Nanopartículas híbridas de sílica mesoporosas

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1 40 C 20 C Nanopartículas híbridas de sílica mesoporosas Elizabete Correia Coutinho Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Bioengenharia e Nanossistemas Orientadores: Prof. Doutor José Paulo Sequeira Farinha Prof. Doutor Carlos Miguel Calisto Baleizão Júri Presidente: Prof. Doutor Luís Joaquim Pina da Fonseca Orientador: Prof. Doutor José Paulo Sequeira Farinha Vogal: Prof. Doutor José Manuel Gaspar Martinho Dezembro de 2014

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3 Agradecimentos Gostaria de agradecer aos meus orientadores, Prof. Doutor José Paulo Sequeira Farinha e Prof. Doutor Carlos Miguel Calisto Baleizão pela oportunidade que me deram de integrar dentro desta equipa de bons profissionais, pelas importantes sugestões, apoio e acompanhamento. Gostaria igualmente de agradecer à Doutora Tânia Ribeiro e a Ana Sofia Rodrigues por todos os conselhos e disponibilidade para ouvir e esclarecer as dúvidas que foram surgindo ao longo do trabalho. Não posso deixar de agradecer aos meus colegas de laboratório por toda a ajuda, boa disposição e amizade. Aos meus amigos de Mestrado pelo apoio constante ao longo do curso, pela troca de ideias e companheirismo. Aos meus amigos de longa data por todos os momentos de descontração e convívio. Finalmente, quero agradecer aos meus pais por toda a compreensão e ajuda ao longo do meu percurso académico. À minha irmã agradeço a forma como sempre me incentivou a ultrapassar os obstáculos que apareceram ao longo de todos estes anos de estudo. iii

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5 Resumo A redução dos efeitos secundários de um fármaco pode ser obtida se estes forem eficazmente aplicados de forma controlada e no local necessário. Assim, são desejáveis sistemas que melhorem o transporte do fármaco e a sua entrega nas células alvo, resultando num aumento da eficácia do fármaco e uma diminuição da toxicidade nos tecidos saudáveis. As nanopartículas ganharam importância na área da medicina devido ao facto de possuírem uma razão área/volume e capacidade de reconhecimento de locais alvo após apropriada modificação. Neste trabalho foram sintetizadas nanopartículas híbridas mesoporosas (MSNs) com uma arquitectura de núcleo-coroa. O núcleo de sílica mesoporosa possui uma morfologia bem definida e controlada sendo excelentes candidatos para a incorporação de moléculas. As MSNs são caracterizadas por poros ordenados com diâmetros de 2-2,5 nm e volumes de poros acima de 1 ml / g. A polimerização RAFT (Reversible Addition-Fragmentation chain Transfer) associada ao método grafting from foi utilizada para o crescimento na coroa de um polímero biocompatível com resposta à temperatura, alternando entre uma conformação colapsada ou expandida. Essa alteração de conformação pode ser utilizada para controlar a saída das moléculas que estão dentro dos poros das MSNs, proporcionando uma plataforma conveniente para a libertação controlada de fármacos. As nanopartículas foram caracterizadas por microscopia electrónica de transmissão (TEM) e dispersão de luz dinâmica (DLS) obtendo-se diâmetros entre 140 e 220 nm e com formato esférico. Foi possível provar com sucesso o conceito da libertação controlada de moléculas no interior das MSNs por estimulação térmica da coroa polimérica. Estas nanoestruturas abrem novos caminhos no desenvolvimento de novos sitemas de libertação controlada. Palavras chave: nanopartículas de sílica mesoporosas, núcleo-coroa, libertação controlada, funcionalização, RAFT. v

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7 Abstract A decrease in the side effects of a drug can be obtained if it is delivered in an effective and timely manner to the needed location. Therefore, systems are needed to improve the transport of the drug and the location of the target cells, resulting in an increase in drug efficiency and decreased toxicity to healthy tissues. Nanoparticles have gained much importance in medicine due to the fact that they have high area to volume ratio and after functionalization with ability to recognize target sites. In this work, hybrid mesoporous silica nanoparticles (MSNs) were synthesized with a coreshell design. The mesoporous silica core has a well-defined morphology with poros that can incorporate molecules. The MSNs are characterized by ordered pores with diameters arround nm and volumes above 1 ml / g. RAFT polymerization (Reversible Addition-Fragmentation chain Transfer) associated with the grafting from method were used to growth a biocompatible polymer with temperature conformation dependence, between a collapsed or expanded conformation. This conformational change can be used to control the release of molecules incorporated in the pores, providing a convenient platform for controlled release of drugs. The nanoparticles were characterized by transmission electron microscopy (TEM), and dynamic light scattering (DLS) to give diameters between 140 and 220 nm and having a spherical shape. We also prove with success the release of molecules from the MSNs pores through thermal stimulation of the polymeric shell. These nanoparticles open new pathways in the development of new controlled release systems. Keywords: mesoporous silica nanoparticles, core-shell nanoparticles, controlled release, functionalization, RAFT. vii

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9 Índice Agradecimentos... iii Resumo...v Abstract... vii Índice de Figuras... xi Índice de Tabelas... xv Abreviaturas... xvii 1º Capítulo Introdução Nanopartículas Nanopartículas de sílica Síntese de nanopartículas por Sol-Gel Método de Stöber para a síntese de nanopartículas compactas Síntese de nanopartículas mesoporosas Nanopartículas Híbridas Modificação das nanopartículas Polimerização Radicalar Controlada Polimerização RAFT Sistemas de libertação controlada Nanopartículas para libertação controlada Sistemas moleculares de libertação controlada Sistemas poliméricos de libertação controlada º Capítulo - Nanopartículas desenvolvidas neste trabalho º Capítulo Parte Experimental Materiais Métodos Síntese de nanopartículas de sílica mesoporosas (MSNs) Nanopartículas de sílica mesoporosas marcadas com PDI (MSN-PDI) Funcionalização da superfície das MSNs com APTES (MSN-PDI-APTES) Remoção do tensioativo Adição do agente RAFT (CTA) ix

10 Polimerização por RAFT (MSN-POLI) Incorporação e libertação nas MSN-POLI Equipamento Centrífuga Dispersão de luz dinâmica Microscopia electrónica de transmissão Potencial Zeta Espectroscopia de fluorescência Espectroscopia UV/Vis º Capítulo- Apresentação e discussão dos resultados Caracterização óptica das partículas Determinação da concentração do agente RAFT por UV/Vis Caracterização das MSNs Nanopartículas de sílica mesoporosas Nanopartículas de sílica mesoporosas com revestimento polimérico Determinação do potencial zeta Incorporação e libertação de sulforodamina B nas MSN-POLI Incorporação de sulforodamina B nas MSN-POLI Estudo da libertação controlada nas MSN-POLI Conclusão x

11 Índice de Figuras Figura 1 - Exemplos de nanopartículas orgânicas, inorgânicas e híbridas Figura 2 - Estruturas mesoporosas de sílica mais comuns a) MCM-41, b)mcm-48, c)mcm-50 [7] Figura 3 - Estrutura molecular de tetraetilortossilicato (TEOS)... 3 Figura 4 - Esquema das equações de formação de nanopartículas de sílica pela hidrólise (1) e condensação (2) (3) de alcóxidos de sílicio Figura 5 - Reacções de hidrólise e condensação do TEOS que ocorrem no método de Stöber Figura 6 - Esquema da síntese de nanopartículas mesoporosas com tensioativo: a) agregados micelares, b) condensação do percursor de sílica, c) remoção do tensioactivo [17]... 5 Figura 7 - Funcionalização da superfície de NPs de sílica, com diferentes grupos funcionais e (bio)moléculas (imagem adaptada de [25])... 6 Figura 8 - Introdução de grupos funcionais em diferentes regiões de MSNs: a) na superfície externa, (b) nas entradas de poros, ou (c) dentro das paredes [26]... 7 Figura 9 - Esquema representativo da funcionalização da superfície um alcoxi-silano Figura 10 Estrutura do Agente RAFT e diferentes tipos Figura 11 Esquema representativo do agente RAFT ancorado na superfície através do grupo R e do grupo Z (imagem adaptada de [31])... 9 Figura 12 - Decomposição do iniciador 2,2'-Azobis(2-metilpropionitrilo) (AIBN) Figura 13 - Diferentes tipos de sistemas de entrega de fármacos (adaptada de [18]) Figura 14 - Processos envolvidos na preparação das nanopartículas híbridas Figura 15 - Comportamento esperado do polímero termossensível quando é aplicada temperatura.. 16 Figura 16 - Esquema representativo do processo de modificação da superfície das MSNs com APTES Figura 17 - Representação esquemática da reacção das MSN-APTES com o agente RAFT Figura 18 - Estrutura molecular dos monómeros oligo (etileno glicol) metacrilato (OEGMA) e 2-(2-metil ethoxi) etilmetacrilato (MEO 2- MA) Figura 19 - Espectro de absorção da solução de PDI em etanol utilizadas nas sínteses MSN-PDI 3a e 3b Figura 20 - Comparação dos espectros normalizados de excitação (a tracejado, λemi=560 nm) e emissão (linhas continuas, λexc=500 nm) para o PDI (vermelho) e MSN-PDI 7a (azul). O PDI numa solução de etanol está apresentado por linhas tracejadas e as nanopartículas MSN-PDI 7a numa dispersão de etanol por linhas contínuas Figura 21 - Espectro de absorção do agente RAFT (a verde) e das MSNs com NH 2 na superfície (a cinzento) da amostra MSNs 2a, em dioxano Figura 22 Imagens obtidas por TEM de nanopartículas de sílica (à esquerda) das sínteses MSN-2a ( A, escala 1000nm), MSN-3a (B, escala 500nm), MSN-3b (C, escala 200nm) e respectivo histograma da distribuição dos diâmetros (à direita) xi

12 Figura 23 - Imagens obtidas por TEM de nanopartículas de sílica (à esquerda) das sínteses MSN-5b (A, escala 1000nm), MSN-7a (B, escala 500nm), MSN-7b (C, escala 200nm) e respectivo histograma da distribuição dos diâmetros (à direita) Figura 24 - Imagem obtida por TEM da amostra MSNs 3b (200nm) ampliada para uma escala de 100nm Figura 25 - Imagens TEM de MSN-POLI 2a (A, 200nm), MSN-POLI 3a (B, 100nm), MSN-POLI 3b (C, 200nm), MSN-POLI 5b (D, 200nm), MSN-POLI 7a (E, 100nm) à esquerda e gráfico de DLS com o aumento de temperatura (20 a 50ºC) à direita Figura 26 - Imagem TEM de MSN-POLI 7b (à esquerda) e gráfico de DLS a diferentes temperaturas, para o ciclo de aquecimento (20-50ºC, a preto) e de arrefecimento (50-20ºC, a cinzento) Figura 27 - Potencial Zeta das amostras com o agente RAFT (MSN-PDI-RAFT) e com polímero (MSN-POLI) Figura 28 - Espectro de absorção da solução de SRB (A) e dos sobrenadantes (B). Sobrenadante 1 (azul), sobrenadante 2 (verde) e sobrenadante 3 (roxo) após a incorporação de SRB nas MSN- POLI e centrifugação Figura 29 - Espectros de excitação (linhas a tracejado) e emissão (linhas continuas) da SRB a 20ºC (vermelho) e 50ºC (azul), com λemi = 620 nm e λexc=520 nm Figura 30 Imagem representativa da preparação da amostra para a realização do estudo de libertação. O tudo de diálise (A) é composto por uma membrana de celulose na base e a célula de plástico (B) contem tampão fosfato (ph~7) Figura 31 - Intensidades de fluorescência obtidas para a SRB a 20ºC (verde) e a 50ºC (azul) ao longo do tempo (A). Com a razão da intensidade de fluorescência da SRB a 50ºC com SRB a 50ºC foram normalizadas as intensidades de fluorescência a 50ºC, obtendo-se a curva a vermelho (B). As intensidades de fluorescência foram medidas ao λemi = 585 nm e λexc=565 nm Figura 32 - Variações de intensidade de fluorescência obtidas para a SRB (azul) e MSN-SRB (verde), alterando a temperatura de 50 para 20ºC, de 20 em 20 minutos (A). As intensidades de fluorescência dos intervalos correspondentes a 50ºC para a SRB (vermelho) e para as MSN- SRB (roxo) foram normalizadas com a razão da intensidade de fluorescência da SRB a 50ºC com SRB a 20ºC (B). As intensidades de fluorescência foram medidas ao λemi = 585 nm e λexc=565 nm Figura 33 - Intensidades de fluorescência obtidas para a SRB a 20ºC (vermelho) e MSN-SRB a 20ºC (azul) e intensidades de fluorescência normalizadas obtidas para a SRB a 50ºC (verde) e MSN- SRB a 50ºC (roxo) e respectivos ajustes para cada intervalo. As intensidades de fluorescência foram medidas ao λemi = 585 nm e λexc=565 nm Figura 34 - Representação dos declives obtidos através dos ajustes efectuados para as variações da intensidade de fluorescência da SRB (amarelo) e MSN-SRB (laranja) a 50ºC e para SRB (cinzento) e MSN-SRB (azul) a 20ºC Figura 35 - Esquema representativo do comportamento das MSN-POLI carregadas com a sulforodamina B. O polímero a 50ºC encontra-se expandido (B e C) e a 50ºC colapsa (C e D). A xii

