UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA LUMA CORREIA FERNANDES

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA LUMA CORREIA FERNANDES PERFIL FENOTÍPICO E GENÉTICO DE ENTEROBACTÉRIAS PRODUTORAS DE CARBAPENEMASE DO TIPO KPC EM UM HOSPITAL DE GOIÂNIA Goiânia 2017

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3 LUMA CORREIA FERNANDES PERFIL FENOTÍPICO E GENÉTICO DE ENTEROBACTÉRIAS PRODUTORAS DE CARBAPENEMASE DO TIPO KPC EM UM HOSPITAL DE GOIÂNIA Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás para obtenção do Título de Mestre em Medicina Tropical e Saúde Pública. Orientador: Prof. Dr. André Kipnis Co-orientadora: Profª. Drª. Adriana Oliveira Guilarde Goiânia 2017 iii

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5 I v

6 Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás BANCA EXAMINADORA DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO Aluno (a): Luma Correia Fernandes Orientador (a): André Kipnis Co-orientador (a): Adriana Oliveira Guilarde Membros: 1. Dra. Marília Dalva Turchi 2. Dra. Maria Cláudia Dantas P. B. André (memória) 3. Dr. André Kipnis Data: 17/03/2017 vi

7 À minha família vii

8 AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus por iluminar o caminho da vida principalmente nos momentos difíceis. À minha família que me apoiou e incentivou a ir mais longe e sempre esteve ao meu lado. Ao meu marido, Douglas, que sempre esteve ao meu lado, me aguentou nos momentos de tristeza e estresse e me acalmou nos momentos agitados. À professora Adriana Oliveira Guilarde, minha co-orientadora e idealizadora desse projeto, que desde o primeiro momento me acolheu e acreditou em mim. Ao professor André Kipnis, por acreditar em mim, por todo o empenho e sabedoria, pela liberdade e confiança na realização deste trabalho e principalmente pela compreensão nos momentos difíceis. À professora Maria Cláudia Dantas P. B. André por ter me ensinado e ajudado no desenvolvimento da técnica PFGE, fornecendo materiais e analisando os resultados das amostras, também por ter participado da minha banca de qualificação, expondo suas ideias para melhorar a dissertação. À professora Juliana Lamaro Cardoso por ter me ensinado e ajudado no desenvolvimento da técnica PFGE, fornecendo materiais e analisando as amostras. À professora Alessandra Marques Cardoso por ter participado da minha banca de qualificação e contribuído com o seu conhecimento para melhorar a dissertação. A todos os diretores do hospital de reabilitação que autorizaram a realização desse trabalho e por todos os recursos colocados à disposição. A todos os colegas dos laboratórios do hospital e IPTSP que me apoiaram e ajudaram no desenvolvimento das técnicas e reações realizadas e especialmente a Carolina Tremea que me auxiliou na dissertação e ao Fábio Muniz que me ensinou as técnicas de biologia molecular. Por fim, agradeço a todos que de alguma forma contribuíram para a realização deste mestrado, um importante desafio da minha vida. vii

9 SUMÁRIO AGRADECIMENTOS... vii TABELAS, FIGURAS E ANEXOS... xi SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS... xiii RESUMO... xv ABSTRACT... xvi 1. INTRODUÇÃO / REVISÃO DA LITERATURA Família Enterobacteriaceae e Patogenicidade Antimicrobianos Beta-lactâmicos Mecanismo de Ação dos Beta-lactâmicos Resistência Bacteriana Beta-lactamases Serino Beta-lactamases Beta-lactamases de Espectro Estendido Inibidores de Beta-lactamases Antimicrobianos Carbapenêmicos Carbapenemases Carbapenemases de Classe A KPC Enzimas Cromossomais: IMI, NMC e SME GES Metalo-Beta-lactamase IMP e VIM NDM Antimicrobiano Polimixina Resistência à Polimixina Resistência à Polimixina por Mutação Genética Resistência à Polimixina por Plasmídeo (MCR-1) Antimicrobiano Tigeciclina Detecção Laboratorial das Carbapenemases Testes Fenotípicos Teste de Gradiente de Difusão Disco Difusão com Ácido Etilenodiamino Tetra-acético e com Ácido Fenilborônico EDTA viii

10 AFB Teste de Hodge modificado Teste de Inativação dos Carbapenêmicos Testes Moleculares Reação em Cadeia da Polimerase Eletroforese em Gel em Campo Pulsado (PFGE) JUSTIFICATIVA OBJETIVOS Objetivo Geral Objetivos Específicos MÉTODOS Seleção das amostras e aspectos ético-legais Perfil Clínico do Hospital Critérios de Inclusão Critério de Exclusão Isolamento e Identificação Bacteriana Teste de Suscetibilidade aos Antimicrobianos Testes Complementares Teste de Hodge Modificado Teste com o Inibidor e Potenciador para Detecção de Carbapenemase do Tipo NDM e KPC (ANVISA, 2013) Teste de Inativação do Carbapenêmico Teste de Gradiente de Difusão para Polimixina e Tigeciclina Condições de Armazenamento Extração de DNA Genômico Bacteriano Extração do DNA Plasmidial Bacteriano Condições de Amplificação do DNA Eletroforese em Gel de Agarose PFGE Análises Estatísticas RESULTADOS Seleção das amostras Perfil das 167 Amostras dos Pacientes Infectados por Enterobactérias Resistentes aos Carbapenemicos do Hospital de Reabilitação Teste de susceptibilidade aos antimicrobianos Determinação da concentração inibitória mínima ix

11 5.5. Testes Fenotípicos para Detecção de Carbapenemases Resultado da Nota Técnica 01/2013 da ANVISA Teste de Hodge Modificado Teste de Inativação do Carbapenêmico Testes Moleculares Detecção dos Genes Codificadores das Carbapenemases KPC e NDM Detecção de Outros Gene Codificador de Resistência a antimicrobianos Testes Fenotípicos e Genéticos Realizados com Resultados Positivos para KPC Determinação do polimorfismo genético por eletroforese de campo pulsado em gel de agarose (PFGE) DISCUSSÃO CONCLUSÕES REFERÊNCIAS ANEXOS Anexo 1. Parecer do Comitê de Ética Anexo 2. Nº das Linhagens Bacterianas de Referência da FIOCRUZ Fundação Osvaldo Cruz Anexo 3. Artigo a ser submetido para a revista Mémorias do Instituto Oswaldo Cruz x

