Espraiado, f. 158 TABELA 30 Valores médios de parâmetros bioquímicos de 16 animais positivos ou expostos e 6 negativos para hemoparasitas na região de São José, f.159 TABELA 31 Valores médios de parâmetros bioquímicos de 9 animais positivos ou expostos e 4 negativos para hemoparasitas na região de Centro,f. 159 TABELA 32 Valores médios de parâmetros hematológicos de 8 animais positivos para Hepatozoon spp com co-infecção e 39 negativos para hemoparasitas na região de Bambuí, f. 160 TABELA 33 Valores médios de parâmetros hematológicos de 4 animais positivos para Hepatozoon spp com co-infecção e 39 negativos para hemoparasitas na região de Espraiado, f. 161 TABELA 34 Valores médios de parâmetros bioquímicos de 8 animais positivos para Hepatozoon spp com co-infecção, e 39 negativos para hemoparasitas na região de Bambuí, f. 162 TABELA 35 Valores médios de parâmetros bioquímicos de 4 animais positivos para Hepatozoon spp com co-infecção, e 39 negativos para hemoparasitas na região de Espraiado, f. 162 TABELA 36 Valores médios de parâmetros hematológicos de 2 animais positivos apenas para Hepatozoon spp. e 39 negativos para hemoparasitas na região de Espraiado, f. 163 TABELA 37 Valores médios de parâmetros bioquímicos de 2 animais positivos apenas para Hepatozoon spp. e 39 negativos para hemoparasitas na região de Espraiado, f. 164

13 LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS µl Microlitros µm Micromolar ALB Albumina ALT Alanino aminotransferase AST Aspartato aminotransferase BID Duas vezes ao dia CHGM Concentração de hemoglobina grobular média CID Coagulação intravascular disseminada CK Creatino quinase CREAT Creatinina DNA Ácido desoxirribonucléico dntp Trifosfatos desoxirribonucleosídeos EDTA Ácido etileno diamino tetracético ELISA Do inglês Enzyme-Linked Imunosorbent Assay ou ensaio imuno enzimático FA Fosfatase alcalina fl Fentolitros g/dl Gramas por decilitro GLOB Globulina HCl Ácido clorídrico IFI Imunofluorescência Indireta IgG Imunoglobulina G IgM Imunoglobulina M IM Intramuscular KCl Cloreto de Potássio LE Leucometria específica LG Leucometria global LTA Leishmaniose Tegumentar Americana LVA Leishmaniose VIsceral Americana M Molar m Metros mg/dl Miligramas por decilitro

14 mg/kg Miligramas por quilo MgCl 2 Cloreto de magnésio mm Milimolar N o OMS Número Organização Mundial da Saúde p. Página pb Pares de base PCR Do inglês Polymerase Chain Reaction ou reação em cadeia da polimerase ph Potencial hidrogeniônico PO Via oral PTN Proteínas Sc Subcutâneo RNAr Ácido ribonucléico ribossomal Taq Thermophilus aquaticus TID Três vezes ao dia U Unidade internacional de medida U/L Unidades por litro VG Volume globular VGM Volume globular médio

15 SUMÁRIO LISTA DE ILUSTRAÇÕES, P. 9 LISTA DE TABELAS, P. 10 LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS, P INTRODUÇÃO, P REVISÃO BIBLIOGRÁFICA, p HEPATOZOONOSE CANINA, p História e etiologia, p Distribuição geográfica, p Epidemiologia, p Prevalência, p Ciclo biológico, Transmissão, p Sinais clínicos, p Alterações hematológicas, p Alterações na Bioquímica sérica, p Alterações teciduais na hepatozoonose canina, p Alterações teciduais na infecção por Hepatozoon canis, p Alterações teciduais na infecção por H. americanum, p Patogenia, p Diagnóstico, p Tratamento, p Prognóstico, p Prevenção, p Ehrlichia canis e Anaplasma spp, p Histórico, p Epidemiologia, p Ocorrência, p Transmissão, p Aspectos Clínicos, p Sinais Clínicos, p Diagnóstico, p. 42

16 2.2.7 Tratamento, p Babesia spp., p Histórico, p Distribuição geográfica, p Epidemiologia, p Ocorrência, p Ciclo Biológico, p Transmissão, p Patogenia, p Aspectos clínicos, p Sinais clínicos, p Alterações laboratoriais, p Diagnóstico, p Tratamento, p Prevenção, p Dirofilaria immitis, p Histórico, p Distribuição geográfica, p Epidemiologia, p Prevalência, p Aspectos clínicos em humanos, p Sinais clínicos, p Alterações hematológicas, p Alterações bioquímicas, p Transmissão, p Diagnóstico, p Prevenção, p Tratamento, p Leishmania, p Histórico, p Epidemiologia, p Distribuição geográfica, p Prevalência, p Ciclo Biológico, p. 65