13 50ºC a SRB presente na coroa polimérica é libertada. Com a diminuição da temperatura, o polímero encontra-se novamente expandido xiii

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15 Índice de Tabelas Tabela 1 - Comparação entre dois sistemas de entrega de fármaco, lipossoma e nanopartícula (+: baixo; ++: moderado; +++: elevado) (adaptada de [18]) Tabela 2 - Reagentes e quantidades utilizadas na modificação da superfície das nanopartículas de sílica com agente RAFT Tabela 3 - Razão molar, quantidade de RAFT e número de monómeros por cadeia utilizado em cada polimerização Tabela 4 - Concentração da solução de PDI obtida a partir de medições de absorvância em etanol. 23 Tabela 5 - Concentração do agente RAFT na superfície das nanopartículas obtido a partir de medições de absorvância em dioxano Tabela 6 - Diâmetro médio e desvio padrão de cada amostra de MSNs, obtido por DLS e TEM Tabela 7 - Diâmetro hidrodinâmico das nanopartículas de sílica a 25º C e nanopartículas híbridas de resposta térmica em água a 25 e 40 º C, medida por DLS Tabela 8 - Potencial Zeta das amostras de MSNs com o agente RAFT (MSN-PDI-RAFT) e com polímero (MSN-POLI) Tabela 9 - Concentrações dos sobrenadantes na célula de quartzo e número de moles de SRB nos sobrenadantes Tabela 10 - Número de moles de SRB usadas na incorporação, nos sobrenadantes e que ficaram nas MSN-POLI 2a xv

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17 Abreviaturas AIBN APTES CMC CRP CTA CTAB D H DLS D TEM EDC LCST 2,2 '-azobis (2-metilpropionitrilo) 3-aminopropiltrietoxisilano Concentração micelar crítica Polimerização Radicalar Controlada Agente de Transferência de Cadeia Brometo de Cetiltrimetilamónio Diâmetro hidrodinâmico Dispersão de luz dinâmica Diâmetro obtido por microscopia de transmissão electrónica N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida Temperatura de solução crítica inferior MCM-41 Mobil Composition of Matter Number 41 MCM-48 Mobil Composition of Matter Number 48 MCM-50 Mobil Composition of Matter Number 50 MEO 2 MA MSNs NPs NaH 2 PO 4 Na 2 HPO 4 NaOH OEGMA PBS PDI PEG RAFT SDS SRB TEM 2-(2 metoxi-etoxi)etil metacrilato Nanopartículas de silíca mesoporosas Nanopartículas Fosfato monossódico Fosfato dissódico Hidróxido de sódio Oligo (Etileno glicol) metacrilato Tampão fosfato Bis(propil)trietoxisilanoperilenodiimida Poli(Etileno Glicol) Transferência Reversível de Cadeia por Adição Fragmentação Dodecil sulfato de sódio Sulforodamina B Microscópio Electrónico de Transmissão xvii

18 TEOS λexc λemi ε ZP Tetraetilortossilicato Comprimento de onda de excitação Comprimento de onda de emissão Coeficiente de absortividade molar Potencial Zeta xviii

19 1º Capítulo Introdução 1.1. Nanopartículas A natureza hidrofóbica da maioria dos agentes quimioterapêuticos torna-os pouco solúveis em água e, por conseguinte, limita a sua administração em doses elevadas. Assim, são requeridos sistemas para melhorar o transporte do fármaco e a sua entrega nas células alvo. Desta forma, obtém-se um aumento da eficácia do fármaco e uma diminuição da toxicidade nos tecidos saudáveis. Estes conceitos continuam a ser uma prioridade na terapia do cancro [1]. As nanopartículas (NPs) têm despertado bastante interesse na área de medicina devido ao facto de ser possível a resolução de vários desafios na área da nanobiotecnologia e da nanomedicina. Por exemplo, estas estruturas podem ser usadas como sistemas de entrega controlada de fármacos, pois conferem a protecção do fármaco de modo a evitar a degradação rápida nos sistemas biológicos durante as terapias [2]. Uma das aplicações mais estudadas é no tratamento do cancro numa fase inicial, para a detecção de células cancerígenas. Actualmente, o maior problema no tratamento do cancro é os tratamentos destroem não só as células cancerígenas, mas também as células saudáveis [3]. As principais características das NPs são: o tamanho, a modificação da superfície e o rácio área/volume. O tamanho das nanopartículas (1 nm nm) permite que as nanopartículas possam atravessar as barreiras biológicas de forma a alcançar os locais de destino, conseguindo assim penetrar nas células. A estabilização das NPs contra a agregação é um pré-requisito essencial na ciência de nanopartículas, para tal é necessário funcionalizar com moléculas ligantes ou cadeia poliméricas [4]. A composição das NPs determina a compatibilidade e a adaptação para diferentes aplicações, tais como entrega do fármaco, bioimagem, reconhecimento biomolecular, sensores, revestimentos. Dependendo da composição das nanopartículas, estas podem ser caracterizadas como orgânicas (agregados micelares, dendrímeros, vesículas, nanopartículas poliméricas), inorgânicas (NPs de sílica, ouro, dióxido de titânio, dióxido de ferro, quantum dots) e híbridas, com dois ou mais componentes na sua constituição, por exemplo, sílica polímero (Figura 1) [5]. Si Au NP Polímero Lipossoma Dendrímero Sílica Quantum dot Ouro Sílica e polímero NPs Orgânicas NPs Inorgânicas NPs Híbridas Figura 1 - Exemplos de nanopartículas orgânicas, inorgânicas e híbridas. 1

20 1.2. Nanopartículas de sílica As nanopartículas de sílica possuem propriedades interessantes como a força mecânica, a permeabilidade, a estabilidade térmica e química, baixo índice de refracção e elevada área superficial. NPs de sílica podem ser modificadas para promover a sua bioconjugação com diferentes moléculas. Em 1992 foram desenvolvidos, pela Mobil Oil Corporation, materiais mesoporosos de sílica com uma estrutura ordenada denominados por M41S. Estes materiais têm diâmetros na ordem dos micrómetros e possuem poros cilíndricos e uniformes com diâmetros de poro entre 2 e 30 nm e consequentemente, uma grande área superficial ( m 2 /g). Rapidamente, estas estruturas mesoporosas foram reconhecidas como uma descoberta bastante importante que poderia levar a uma grande variedade de aplicações. Para produzir estas estruturas são utilizados tensioactivos que servem de molde para criar poros. As estruturas mesoporosas que melhor representam esta classe de materiais são os MCM-41 (Mobil Crystalline Materials), com um arranjo hexagonal dos mesoporos e poros com formato cilíndrico (Figura 2 a), os MCM-48 (Figura 2 b) com um arranjo cúbico e os MCM-50 que possuem uma estrutura laminar (figura 2c) [6] [7]. Figura 2 - Estruturas mesoporosas de sílica mais comuns a) MCM-41, b)mcm-48, c)mcm-50 [6]. A redução do tamanho é bastante importante para que estes materiais mesoporosos possam ser utilizados para aplicações biomédicas como sistema de libertação de fármaco. Actualmente, é possível obter nanopartículas de sílica mesoporosas com diâmetros de 40 a centenas de nanómetros. As nanopartículas de sílica mesoporosa têm uma estrutura mesoporosa adaptável, com poros bem definidos e volume de poro superior a 1 ml / g. Essa estrutura é uma propriedade bastante importante e interessante visto que os mesoporos encontram-se especificamente alinhados e estruturados de tal maneira que aparentam a forma de favos de mel. Os canais ou poros observados funcionam como um reservatório individual sem ligações entre eles e a estrutura destes pode ser controlada pelo tensioactivo. Estas nanopartículas são biocompatíveis e a rede tridimensional com grupos silanol (Si-OH) dentro dos poros ou na superfície) e siloxano ( Si-O-Si, no interior da rede), atribuem características hidrofílicas às partículas que são estáveis tanto a nível químico como térmico, têm morfologia controlável e são simples de sintetizar. A fácil funcionalização da sílica permite que este material seja ideal para uma combinação de diagnóstico e de terapia (teragnóstico) [7] [8]. As vantagens únicas das estruturas mesoporosas de sílica são bastantes estudadas pois têm a capacidade de bioconjugação com diferentes moléculas o que possibilita o uso destas como 2

21 sistemas de entrega de fármaco [9]. As nanopartículas de sílica mesoporosa têm sido especialmente destacadas devido à capacidade de atravessar a membrana celular e à elevada eficácia na incorporação de diversos agentes terapêuticos que serão libertados controladamente no local alvo durante um período de tempo [10] [11] Síntese de nanopartículas por Sol-Gel Vários métodos de sol-gel têm sido desenvolvidos para controlar a morfologia e tamanho ( nm) das nanopartículas. Dependendo da variação de alguns parâmetros tais como ph, temperatura, solventes, catalisadores e precursores podem ser produzidas diferentes nanopartículas. O processo sol-gel tem sido bastante utilizado na preparação de materiais híbridos onde ocorre a hidrólise de um percursor do tipo alcóxido de silício numa solução aquosa de etanol que leva à formação de partículas. Os precursores de sílica mais comuns no processo sol-gel são os alcóxidos de silício, sendo o mais utilizado o tetraetilortossilicato (TEOS) (Figura 3). Os catalisadores frequentemente utilizados são o ácido clorídrico (HCl), ácido nítrico (HNO 3 ), ácido fluorídrico (HF), ácido acético (CH 3 COOH), hidróxido de sódio (NaOH) e hidróxido de amónio (NH 4 OH) [12] [13]. Figura 3 - Estrutura molecular de tetraetilortossilicato (TEOS) Método de Stöber para a síntese de nanopartículas compactas A síntese de nanopartículas de sílica foi realizada, pela primeira vez, por Stöber et al. [14], obtendo partículas de sílica esféricas e monodispersas com diâmetros entre 30 nm e 2 µm, através do controlo das quantidades dos reagentes utilizados. O método de Stöber consiste na hidrólise (Figura 4-1) e condensação (Figura 4 2 e 3) de alcóxidos de sílicio em meio básico. 3