12 TABELAS, FIGURAS E ANEXOS Tabela 1. Classificação segundo Bush, Jacoby, Medeiros e Ambler com as principais enzimas de resistência Tabela 2. Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para realização dos PCR Tabela 3. Frequência das espécies bacterianas produtoras de carbapenemases isoladas durante o período de estudo relacionadas ao material clínico Tabela 4. Frequência das espécies bacterianas produtoras de carbapenemases isoladas durante o período de estudo relacionadas a origem Tabela 5. Frequência de isolados resistentes aos diferentes antimicrobianos de acordo com a espécie bacteriana estudada determinado pelo sistema automatizado Vitek II Tabela 6. Teste com o Inibidor e Potenciador para Detecção de Carbapenemase do Tipo NDM e KPC (ANVISA, 2013) Tabela 7. Amostras positivas para os genes blakpc, blandm e MCR Tabela 8. Percentual de amostras produtoras de blakpc associadas aos testes fenotípicos Figura 1. Estrutura dos antimicrobianos beta-lactâmicos Figura 2. Estrutura dos inibidores de BLA Figura 3. Teste de sensibilidade através TGD de polimixina B Figura 4. Teste da nota técnica 01/2013 da ANVISA com carbapenêmicos sem aditivo, com 10 µl de AFB e 10 µl de EDTA para avaliar aumento dos halos de inibição dos antimicrobianos (mm) Figura 5. Teste de Hodge modificado para avaliar a produção de KPC Figura 6. Teste de inativação do carbapenêmico para avaliar a produção de carbapenemase Figura 7 Frequência de isolados de enterobactérias produtores de carbapenemases (A) e distribuição por espécie (B) Figura 8 Número de amostras produtoras de carbapenemases isoladas, de acordo com as espécies bacterianas e por mês de estudo Figura 9 Susceptibilidade aos antimicrobianos dos 167 isolados de enterobactérias produtores de carbapenemases xi

13 Figura 10 Concentrações inibitórias mínimas (CIM) determinada para tigeciclina realizados pelo método automatizado (Vitek II, barras pretas) e pelo TGD (barras cinzas) com a interpretação segundo a ANVISA 01/ Figura 11 Concentrações inibitórias mínimas (CIM) determinada para polimixina B realizados pelo método automatizado (Vitek II, barras pretas) e pelo TGD (barras cinzas) com a interpretação segundo a ANVISA 01/ Figura 12. Eletroforese do produto do PCR para o gene blakpc de 13 amostras da espécie K. pneumoniae Figura 13. Eletroforese em gel de agarose dos produtos da PCR para o gene blandm de 9 amostras das espécies K. pneumoniae e E. coli Figura 14. Eletroforese em gel de agarose da PCR para o gene MCR-1 para pesquisa de resistência plasmidial à poliximina em 15 amostras Figura 15 Dendrograma representativo dos 13 perfis de fragmentação de DNA cromossomal encontrado nas 52 amostras de K. pneumoniae produtoras de KPC Anexo 1. Parecer do Comitê de Ética Anexo 2. Nº das Linhagens Bacterianas de Referência da FIOCRUZ Fundação Osvaldo Cruz Anexo 3. Artigo a ser submetido para a revista Mémorias do Instituto Oswaldo Cruz xii

14 SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS AFB Ácido Fenilborônico BLA Beta-lactamase Ca Cálcio CESP Citrobacter freundii, Enterobacter spp., Serratia spp., Providencia spp., Morganella morganii e Hafnia alvei CIM Concentração Inibitória Mínima CLSI Clinical Laboratory Standard Institute DHP-1 Dehidropeptidase-1 DNA Ácido Desoxirribonucleico dntps Desoxirribonucleotídeos trifosfato EDTA Ácido Etilenodiamino Tetra-acético ESBL Beta-lactamase de Espectro Estendido, do inglês: Expanded Spectrum Beta Lactamase FDA U. S. Food and Drug Administration Fe Ferro GIM German Imipenemase IMP Imipenemase ITU Infecção do Trato Urinário KPC Klebsiella pneumoniae Carbapenemase LPS Lipopolissacarído MBL Metalo-beta-lactamase Mg Magnésio MRSA Methicillin-resistant Staphylococcus aureus NAG Nacetilglucosamina NAM N-acetil Murâmico NDM New Delhi Metalo-beta-lactamase PBP Proteína ligadora à penicilina, do inglês: Penicillin Binding Protein PCR Reação em Cadeia da Polimerase, do inglês: Polymerase Chain Reaction PFGE Eletroforese em gel de campo pulsado, do inglês: Pulsed Field Gel Eletrophoresis SCIH Serviço de Controle de Infecção Hospitalar xiii

15 SIM Seoul Imipenemase SPM São Paulo Metalo-beta-lactamase ST Secreção Traqueal SUS Sistema Único de Saúde TGD Teste de Gradiente de Difusão THM Teste de Hodge Modificado TIC Teste de Inativação dos Carbapenens TSA Ágar de soja tríptico, do inglês: Tryptic Soy Agar TSB Caldo de soja tríptico, do inglês: Tryptic Soy Broth UPGMA do inglês: Unweighted Pair-Groups Method with Arithmetic mean UPS Úlcera de Pressão Sacral UPTD Úlcera de Pressão Trocantérica Direita UTI Unidade de Terapia Intensiva VIM Verona Imipenemase xiv