17 2.5.6 Aspectos clínicos e laboratoriais, p Diagnóstico, p Prevenção, p Tratamento, p OBJETIVOS, p MATERIAL E MÉTODOS, p Animais, p Coleta e processamento das amostras de Sangue, p Obtenção da capa leucocitária, p Realização do hemograma, p Dosagens bioquímicas, p Diagnóstico molecular, p Extração de DNA, p Ensaios de PCR para detecção de Hepatozoon spp, p primers, p PCR, p Análise dos produtos da PCR, p Seqüenciamento de DNA dos amplicons obtidos nos ensaios de PCR, p Produção de antígenos de Leishmania, p ELISA (Enzymed Linked Immunosorbent assay) para detecção de anticorpo anti-leishmania, p Detecção do antígeno da Dirofilaria immitis e anticorpos de Anaplasma phagocytophilum, Borrelia burgdoferi e Erhrlichia canis, p Análise estatística, p RESULTADOS E DISCUSSÃO, p COMPARAÇÃO DA SENSIBILIDADE ENTRE AS AMOSTRAS DE SANGUE TOTAL E CAPA LEUCOCITÁRIA UTILIZADAS PARA REALIZAÇÃO DA PCR PARA Hepatozoon spp.p RESULTADO DA PESQUISA DE HEMOPARASITAS ATRAVÉS DE MORFOLOGIA EM LÂMINAS DE ESFREGAÇO SANGÜÍNEO, AVALIAÇÃO MOLECULAR (PCR), SOROLOGIA, E DE LEISHMANIOSE NA REGIÃO DE MARICÁ RJ, p RESULTADO DA PESQUISA MORFOLÓGICA DE HEMOPARASITAS NA REGIÃO DE MARICÁ E SEUS BAIRROS, p. 87

18 5.3.1 COMPARAÇÃO ENTRE MÉTODOS REALIZADOS PARA DIAGNOSTICAR A PRESENÇA DE Hepatozoon spp., Ehrlichia canis E Dirofilaria immitis EM CÃES DA REGIÃO DE MARICÁ, p OCORRÊNCIA DE Hepatozoon spp ATRAVÉS DE AVALIAÇÃO MOLECULAR NAS REGIÕES DE MARICÁ, p OCORRÊNCIA DE Ehrlichia canis E Anaplasma phagocitophylum ATRAVÉS DA SOROLOGIA FEITA EM MARICÁ, p OCORRÊNCIA DE Babesia spp ATRAVÉS DA AVALIAÇÃO MORFOLÓGICA DOS ESFREGAÇOS SANGUÍNEOS NAS REGIÕES DE MARICÁ, p OCORRÊNCIA DE Dirofilaria immitis ATRAVÉS DA SOROLOGIA NAS REGIÕES DE MARICÁ, p OCORRÊNCIA DE LEISHMANIOSES ATRAVÉS DA SOROLOGIA (ELISA) NAS REGIÕES DE MARICÁ, p AVALIAÇÃO DOS PARÂMETROS HEMATOLÓGICOS DOS ANIMAIS POSITIVOS OU EXPOSTOS E NEGATIVOS PARA QUALQUER HEMOPARASITA ESTUDADO E LEISHIMANIOSES NA REGIÃO DE MARICÁ E SEUS BAIRROS, p AVALIAÇÃO DOS PARÂMETROS BIOQUÍMICOS DOS ANIMAIS POSITIVOS OU EXPOSTOS E NEGATIVOS PARA QUALQUER HEMOPARASITA ESTUDADO E LEISHMANIOSES NA REGIÃO DE MARICÁ E SEUS BAIRROS, p CÃES, POSITIVOS E NEGATIVOS PARA HEPATOZOON, EM INFECÇÃO ASSOCIADA, NA REGIÃO DE MARICA EM GERAL E DETALHAMENTO DOS VALORES OBTIDOS NOS VÁRIOS BAIRROS, p CÃES, POSITIVOS E NEGATIVOS PARA Hepatozoon, EM INFECÇÃO ISOLADA, DA REGIÃO DE MARICA EM GERAL E DETALHAMENTO DOS VALORES OBTIDOS NOS VÁRIOS BAIRROS, p RESULTADO DO SEQUENCIAMENTO, p CONCLUSÕES, p REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS, p ANEXOS, p. 149

19 19 1 INTRODUÇÃO O rápido crescimento das cidades provoca degradações irreversíveis ao meio ambiente. As transformações que ocorrem como desmatamento, expansão das áreas urbanas e condições precárias de habitação e saneamento, estão causando uma incidência crescente de diversas enfermidades em centros urbanos e seus arredores. Este crescimento desordenado das cidades está agravando os problemas de saúde pública no país. Os animais domésticos se tornam potenciais reservatórios de diversas doenças facilitando a transmissão e proliferação de zoonoses. O Município de Maricá (Rio de Janeiro) sofreu um processo de urbanização, iniciado na década de 40, por meio da fragmentação da terra das fazendas locais, alterando sua estrutura espacial e transformando-o em um município peri-urbano. Dessa forma, tornou-se integrado definitivamente à Região Metropolitana do Rio de Janeiro (MARTINS, 1986). A paisagem natural foi bastante alterada por desmatamentos sucessivos, que ainda acontecem e acarretam importantes desequilíbrios ambientais, favorecedores à instalação do ciclo peri-doméstico da leishmaniose tegumentar americana (LTA). Em Maricá, a ocorrência esporádica de casos humanos e caninos de LTA tem sido associada com a ocupação humana próximo às encostas de matas (HORTA et al., 1998; MADEIRA et al., 2001). Recentemente, foram notificados na Secretaria Municipal de Saúde de Maricá (SMS-Maricá) dois casos humanos de LTA (SERRA et al., 2003). A leishmaniose é uma doença infecciosa causada por protozoário do gênero Leishmania que pode ser transmitido a pessoas, animais domésticos e silvestres. É transmitida pelo flebótomo do gênero Phlebotomus no Velho Mundo e Lutzomyia no Novo Mundo.