22 Si(OCH 2 CH 3 ) H 2 O Si(OH) 4 + 4CH 3 CH 2 OH (1) Si(OCH 2 CH 3 ) 4 + Si(OH) 4+3H 2 O (OH) 3 Si-O-Si(OH) 3 +4CH 3 CH 2 OH (2) Si(OH) 4 + Si(OH) 4 (OH) 3 Si-O-Si(OH) 3 + H 2 O (3) Figura 4 - Esquema das equações de formação de nanopartículas de sílica pela hidrólise (1) e condensação (2) (3) de alcóxidos de sílicio. As nanopartículas de sílica são produzidas por hidrólise e condensação de tetraetilortosilicato (TEOS) na presença de água, hidróxido de amónio e etanol. Após a hidrólise do TEOS, a reacção prossegue com a condensação dos grupos hidroxilo (OH), que resulta na formação da rede de ligações Si-O-Si [15]. Na Figura 5, está representado um esquema das reacções envolvidas neste método de síntese. Figura 5 - Reacções de hidrólise e condensação do TEOS que ocorrem no método de Stöber. O crescente interesse em materiais híbridos gerou a necessidade da modificação química da superfície das partículas de sílica, visando melhorar as interacções intermoleculares e aumentando a biocompatibilidade. Os grupos hidroxilo na superfície das partículas de sílica podem ser facilmente modificados com compostos orgânicos ou polímeros, desde que sejam funcionalizados com agentes de acoplamento adequados Síntese de nanopartículas mesoporosas A síntese de nanopartículas de sílica mesoporosas (Mesoporous Sílica Nanoparticles, MSNs) requer um tensioactivo de forma a actuar como molde, um precursor de sílica e um catalisador. Os tensioactivos possuem uma estrutura molecular anfifílica, ou seja, são constituídos por uma parte hidrofóbica e uma parte hidrofílica. No processo de síntese, quando a concentração é superior à concentração micelar crítica (CMC), o tensioactivo forma agregados moleculares que se associam espontaneamente em solução formando uma variedade de estruturas, sendo as mais simples, a esférica e a cilíndrica (Figura 6). Essas diferentes estruturas que as moléculas apresentam não dependem só da concentração, mas também de diferentes parâmetros tais como: o comprimento das 4

23 cadeias hidrofílicas e hidrofóbicas, o ph, a temperatura. O precursor de sílica condensa nas cabeças polares que constituem as micelas e após a remoção do tensioactivo são obtidas partículas com mesoporosos disponíveis para a incorporação de moléculas. O tensioactivo pode ser removido por calcinação ou extracção ácida [16]. O tamanho dos poros é influenciado pelo tensioativo utilizado. Quanto maiores forem as estruturas formadas pelo tensioativo, maior o diâmetro das micelas e consequentemente maior o tamanho dos poros [17]. a) b) c) Figura 6 - Esquema da síntese de nanopartículas mesoporosas com tensioativo: a) agregados micelares, b) condensação do percursor de sílica, c) remoção do tensioactivo [17]. Na última década, as nanopartículas de sílica têm vindo a mostrar grande importância no desenvolvimento de novos materiais, visto que apresentam propriedades específicas como a área superficial, o volume de poros e a possibilidade de incorporar moléculas orgânicas na rede de sílica formando materiais híbridos [18] Nanopartículas Híbridas Apesar dos benefícios que as nanopartículas têm prestado à medicina, algumas aplicações continuam a ser um desafio, como por exemplo, na monitorização em tempo real dos processos celulares, principalmente o local onde se dá a libertação do fármaco. A criação de nanopartículas híbridas pode melhorar significativamente as características das NPs já existentes e superar este tipo de desafios. As nanopartículas de núcleo-coroa podem ser preparadas numa larga série de combinações diferentes, inorgânico - inorgânico, inorgânico - orgânico, orgânico -inorgânico e orgânicos-orgânico. A coroa e o núcleo podem ser compostos por sílica, metais, semicondutores ou polímeros. Exemplos de tais materiais são a sílica-au [19][20], sílica-peg [9], PEG-sílica [21]. O material inorgânico, quando utilizado como revestimento de um material orgânico, por exemplo, núcleo polimérico e coroa de sílica, é benéfico em vários aspectos, tais como o aumento da resistência do material, resistência à oxidação, estabilidade térmica e resistência à abrasão. Também metais como o ouro e a prata são utilizados para revestir o núcleo. As nanoparticulas podem ser utilizadas em diferentes áreas de biotecnologia, imunodetecção e aplicações biomédicas [22]. Os materiais híbridos com núcleo de sílica e coroa de polímero podem ser obtidos por uma simples mistura dos componentes orgânicos e inorgânicos. No entanto, a combinação de sílica e 5

24 polímero orgânico não é fácil de obter devido à incompatibilidade entre os dois componentes. Os grupos hidrofílicos (grupos silanol) presentes na superfície das NPs formam ligações de hidrogénio que conduzem à formação de agregados e na ausência de polímero os agregados de NPs de sílica permanecem intactos afectando as propriedades funcionais das partículas. O revestimento orgânico sobre o material inorgânico apresenta uma melhor biocompatibilidade e funciona como protector para impedir qualquer influência da composição do núcleo sobre a mobilidade da partícula. Uma forma de aumentar a compatibilidade entre o polímero e as NPs de sílica é a funcionalização da superfície da sílica. O uso de agentes de acoplamento não só melhora a compatibilidade entre as fases orgânicas e inorgânicas, mas também aumenta a interacção entre os componentes [23]. A incorporação de vários materiais numa estrutura oferece oportunidades para melhorar as propriedades físicas e químicas, e adquirir mais funções numa única nanoestrutura [2]. Por exemplo, corantes integrados na estrutura da sílica têm sido amplamente estudados para aplicações em bioanálise, imagem e marcação devido à elevada estabilidade, boa biocompatibilidade e baixo custo. Derivados de perilenodiimida (PDI) são exemplos de corantes que podem ser incorporados na rede de sílica [9] Modificação das nanopartículas A presença de grupos silanol na superfície das nanopartículas permite a sua modificação com grupos funcionais ou (bio)moléculas (Figura 7), tais como moléculas fluorescentes, agentes de acoplamento e biomoléculas, quer por uma ligação covalente ou por adsorção [21]. A presença de grupos reactivos (tais como amina, carboxilo ou hidroxilo) na superfície das partículas proporciona locais activos para ligar outras moléculas. A elevada área de superfície, a versatilidade em ligar-se a grupos funcionais e a biocompatibilidade faz das nanopartículas um dos nanomateriais mais estudados como sistemas de entrega de fármacos [24]. Figura 7 - Funcionalização da superfície de NPs de sílica, com diferentes grupos funcionais e (bio)moléculas (imagem adaptada de [24]). 6

25 A funcionalização das nanopartículas pode ocorrer em diferentes regiões da partícula consoante o propósito. Na superfície externa das MSNs pode-se imobilizar polímeros ou biomoléculas para possível direccionamento ou detecção. Para funcionalizar as MSNs somente na superfície externa é necessário a presença do tensiativo que permite que os poros fiquem bloqueados e não ocorra funcionalização no interior. Após a funcionalização o tensioativo poderá ser removido ficando o poro disponível para incorporar diferentes moléculas (Figura 8) [25]. Figura 8 - Introdução de grupos funcionais em diferentes regiões de MSNs: a) na superfície externa, (b) nas entradas de poros, ou (c) dentro das paredes [25]. A modificação da superfície tem como finalidade o acoplamento de um agente modificador ou realizar o enxerto de uma cadeia polimérica. O agente modificador é constituído por grupos silano e pode ser representado por RSi(OR ) 3, em que o grupo hidrolizável corresponde ao OR e o grupo R dará a nova funcionalidade à superfície da nanopartícula [26]. Um exemplo de um agente modificador é 3-aminopropiltrietoxisilano (APTES). Ao utilizar este agente modificador, a superfície da nanopartícula fica revestida de grupos amina. Na figura 9, está representada a composição inicial da superfície da NP e a estrutura da partícula após modificação da superfície com o agente modificador. Figura 9 - Esquema representativo da funcionalização da superfície um alcoxi-silano. 7

26 1.6. Polimerização Radicalar Controlada A síntese de polímeros teve um grande progresso nos últimos 15 anos com o aparecimento das técnicas de polimerização radicalar controlada (CRP). Estas técnicas atrairam muita atenção dos químicos devido ao facto de ser uma poderosa ferramenta para sintetizar polímeros com estruturas bem definidas [27]. Com esta técnica, tornou-se possível a obtenção de (co)polímeros com baixa polidispersividade e com as mais diversas morfologias. Existem três géneros principais de CRP: a Polimerização Radicalar por Transferência Atómica (atom transfer radical polymerization, ATRP), a Polimerização Mediada por Nitróxido (Nitroxide-mediated polymerization, NMP) e a Transferência Reversível de Cadeia por Adição Fragmentação (Reversible addition-fragmentation chain transfer, RAFT) [28] Polimerização RAFT A técnica de polimerização por RAFT foi introduzida pelo grupo de Rizzardo no instituto CSIRO, em 1998 [29]. A polimerização por RAFT é uma técnica versátil de polimerização radicalar controlada que permite a síntese de uma grande variedade de macromoléculas com estruturas bem definidas. O processo baseia-se numa reacção de adição-fragmentação reversível mediada por compostos com grupos tiocarbonílo usados como agentes de transferência de cadeia (Chain Transfer Agent, CTA). Este processo possui vantagens com a capacidade de controlar a polimerização de uma ampla gama de monómeros; a compatibilidade com um grande número de condições experimentais (por exemplo, em solução orgânica ou aquosa, emulsão, mini-emulsão, suspensão); e a fácil implementação. O RAFT é uma técnica de polimerização controlada que na presença de agentes de transferência de cadeia (CTA) faz com que as cadeias poliméricas cresçam de maneira similar [30]. No processo RAFT, o CTA que desactiva de forma reversível a propagação de radicais é conhecido como agente RAFT (Figura 10). Geralmente, um agente RAFT tem grupos tritiocarbonato ou ditioester, com substituintes R e Z que têm de ser seleccionadas de acordo com os monómeros a polimerizar e condições de reacção. O Z corresponde a um grupo estabilizante e R, um grupo de saída. Os grupos estabilizantes e de saída irão influenciar o grau de controle da polimerização e a cinética da reacção. A selecção do agente de transferência de cadeia é crucial nestes sistemas uma vez que a sua natureza influencia a arquitectura molecular dos polímeros [25]. Estrutura Grupo estabilizante (Z) -R Ditioéster -S-R Tritiocarbonato (tritioéster) Figura 10 Estrutura do Agente RAFT e diferentes tipos. 8

27 Para o grafting das cadeias de polímero na nanopartícula de sílica são utilizados dois métodos: grafting to e grafting from. No método grafting to as cadeias poliméricas que transportam grupos reactivos nas cadeias laterais ou terminais são acoplados de forma covalente à superfície. O método grafting from utiliza as espécies activas existentes nas superfícies de materiais para iniciar a polimerização de monómeros a partir da superfície. Este método dá origem a um revestimento polimérico com uma maior densidade de grafting [31]. Para ocorrer a polimerização em nanopartículas é necessário modificar a superfície com um agente de acoplamento. O agente de acoplamento ou agente RAFT pode ser ancorado a uma superfície inorgânica pelo grupo R ou pelo grupo Z. No caso do agente RAFT estiver ligado à superfície da partícula pelo grupo R, as cadeias poliméricas podem crescer facilmente a partir da superfície desde que haja difusão de pequenas moléculas de monómero. Se o agente RAFT estiver ligado à superfície inorgânica pelo grupo Z, a propagação vai ocorrer em solução com o controlo do agente de transferência de cadeia a partir da superfície inorgânica [32]. A figura 11 mostra como o agente RAFT pode ser estar ligado à superfície através deste dois métodos. Figura 11 Esquema representativo do agente RAFT ancorado na superfície através do grupo R e do grupo Z (imagem adaptada de [32]). As reacções em cadeia são caracterizadas por três etapas com diferentes cinéticas: iniciação, propagação e terminação. Inicialmente ocorre a decomposição do iniciador, gerando radicais. Por exemplo, o iniciador 2,2'-Azobis(2-metilpropionitrilo) (AIBN), pode ser decomposto termicamente ou por irradiação UV para a produção de radicais livres, que são moléculas que contêm átomos com electrões desemparelhados. A decomposição do iniciador AIBN está apresentada na figura 12. Figura 12 - Decomposição do iniciador 2,2'-Azobis(2-metilpropionitrilo) (AIBN). 9