16 RESUMO Nas últimas décadas, as bactérias da família Enterobacteriaceae têm adquirido um papel cada vez mais importante nas infecções hospitalares devido à sua prevalência e altos índices de resistência a antimicrobianos associados à mortalidade. Essa resistência devido a produção de carbapenemases é reconhecida mundialmente como um grande problema emergente para pacientes hospitalizados, devido à localização de genes em elementos transferíveis, facilitando sua disseminação. O objetivo desse trabalho foi caracterizar fenotípica e geneticamente enterobactérias produtoras de carbapenemases. Entre os anos 2012 a 2016 foram isoladas 167 amostras de enterobactérias de um hospital em Goiânia que apresentaram resistência aos carbapenêmicos. Dos 167 isolados, 107 (64,1%) foram de Klebsiella pneumoniae, 44 (26,3%) de Enterobacter aerogenes, 13 (7,8%) de Escherichia coli e 3 (1,8%) de outras espécies. Dos 167 isolados, 94,0% apresentaram resistência ao ertapenem, 73,6% ao meropenem, 80,8% ao imipenem, 9,0% à tigeciclina e 9,0% à polimixina B. Do total de isolados, 119 (71,2%) foram positivos no Teste de Hodge Modificado (THM), 162 (97,0%) foram positivos no Teste Inativação do Carbapenêmico (TIC) e 125 foram positivos para KPC e 1 para metalo-beta-lactamase no Teste da Nota Técnica 01/2013. A técnica de PCR evidenciou que 80 (47,9%) isolados continham o gene blakpc e que nenhum continha os genes blandm e MCR-1. Para determinação do grau de similaridade entre os isolados de K. pneumoniae KPC foi realizado o polimorfismo genético por eletroforese de campo pulsado em gel de agarose (PFGE) evidenciando 8 clusters. Dentre as amostras não sensíveis a tigeciclina, 22 apresentaram blakpc e pertenciam a 13 tipos de clones diferentes. Dentre as amostras resistentes a polimixina B, 10 apresentaram blakpc em 7 tipos de clusters, 9 (17,31%) isolados apresentaram resistência tanto a tigeciclina quanto a polimixina B. Através deste estudo, pudemos evidenciar que o gene blakpc consegue disseminar de forma muito eficiente entre espécies de enterobactérias. Além disso, pode estar sendo carreado com outros determinantes de resistência, dificultando ainda mais o tratamento do ambiente hospitalar. Palavras-chaves: Carbapenemases, enterobactérias, testes fenotípicos. xv

17 ABSTRACT In the Enterobacteriaceae family, bacteria acquired an increasingly important role in hospital infections due to their prevalence and high rates of antimicrobial resistance associated with mortality. This image produced by carbapenemases is recognized worldwide as a major emerging problem for hospitalized patients due to the localization of genes in transferable elements, facilitating their dissemination. The objective of this work was to characterize phenotypic and genetically enterobacteria of carbonapenemases. Between 2012 and 2016, 167 samples of enterobacteria from a hospital in Goiânia were isolated, which showed support for carbapenems. Of the 167 isolates, 107 (64.1%) were of Klebsiella pneumoniae, 44 (26.3%) of Enterobacter aerogenes, 13 (7.8%) of Escherichia coli and 3 (1.8%) of other species. Of the 167 isolates, 94.0% had resistance to ertapenem, 73.6% to meropenem, 80.8% to imipenem, 9.0% to tigecycline and 9.0% to polymyxin B. Of the total isolates, 119 (71, 2%) were positive in the Modified Hodge Test (THM), 162 (97.0%) were positive in the Carbapenem Inoculation Test (TIC) and 125 in the KPC and 1 in the metallo-beta-lactamase technique 01 / The PCR technique showed that 80 (47.9%) isolates contained the blakpc gene and that none contained the blandm and MCR-1 genes. To determine the degree of similarity between the isolates of K. pneumoniae KPC, the genetic polymorphism was performed by agarose gel pulsed field electrophoresis (PFGE), showing 13 clusters. Among the non-tigecycline sensitive samples, 22 presented blakpc and belonged to 8 different clone types. Among the samples resistant to polymyxin B, 10 presented blakpc in 7 types of clusters, 9 (17.31%) isolated showed resistance to both tigecycline and polymyxin B. Through this study, we could show that the blakpc gene manages to disseminate very Efficient among species of enterobacteria. In addition, it can be assembled with other resistance determinants, making it even more difficult to treat the hospital environment. Keywords: Carbapenemases, enterobacteria, phenotypic testes. xvi

18 1. INTRODUÇÃO / REVISÃO DA LITERATURA 1.1. Família Enterobacteriaceae e Patogenicidade As bactérias da família Enterobacteriaceae são anaeróbicas facultativas, compostas por bacilos Gram negativos, não esporulados, fermentadores da glicose e redutores de nitrato. Embora possam ser encontradas amplamente na natureza, a maioria habita os intestinos do homem e dos animais, seja como membros da microbiota normal ou como agentes de infecção (KONEMAN et al.,2001) Nas últimas décadas, as bactérias da família Enterobacteriaceae têm adquirido um papel cada vez mais importante nas infecções hospitalares, tornando-se um problema de saúde pública devido à sua prevalência e altos índices de resistência aos antimicrobianos associados à mortalidade. Estudos multicêntricos têm destacado as espécies Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae, seguidos pelo gênero Enterobacter, como as enterobactérias mais prevalentes causadores de infecções em Unidades de Terapia Intensiva (UTI) na América do Sul (FEDLER, BIEDENBACH & JONES, 2006, RHOMBERG & JONES, 2009, BANERJEE & HUMPHRIES, 2016). Escherichia coli tem sido a segunda espécie mais prevalente em infecções hospitalares no mundo, atrás apenas do Staphylococcus aureus. Na América Latina, E. coli é a primeira da lista dos patógenos mais frequentes em infecções hospitalares e está principalmente associada a infecções do trato urinário (ITU) (FEDLER, BIEDENBACH & JONES, 2006, DE MAIO CARRILLHO, GAUDERETO, MARTINS et al., 2016). No Brasil, este patógeno é responsável por 48% das ITU; 11,2% das infecções sanguíneas e 7,2% das infecções de tecido (SADER, GALES, PFALLER et al., 2001, SAMPAIO & GALES, 2016). Dentre as enterobactérias, K. pneumoniae é uma das principais bactérias causadoras de infecção hospitalar associada à pneumonia decorrente da colonização dos pacientes hospitalizados, e pode ser isolada nas mãos, nasofaringe e fezes. No Brasil, 16,9% das infecções em UTI são causadas por K. pneumoniae e é a segunda enterobactéria mais prevalente, atrás apenas da E. coli (KIFFER, HSIUNG, OPLUSTIL et al., 2005, DE MAIO CARRILLHO, GAUDERETO, MARTINS et al., 2016). O gênero Enterobacter é considerado emergente nas infecções hospitalares, e ocupa o terceiro lugar na prevalência da família Enterobacteriaceae no mundo (KIFFER, HSIUNG, OPLUSTIL et al., 2005). No Brasil, este gênero é responsável por 7,9% das 1