20 20 A distribuição da hepatozoonose, erlichiose e babesiose estão intimamente relacionadas à presença dos carrapatos. Estes por sua vez ocupam áreas de clima quente e úmido como as regiões tropicais e subtropicais (BANETH, 2006a). Hepatozoon canis tem sido alvo de estudos que visam elucidar a patogenia determinada por este protozoário no Brasil enquanto a babesiose é uma protozoose que determina anemia hemolítica importante acarretando processos patológicos hepato-renais e auto-imunes. Ehrlichia canis é uma riquetsiose, causada por um parasita intracelular obrigatório. Ocorre em muitos países de clima temperado, tropical e subtropical e tem sido relatada na Ásia, África, Europa e Américas (ALMOSNY e MASSARD, 2002). Recentemente o gênero Ehrlichia foi reclassificado e algumas espécies foram renomeadas dentro de outros gêneros, como Anaplasma e Neorickettsia, sendo que este último não está relacionado a carrapatos. Ehrlichia canis permaneceu no mesmo gênero. A dirofilariose, conhecida vulgarmente como doença do verme do coração, tem como agente etiológico o nematóide Dirofilaria immitis Raillet e Henry (1911) (LABARTHE et al., 2002), com distribuição mundial, sendo consideradas áreas endêmicas os países com clima temperado, tropical e subtropical (KUME, 1970). Há mais de 70 espécies de mosquitos conhecidas como possíveis vetores (LUDLAM et al., 1970). Os mais apontados no Brasil são Aedes scapularis e A. taeniorhynchus, entretanto A. fluviatilis e Culex quinquefasciatus Say também foram relatados (LABARTHE et al., 1998).

21 21 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 HEPATOZOONOSE CANINA História e Etiologia A hepatozoonose canina foi descrita pela primeira vez na Índia e o agente da doença foi classificado inicialmente por Leukocytozoon canis (JAMES, 1905). Depois o gênero foi modificado para Hepatozoon (CHRISTOPHERS, 1907), devido à observação de merontes no fígado de ratos infectados com H. muris (MILLER, 1908). O gênero Hepatozoon foi atribuído à família Hemogregarinidae (LÉGER, 1911) e posteriormente para Hepatozoidae (WENYON, 1926). Acreditava-se que a hepatozoonose canina era causada por uma única espécie (CRAIG et al., 1978). No entanto, estudos relacionados com as espécies de carrapatos transmissores, o ciclo de vida do parasito (BANETH et al., 2001; MATHEW et al., 1998; MATHEW et al., 1999) e a caracterização genética e antigênica (MATHEW et al., 2000; BANETH et al., 2000a) revelam a existência de duas síndromes diferentes. As hepatozoonoses são doenças transmitidas por artrópodes e causadas por um protozoário pertencente ao Filo Apicomplexa, Classe Telosporasida, Subclasse Coccidiasina, Ordem Eucoccidiorida, Subordem Adeleorina, e Família Hepatozoidae (WENYON, 1926). Segundo Smith (1996) existe mais de 300 espécies de Hepatozoon que acometem anfíbios, répteis, aves e mamíferos. Diversos artrópodes invertebrados são descritos como transmissores de Hepatozoon spp. em animais como ácaros, carrapatos e insetos. O hospedeiro definitivo do Hepatozoon canis é o carrapato

22 22 Rhipicephalus sanguineus (CRHISTOPHERS, 1907), e de H. americanum é o Amblyomma maculatum (EWING et al., 2002; MATHEW et al., 1998) Distribuição Geográfica Desde a primeira descrição (JAMES, 1905; BENTLEY, 1905) a hepatozoonose vem sendo relatada na África, Ásia, metade do Oeste e Sul da Europa (MURATA et al., 1991) e no Sul dos Estados Unidos (VINCENT-JOHNSON et al., 1997a). Atualmente é considerada uma enfermidade de ampla distribuição, estando em diversas regiões do mundo, onde encontra um clima favorável para o desenvolvimento do vetor (carrapato) (EWING, PANCIERA, 2003). No Brasil H. canis foi relatado pela primeira vez por Massard (1979), em cães no Estado do Rio de Janeiro. Desde então outros Estados como São Paulo (O DWYER et al., 1997; GONDIM et al., 1998), Minas Gerais (MUNDIM et al., 1992, MUNDIM et al.,1994), Rio Grande do Sul, e na cidade de Brasília (PALUDO et al., 2003) relataram o seu aparecimento. H. canis foi descrito também na Espanha (GARCIA et al., 1990), Japão (MURATA et al., 1991), Israel (BANETH et al., 1995; BANETH et al., 1997), Itália (GAVAZZA et al., 2003), Turquia (KARAGENC et al., 2005), Buenos Aires (EIRAS et al., 2007). A infecção por H. americanum é uma doença emergente que se estende do Norte ao Oeste da costa do Texas, Estados Unidos (CRAIG et al., 1978), e desde 1978 vem sendo relatados nos Estados: Sudeste como Alabama (MACINTIRE et al., 1997), Lousiana (GOSSETT et al., 1985), Oklahoma (PANCIERA et al., 1997), Geórgia (MACINTIRE et al., 1997), Tennessee e Flórida (BANETH et al., 2003) Epidemiologia A disseminação da hepatozoonose canina está relacionada com a presença do carrapato (vetor). As regiões de clima quente e úmido são propícias para a proliferação desses vetores (EWING E PANCIERA, 2003). No Brasil a maior parte dos casos parecem ocorrer durante o verão que vai desde novembro a março, pois coincidem com a época de maior ocorrência dos carrapatos. Segundo Baneth e Weigler (1997) 77% dos casos de hepatozoonose canina em Israel ocorreram