28 Esta decomposição origina uma molécula de azoto e dois radicais. I 2R* Esses radicais vão reagir radicalmente com unidades de monómero, formando radicais de propagação. R*+M Pm* Os radicais gerados durante a iniciação (Pm*) reagem com o agente RAFT, ao ligar-se à dupla ligação do enxofre (1) formando assim um radicalar intermediário (2). Esse intermediário é decomposto, originando um composto tiocarbonílico polimérico (3) e há libertação do grupo ligado ao segundo enxofre, conhecido como grupo R. Esta etapa é denominada de pré-equilibrio, onde k add e k -β são as constantes de adição para a formação do radical intermediário e k -add e k β são as constantes de fragmentação do radical intermediário. O novo radical (R*), que está activo, vai reagir com outras moléculas de monómeros livres e criar um novo radical de propagação (Pn*). Ocorrendo, assim, a reiniciação. R* + M Pn* Por fim, gera-se um equilíbrio nos radicais estabelecido entre as espécies propagantes ativas (Pn* e Pm*) e os compostos dormentes (3 e 5) permitindo igual probabilidade para o crescimento de todas as cadeias poliméricas e, desta forma, a obtenção de cadeias poliméricas com estreita distribuição de massas moleculares. A cadeia propagante é desativada sem a formação de um novo centro ativo, terminando, assim, o crescimento da macromolécula. Esta etapa denomina-se de terminação. Pn* + Pm* Polímero morto 10

29 Ou seja, na presença de espécies radicalares, o CTA induz reacções de transferência de adição-fragmentação reversíveis para criar um equilíbrio entre as espécies activas (radicais de propagação) e onde as chamadas espécies dormentes podem tornar-se ativas novamente. Este equilíbrio é responsável pelo controlo da polimerização. O peso molecular é influenciado por vários parâmetros como o iniciador e o agente de transferência de cadeia. Se a quantidade de iniciador for elevada o número de radicais vai ser maior e consequentemente haverá mais cadeias polímericas em torno da nanopartícula o que leva a que M w seja menor. No caso de uma maior quantidade de CTA, obtém-se uma distribuição mais estreita do peso molecular pois as cadeia poliméricas possuem comprimento idêntico sendo que a reacção é mais controlada [33] Sistemas de libertação controlada Os sistemas de libertação controlada, frequentemente descritos como Drug Delivery Systems (DDS) possibilitam a libertação localizada do fármaco num local alvo e o controlo da taxa de libertação, reduzindo assim a toxicidade no organismo. Estes devem ser biocompatíveis, não causar quaisquer reacções imunogénicas e libertar de forma controlável o fármaco nos locais alvos, sem alterar os seus efeitos terapêuticos. Num sistema de libertação ideal, não ocorre libertação prematura do fármaco, a libertação é realizada no local alvo e o transportador contém um grande armazenamento de fármaco [18] Nanopartículas para libertação controlada No tratamento do cancro, os compostos terapêuticos necessitam de ser direccionados para o local onde estes são necessários, ou seja, apenas nas células tumorais, limitando assim os potenciais efeitos secundários. No entanto, as moléculas são administradas sistematicamente e por sua vez, são distribuídas pelo organismo através da circulação sanguínea e sujeitas à hidrólise, à degradação enzimática e excreção rápida. Com um sistema baseado em nanopartículas pode-se melhorar a biodistribuição, aumentar o tempo de circulação, e proteger o fármaco a partir do microambiente, aumentando assim a eficácia e reduzindo os efeitos colaterais [34]. Diferentes nanopartículas podem ser utilizadas para a entrega do fármaco, sendo que, cada uma tem as suas características e propriedades, vantagens e desvantagens. É evidente que o potencial de interacção com células e tecidos e a toxicidade depende muito da composição das nanopartículas. Os DDS apresentados na Figura 13 têm diferentes propriedades físico-químicas que os tornam apropriados para diferentes fármacos e diferentes aplicações. 11

30 Sistema de entrega de fármaco Estrutura Propriedades / Características Lipossomas Dendrímeros Nanotubos de carbono Nanopartículas de ouro Nanopartículas de dióxido de titânio Nanopartículas de óxido de ferro Nanopartículas de sílica Forma vesículas com núcleo aquoso Encapsulação de fármaco ocorre no núcleo ou na bicamada lipídica Núcleo bem definido Incorpora biomoléculas através de interacções electroestáticas e hidrofóbicas Nanoestrutura cilíndrica Nanotubo de parede única ou múltiplas paredes Fotossensíveis Utilizadas como núcleo Nanopartículas superparamagnéticas Necessita de estímulo para libertar biomoléculas Estrutura nanotubular Terapia fotodinâmica Estrutura mesoporosa Multifuncionais Figura 13 - Diferentes tipos de sistemas de entrega de fármacos (adaptada de [17]). O sistema nervoso central, um dos microambientes mais delicados do corpo, é protegido pela barreira hematoencefálica (Blood Brain Barrier, BBB) que regula a homeostasia. A BBB é uma estrutura altamente complexa, que regula o movimento de iões e moléculas a partir do sangue para o cérebro, protegendo o cérebro de lesões e doenças. No entanto, a BBB também impede, significativamente, a distribuição de fármacos no cérebro assim, prevenir a terapia de uma série de distúrbios neurológicos (como Alzheimer e Parkinson) torna-se um desafio. Como consequência, várias estratégias estão actualmente a ser estudadas para melhorar a administração de fármacos através da BBB. A possibilidade de utilizar NPs para a entrega de fármacos no cérebro têm sido extensivamente descrita. A sua capacidade de incorporar fármacos hidrofílicos ou hidrofóbicos e a capacidade de serem administradas através de diferentes vias (como por exemplo, por inalação ou via oral) faz com que as NPs sejam ainda mais atractivas [35] Sistemas moleculares de libertação controlada Os lipossomas são sistemas de entrega de fármaco bastante populares na terapia do cancro devido à sua elevada biocompatibilidade. Os lipossomas possuem uma estrutura esférica composta por uma ou várias bicamadas lipídicas e têm a capacidade de se organizar espontaneamente 12

31 consoante o meio em que se encontram. Isto deve-se ao facto de serem moléculas anfifílicas (cabeça hidrofílica e cauda hidrofóbica). O encapsulamento do fármaco ocorre no interior da dupla camada lipídica ou no núcleo aquoso. Outros DDS muito utilizados são também as nanopartículas de ouro, as nanopartículas de dióxido de titânio e as nanopartículas de óxido de ferro. Contudo existem DDS que possuem melhores características consoante a tarefa a desempenhar. Ao comparar uma nanopartícula com um lipossoma, esta possui mais vantagens relativamente ao tamanho, à encapsulação do fármaco, à libertação controlada e ao custo. Na Tabela 1 pode observar-se a comparação entre os dois DDS mencionados [36]. Tabela 1 - Comparação entre dois sistemas de entrega de fármaco, lipossoma e nanopartícula (+: baixo; ++: moderado; +++: elevado) (adaptada de [17]). Nanosistema Tamanho menor Quantidade de fármaco Libertação sustentada Alvo Estabilidade in vivo Biocompatibilidade Lipossoma Baixo custo Nanopartícula Sistemas poliméricos de libertação controlada Alguns polímeros são sensíveis a estímulos. Esses estímulos são geralmente classificados em três categorias: físicos (luz, temperatura, ultra-sons), químicos (solvente, redox, ph) ou biológicos (enzimas, glucose, receptores). Os estímulos físicos normalmente estão associados à dinâmica da cadeia, enquanto os químicos baseiam-se nas interacções moleculares, quer entre o polímero e as moléculas de solvente, quer entre cadeias de polímero; os biológicos referem-se ao funcionamento das moléculas como as reacções enzimáticas onde, por exemplo, as enzimas hidrolíticas (glicosidases) são utilizadas para degradar o polímero. Contudo há polímeros que possuem a capacidade de responder a dois ou mais estímulos em simultâneo [37]. Os polímeros que respondem a estímulos podem eventualmente modificar o tamanho da cadeia, a estrutura secundária, a solubilidade e também o grau de associação intermolecular. Na generalidade, estas alterações são provocadas pela formação ou a destruição de ligações de hidrogénio, interacções electroestáticas ou equilíbrios ácido-base [38]. Uma característica importante deste tipo de material é a reversibilidade da transformação. É importante reter que existe uma grande diversidade de polímeros que possuem resposta a estímulos, contudo essa diversidade é dramaticamente reduzida quando estes se destinam a aplicações médicas devido às restrições biológicas existentes e à falta de biocompatibilidade. Os polímeros termossensíveis têm atraído grande atenção em aplicações de bioengenharia e biotecnologia. Estes polímeros têm a capacidade de responder a uma mudança de temperatura, uma propriedade que os torna materiais úteis numa ampla gama de aplicações e, consequentemente atrai muito interesse científico. Os polímeros termossensíveis são caracterizados por um ponto crítico onde ocorre uma transição de fase. Esse ponto é denominado de temperatura de solução crítica inferior (Lower Critical Solution Temperature, LCST) onde as cadeias poliméricas sofrem contracção com o aumento da 13

32 temperatura acima do ponto crítico ou temperatura de solução critica superior (Upper Critical Solution Temperature, UCST) onde as cadeias poliméricas sofrem contracção ao ser arrefecido abaixo dessa temperatura [33]. No ponto crítico, as interacções hidrofílicas e hidrofóbicas entre as cadeias poliméricas e o meio aquoso alteram-se rapidamente com a mudança da temperatura. A temperaturas inferiores à temperatura crítica, onde existe apenas uma fase, as ligações de hidrogénio formadas entre os segmentos hidrofílicos da rede polimérica e as moléculas de água são as interacções dominantes, favorecendo assim a sua expansão. Com o aumento da temperatura acima da temperatura crítica, as interacções entre os segmentos tornam-se mais fortes, e assim as ligações de hidrogénio tornam-se desfavorecidas. Isso leva a uma contracção do polímero, resultando num estado onde as interacções polímero-polímero e solvente-solvente são preferenciais. Os polímeros mais comuns com propriedades termossensíveis são: a poli(nisopropilacrilamida) (PNIPAAm), com LCST cerca de 32 C, (uma temperatura muito útil para aplicações biomédicas, uma vez que é próxima da temperatura corporal (37 C)), e o poli(etileno glicol) (PEG), também denominado poli(óxido de etileno) (PEO) [39]. Os derivados de PEG como Oligo(Etilenoglicol)metacrilato (OEGMA) ou 2-(2 metoxi-etoxi)etil metacrilato (MEO 2 MA) ganharam atenção dos investigadores, por possuírem propriedades químicas desejáveis, como a biocompatibilidade, que as tornam especialmente úteis para aplicações biológicas e farmacêuticas. Lutz et al. [40] avaliaram a influência do tamanho da cadeia lateral de PEG na LCST e observaram que há um aumento da LCST com o aumento da cadeia lateral de PEG. A LCST do copolímero P(MEO 2 -MA-co-OEGMA) pode ser prevista a partir da fracção molar de OEGMA (F OEGMA ) através da equação 1. LCST= ,04 F OEGMA (1) A composição molar do copolímero (ver figura 18) foi de 8% de OEGMA e 92% de MEO 2 MA, o que significa que em 100 monómeros, 8 correspondem a monómeros de OEGMA. Assim, a LCST prevista para o polímero sintetizado é aproximadamente 37 ºC. No corpo humano existe diferentes níveis de ph, por exemplo, a saliva tem um ph neutro, contudo o ph ao longo do trato gastrointestinal sofre alterações, no estômago está entre de 1 e 3 e no intestino delgado entre 5 e 8. Já os tecidos tumorais encontram-se um ph de 6,75, o que diferencia dos tecidos normais com ph 7,23. Com base nestas variações de ph, têm sido desenvolvidas diversas nanopartículas sensíveis ao ph, para a entrega de fármacos, genes e proteínas. Os polímeros sensíveis ao ph possuem grupos ionizáveis (grupos carboxilo ou amina) que podem aceitar ou doar protões em resposta a mudanças do ph do meio ambiente onde se encontram. Estes polímeros são por exemplo, poliacrilamida, poli (ácido acrílico) e poli(vinil piridina). Num meio ácido, polímeros com grupos funcionais ácidos retém o fármaco e num meio alcalino o fármaco é libertado [41]. 14