19 infecções hospitalares em pacientes das UTI (SADER, CASTANHEIRA, MENDES et al., 2005). As enterobactérias têm grande incidência relacionadas a infecções hospitalares, com isso, a utilização dos antimicrobianos está cada vez mais frequente e necessária, e apesar do desenvolvimento de antimicrobianos ser um dos mais significativos avanços na medicina moderna, as infecções bacterianas continuam causando inúmeras mortes (SAMAHA-KFOURY & ARAJ, 2003, ROSSI, GIRARDELLO, CURY et al., 2016). Os antimicrobianos mais utilizados para as infecções por enterobactérias são betalactâmicos, que atuam bloqueando a síntese da parede celular, estrutura bacteriana sem homólogo em células eucarióticas. Porém o tratamento das infecções por estes agentes representa um desafio crescente por ocorrer um aumento progressivo das taxas de resistência antimicrobiana aos beta-lactâmicos (THADEN, POGUE & KAYE, 2016) Antimicrobianos Beta-lactâmicos Os beta-lactâmicos são um grupo de antimicrobianos definidos pela presença do anel beta-lactâmico, sendo uma classe de elevada importância devido à sua excelente eficácia terapêutica e baixa toxicidade. O anel beta-lactâmico determina o mecanismo de ação, a baixa toxicidade no homem, visto que atuam na parede celular e esta não está presente nas células eucarióticas e também é o alvo do principal mecanismo de resistência por parte das bactérias, as betalactamases (SCHEFFERS & PINHO, 2005, SUAREZ & GUDIOL, 2009). O anel beta-lactâmico é constituído por três átomos de carbono e um de nitrogênio, podendo conter diversos radicais substituintes que o tornam ativo. Esse anel pode estar fundido com diversos anéis, criando os grupos, penicilinas, cefalosporinas, carbapenêmicos e monobactâmicos que representam a classe dos beta-lactâmicos. Cada representante tem uma estrutura singular. As penicilinas possuem um anel tiazolidina, as cefalosporinas um anel dihidrotiazina e os carbapenêmicos um anel pirrólico, já os monobactâmicos não possuem nenhum anel fundido ao anel principal (Figura 1)(BUSH, JACOBY & MEDEIROS, 1995). 2

20 Figura 1. Estrutura dos antimicrobianos beta-lactâmicos. As penicilinas possuem o anel beta-lactâmico associado a uma estrutura cíclica de 5 membros, enquanto as cefalosporinas e os carbapenêmicos estão associados a estrutura cíclica de 6 membros. Os monobactâmicos não possuem estrutura cíclica associada ao anel beta-lactâmico (WILLIAMS, 1999) Mecanismo de Ação dos Beta-lactâmicos Para o tratamento de uma infeção, o ideal seria administrar um antimicrobiano que exercesse apenas o seu efeito nas bactérias, não prejudicando as células eucarióticas. As bactérias têm uma estrutura celular muito simples, não contendo membrana nuclear e não possuem as organelas presentes nos eucariotos, porém possuem parede celular, que reveste externamente a célula e contêm uma macromolécula denominada de peptideoglicano (VOLLMER & BERTSCHE, 2008). O peptideoglicano é um componente essencial da parede celular bacteriana e sua principal função é preservar a integridade celular. Ele é constituído por cadeias lineares de açúcares alternados, a N-acetilglucosamina (NAG) e o ácido N-acetilmurânico (NAM) (VOLLMER, BLANOT & DE PEDRO, 2008). A síntese do peptideoglicano ocorre em três fases. A primeira ocorre no citoplasma, a síntese dos peptídeos NAG e NAM, os precursores da malha do peptideoglicano. A segunda fase é o transporte desses peptídeos pela membrana plasmática para o exterior celular associados a um transportador de membrana, o bactoprenol e a terceira fase ocorre 3

21 a ligação destes novos fragmentos à parede celular existente, formando as pontes interpeptídicas mediadas por ação das transpeptidases da membrana celular bacteriana (SCHEFFERS & PINHO, 2005). Os antimicrobianos beta-lactâmicos têm ação na terceira fase da síntese do peptideoglicano. Nesta fase ocorre a ação das lisinas bacterianas que rompem as ligações covalentes existentes, para que ocorra a inserção dos novos peptídeos na parede celular. Esses antimicrobianos conseguem inibir irreversivelmente as transpeptidases, conhecidas como proteínas de ligação a penicilina (PBP s, do inglês penicillin-binding-proteins ), impedindo assim a formação das ligações entre as cadeias peptídicas de peptideoglicano. Isto acontece devido à similaridade existente entre o anel beta-lactâmico e a região dos tetrapeptídeos recém-formados onde se ligariam as PBP s (BOUHSS, TRUNKFIELD, BUGG et al., 2008, OZTURK, OZKIRIMLI & OZGUR, 2015) Resistência Bacteriana Como resposta evolutiva ao contato das bactérias com os antimicrobianos, as bactérias desenvolveram mecanismos variados de persistir na presença destes compostos. A resistência aos antimicrobianos ocorre devido às características codificadas geneticamente, podendo ser intrínseca ou adquirida. A resistência intrínseca é aquela que ocorre naturalmente e é característica de cada espécie. Já a resistência adquirida, resulta da mutação espontânea, que surge durante o crescimento bacteriano ou através de aquisição do ácido desoxirribonucleico (DNA, do inglês deoxyribonucleic acid ) exógeno, por transferência de genes de resistência aos microrganismos sensíveis (RASMUSSEN & BUSH, 1997, WALTHER-RASMUSSEN & HOIBY, 2007). A dinâmica do surgimento e disseminação da resistência bacteriana envolve diversos fatores de mobilização de genes que interagem e contribuem para a seleção bacteriana. Dentre eles, a transmissão horizontal, que é a capacidade de mobilização dos genes de resistência de uma célula bacteriana para outra por plasmídeos e transposons conjugativos e a recombinação que ocorre no mesmo genoma, por transposons, cassetes gênicos em integrons e sequências de inserção, que podem estar inseridos em plasmídeos ou transposons e assim, transferidos para outras bactérias. Estes elementos genéticos móveis possibilitam a mobilização de múltiplos genes permitindo às bactérias sobreviverem sob pressão seletiva de antimicrobianos (HAWKEY, 2008, CARATTOLI, 2009). 4