23 23 durante os meses de maio a novembro que corresponde ao período quente. No Japão o pico da parasitemia ocorre durante a primavera e o outono (MURATA et al., 1993a). No entanto a transmissão pelo vetor se torna mais lenta durante os meses frios do ano, que é observada pela persistência crônica da infecção (BANETH e WEIGLER, 1997). Rhipicephalus sanguineus é o vetor responsável pela transmissão biológica de H. canis no Brasil, devido esta espécie ser mais associada com cães (MASSARD, 1979). No entanto, a infestação por R. sanguineus em cães é frequentemente associada a uma mistura de carrapatos e frequentemente esta associação está relacionada a espécies do gênero Amblyomma (O DWYER et al., 2001). Um estudo recente mostrou uma alta prevalência de espécies de Amblyomma spp. na zona rural do Estado do Rio de Janeiro, além de cães infectados por H. canis apresentando infestação por A. cajennense (O DWYER et al., 2001). Forlano et al. (2005), em trabalho experimental com espécies de A. ovale, detectaram formas de Hepatozoon spp. em cães após 63 dias de ingestão do macerado de carrapatos desta espécie, mostrando o envolvimento deste vetor na transmissão da infecção. No Japão Murata et al. (1995) descreve Haemaphysalis flavas e H. longicornus como vetores. Nos Estados Unidos o agente transmissor de Hepatozoon americanum é o carrapato Amblyomma maculatum (VINCENT-JOHNSON et al., 1997a). Segundo Mathew et al. (1998) os carrapatos Amblyomma maculatum, Amblyomma americanum, R. sanguineus e Dermacentor variabilis foram testados como vetores do H. americanum, porém somente encontraram os oocistos na hemocele de Amblyomma maculatum. Carnívoros selvagens como o coiote (Canis latrans), têm sido descritos como sendo reservatórios de H. americanum (KOCAN et al., 1999; DAVIS et al., 1978; MERCER et al., 1988). Segundo Panciera et al. (1997) e Mathew et al. (1998) coiotes jovens apresentam doença clínica grave e fatal. Esses animais são susceptíveis à infecção, mas em alguns casos não apresentam sinais clínicos da doença (KOCAN et al., 1999), servindo como fonte de infecção para o vetor e outros animais predadores (KOCAN et al., 1999; KOCAN et al., 2000). Os cães de áreas rurais possuem livre acesso às matas e florestas, e por muitas vezes apresentam hábitos de caça que facilitam a infestação por carrapatos e consequentemente a transmissão de diversas doenças (O DWYER et al., 2001).

24 Prevalência Existe uma variação na prevalência da doença nas mais diversas regiões do mundo. A presença de gametócitos circulantes de H. canis em cães de áreas rurais do Rio de Janeiro foi de 31,58% (MASSARD, 1979), posteriormente em regiões semelhantes foi observada uma prevalência de 39,2% utilizando o mesmo método (O DWYER et al. 2001). Entretanto em áreas urbanas da cidade do Rio de Janeiro a ocorrência foi de 4,48% (MASSARD, 1979), e 8,3% durante a campanha de vacinação anti-rábica de 2005 (SÁ et al., 2007). Em áreas urbanas de São Paulo foi observada um taxa de 5,9% de cães apresentando gametócitos circulantes (O DWYER et al., 2004). A ocorrência de H. canis está relacionada com a presença dos vetores. Elevada prevalência de espécies de Amblyomma parasitando cães de áreas rurais do Rio de Janeiro foram relatadas previamente por Massard et al., (1981). Riphicephalus sanguineus são encontrados principalmente em áreas urbanas (ODWYER et al., 2001). Em cães avaliados na Turquia através da Imunofluorência indireta (IFI), reação em cadeia da polimerase (PCR) e esfregaço sanguíneo apresentaram uma ocorrência respectivamente de 36,8%, 25,8% e 10,6% (KARAGENC et al., 2005). Na Nigéria (EZEKOLI et al., 1983) a detecção de gametócitos em leucócitos foi de 22% e na Malásia de 1,2% (RAJAMANICKAM et al., 1985). Em Israel estudos sorológicos demonstraram uma ocorrência de 33% (BANETH et al., 1996) e de 4,2% no Japão (INOKUMA et al., 1999) Ciclo Biológico O ciclo biológico do Hepatozoon spp. é semelhante ao ciclo dos coccídios que apresentam estágio sexuado e assexuado. No assexuado ocorrem as fases de esquizogonia e esporogonia, sendo que, a primeira ocorre no hospedeiro intermediário (cão) e a segunda no hospedeiro definitivo (carrapato). A gametogonia é o estágio sexuado e também se desenvolve no hospedeiro definitivo. A esporogonia consiste na formação de oocistos e ocorre no hospedeiro definitivo (carrapato). A infecção do carrapato inicia com alimentação de sangue