33 2º Capítulo - Nanopartículas desenvolvidas neste trabalho O principal objectivo deste trabalho consiste em desenvolver nanopartículas hibrídas de sílica mesoporosa com um núcleo de sílica nanoestruturado e uma coroa polimérica biocompatível com resposta a alterações de temperatura. Utilizaram-se polímeros PEG-acrilatos (MEO 2 MA e OEGMA) que apresentam uma LCST de 37ºC, proporcionando o colapso ou a expansão da cadeia polimérica consoante a temperatura aplicada. Quando a temperatura é elevada as cadeias poliméricas colapsam em torno da partícula e a temperaturas inferiores à LCST as cadeias encontram-se extendidas. Este mecanismo proporciona a abertura e fecho dos poros o que permite utilizar as MSNs como nanocontentores para a libertação controlada do fármaco. Uma sonda fluorescente foi incorporada nas MSNs híbridas com o intuito de estudar a libertação controlada in vitro utilizando técnicas de fluorescência. De forma a compreender todo o trabalho realizado na preparação de nanopartículas de sílica mesoporosas híbridas, foram esquematizados todos os passos laboratoriais envolvidos (Figura 14). As MSNs foram sintetizadas através da hidrólise e condensação do tetraetoxisilano (TEOS). Na síntese, adicionou-se um corante derivado do perilenodiimida (PDI) que foi incorporado na rede de sílica obtendo partículas fluorescentes. Após a síntese das partículas de sílica, realizou-se a modificação química da superfície com 3-aminopropiltrietoxisilano (APTES) e posteriormente foi removido o tensioativo permitindo que os mesoporos fiquem disponíveis para a difusão do solvente e incorporação de moléculas. Em seguida, foi imobilizado o agente RAFT na superfície das MSNs, com o grupo carboxílico do agente RAFT a reagir com o grupo amina da superfície das nanopartículas imobilizando o agente RAFT. O agente RAFT permite o controlo do peso das cadeias de polímero e consequentemente, a espessura da coroa polimérica. A polimerização RAFT associada ao método grafting from foi utilizada para o crescimento do revestimento polimérico. É sintetizado um copolímero termossensivel utilizando os monómeros 2 (2'-metoxietoxi) etil-metacrilato (MEO 2 MA) e oligo (etilenoglicol) metacrilato (OEGMA). Os polímeros à base de PEG têm uma boa solubilidade em água e solventes orgânicos, não são tóxicos nem imunogénicos e impedem a adsorção não específica de proteínas e adesão celular [42][43]. 15

34 Figura 14 - Processos envolvidos na preparação das nanopartículas híbridas. Espera-se que a combinação das MSNs com o polímero termossensível possa trazer uma grande contribuição nos estudos de libertação controlada de fármacos, uma vez que os poros das nanopartículas de sílica se encontram disponíveis para a incorporação de moléculas e a sua libertação é controlada pelo comportamento que o polímero apresenta com a alteração da temperatura. Pretende-se que o polímero termo sensível colapse com o aumento da temperatura e expanda quando sujeito a temperaturas mais baixas (Figura 15). Figura 15 - Comportamento esperado do polímero termossensível quando é aplicada temperatura. Foram utilizadas as técnicas de Microscopia Eletrónica de Transmissão (TEM) e Dispersão de Luz Dinâmica (DLS) para a caracterização das nanopartículas em termo de dimensão e polidispersidade. Também foram realizadas medidas da fluorescência e absorção das diferentes amostras. Para o estudo da libertação das moléculas da sulforodamina B incorporadas nas MSNs foram realizadas cinéticas para verificar a utilização destas partículas como sistema de libertação controlada de fármacos. 16

35 3º Capítulo Parte Experimental 3.1. Materiais O etanol absoluto (EtOH, 99,9% Scharlau), o tetraetoxisilano (TEOS, 98% Aldrich), o brometo de cetiltrimetilamónio (CTAB, 99% Sigma) e a solução de hidróxido de amónio (NH 4 OH, 25% Fluka) foram utilizados sem qualquer purificação na síntese das nanopartículas de sílica mesoporosas. O corante incorporado nas MSNs, bis(propil)trietoxisilanoperilenodiimida (PDI), foi sintetizado pelo grupo de acordo coma literatura [44]. A superfície das nanopartículas foi modificada com (3-aminopropil)trietoxisilano (APTES, 98% Sigma-Aldrich) em tolueno seco (tolueno comercial seco com hidreto de cálcio e destilado). Para a remoção do tensioactivo utilizou-se uma solução de 0,5M de ácido clorídrico (HCl, 37% Panreac) em etanol absoluto. O acoplamento do agente RAFT foi feito utilizando N-(3-dimetillaminopropil)-N - etilcarbodiimida (EDC,98% Sigma-Aldrich) em diclorometano comercial e destilado e 3- (benzylsulfanylthiocarbonylsulfanyl) propionicacid como agente RAFT, sintetizado pelo grupo como descrito na literatura [45]. Os monómeros utilizados na polimerização foram oligo(etileno glicol) metacrilato (OEGMA, 98% Sigma-Aldrich), 2-(2-metil ethoxy)etilmetacrilato (MEO 2 MA, 95% Sigma-Aldrich), como iniciador utilizou-se 2,2'-Azobis(2-metilpropionitrilo) (AIBN, 99% Sigma-Aldrich), todos sem qualquer purificação. Na preparação das amostras para medir o diâmetro hidrodinâmico e o potencial Zeta foram utilizadas seringas de plástico de 3mL da B-BRAUN e água purificada por um sistema MilliporeMilli-Q 18 MΩcm. Para a medição do diâmetro hidrodinâmico, as amostras foram preparadas com dodecil sulfato de sódio (SDS, 99% Fluka) e filtradas com filtros de celulose 0,45 μm. Para medir o potencial zeta utilizaram-se células DTS1070. Para preparar o tampão fosfato foi utilizado fosfato monossódico (NaH 2 PO 4, 98% Panreac), fosfato disódico (Na2HPO4, 99 % Riedel-de-Haën) e hidróxido de sódio (NaOH, 98% Sigma-Aldrich). No estudo da libertação com as nanopartículas híbridas foi utilizada sulforodamina B (SRB, Molecular probes), um tampão fosfato com ph aproximado de 7 e dispositivos de diálise de polipropileno com uma membrana de celulose (Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices, 10K MWCO) Métodos Síntese de nanopartículas de sílica mesoporosas (MSNs) As MSNs foram sintetizadas pelo método sol-gel. Num frasco de polipropileno dissolveram-se 0,113 g de CTAB em 58,7 ml de uma solução aquosa de NH 4 OH (0.5 M) a 50ºC. Após o CTAB estar dissolvido, adicionaram-se 2,5 ml de uma solução de TEOS (0,2 M em etanol) e 9,7 ml de etanol 17

36 absoluto. A adição da solução de TEOS e de etanol foi efectuada gota a gota e a mistura manteve-se em agitação a 50ºC durante 5 horas. Ao fim desse tempo, as mesmas quantidades foram novamente adicionadas à mistura reaccional e esta foi mantida por mais 1h nas mesmas condições. Por fim, a dispersão foi colocada na estufa a 50ºC durante 24 horas. A dispersão foi centrifugada a g durante 20 minutos e dispersada duas vezes numa solução de etanol e água (50% V/V) e três vezes em etanol destilado. As nanopartículas foram secas na estufa a 50 C [46] Nanopartículas de sílica mesoporosas marcadas com PDI (MSN-PDI) Para as nanopartículas marcadasz com PDI, preparou-se previamente uma solução de PDI em etanol (6 mg de PDI em 15 ml de etanol absoluto). A solução foi colocada nos ultra-sons de forma a dissolver o PDI e posteriormente mediu-se a absorvância para determinar a concentração. A síntese das MSNs foi realizada da mesma forma como descrita anteriormente contudo, após a adição da solução de TEOS (0,2 M em etanol) adicionou-se 0,5 ml da solução de PDI e 9,2mL de etanol absoluto. Foi preparada uma solução de PDI diferente para cada síntese Funcionalização da superfície das MSNs com APTES (MSN-PDI-APTES) Para modificar a superfície com APTES, as MSNs foram dispersas em tolueno seco e levadas a ultra-sons durante 10 min. O APTES foi adicionado à dispersão e a mistura foi aquecida a 125º C e deixada sob refluxo durante 24 horas, sob atmosfera de árgon. Por fim, as nanopartículas foram centrifugadas em três ciclos (19118 g, 20 min) e redispersas em etanol absoluto. No último ciclo retirou-se o sobrenadante e colocou-se as partículas a secar na estufa a 50ºC. O rácio da mistura reaccional utilizado foi 0,2 g MSNs: 10 ml tolueno: 0,468 ml APTES [9]. A reacção está representada na Figura 16. Figura 16 - Esquema representativo do processo de modificação da superfície das MSNs com APTES Remoção do tensioativo Para remover o tensioativo, as partículas lavadas e secas foram colocadas num frasco de polipropileno juntamente com uma solução de HCl 0,5 M em etanol. A mistura foi mantida durante 2 horas, em agitação, a 40 ºC. Por cada 500 mg de MSNs foram utilizados 20 ml da solução de HCl. 18

37 As nanopartículas foram centrifugadas três vezes com etanol (19118 g, 10 min) e posteriormente secas a 50ºC [9] Adição do agente RAFT (CTA) O último passo antes da polimerização na superfície das MSNs foi a ligação do agente RAFT, pelo grupo R, na superfície das nanopartículas de sílica. Essa ligação ocorre devido à presença dos grupos amina na superfície das partículas. Num tubo de schlenk foram introduzidas as MSNs funcionalizadas com APTES e o agente RAFT. O EDC foi pesado num frasco e adicionou-se diclorometano seco. De seguida, transferiu-se a mistura para o tubo de schlenk onde a reacção prosseguiu durante 24 horas com agitação e sob atmosfera de árgon à temperatura ambiente. Finalmente, as MSNs foram centrifugadas três vezes em etanol (19118 g, 20 min) e secas a 50ºC na estufa. Para efeito de cálculo, admitiu-se que a concentração de APTES é de 0,04 mmol/g de sílica conforme a literatura.[9] A reacção está representada na figura 17. Figura 17 - Representação esquemática da reacção das MSN-APTES com o agente RAFT. Na tabela 2, estão apresentadas as quantidades de partículas de cada amostra, após remoção do tensioativo, utilizadas neste processo e as respectivas quantidades dos reagentes. Tabela 2 - Reagentes e quantidades utilizadas na modificação da superfície das nanopartículas de sílica com agente RAFT. Amostra MSN EDC Agente RAFT CH 2 Cl 2 (mg) (mg) (mg) (ml) MSNs 2a 36,8 2,8 4,0 0,736 MSNs 3a 70,0 5,2 7,6 1,400 MSNs 3b 49,5 3,7 5,4 0,992 MSNs 5b 41,4 3,1 4,5 0,828 MSNs 7a 29,0 2,2 3,2 0,580 MSNs 7b 49,7 3,7 5,4 0,994 19

38 Polimerização por RAFT (MSN-POLI) A polimerização por RAFT foi realizada para sintetizar um copolímero formado por uma mistura de dois PEG-acrilatos. Os monómeros utilizados são o oligo (etileno glicol) metacrilato (OEGMA) e o 2-(2 Metoxi-Etoxi)etilmetacrilato (MEO 2- MA). Num tubo de schlenk equipado com um agitador magnético pesaram-se os monómeros (MEO 2- MA e OEGMA) as MSNs e adicionou-se etanol à mistura reaccional. A mistura foi colocada durante 30 minutos nos ultra-sons. Num balão volumétrico de 10 ml pesou-se o AIBN e perfez-se o balão volumétrico com etanol. Ambas as soluções foram colocadas 45 minutos em agitação, a temperatura ambiente sob atmosfera de árgon. Ao fim desse tempo, o tubo de schlenk foi colocado num banho de óleo a 70ºC e adicionaram-se 30 μl da solução de AIBN. A mistura reacional foi mantida em atmosfera inerte durante 24 horas, ao abrir e expor o conteúdo ao ar a reacção de polimerização termina. No final da polimerização, as nanopartículas foram lavadas e redispersas três vezes em etanol (8497 g, 10 min). A estrutura molecular dos monómeros escolhidos para a polimerização das partículas encontra-se na figura 18. Figura 18 - Estrutura molecular dos monómeros oligo (etileno glicol) metacrilato (OEGMA) e 2-(2-metil ethoxi) etilmetacrilato (MEO 2-MA). A quantidade de RAFT presente, a razão molar iniciador/cta e o número de monómeros por cadeia para cada polimerização estão descritos na Tabela 3. Tabela 3 - Razão molar, quantidade de RAFT e número de monómeros por cadeia utilizado em cada polimerização. Amostra Quantidade RAFT Razão molar Número de monómeros (mmol/g) [Iniciador]/[CTA] esperados por cadeia MSNs 2a 0,064 1/ MSNs 3a 0,056 1/5 140 MSNs 3b 0,052 1/5 140 MSNs 5b 0,061 1/ MSNs 7a 0,050 1/ MSNs 7b 0,045 1/