22 Nos beta-lactâmicos, as bactérias conseguem adquirir resistência principalmente devido a alteração do sítio de ligação, as PBP s, alteração da permeabilidade da membrana externa bacteriana e degradação da droga através da produção de beta-lactamases (MASSOVA & MOBASHERY, 1998, FISHER, MEROUEH & MOBASHERY, 2005, KONG, SCHNEPER & MATHEE, 2010) Beta-lactamases A utilização dos antimicrobianos beta-lactâmicos não é tão eficaz devido à existência das beta-lactamases. A produção de beta-lactamases (BLA) é um dos mecanismos de resistência adquiridos mais importantes, devido à sua alta prevalência e por representar uma vantagem adaptativa garantindo a integridade da parede celular na presença do antimicrobiano. Elas são responsáveis por uma alta taxa de falha terapêutica, pois as BLA são enzimas que hidrolisam o anel beta-lactâmico. Os genes que codificam as BLA podem ter localização cromossômica ou plasmidial e quando estão relacionadas com plasmídeos são facilmente transferidos entre as enterobactérias (LIVERMORE, 1995, WILKE, LOVERING & STRYNADKA, 2005, DRAWZ & BONOMO, 2010). Na tentativa de classificar e agrupar estas enzimas para facilitar os estudos, várias classificações foram criadas, porém as duas mais utilizadas são de Ambler e a de Bush, Jacoby e Medeiros (Tabela 1) (AMBLER, 1980, BUSH, JACOBY & MEDEIROS, 1995). A classificação de Ambler foi baseada na estrutura molecular das BLA, de acordo com a sequência de aminoácidos que as codificam. Foram divididas em quatro classes: A- Beta-lactamases de espectro estendido (ESBL, do inglês extended-spectrum betalactamases ), penicilinases e carbenicilinases; B- metalo-beta-lactamases (MBLs); C- cefalosporinases cromossomais; e D- oxacilinases (AMBLER, 1980). A classificação de Bush correlaciona as propriedades inibitórias e o substrato preferencial com a estrutura molecular da enzima divididas em quatro grupos (1, 2, 3, 4) e vários subgrupos. Em 1995, a classificação de Bush foi atualizada combinando características funcionais e estruturais das BLA (BUSH, JACOBY et al., 1995). Atualmente novas tabelas de classificação incluem os elementos genéticos (BUSH & JACOBY, 2010, LEE, DAS, DAWSON et al., 2016) 5

23 Tabela 1. Classificação segundo Bush, Jacoby, Medeiros e Ambler com as principais enzimas de resistência. Grupo de Bush, Jacoby e Medeiros Classe Molecular Ambler Substratos preferidos Características do grupo funcional Algumas Enzimas representativas Grupo de Bush, Jacoby e Medeiros 1 C Cefalosporinas Enzimas cromossômicas e plasmidiais e não são AmpC e MIR-1 1 inibidas pelo ácido clavulânico. 2a A Penicilinas Penicilinases produzidas por Staphylococcus spp. e TEM-1, TEM-2, SHV-2 a SHV-6 2a Enterococcus spp. 2b A Penicilinas e Beta-lactamase de espectro estendido em bacilos TEM-1, TEM-2 e SHV-1 2b cefalosporinas. 2be A Penicilinas, cefalosporinas de espectro estendido e monobactâmicos. Gram negativos. Confere resistência a todos os beta-lactâmicos. TEM-3 a TEM-26, SHV-2 a SHV-6 2be 2br A Penicilinas Beta-lactamases resistentes aos inibidores de betalactamases. TEM-30 a TEM-36 e TRC-1 2br 2c A Penicilinas e Enzimas de hidrolisam carbenicilina. PSE-1, PSE-3, PSE-4 2c carbenicila. 2d D Penicilina e Enzimas que hidrolisam a oxacilina e são levemente OXA-1 a OXA-11 e PSE-2 2d cloxacilina. inibidas pelo ácido clavulânico. 2e A Cefalosporinas Cefalosporinases inibidas pelo ácido clavulânico. Cefalosporinases de Proteus vulgaris 2e 2f A Penicilina, cefalosporinas e carbapenêmicos. Enzimas que hidrolisam os carbapenêmicos, são inibidas pelo ácido clavulânico. KPC- 2 em Enterobactérias 2f 3 B Beta-lactâmicos, carbapenêmicos. Metalo-beta-lactamases, hidrolisam todos os betalactâmicos exceto monobactâmico e não são inibidas pelo ácido clavulânico. 4 Não definido Penicilina Penicilinases miscelâneas não categorizadas em nenhum dos grupos. Adaptado de (BUSH, JACOBY & MEDEIROS, 1995, RASMUSSEN & BUSH, 1997). L1 de Xanthomonas maltophilia e CcrA de Bacterioides fragilis Penicilinases de Pseudomonas cepacia 4 3 6