25 25 (repasto sanguíneo) apresentando gametócitos (gametócitos) de Hepatozoon spp. de animal previamente infectado. Após o repasto sanguíneo os gametócitos caem no intestino diferenciando-se em macrogametócitos e microgametócitos. A gametogonia ocorre com a união dos macrogametócitos e microgametócitos formando um zigoto chamado oocineto. Esta célula contendo dois núcleos (oocineto) penetra a parede do intestino e entra na hemocele do hospedeiro definitivo (CRAIG et. al., 1978). Segundo Smith e Desser (1997) a singamia (gametogonia) e a esporogonia de muitas espécies de Hepatozoon spp. ocorrem na hemocele do hospedeiro definitivo. Porém na espécie H. americanum estas duas fases ocorrem nas células intestinais do hospedeiro definitivo (MATHEW et al., 1999). O oocineto continua o seu desenvolvimento formando um oocisto com formato irregular contendo de 30 a 50 esporocistos, sendo que cada esporocisto possui aproximadamente 16 esporozoítos (CRAIG et al., 1978; MATHEW et al., 1998; O DWYER, MASSARD, 2003), (MATHEW et al., 1999), 12 a 24 (VINCENT- JOHNSON et al., 1997a) esporozoítos. Temperatura de desenvolvimento dos oocistos e espécie de mosquito hospedeiro são fatores sugeridos por Smith (1996) para as variações nos tamanhos e números de oocistos e esporocistos, número de esporocistos por oocistos e no número de esporozoítos por esporocisto em espécies de Hepatozoon que acometem cobras. Segundo Mathew et al., (1999) ninfas de carrapatos que se infectaram em cães na fase aguda da doença apresentaram um número maior de oocistos do que aqueles infectados por cães na fase crônica. A infecção no cão ocorre devido à ingestão de carrapatos infectados por oocistos esporulados. Os esporozoítos são liberados dos oocistos e caem no intestino. Os esporozoítos penetram a parede do intestino e entram na circulação sanguínea ou linfática podendo atingir diversos órgãos como fígado, baço, pulmões, medula óssea, linfonodos ou no miocárdio e musculatura esquelética (VINCENT- JOHNSON et al., 1997a; EWING, PANCIERA, 2003). Os esporozoítos invadem os macrófagos nas paredes intestinais, nos linfonodos mesentéricos ou hepáticos e, a partir daí, são carreados até o baço, medula óssea, músculos, fígado e pulmões (VINCENT-JOHNSON et al., 1997a; EWING, PANCIERA, 2003). Segundo Massard (1979) o primeiro ciclo esquizogônico de H. canis ocorre na parede intestinal dos cães. Nestes tecidos ocorre a esquizogonia com a formação de cistos e/ou merontes na musculatura ou nos órgãos acima citados. Os esporozoítos se diferenciam em merontes nos tecidos e por fissão múltipla se dividem em merozoítos (VINCENT-

26 26 JOHNSON et al., 1997a; EWING, PANCIERA, 2003) formando macromerozoítos e micromerozoítos. Os micromerozoítos penetram na circulação sanguínea e se transformam em gametócitos, enquanto que os macromerozoítos retornam a merontes infectando novos tecidos (VINCENT-JOHNSON et al., 1997a) Transmissão A transmissão ocorre pela ingestão de ectoparasitas hematófagos infectados pelo protozoário (SMITH, 1996), durante pruridos e também pela predação de animais infestados pelos vetores infectados. Outra forma de transmissão que foi descrita no Japão é transmissão congênita (MURATA et al., 1993b) Sinais clínicos A presença de sinais clínicos está relacionada com a parasitemia dos animais infectados por H. canis. Infecções assintomáticas normalmente indicam uma baixa parasitemia com poucos gametócitos presentes na circulação sanguínea. Isto sugere que animais que foram infectados meses antes do aparecimento dos sinais podem apresentar infecção latente semelhante à toxoplasmose, podendo permanecer ao longo da vida do animal sem apresentar manifestações clínicas graves (BANETH et al., 1997). A parasitemia pode aumentar com o decorrer do tempo e, casos de infecção leve ou moderada podem evoluir para a infecção grave (BANETH e WEIGLER, 1997). Os sinais clínicos causados por Hepatozoon spp. são depressão, anorexia, perda de peso, mucosas pálidas (EZEOKOLI et al., 1983; ELIAS e HOMANS, 1988; PALUDO et al., 2003), desidratação, febre (EZEOKOLI et al., 1983; ELIAS e HOMANS, 1988), fraqueza e secreção ocular mucóide (EZEOKOLI et al., 1983), dores musculares e ósseas, atrofia muscular e dificuldades na locomoção (CRAIG et al., 1978). Em Brasília (Brasil) os sinais encontrados foram perda de peso, anorexia e mucosas pálidas (PALUDO et al., 2003). Em Uberlândia (Minas Gerais-Brasil) além dos sinais de perda de peso, anorexia e mucosas pálidas os animais apresentaram corrimento óculo-nasal, febre, diarréia, taquicardia, vômitos e mucosas hiperêmicas