39 Incorporação e libertação nas MSN-POLI Uma solução de tampão fosfato foi preparada pesando 6,58 g de fosfato monossódico (NaH2PO4) e 7,42 g de fosfato dissódico (Na2HPO4) para um frasco de polipropileno. A mistura foi dissolvida em 93 ml de água. O ph do tampão fosfato foi medido e acertado para um ph próximo de 7 com uma solução de NaOH (10M). Preparou-se uma solução de sulforodamina B (SRB) em tampão fosfato (PBS) (1, M) e foram realizadas duas cinéticas a 20 e a 50ºC de forma a obter as intensidades de fluorescência da SRB durante 4 horas. Colocaram-se 200 μl da solução no tubo de diálise e 3,5 ml PBS numa célula com agitador. Foi realizada também uma cinética com alteração de temperatura de 20 em 20 minutos, com início a 50ºC e com 4 horas de duração. Para a incorporação de sulforodamina B nas nanopartículas híbridas (MSN-SRB) foi preparada uma solução de SRB em tampão fosfato ph 7 (4, M). Primeiro, as MSN-POLI (3 mg, que foram secas na estufa a 50ºC) foram adicionadas a 3 ml da solução de SRB e a mistura ficou a agitar durante a noite a 20ºC. Alterou-se a temperatura para 50ºC e ao fim de 3 horas retirou-se 1 ml dessa dispersão. Centrifugou-se (10 min, 8497 g, 40 ºC) três vezes e redispersaram-se as MSNs em PBS, de forma a remover a SRB que não foi incorporada. Os sobrenadantes foram guardados para quantificar a SRB que se não incorporou nas MSN-POLI. A quantidade de SRB incorporada nas MSN-POLI foi calculada a partir da diferença entre a concentração da solução inicial de SRB usada na incorporação e a concentração dos sobrenadantes após a centrifugação. Para a experiência de libertação, 200 μl da dispersão com MSN-POLI e SRB, foram colocados num tubo de diálise e numa célula foram introduzidos 3,5 ml de PBS e um agitador magnético. Foi realizada uma cinética com alteração de temperatura de 20 em 20 minutos entre 20ºC e 50ºC com início a 50ºC durante 4 horas Equipamento Centrífuga A centrífuga Sigma 2K15, rotor 12141,foi utilizada para as lavagens das MSNs. Esta atinge uma velocidade máxima de 15300rpm e força gravitacional de g. Os tubos utilizados foram de polipropileno com capacidade de 10 ml. No final de cada processo de modificação das MSNs foram retiradas amostras para eppendorfs de 1,5mL para medir o potencial zeta e o diâmetro hidrodinâmico. Nas lavagens dessas amostras foi utilizada a centrífuga Hitachi himac CT 15RE Dispersão de luz dinâmica Para obter o tamanho das partículas foi utilizado o Zetasizer Nano ZS, model ZEN3600, com o detector a 173º e 90º. Este sistema determina o tamanho das partículas através do movimento Browniano baseando-se na dispersão de luz dinâmica (DLS). Uma característica importante do 21

40 movimento Browniano é que pequenas partículas movem-se rapidamente num líquido e partículas grandes movem-se lentamente. Isto deve-se ao facto do coeficiente de difusão relacionar-se com o raio das partículas pela equação de Stokes-Einstein. As flutuações da intensidade de luz espalhada são convertidas em pulso eléctricos, que são alimentados por um correlacionador digital. Este gera uma função de autocorrelação a partir do qual se relaciona o coeficiente de difusão das partículas com o tamanho. As funções de autocorrelação são analisadas pelo método CONTIN para determinar o diâmetro hidrodinâmico das nanopartículas (D h ) Microscopia electrónica de transmissão Com a microscopia electrónica de transmissão (TEM) é possível observar os poros das MSNs e determinar o diâmetro das partículas. Utilizou-se um microscópio da marca Hitachi, modelo H-8100, com filamento LaB6 e uma tensão de aceleração de 200 kv. As amostras analisadas foram preparadas colocando uma gota da amostra, em água ou etanol, em grelhas de cobre. Após a secagem ao ar, as grelhas de cobre foram transferidas, com uma pinça, para o suporte e inseridas no microscópio. Este aparelho está equipado com uma câmara KeenView da Soft Imaging System que utiliza o programa item para adquirir as imagens Potencial Zeta O potencial Zeta é a diferença do potencial entre o meio de dispersão e a camada estacionária do fluido ligada à partícula dispersada. Para caracterizar as cargas superficiais das nanopartículas mediram-se os potencias Zeta (ξ) de diferentes amostras. Os valores do potencial zeta foram obtidos utilizando medidas de mobilidade electroforética realizadas num Zetasizer Nano ZS, model ZEN3600 (Malvern Instruments). O potencial zeta é calculado automaticamente a partir da mobilidade electroforética baseada na equação de Smoluchowski [47]. Como solvente foi utilizada água milipore e as medições foram efectuadas a 25º C Espectroscopia de fluorescência Os espectros de emissão e excitação foram obtidos no Horiba-JobinYvon Fluorolog-3 spectrofluorimeter, em modo Right Angle e as medidas foram efectuadas em células de Quartzo com dimensões de 1cm x 1cm à temperatura ambiente Espectroscopia UV/Vis Os espectros de absorvância foram registados num espectrofotómetro Jasco V-660. Todos os espectros obtidos foram realizados à temperatura ambiente e utilizando células de Quartzo com dimensões de 1cm x 1cm. 22

41 Absorvância 4º Capítulo- Apresentação e discussão dos resultados 4.1. Caracterização óptica das partículas A solução de PDI usada na síntese de nanopartículas fluorescentes foi preparada em etanol. A concentração da solução foi obtida medindo a absorvância e usando a Lei de Lambert-Beer. A=εbc (2) Onde ε corresponde ao coeficiente de absortividade molar para o PDI usado em etanol (ε= M - 1 cm -1 )[48], b é a espessura da célula (b=1cm) e c indica a concentração. Na figura 19 encontra-se o espectro de absorvância da solução de PDI utilizada na síntese das amostras MSN 3a e 3b. Os espectros de absorvância das soluções de PDI preparadas para as sínteses MSN 2 e MSN 7 encontram-se no anexo 1. 0,1 0,08 0,06 0,04 0, Comprimento de onda (nm) Figura 19 - Espectro de absorção da solução de PDI em etanol utilizadas nas sínteses MSN-PDI 3a e 3b. Na Tabela 4 estão apresentados os valores de absorvância a 521 nm para cada solução de PDI e as respectivas concentrações. Tabela 4 - Concentração da solução de PDI obtida a partir de medições de absorvância em etanol. Amostra Abs PDI λ=521nm C (mol/l) MSNs 2a MSNs MSNs

42 Intensidade (u.a) As medidas de fluorescência para obter os espectros de emissão e excitação das nanopartículas de sílica com PDI foram realizadas com dispersões limpas, (ou seja, depois de centrifugadas), com iluminação em ângulo recto, em células de plástico. As medidas da solução de PDI em etanol foram feitas numa célula de quartzo também com iluminação em ângulo recto. Os espectros normalizados de emissão e excitação do PDI e da dispersão de nanopartículas com PDI, em etanol, são apresentados na Figura 20. Comparando estes espectros, observou-se que as formas dos espectros de fluorescência para as nanopartículas MSN-PDI 7a são muito semelhantes aos espectros do PDI em solução, podendo assim concluir que as moléculas de PDI não sofreram alterações quando incorporadas nas nanopartículas de sílica. 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0, Comprimento de onda (nm) Figura 20 - Comparação dos espectros normalizados de excitação (a tracejado, λemi=560 nm) e emissão (linhas continuas, λexc=500 nm) para o PDI em etanol (vermelho) e MSN-PDI 7a (azul) Determinação da concentração do agente RAFT por UV/Vis De forma a calcular a concentração do agente RAFT na superfície das MSNs, foram obtidas espectros de absorvância das partículas com NH 2 e com o agente RAFT na superfície, em dioxano. Na figura 21 encontra-se o espectro de absorvância correspondente à amostra MSNs 2a. Seguiu-se o mesmo procedimento para as restantes amostras. 24

43 Absorvância 3 2,5 2 1,5 1 0, Comprimento de onda (nm) Figura 21 - Espectro de absorção do agente RAFT (a verde) e das MSNs com NH 2 na superfície (a cinzento) da amostra MSNs 2a, em dioxano. As concentrações de agente RAFT (Tabela 5) foram obtidas medindo a absorvância e aplicando a Lei de Lambert-Beer (eq.1), conhecendo o coeficiente de absortividade molar do agente RAFT em dioxano (ε=13975 M -1 cm -1 ) [48] e a espessura da célula (b=1cm). A absorvância utilizada para determinar a concentração do agente RAFT foi corrigida subtraindo o valor de absorvância máxima do espectro do agente RAFT ao valor de absorvância correspondente ao mesmo comprimento de onda para o espectro de MSNs com NH 2. A concentração do agente RAFT na superfície é bastante importante para a etapa da polimerização pois, a quantidade de iniciador a utilizar é definida pela razão [iniciador]/[cta]. O iniciador, ou seja, o AIBN tem influência no tamanho das cadeias de polímero. Quanto maior a quantidade de AIBN, mais radicais são gerados para reagirem com os monómeros, logo existe menos monómeros por cadeia e como consequência o peso molecular é menor. A concentração de iniciador é normalmente dez vezes menor do que a concentração do agente RAFT. O dioxano foi escolhido como solvente uma vez que o seu índice de refracção (RI) é semelhante ao RI das nanopartículas de sílica. Tabela 5 - Concentração do agente RAFT na superfície das nanopartículas obtido a partir de medições de absorvância em dioxano. Amostra Abs MSN-RAFT Abs.corrigida Conc.(mmol/L) mmol RAFT/g partículas MSNs 2a 2,812 1,480 0,106 0,064 MSNs 3a 2,981 1,304 0,093 0,056 MSNs 3b 2,886 1,208 0,086 0,052 MSNs 5b 2,848 1,415 0,101 0,061 MSNs 7a 2,704 1,159 0,083 0,050 MSNs 7b 2,743 1,052 0,075 0,045 A partir da concentração do agente RAFT e sabendo a massa das MSNs (0,005 g) e o volume de dioxano (0,003 L) utilizado, calculou-se a quantidade de RAFT por grama de partículas. 25