24 Serino Beta-lactamases As serino beta-lactamases são enzimas que possuem serina no seu centro ativo, e pertencem aos grupos A, C e D na classificação de Ambler. Estas, acilam os betalactâmicos e quebram a ligação amida do anel beta-lactâmico (AMBLER, 1980) Beta-lactamases de Espectro Estendido As ESBL pertencem ao grupo das serino beta-lactamases por conter serina no centro ativo (PATERSON & BONOMO, 2005). As ESBLs são beta-lactamases da classe molecular A ou D segundo a classificação de Ambler, ou das classes 2be ou 2d segundo a classificação de Bush, elas conseguem inativar penicilinas, aztreonam, cefalosporinas de terceira e quarta geração, porém não são capazes de hidrolisar cefamicinas ou carbapenêmicos e a maioria é bloqueada por inibidores de BLA como o ácido clavulânico, sulbactam ou tazobactam (LIVERMORE, 2008). As enzimas ESBLs têm localização plasmidial, mas podem ter sido originadas nos cromossomos, pois a maioria das enterobactérias contem enzimas cromossômicas constitutivas produzidas em baixos níveis. Os plasmídeos que transportam os genes codificadores das ESBLs podem também transportar determinantes de resistência à tetraciclinas, aminoglicosídeos, trimetoprim, sulfonamidas e cloranfenicol (SAMAHA- KFOURY & ARAJ, 2003) Inibidores de Beta-lactamases Uma maneira de contornar a ação das BLA produzidas por bactérias e consequentemente evitar a resistência bacteriana é o uso de inibidores. Os inibidores de BLA são semelhantes às penicilinas, retendo a propriedade de se ligar a porção amida do grupo beta-lactâmico com uma cadeia lateral diferente, porém sem a atividade de inibir as enzimas de síntese do peptideoglicano. Estas estruturas permitem aos inibidores ligar-se irreversivelmente às BLA como substratos suicidas, mantendo-as inativas. Atualmente, três inibidores de BLA são utilizados na clínica médica, ácido clavulânico, tazobactam e sulbactam (Figura 2) (BUSH, JACOBY & MEDEIROS, 1995, SADER, TOSIN, SEJAS et al., 2000). No entanto, novos inibidores de beta-lactamases, como o avibactam estão sendo desenvolvidos com a capacidade de inibir além das beta-lactamases, as 7

25 carbapenemases do tipo Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) (PAPP- WALLACE, BETHEL, DISTLER et al., 2010, KRISHNAN, NGUYEN, PAPP- WALLACE et al., 2015, PAPP-WALLACE, WINKLER, TARACILA et al., 2015) e das metalo-beta-lactamases (MBL) do tipo VIM-2 (XIAO, FANG, SHI et al., 2015). Figura 2. Estrutura dos inibidores de BLA (WILLIAMS, 1999) Antimicrobianos Carbapenêmicos Devido ao surgimento das ESBLs que apresentavam resistência a maioria os betalactâmicos já existentes, em 1990, as indústrias farmacêuticas disponibilizaram os antimicrobianos carbapenêmicos que atualmente tem como representantes o meropenem, imipenem, ertapenem e doripenem (LANDMAN, BRATU, KOCHAR et al., 2007) O primeiro antimicrobiano da classe dos carbapenêmicos descoberto foi o imipenem que apresenta uma estrutura de amidina derivada da tianomicina com substituições do grupo metila para aumentar a ação bactericida e fornecer estabilidade contra as enzimas BLA. Uma desvantagem desse antimicrobiano é a sua rápida degradação pela enzima dehidropeptidase-1 (DHP-1) que está localizada nos túbulos renais, necessitando uma administração combinada com um inibidor de DHP-1. Mais tarde, os antimicrobianos ertapenem e meropenem demonstraram uma maior estabilidade para DHP-1 (KATTAN, VILLEGAS & QUINN, 2008). Os antimicrobianos carbapenêmicos imipenem e meropenem possuem um amplo espectro de ação in vitro, com atividade contra as bactérias Gram positivas, Gram negativas e anaeróbias, com exceção de Stenotrophomonas maltophilia, Staphylococcus meticilina resistente (MRSA, do inglês Methicillin-resistant Staphylococcus aureus ) e Enterococcus faecium. Quanto ao ertapenem, este fármaco possui um espectro de ação mais limitado, não conseguindo atuar contra os bacilos Gram negativos não fermentadores. Já o doripenem, o mais novo antimicrobiano carbapenêmico, combina os espectros de ação do imipenem e meropenem com uma atividade mais potente contra a Pseudomonas aeruginosa (MOHR, 2008). 8

26 Os antimicrobianos do grupo dos carbapenêmicos têm sido considerados terapia de escolha pelo seu amplo espectro de ação, pela sua estabilidade e por serem fármacos bem tolerados pelos pacientes com pouco efeitos adversos. Na última década, porém, aumentaram muito os índices de resistência, como uma resposta adaptativa das bactérias e por consequência do uso indiscriminado desses antimicrobianos (NICOLAU, 2008) Carbapenemases Atualmente, o uso dos carbapenêmicos pode selecionar as bactérias que produzem mecanismos de resistência. As carbapenemases são BLA com atividade hidrolítica contra os carbapenêmicos, possuem um amplo espectro de atividade incluindo quase todos os antimicrobianos beta-lactâmicos e algumas destas enzimas apresentam maior resistência aos inibidores de BLA (LIVERMORE & WOODFORD, 2006, QUEENAN & BUSH, 2007). As carbapenemases estão classificadas segundo Ambler na classe A, as MBLs na classe B e as oxacilinases na classe D e nos grupos funcionais 2f e 3 de Bush Carbapenemases de Classe A As serino-carbapenemases pertencem ao grupo funcional 2f de Bush, são atualmente as carbapenemases mais reportadas em isolados clínicos desde sua primeira descoberta há mais de 20 anos. Estas enzimas quando presentes nas bactérias podem conferir alto grau de resistência aos carbapenêmicos ou permanecerem silenciosas nos testes de antibiogramas apresentando concentrações inibitórias mínimas (CIMs) no intervalo de sensibilidade. Estas BLA, portanto, podem não ser detectadas pelo teste de antibiograma rotineiro (QUEENAN & BUSH, 2007). As serino-carbapenemases são divididas em quatro grupos, sendo que três pertencem à classe A e são enzimas NMC/IMI, SME e KPC caracterizadas por hidrolisar uma variedade de antimicrobianos beta-lactâmicos, incluindo penicilinas, cefalosporinas, aztreonam e carbapenêmicos, porém as enzimas NMC/IMI e SME podem ser inibidas fracamente pelo ácido clavulânico e tazobactam (NORDMANN & POIREL, 2002). O quarto grupo é composto pelas enzimas GES, que são originadas das ESBL, mas ao longo do tempo, variantes com atividade hidrolítica ao imipenem foram descobertas (QUEENAN & BUSH, 2007, WALTHER-RASMUSSEN & HOIBY, 2007). 9