27 27 (MUNDIM et al., 1992; MUNDIM et al., 1994). Em Botucatu (São Paulo-Brasil) foi observado também poliúria e polidipsia (GONDIM et al., 1998). No Brasil os sinais observados foram de infecção causada por H. canis. Na Nigéria os sinais clínicos observados por Ezeokoli et al. (1983) foram epistaxe, anemia e febre e são comumente observados na ehrliquiose canina. Em Israel foi observado grave caquexia, esplenomegalia, presença de pontos brancos difusos no baço e fígado, hepatite crônica, necrose multifocal no baço, pneumonia instersticial, lesões nodulares grandes na superfície do baço e da pleura, glomerulonefrite, e presença de merontes no fígado, pulmão, rins, pâncreas, medula óssea e pleura (BANETH e WEIGLER, 1997). Os sinais clínicos causados pelo H. americanum são febre, fraqueza, mialgia, dores ósseas, leucocitose neutrofílica matura, pobre resposta ao tratamento, proliferação óssea periosteal, anorexia, letargia, dificuldades de locomoção e manutenção da postura, secreção ocular mucopurulenta, atrofia muscular generalizada (VINCENT-JOHNSON et al., 1997a; MACINTIRE et al., 1997; BARTON et al., 1985; CRAIG et al., 1978; GAUNT et al., 1983; PANCIERA et al., 1997; BANETH et al., 2003). Os sinais clínicos comumente observados são febre, anorexia, perda de peso, anemia, secreção ocular e fraqueza dos membros traseiros (VINCENT-JOHNSON et al., 1997a). Quando o animal apresenta prévia infecção por H. canis e posteriormente é infectado por outro patógeno pode causar imunossupressão induzindo o aparecimento da doença (BANETH et al., 1997). Sinais de dor, diarréia hemorrágica, vômito, desidratação, febre, poliúria e polidipsia, além dos já relatados para a hepatozoonose mostram a presença de co-infecção com Toxocara spp., Ancylostoma spp., B. canis, e hérnia umbilical (GONDIM et al., 1998; BANETH et al., 1997; BANETH e WEIGLER, 1997; BANETH et al., 1995) Esses achados demostraram que os sinais mais graves apresentados pelos animais infectados por H. canis geralmente são observados com a co-infecção de outras doenças Alterações Hematológicas De acordo com alguns autores as alterações observadas são leucocitose neutrofílica, monocitose, anemia, e linfopenia, porém nem todas essas alterações

28 28 são encontradas em todos os animais simultaneamente (CRAIG et al., 1978; GAUNT et al., 1983; BARTON et al., 1985; BANETH et al., 1995; BANETH et al., 1997; BANETH e WEIGLER, 1997; GONDIM et al., 1998; MACINTIRE et al., 1997; PANCIERA et al., 1997). Nos casos de infecção isolada em que se observa anemia, ela é do tipo normocítica normocrômica (CRAIG et al., 1978; GAUNT et al., 1983; BARTON et al., 1985; BANETH et al., 1995; BANETH et al., 1997; BANETH e WEIGLER, 1997; MACINTIRE et al., 1997; PANCIERA et al., 1997; PALUDO et al., 2003). Anemia normocitica normocrômica foi obsevada em todos os animais incluindo os negativos para H. canis. Além disso, os eosinófilos encontrados em alguns esfregaços apresentavam grânulos maiores do que o usualmente encontrado (PALUDO et al., 2003). Freqüentemente são relatados casos de eosinofilia (EZEOKOLI et al., 1983; BARTON et al., 1985; PALUDO et al., 2003) e basofilia (PALUDO et al., 2003). É descrito trombocitopenia em alguns casos (EZEOKOLI et al., 1983; BANETH et al., 1995; BANETH e WEIGLER, 1997; MACINTIRE et al., 1997; PANCIERA et al., 1997; PALUDO et al., 2003) e trombocitose em outros (MACINTIRE et al., 1997), bem como eosinopenia (CRAIG et al., 1978; BARTON et al., 1985). Segundo Elias e Homans (1988) dos seis cães positivos para H. canis, todos apresentaram um valor baixo de hematócrito. Os animais com infecção simples apresentaram valor de hemoglobina abaixo dos valores normais e trombocitopenia, sendo que um deles apresentou ainda leucocitose. Um outro cão que apresentou leucocitose tinha também neutropenia. Um animal apresentou neutropenia e monocitose. Os dois cães co-infectados com Ehrlichia spp. apresentaram respectivamente trombocitopenia e monocitose. Em outro estudo, foi observada em uma cadela a presença de co-infecção com E. canis, B. canis, H. canis, Isospora spp., Giárdia spp. e Dipylidium caninum. Ela apresentou acentuada trombocitopenia, anemia e hipoproteinemia além de sinais gastrintestinais causados pelas parasitoses mencionadas (GAL et al., 2007). Cães que apresentam alta parasitemia, em torno de 100% dos leucócitos infectados apresentam também uma intensa leucocitose podendo chegar a leucocitos/µl de sangue (BANETH et al., 1995; BANETH e WEIGER, 1997). Porém o mecanismo que causa essa elevação, principalmente em leucócitos ainda não foi elucidado (BANETH, 2006a).