44 4.3.Caracterização das MSNs Os diâmetros das nanopartículas de sílica mesoporosas foram medidos usando DLS e TEM, assim como as nanopartículas hibrídas compostas por um núcleo de sílica mesoporosa e uma coroa polimérica Nanopartículas de sílica mesoporosas As dispersões de nanopartículas em água foram medidas por DLS a temperatura controlada de 20ºC e por TEM de forma a obter os diâmetros das nanopartículas de sílica. A Tabela 6 apresenta as médias dos diâmetros das partículas e desvios-padrão por DLS e TEM e a figura correspondente de cada amostra. Através da determinação dos diâmetros das nanopartículas de sílica por TEM e DLS pode-se observar que o diâmetro por DLS é maior que o observado por TEM, indicando a tendência das mesmas para agregar em dispersão, sabendo contudo que o diâmetro por DLS é normalmente superior ao do TEM devido à existência de uma camada de hidratação em torno da partícula, enquanto no TEM a amostra encontra-se seca numa grelha. Tabela 6 - Diâmetro médio e desvio padrão de cada amostra de MSNs, obtido por DLS e TEM. Amostra D h (nm) D TEM (nm) Figura MSN-PDI 2a 210±7 150±32 22 (A) MSN-PDI 3a 220±5 160±35 22 (B) MSN-PDI 3b 180±14 170±27 22 (C) MSN-PDI 5b 170±2 160±34 23 (A) MSN-PDI 7a 160±2 140±38 23 (B) MSN-PDI 7b 170±10 160±44 23 (C) Para determinação do diâmetro hidrodinamico médio das partículas, efectuaram-se três medições para cada amostra e no TEM foram quantificadas, aproximadamente, cinquenta partículas. A caracterização das nanopartículas por TEM permitiu obter a distribuição de diâmetros por análise das imagens recorrendo ao software Fiji (Anexo 3). As figuras 22 e 23 mostram as imagens obtidas por TEM e as respectivas distribuições de diâmetros de cada amostra, tendo-se desprezado os agregados, para o cálculo dos diâmetros. 26

45 Figura 22 Imagens obtidas por TEM de nanopartículas de sílica (à esquerda) das sínteses MSN-2a ( A, escala 1000nm), MSN-3a (B, escala 500nm), MSN-3b (C, escala 200nm) e respectivo histograma da distribuição dos diâmetros (à direita). 27

46 Figura 23 - Imagens obtidas por TEM de nanopartículas de sílica (à esquerda) das sínteses MSN-5b (A, escala 1000nm), MSN-7a (B, escala 500nm), MSN-7b (C, escala 200nm) e respectivo histograma da distribuição dos diâmetros (à direita). Através das imagens obtidas por TEM ainda foi possível verificar a porosidade das partículas de sílica visualizando pequenos pontos no seu interior, contudo em algumas imagens de TEM não é possível observar os poros com boa definição devido à orientação destes. Na figura 24 encontra-se uma imagem ampliada de uma partícula correspondente à síntese MSNs 3b onde se observam os mesoporos. 28

47 Figura 24 - Imagem obtida por TEM da amostra MSNs 3b (200nm) ampliada para uma escala de 100nm Nanopartículas de sílica mesoporosas com revestimento polimérico Ao realizar o DLS das partículas MSN-POLI observou-se que a modificação da superfície das nanopartículas com PEG permitiu prevenir a agregação destas tornando-se mais fácil a obtenção dos diâmetros comparativamente às partículas de sílica MSN-PDI. Os diâmetros hidrodinâmicos médios a 25 e 40ºC das partículas MSN-POLI determinados por DLS para cada amostra, encontram-se na Tabela 7. Verificou-se que houve um aumento dos diâmetros a 25º C quando comparados com as MSN-PDI, o que comprova a existência de uma coroa polimérica. Com o aumento da temperatura para 40º C verificou-se uma diminuição dos diâmetros relativamente aos diâmetros a 25ºC, o que indica que a baixas temperaturas o polímero se encontra expandido e a temperatura elevada o polímero colapsa [6]. O diâmetro hidrodinâmico das MSN-POLI a 40ºC é, em algumas amostras, inferior ao diâmetro hidrodinâmico das MSN-PDI, visto que as nanopartículas de sílica (MSN-PDI) têm mais tendência para agregarem do que as nanopartículas de sílica com coroa polimérica (MSN-POLI) que são mais estáveis e por isso estão melhor dispersas. Comparando o diâmetro das MSNs medido por TEM (Tabela 6) com o diâmetro hidrodinâmico a 40ºC (Tabela 7) verifica-se que em alguns casos o diâmetro das MSN-POLI é inferior ao diâmetro das MSN-PDI por TEM. Este resultado pode estar relacionado com o facto de algumas partículas MSN-POLI terem sedimentado durante a experiência, ficando apenas as partículas menores em suspensão, o que explica que as partículas com polímero possam aparentar diâmetros inferiores ao das nanopartículas de sílica. 29

48 Tabela 7 - Diâmetro hidrodinâmico das nanopartículas de sílica a 25º C e nanopartículas híbridas de resposta térmica em água a 25 e 40 º C, medida por DLS. Amostra D h MSN-PDI (nm) 25ºC D h MSN-POLI (nm) 25ºC D h MSN-POLI (nm) 40ºC MSN 2a 210±7 270±21 180±26 MSN 3a 220±5 210±11 150±7 MSN 3b 180±14 290±5 180±10 MSN 5b 170±2 190±2 140±1 MSN 7a 160±2 310±16 180±12 MSN 7b 170±10 190±5 150±3 Na Figura 25, encontram-se as imagens obtidas por TEM das nanopartículas revestidas com polímero e a distribuição dos diâmetros a diferentes temperaturas realizadas por DLS. As imagens A,D e E da Figura 25 confirmam a polimerização das nanopartículas de sílica mesoporosas visto que é possível visualizar uma camada em torno do núcleo de sílica. Nas imagens B e C a camada de polímero em torno das partículas não é visível por TEM devido à razão molar iniciador/cta destas sínteses ter sido diferente (Tabela 3). A presença da coroa polimérica é mais visível na Figura 26. O efeito da temperatura nas cadeias poliméricas foi analisado pela medição da variação dos diâmetros hidrodinâmicos com a temperatura. As medidas de DLS foram realizadas de 5 em 5ºC para a amostra MSN-POLI 2a (Figura 25 A) e de 2 em 2ºC para as restantes amostras de MSN-POLI (Figura 25 B,C,D e E), registando-se no mínimo 3 medições para cada temperatura. Na distribuição dos diâmetros por DLS observou-se que ocorreu alteração do tamanho dos diâmetros das nanopartículas com a mudança da temperatura. As LCSTs foram obtidas através de um ajuste com três linhas de tendência diferentes, uma linha para os pontos no nível superior (antes do colapso) e outra linha para os pontos no nível inferior (após o colapso). Uma terceira linha de tendência foi elaborada para os pontos no nível de transição. Para as MSN-POLI 2a e MSN-POLI 7a obteve-se uma LCST de 36,3ºC e 35,6ºC respectivamente, enquanto para MSN-POLI 3a, MSN-POLI 3b, MSN-POLI 5b calculou-se uma LCST de 32,4ºC, 33,3ºC e 30,5ºC. A LCST foi caracterizada entre 30 a 36ºC, isto poderá dever-se ao facto das cadeias poliméricas estarem ancoradas na superfície das nanopartículas o que complica a sua caracterização. 30

49 A B C D E Figura 25 - Imagens TEM de MSN-POLI 2a (A, 200nm), MSN-POLI 3a (B, 100nm), MSN-POLI 3b (C, 200nm), MSN-POLI 5b (D, 200nm), MSN-POLI 7a (E, 100nm) à esquerda e gráfico de DLS com o aumento de temperatura (20 a 50ºC) à direita. 31

50 Na figura 26 pode observar-se o comportamento das nanopartículas revestidas com polímero quando estas são sujeitas ao aumento e diminuição da temperatura. No início da experiência a 20ºC as partículas têm um diâmetro de 218 nm e a 50ºC o diâmetro registado é de 116 nm. Neste caso ocorreu o colapso das cadeias poliméricas pois houve uma diminuição do diâmetro com o aumento da temperatura. Pelo contrário, quando se baixa a temperatura de 50 para 20ºC, foi registado um diâmetro de 114 nm a 50ºC e de 208 nm a 20ºC o que indica que houve uma expansão das cadeias poliméricas. Os diâmetros das MSN-POLI a 50ºC são inferiores ao diâmetro obtido por TEM das MSN-PDI o que indica que poderá ter ocorrido sedimentação das nanopartículas de maiores dimensões. Figura 26 - Imagem TEM de MSN-POLI 7b (à esquerda) e gráfico de DLS a diferentes temperaturas, para o ciclo de aquecimento (20-50ºC, a preto) e de arrefecimento (50-20ºC, a cinzento) Determinação do potencial zeta O potencial zeta (ZP) de uma amostra é frequentemente utilizado como indicador de estabilidade de uma dispersão, quanto maior o potencial zeta (em módulo) maior é a probabilidade da dispersão ser estável, pois as partículas carregadas repelam-se e essa força supera a tendência de agregação. Como tal, é conveniente que as partículas tenham um elevado potencial zeta, negativo ou positivo [42]. O potencial zeta foi medido em todos os passos de preparação das nanopartículas híbridas de forma a obter informações sobre a sua carga na superfície. Na figura 27 encontram-se os potenciais zeta obtidos antes e depois da funcionalização com APTES, com o agente RAFT e com polímero. 32

51 Figura 27 - Potencial Zeta das amostras com o agente RAFT (MSN-PDI-RAFT) e com polímero (MSN- POLI). Na figura 28 verifica-se que as MSN-PDI,(sem modificação da superfície e sem tensioactivo, apresentam potenciais zeta negativos. Isto deve-se ao facto dos grupos silanol em água estarem desprotonados, pois estes têm o ponto isoeléctrico a um ph igual a 1,5 e a água millipore encontra-se a um ph aproximadamente de 5, o que origina carga negativa na superfície. Segundo a literatura [49], o pka do grupo aminopropil é de 9,8 e o ponto isoeléctrico é de 10,6, pelo que os grupos amina das partículas se encontram protonados, dando origem a carga positiva na superfície. Pode-se observar que o ZP das nanopartículas modificadas com o agente RAFT alterou-se devido aos grupos ácido do agente RAFT que reagem com os grupos NH 2 existentes na superfície da sílica. O potencial zeta das partículas de sílica com polímero (MSN-POLI) aumentou em relação ao das nanopartículas com o agente RAFT (MSN-PDI-RAFT), confirmando a modificação da superfície das nanopartículas com o polímero. As polimerizações das diferentes amostras de MSNs foram realizadas com sucesso como se pode observar na Tabela 8. Tabela 8 - Potencial Zeta das amostras de MSNs com o agente RAFT (MSN-PDI-RAFT) e com polímero (MSN-POLI). Potencial Zeta (mv) Amostra MSN-PDI-RAFT MSN-POLI MSNs 2a -35,23 23,57 MSNs 3a -10,5 16 MSNs 3b -5,18 24,47 MSNs 5b -28,5 30,97 MSNs 7a -10,18 31,4 33

52 Absorvância Absorvância 4.5. Incorporação e libertação de sulforodamina B nas MSN-POLI Com este estudo pretendeu-se testar a libertação controlada de moléculas de sulforodamina B (SRB, moléculas hidrofílicas) incorporadas em nanopartículas de sílica mesoporosas revestidas com uma coroa polimérica. A libertação controlada foi efectuada com o estímulo da temperatura. Este estudo é inovador visto que não se encontram descritos na literatura sistemas de libertação controlada com resposta à temperatura com o mecanismo descrito. O sistema apresentado é somente um modelo, isto é, uma prova de conceito Incorporação de sulforodamina B nas MSN-POLI A incorporação de fármacos em nanopartículas pode ser obtida por dois métodos: a incorporação do fármaco durante a síntese das nanopartículas ou adsorção do fármaco após a formação de nanopartículas. O método mais frequente para a incorporação do fármaco é a adsorção em solução. Nas nanopartículas de sílica, os grupos silanol, presentes na superfície servem como locais de adsorção. A elevada área superficial e elevado volume dos poros das MSNs permite que estas sejam carregadas com quantidades significativas de fármaco. O carregamento das MSNs é normalmente realizado na ordem das centenas de miligramas de fármaco por grama de MSNs. A libertação do fármaco incorporado em MSNs pode ser estudada por difusão de moléculas através de uma membrana de celulose ou por degradação dos sistemas de libertação, isto é, ocorre a degradação das nanopartículas ou polímero e permite a libertação das moléculas para o meio [11][50]. A sulforodamina B (SRB) foi utilizada neste estudo para incorporar nas MSNs e testar as nanopartículas híbridas pois tem elevado rendimento quântico. O espectro de absorção da solução de SRB utilizada (Figura 28 A) foi obtido para uma concentração de 5, M. Com o coeficiente de absortividade molar da SRB (ε= M -1 cm -1 ) com espectros de absorvância de cada sobrenadante (Figura 28 B) foram calculadas as concentrações de cada sobrenadante diluído em tampão fosfato. 0,05 0,04 A 0,05 0,04 B 0,03 0,02 0, Comprimento de onda (nm) 0,03 0,02 0, Comprimento de onda (nm) Figura 28 - Espectro de absorção da solução de SRB em tampão fosfato (A) e dos sobrenadantes (B). Sobrenadante 1 (azul), sobrenadante 2 (verde) e sobrenadante 3 (roxo) após a incorporação de SRB nas MSN-POLI e centrifugação. 34