27 O mecanismo hidrolítico destas carbapenemases ocorre quando a enzima se associa de forma não covalente ao antimicrobiano. O anel beta-lactâmico é então bloqueado pelo radical hidroxila livre que está no sítio ativo da BLA, formando uma ligação covalente aciléster. Ao ocorrer a hidrólise deste éster, o antimicrobiano beta-lactâmico é inativado (LIVERMORE, 1995) KPC Dentre as serino-carbapenemases, a enzima KPC tem grande relevância pela alta incidência nos ambientes hospitalares. A KPC foi descrita primeiramente em uma cepa de K. pneumoniae identificada no ano de 1996, mas a publicação só ocorreu em 2001 nos Estados Unidos e seu nome refere-se à espécie na qual a enzima KPC foi identificada. Este isolado apresentava resistência a todos os antimicrobianos beta-lactâmicos, porém a CIM aos carbapenêmicos diminuía quando adicionado ácido clavulânico (YIGIT, QUEENAN, ANDERSON et al., 2001). Depois desta descoberta, surgiram outras variantes, totalizando dez até o momento, sendo que duas delas foram encontradas em Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii, o que mostra que dada a localização plasmidial do gene, ocorre a disseminação de determinantes genéticos móveis entre gêneros bacterianos distintos (WALSH, 2010, WIDMANN, PLEISS & OELSCHLAEGER, 2012) As enzimas do tipo KPC por serem encontradas em plasmídeos transferíveis e apresentarem um perfil hidrolítico mais amplo quando comparadas às enzimas cromossomais, hidrolisam todos os antimicrobianos beta-lactâmicos incluindo penicilinas, monobactâmicos, cefalosporinas e carbapenêmicos. Estando ausentes outros mecanismos de resistência, as KPC não conferem resistência aos carbapenêmicos, apenas conferem uma sensibilidade reduzida. Com isto, alguns testes fenotípicos não conseguem detectar a produção de KPC por estas bactérias (CUZON, NAAS, TRUONG et al., 2010). Ainda existe dificuldade em detectar laboratorialmente bactérias produtoras de KPC, pois essas bactérias podem não demonstrar resistência aos carbapenêmicos in vitro, pelos testes convencionais e, se a opção terapêutica for os carbapenêmicos, pode ocorrer falha terapêutica e seleção das bactérias produtoras de KPC (PFEIFER, CULLIK & WITTE, 2010). O Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI) em 2009 propôs utilizar o teste de Hodge modificado (THM) como um teste complementar para a detecção da produção de KPC, e em 2011 para aumentar a sensibilidade de detecção laboratorial dessa 10

28 carbapenemase, diminuíram os pontos de cortes dos antimicrobianos ertapenem, meropenem e imipenem considerando dados epidemiológicos, genéticos e de avaliação da farmacocinética e farmacodinâmica dos carbapenêmicos (CLSI, 2009, CLSI 2011) Enzimas Cromossomais: IMI, NMC e SME As carbapenemases IMI, NMC e SME são representantes das serinocarbapenemases com atividade cromossomal e induzível. Essas enzimas possuem um perfil hidrolítico forte frente as aminopenicilinas e aos carbapenêmicos e uma hidrólise fraca das ureido-penicilinas e do azetreonam e não hidrolisa cefalosporinas de espectro estendido. O perfil de antibiograma apresenta sensibilidade reduzida ou resistência aos carbapenêmicos associado à sensibilidade às cefalosporinas de espectro estendido (NORDMANN & POIREL, 2002). Estas carbapenemases cromossomais podem ser induzidas em resposta ao uso de imipenem e cefoxitina e por não apresentarem nenhuma associação com elementos móveis possuem uma baixa prevalência. Estes mecanismos têm sido descritos em particularmente duas espécies de enterobactérias, Serratia marcescens a enzima SME e em Enterobacter cloacae as enzimas NMC e IMI (QUEENAN & BUSH, 2007) GES As últimas serino-carbapenemases da classe A relatadas são as enzimas do tipo GES. Este grupo contém quinze enzimas, porém apenas quatro, GES-2, GES-4, GES-5, e GES-6, têm atividade para os carbapenêmicos (QUEENAN & BUSH, 2007). Existem poucos relatos de carbapenemases do tipo GES e a GES-5 é a enzima com maior disseminação, tendo sido encontrada da África do Sul, Grécia e Japão. Estas enzimas são relatadas associadas a frequências únicas de casos (QUEENAN & BUSH, 2007). No Brasil apenas a GES-5 foi detectada em isolados de P. aeruginosa e K. pneumoniae em um hospital em São Paulo (PICAO, POIREL, GALES et al., 2009, RIBEIRO, FALCI, ROZALES et al., 2014) Metalo-Beta-lactamase A primeira MBL foi descrita em 1966 em isolados de Bacillus cereus, sendo codificada cromossomicamente (DAVIES & ABRAHAM, 1974). Devido ao surgimento 11