29 29 Em animais com infecção grave com formação de cistos em órgãos pode-se observar uma intensa leucocitose neutrofílica normalmente desenvolvida em cães que apresentam outras doenças associadas como inflamação purulenta localizada (piometra), peritonite ou abscessos e em desordens sistêmicas como anemia hemolítica autoimune, endocardite, micoses e toxicoses estrogênicas. Segundo Baneth et al. (1997) devido à co-infeção pelo parvovirus canino os animais apresentaram intensa leucopenia, sendo que a parasitemia pelo H. canis foi variável de acordo com a gravidade da parvovirose Alterações na Bioquímica Sérica A hipoalbuminemia observada está associada a proteinúria e anorexia (BARTON et al., 1985). São descritos hiperglobulinemia e aumento das atividades séricas da fosfatase alcalina e creatina quinase (BANETH et al., 1995; BANETH e WEIGLER, 1997), assim como hipoglicemia e hiperfosfatemia (GAUNT et al., 1983; BANETH et al., 1995; BANETH e WEIGLER, 1997; MACINTIRE et al., 1997; PANCIERA et al., 1997). O aumento da atividade sérica da fosfatase alcalina está associado com o aumento da atividade dos osteoblastos como a proliferação do periósteo ósseo (CRAIG et al., 1978) e lesões hepáticas (BANETH et al., 1995) enquanto os da creatina cinase com necrose do miocárdio, disfunção cardíaca e decúbito (BANETH et al., 1995). Alguns animais apresentam hipercalcemia (BARTON et al., 1985; MACINTIRE et al., 1997) e redução na concentração do nitrogênio uréico sanguíneo (MACINTIRE et al., 1997) Alterações Teciduais na hepatozoonose canina Lesões teciduais são encontradas em diversos tecidos, porém o tropismo tecidual de H canis é diferente de H americanum. Na hepatozoonose causada por H. canis os estágios de merogonia são encontrados preferencialmente em órgãos parenquimais, preferencialmente em fígado, baço, linfonodos e medula óssea, mas podem ser encontrados também no pâncreas, nos pulmões e rins (BANETH, 2006a).

30 30 A merogonia em infecções por H. americanum ocorre na musculatura estriada, mas raramente no fígado, baço, linfonodos, pulmões e pâncreas são acometidos (BANETH, 2006a) Alterações Teciduais na infecção por Hepatozoon canis Os achados patológicos em cães infectados por H. canis estão associados a alterações acidentais como a presença de raros merontes até a falência total dos órgãos. As alterações macroscópicas observadas são esplenomegalia e hepatomegalia além de pontos necróticos brancos difusos medindo 1-2mm de diâmetro (BANETH et al., 1995; HERVAS et al., 1995). Segundo O Dwyer et al. (2004) não foram evidenciadas lesões macroscópicas durante a necropsia. Foram observadas no miocárdio áreas focais de miocardite subaguda contendo neutrófilos e histiócitos e áreas de infarto agudo sem parasitas visíveis (BANETH et al., 1995). Alguns cães podem apresentar pneumonia e lesões nodulares na pleura, hepatite crônica e glomerulonefrite (BANETH et al., 1995; BANETH e WEIGLER, 1997). Segundo O Dwyer et al. (2004) diversas formas teciduais denominadas merontes foram encontradas nos órgãos de cães necropsiados, porém merontes maduros não foram encontrados. O primeiro estágio chamado de formas nuas por Christophers (1906) foi caracterizado por um parasita redondo ou oval sem parede cística e encontrado apenas no baço e na medula óssea. Outro estágio cístico encontrado predominantemente oval, com grânulos refráteis ovais ou redondos e um grande zoíto em formato de banana em seu interior deslocado lateralmente. Este cisto foi semelhante ao encontrado por Baneth e Shkap (2003) chamado de cisto monozóico. O último estágio observado foi de cisto grande preenchido com grânulos refráteis grandes redondos ou ovais, porém sem o zoíto (O DWYER et al., 2004) Alterações Teciduais na infecção por H. americanum As alterações macroscópicas no tecido periesquelético e periósteo dos membros posteriores observadas em cães infectados com H. americanum são aumento de volume e edema (PANCIERA et al., 2000). Em animais com doença

31 31 crônica ocorre redução da massa muscular principalmente nos músculos temporais. Um moderado aumento nos linfonodos e baço são observados (EWING e PANCIERA, 2003). Nos ossos adjacentes à musculatura acometida ocorre reação periosteal, petéquias e aspecto esponjoso do osso (PANCIERA et al., 2000). As lesões ósseas ocorrem em diversas porções da maioria dos ossos, porém as lesões graves e intensas ocorrem com freqüência no terço distal da diáfise em fêmur e úmero, que são ossos mais longos. Ocasionalmente ocorre lesão leve na metáfise. Metacarpos e metatarsos apresentaram lesões proliferativas leves enquanto na tíbia e na fíbula elas ocorrem em dois terços proximais na superfície caudal e lateral. Essas lesões são também freqüentes nas fossas supra-espinhais e infra-espinhais (PANCIERA et al., 2000). As lesões microscópicas observadas são osteoproliferação na superfície cortical do osso, uma camada de osteoblastos com uma zona de células osteoprogenitoras hipertrofiadas e uma grande camada edemaciada, com densas fibras de periósteo (PANCIERA et al., 2000). Os vasos ao redor do periósteo apresentam inflamação e mineralização (VINCENT-JOHNSON et al., 1997a). Na histopatologia, observa-se miosite piogranulomatosa com inflamação difusa ao longo de planos faciais da musculatura. Os piogranulomas são freqüentemente associados com miosite aguda e subaguda com necrose e degeneração miofibrilar e infiltrado de células inflamatórias. A presença de granulomas multifocais é evidenciada no pâncreas, músculo cardíaco e esquelético e raramente em linfonodos e língua (MACINTIRE et al., 1997). Depósitos de amilóide são detectados ocasionalmente em baço, linfonodos, intestino, fígado, pulmões e rins (MACINTIRE et al., 1997; VINCENT-JOHNSON et al., 1997a). Alguns cães apresentam degeneração fibrinoide vascular multifocal na parede dos vasos do baço, fígado, pâncreas e linfonodos (MACINTIRE et al., 1997). As lesões microscópicas são caracterizadas como cistos, merontes e granulomas (PANCIERA et al., 2000). A evidência inicial da infecção por H. americanum na musculatura esquelética é a presença de um cisto lamelar mucopolissacarídeo (aspecto de casca de cebola) que possui um aspecto redondo ou ovóide com estruturas lamelares ao seu redor com dimensões variando de 80µm a 300µm (PANCIERA et al., 1998; PANCIERA et al., 1999; MATHEW et al., 1999). Este cisto possui uma célula hospedeira centralizada, grande e com margens discretas, núcleo único e grande com nucléolo