53 Após obter as concentrações de cada sobrenadante na célula (c(m) célula ) foram calculadas as concentrações antes das diluições e o número de moles de cada sobrenadante (tabela 9). A quantidade de SRB que incorporou nas MSN-POLI 2a foi calculada a partir da diferença entre a concentração da solução inicial de SRB usada na incorporação (4, M) e as concentrações dos sobrenadantes após a centrifugação (tabela 9). Tabela 9 - Concentrações dos sobrenadantes na célula de quartzo e número de moles de SRB nos sobrenadantes. Sobrenadante 1 Sobrenadante 2 Sobrenadante 3 c (M) célula 6, , , n (mol) 3, , , Tabela 10 - Número de moles de SRB usadas na incorporação, nos sobrenadantes e que ficaram nas MSN-POLI 2a. SRB na incorporação SRB nos sobrenadantes SRB nas MSN-POLI 2a n (mol) 4, , , Estudo da libertação controlada nas MSN-POLI No estudo de libertação de moléculas de SRB foi utilizada a amostra MSN-POLI 2a. Foram obtidos espectros fluorescência (λexc=520 nm) e excitação (λemi = 620 nm) da SRB a 20ºC e a 50ºC (Figura 29) visto que o estudo de libertação consiste na observação do comportamento da coroa polimérica das nanopartículas, que têm uma LCST aproximadamente a 37ºC. Estas duas temperaturas foram escolhidas devido ao facto de abrangerem a temperatura da fase de transição do polímero. Na figura 29, nota-se que a intensidade de fluorescência a 50ºC é menor comparativamente com a de 20ºC e este facto deve-se à diminuição de rendimento quântico com o aumento da temperatura (aumento das componentes não radiativas e consequentemente uma diminuição do rendimento quântico). Assim, calculou-se a razão de intensidades de fluorescência (RI) a 50ºC e a 20ºC ao comprimento de onda máximo. 35

54 Figura 29 - Espectros de excitação (linhas a tracejado) e emissão (linhas continuas) da SRB a 20ºC (vermelho) e 50ºC (azul), com λemi = 620 nm e λexc=520 nm. No estudo de libertação foi utilizada uma célula de plástico contendo tampão fosfato (PBS) e um agitador, e um tudo de diálise com uma membrana de celulose na base. O aumento da fluorescência foi seguido no compartimento B (Figura 30). O tubo de diálise deve estar em contacto com o tampão contido na célula para que ocorra a passagem de moléculas através dos poros da membrana. Num tubo de diálise foi colocada uma solução de SRB e noutro tubo de diálise nanopartículas carregadas com SRB. A libertação foi estudada por difusão da SRB através da membrana de celulose que não permite a difusão de partículas. Figura 30 Imagem representativa da preparação da amostra para a realização do estudo de libertação. O tudo de diálise (A) é composto por uma membrana de celulose na base e a célula de plástico (B) contem tampão fosfato (ph~7). Para estudar o comportamento da membrana com a temperatura foram realizadas duas cinéticas com SRB, uma a 20ºC e outra a 50ºC durante 4 horas. Na Figura 31, observa-se que os valores das intensidades de fluorescência são superiores a 50ºC comparativamente aos de 20ºC. Ao longo do tempo a intensidade de fluorescência vai aumentando esperando obter-se um patamar, pois a difusão de moléculas de SRB pela membrana deveria aumentar, tal não acontece por a concentração da solução de SRB utilizada ser elevada (10-5 M). O efeito da temperatura na membrana pode-se observar, por exemplo, aos 6000 s onde os valores da intensidade de 36

55 fluorescência a 50ºC são superiores aos de 20ºC. Esta diferença de intensidade, a diferentes temperatura, poderá ocorrer devido à influência da temperatura na membrana alterando a porosidade desta a 50ºC permitindo a passagem de mais moléculas de SRB. Caso não houvesse influência da temperatura na membrana, esperava-se que os valores das intensidades de fluorescência a 20ºC fossem superiores aos de 50ºC, pois com o aumento da temperatura há uma diminuição do rendimento quântico. De forma a descontar esse efeito da temperatura no rendimento quântico, as intensidades de fluorescência a 50ºC foram normalizadas, dividindo pela razão RI (Figura 31 B). A B Figura 31 - Intensidades de fluorescência obtidas para a SRB a 20ºC (verde) e a 50ºC (azul) ao longo do tempo (A). Com a razão da intensidade de fluorescência da SRB a 50ºC com SRB a 20ºC foram normalizadas as intensidades de fluorescência a 50ºC, obtendo-se a curva a vermelho (B). As intensidades de fluorescência foram medidas ao λemi = 585 nm e λexc=565 nm. Nas nanopartículas de sílica mesoporosa com coroa polimérica (MSN-POLI) foi incorporada sulforodamina B (MSN-SRB) como descrito no 3º Capítulo. Após a incorporação, prepararam-se dois tubos de diálise, um com SRB em solução e outro com MSN-SRB e foi realizada uma cinética com ciclos ºC para cada preparação. Inicialmente a temperatura foi de 50ºC, pois as nanopartículas no final do processo de incorporação da SRB encontram-se a essa temperatura, onde o polímero está colapsado e o núcleo carregado. 37

56 As intensidades de fluorescência, tanto para a SRB como para MSN-SRB foram normalizadas para que as intensidades iniciais fossem iguais a zero. Na figura 32 (A), observou-se novamente a influência da temperatura no rendimento quântico pois ocorreu variações de intensidade de fluorescência para a SRB e MSN-SRB a 20ºC e a 50ºC, isto é, as intensidades de fluorescência dos intervalos correspondentes a 50ºC são inferiores às intensidades de fluorescência a 20ºC assim, as cinéticas foram corrigidas, dividindo os respectivos intervalos a 50ºC pela razão RI calculada anteriormente. A B Figura 32 - Variações de intensidade de fluorescência obtidas para a SRB (azul) e MSN-SRB (verde), alterando a temperatura de 50 para 20ºC, de 20 em 20 minutos (A). As intensidades de fluorescência dos intervalos correspondentes a 50ºC para a SRB (vermelho) e para as MSN-SRB (roxo) foram normalizadas com a razão da intensidade de fluorescência da SRB a 50ºC com SRB a 20ºC (B). As intensidades de fluorescência foram medidas ao λemi = 585 nm e λexc=565 nm. Após a correcção das intensidades de fluorescência a 50ºC foram representados na Figura 33 os intervalos de tempo, para SRB e MSN-SRB a 20ºC e a 50ºC excluindo os valores de intensidade de fluorescência das rampas. Os valores de intensidades nos intervalos de tempo foram ajustados com uma recta tendo-se calculado os seus declives. 38

57 Figura 33 - Intensidades de fluorescência obtidas para a SRB a 20ºC (vermelho) e MSN-SRB a 20ºC (azul) e intensidades de fluorescência normalizadas obtidas para a SRB a 50ºC (verde) e MSN-SRB a 50ºC (roxo) e respectivos ajustes para cada intervalo. As intensidades de fluorescência foram medidas ao λemi = 585 nm e λexc=565 nm. Dos ajustes (Figura 33), notou-se que o declive para a SRB e MSN-SRB a 20ºC se mantem idênticos ao longo do tempo, contudo a 50ºC observam-se alterações nos declives. Esta diferença de declives está relacionada com a libertação de SRB. A representação dos declives em função do tempo (Figura 34), mostra que para a SRB livre os declives a 20ºC são semelhantes ao longo do tempo (devido à difusão lenta de moléculas de SRB livres em solução pela membrana). A 50ºC o declive referente a SRB livre não se alterou significativamente (embora sejam mais elevados que os declives a 20ºC, devido ao aumento da porosidade da membrana com a temperatura). Os declives das MSN-SRB a 20ºC foram idênticos durante a cinética o que era esperado, pois a 20ºC as cadeias poliméricas estão hidratadas logo, o polímero está expandido, permitindo que as moléculas de SRB difundam do núcleo da partícula para a coroa polimérica, mas ficando aí retidas. Pressupõe-se que o aumento de intensidade a 20ºC se deve às moléculas de SRB livres em solução, contudo os declives são constantes ao longo do tempo. A observar os declives de MSN-SRB a 50ºC reparou-se que estes diminuem ao longo do tempo. No primeiro intervalo, o declive é bastante elevado mostrando que ocorreu maior difusão de moléculas de SRB pela membrana. A 50ºC, as cadeias poliméricas colapsam em torno da nanopartícula e ficam mais hidrofóbicas havendo interacções preferenciais entre solvente-solvente e polímero-polímero. Assim, as moléculas de SRB que se encontram na coroa polimérica são expelidas provocando um aumento da concentração de SRB no tubo de diálise e em consequência, uma maior difusão de moléculas de SRB pela membrana. A diminuição dos declives obtidos a 50ºC para as partículas carregadas com SRB ao longo do tempo, sugere que as partículas foram descarregando o seu conteúdo e desta forma a difusão de moléculas através da membrana de celulose foi menor. A figura 34 mostra uma elevada libertação de moléculas a 50ºC para as MSN-SRB comparativamente com SRB em todos os intervalos de tempo. A temperaturas baixas a libertação é pouco significativa. 39

58 Decilve Pondo isto, a coroa polimérica das MSNs híbridas possui um mecanismo que possibilita a libertação controlada através da temperatura SRB 50 C MSN-SRB 50 C SRB 20 C MSN-SRB 20 C C C C 20 C C 20 C C 20 C C 20 C Intervalo tempo (min) 20 em 20 min Figura 34 - Representação dos declives obtidos através dos ajustes efectuados para as variações da intensidade de fluorescência da SRB (amarelo) e MSN-SRB (laranja) a 50ºC e para SRB (cinzento) e MSN-SRB (azul) a 20ºC. Na figura 35 está representado um esquema do comportamento das nanopartículas carregadas com SRB. A quantidade de moléculas de SRB na nanopartícula foi diminuindo ao longo do tempo devido à libertação de SRB que ocorreu quando se aumentou a temperatura. Inicialmente, a 50ºC, as nanopartículas estavam completamente carregadas (Figura 35 A). Com a diminuição da temperatura as cadeias poliméricas modificaram a sua conformação ficando mais hidrofílicas e permitindo a migração de moléculas de SRB do núcleo da nanopartícula para a coroa polímerica que se encontra expandida (Figura 35 B). Ao aumentar novamente a temperatura o polímero volta a colapsar, libertando as moléculas presentes na coroa (Figura 35 C). A libertação de moléculas de SRB pelas nanopartículas ocorre até as MSNs ficarem completamente descarregadas. Na célula (Figura 35) observa-se um aumento progressivo da intensidade de fluorescência devido ao efeito cumulativo, no entanto a difusão de SRB pela membrana de celulose vai diminuindo à medida que a SRB sai das partículas para o meio aquoso. 40

59 No estudo realizado ocorreu maior libertação de moléculas de SRB a 50ºC nas MSN-SRB o que demonstra que estas nanopartículas híbridas podem ser utilizadas para incorporar fármacos e funcionarem como sistema de libertação controlada de resposta a temperatura. A B C D Figura 35 - Esquema representativo do comportamento das MSN-POLI carregadas com a sulforodamina B. O polímero a 50ºC encontra-se expandido (B e C) e a 50ºC colapsa (C e D). A 50ºC a SRB presente na coroa polimérica é libertada. Com a diminuição da temperatura, o polímero encontra-se novamente expandido. 41