32 32 aumentado e proeminente, e ainda, um citoplasma volumoso, granular e eosinofílico (PANCIERA et al., 1998; PANCIERA et al., 1999; MATHEW et al., 1999). Ao longo do desenvolvimento desse cisto o parasita em seu interior também sofre mudanças tornando sua visualização mais clara devido à delimitação que a célula hospedeira produz ao redor do parasito, formando um vacúolo (PANCIERA et al., 1998; PANCIERA et al., 1999; MATHEW et al., 1999). Durante a merogonia do parasito, o material nuclear dele se agrega à periferia do meronte e em seguida forma os merozoítos individuais dentro de uma parede delgada. Até então não se observa infiltrado inflamatório, porém tempos depois essa parede dos merozoítos se rompe, liberando os merozoítos e começa a ocorrer rapidamente uma resposta inflamatória neutrofílica intensa. Durante este estágio podem ser observados os parasitos no interior de neutrófilos (PANCIERA et al., 1998; PANCIERA et al., 1999; MATHEW et al., 1999). A atração de macrófagos a área de inflamação permite a formação de um granuloma. Os macrófagos contendo os parasitas são inicialmente localizados no compartimento estromal do granuloma. Algumas células contendo zoítos migram pela parede do vaso para o compartimento intravascular mostrando aumento do diâmetro dos vasos (PANCIERA et al., 1998; PANCIERA et al., 1999; MATHEW et al., 1999) Patogenia A desintegração da parede cística do esquizonte provoca a liberação de merozoítos levando a uma reação inflamatória neutrofílica grave dentro e ao redor do cisto (PANCIERA et al., 1998). Já no estágio tardio predominam macrófagos que chegam a este sítio inflamatório. Os linfócitos e plasmócitos são raramente visualizados (BARTON et al., 1985). A miosite piogranulomatosa consiste em necrose e atrofia muscular com infiltração de neutrófilos e macrófagos e ocasionalmente linfócitos entre as fibras musculares. Esta atrofia pode ocorrer em todos os músculos, variando com a cronicidade da doença. A fraqueza é secundária à atrofia muscular (VINCENT- JOHNSON et al., 1997a). Este processo inflamatório na musculatura determina

33 33 intensa dor muscular levando a dificuldade de locomoção e manutenção da postura e ainda hiperestesia (VINCENT-JOHNSON et al., 1997a). A extrema parasitemia causada pela infecção por H. canis reflete um grande número de merontes teciduais que provocam demanda de nutrientes e causam danos teciduais diretos levando a perda de peso e caquexia (BANETH et al., 2003). A inflamação piogranulomatosa dos músculos extra-oculares pode ocasionar destruição da glândula lacrimal provocando secreção ocular (MACINTIRE e VINCENT-JOHNSON, 2000). Extrema leucocitose neutrofílica normalmente ocorre em cães com inflamação purulenta localizada como um abscesso, piometra, endocardite (GAUNT et al., 1983). A predominância de neutrófilos segmentados na corrente circulatória é multifatorial refletindo a grande demanda de neutrófilos pelo tecido e o aumento do tempo de circulação do neutrófilo. Isto ocorre em função de inflamações crônicas e uso prolongado de corticóides, ou ambos (CRAIG et al., 1978). Os neutrófilos infectados com H. canis apresentam deficiência de mieloperoxidase e falta de atividade fagocítica tornando o sistema do animal mais suceptível a infecções secundárias (MACINTIRE et al., 1997). A anemia é secundária a resposta medular à este processo inflamatório, já que aspirados da medula óssea mostram hiperplasia granulocítica com aumento da taxa mielóide:eritróide (VINCENT-JOHNSON et al., 1997a) Diagnóstico O diagnóstico clínico na hepatozoonose canina causada por H. canis não é preciso, pois os sintomas apresentados pela maioria dos cães são inespecíficos, podendo ser encontrados em outras doenças. Para a confirmação dos sinais clínicos apresentados pode ser realizada investigação direta do parasito por análises de esfregaços sanguíneos de sangue periférico, corados pelo Giemsa (BANETH et al., 1996; ELIAS e HOMANS, 1988; IBRAHIM et al., 1989; O DWYER et al., 1997; O DWYER et al, 2001). O encontro de gametócitos nos esfregaços sanguíneos é um importante achado hematológico para o diagnóstico da doença, porém em cães com H. americanum os gametócitos são dificilmente encontrados, pois o encontro de