29 das MBLs mediadas por plasmídeos em Pseudomonas spp., Acinetobacter spp. e em membros da família Enterobacteriaceae em vários países, este mecanismo de resistência tem se tornado um sério problema, pois limita as opções terapêuticas para combater infecções causadas por essas bactérias. Além disso, não são descritos inibidores efetivos dessas enzimas (POIREL, MAGALHAES, LOPES et al., 2004). Atualmente apenas para a enzima VIM-2 um inibidor possui ação efetiva, porém ainda em fase de teste (XIAO, FANG, SHI et al., 2015). As MBLs são BLA pertencentes a classe B de Ambler ou classe 3 de Bush, são capazes de hidrolisar todos os beta-lactâmicos, exceto o aztreonam e são resistentes aos inibidores de BLA e sensíveis à inibição por quelantes. Estas enzimas dependem dos íons de zinco divalentes para hidrolisar os antimicrobianos. As MBLs cromossômicas são produzidas intrinsecamente em Stenotrophomonas maltophila, Bacillus cereus, Legionella gormaniie, Aeromonas spp. e Chryseobacterium meningosepticum. Já as MBLs plasmidiais têm aumentado a disseminação nos últimos anos e está diretamente relacionada a frequência da espécie (RICCIO, FRANCESCHINI, BOSCHI et al., 2000). As classes de MBLs relatadas em isolados clínicos incluem Verona imipemenase (VIM), imipenemase (IMP), Nova Delhi metalo-beta-lactamase (NDM), German imipenemase (GIM), São Paulo metalo-beta-lactamase (SPM) e Seoul imipenemase (SIM) (WALSH, TOLEMAN, POIREL et al., 2005) IMP e VIM A primeira enzima IMP foi descoberta em 1988 no Japão em uma cepa de P. aeruginosa e durante muitos anos ficou restrita apenas neste país, porém, atualmente IMP- 1 tem sido encontrada em diversos países e em diferentes espécies bacterianas, como Acinetobacter baumannii, P. aeruginosa e K. pneumoniae. Existem 26 variantes pertencentes à sub-classe IMP descritas até o momento (OSANO, ARAKAWA, WACHAROTAYANKUN et al., 1994, DANEL, HALL, DUKE et al., 1999, CARRER, POIREL, YILMAZ et al., 2010). A primeira enzima VIM foi descrita na Itália a partir de uma cepa de P. aeruginosa isolada em O gene blavim-1 codifica uma proteína composta por 266 aminoácidos e possui pouca semelhança com outras MBLs, entretanto, possuem atividades cinéticas similares. Das vinte e três enzimas de VIM, três, VIM-12, VIM-19 e VIM-23 foram 12

30 descritas em enterobactérias e as demais em P. aeruginosa (YONG, TOLEMAN, GISKE et al., 2009) NDM A primeira NDM foi descrita em 2008 em uma viajante sueca que esteve na Índia, deste então blandm foi encontrada em todos os continentes (YONG, TOLEMAN, GISKE et al., 2009). Em comparação com outras MBLs, a NDM tem características de propagação alarmante, incluindo ampla distribuição em bactérias Gram negativas, sendo facilmente adquiridas por E. coli e K. pneumoniae, que são espécies da microbiota intestinal e com grande capacidade de sobreviver no ambiente inanimado. A NDM está presente de forma endêmica no continente indiano, sudeste e leste da Ásia, que abriga uma grande proporção da população mundial, tem grande transferência interespécies e pode ser transportado com outros genes de resistência (RAHMAN, SHUKLA, PRASAD et al., 2014) Antimicrobiano Polimixina O surgimento de microrganismos pan-resistentes, os quais resistem a todas as classes de antimicrobianos testados, são atualmente uma ameaça para a saúde humana que pode ocasionar uma catástrofe iminente de uma era pós- antimicrobianos, em que infecções comuns e ferimentos leves podem voltar a matar. A resistência aos antimicrobianos pode colocar as conquistas da medicina moderna em risco. Sem antimicrobianos eficazes para a prevenção e tratamento de infecções, transplantes de órgãos, quimioterapia e cirurgias como cesarianas serão mais arriscadas e perigosas (NORDMANN & POIREL, 2014). A polimixina é um polipeptídio catiônico produzido por Bacillus polymyxa, descoberta em 1947, e os principais representantes são, polimixina A, B, C, D e E (colistina), sendo utilizada clinicamente apenas Polimixina B e (LI, NATION, MILNE et al., 2005). A utilização destes antimicrobianos por via intravenosa para combater infecções causadas por bactérias Gram negativas foi diminuindo em 1980, devido à alta toxicidade, principalmente lesão renal, e ao surgimento de outros antimicrobianos menos tóxicos. Com isso, o uso endovenoso de colistina foi restringido durante duas décadas para o tratamento de infecções pulmonares causadas por bactérias Gram negativas multirresistentes em pacientes com fibrose cística (FALAGAS & KASIAKOU, 2005). O surgimento de bactérias resistentes à maioria das classes de antimicrobianos e a indústria farmacêutica não ter desenvolvido novos antimicrobianos os quais as bactérias 13

31 ainda não tenham mecanismo de resistência efetivos, as polimixinas foram novamente introduzidas na prática clínica, em alguns casos, como última opção terapêutica disponível (FALAGAS & KASIAKOU, 2005, LIU, ZHANG, LIU et al., 2015) Resistência à Polimixina Para graves infecções causadas por Enterobacteriaceae produtoras de carbapenemase as opções de tratamento são restritas e normalmente contam com tigeciclina e polimixina isoladamente ou em combinação com outros antimicrobianos (LIU, ZHANG, LIU et al., 2015). Como a incidência de enterobactérias produtoras de carbapenemases está cada vez maior, a utilização em grande escala da polimixina para tratamento pode aumentar o risco de pan-resistência (FALAGAS, LOURIDA, POULIKAKOS et al., 2014) Resistência à Polimixina por Mutação Genética As bactérias já desenvolveram mecanismos capazes de inativar a ação da polimixina. Um deles é a resistência cromossômica mediada que tem como alvo impedir a ação da polimixina na membrana celular da bactéria. A ligação inicial da polimixina com a membrana ocorre através de interações eletrostáticas entre o polipeptídeo catiônico do fármaco e o lipopolissacárideo (LPS) da membrana externa da bactéria Gram negativa. A polimixina libera magnésio (Mg +2 ) e cálcio (Ca +2 ), que normalmente estabiliza as moléculas de LPS, levando a uma perturbação na membrana externa, o que provoca um aumento na permeabilidade da membrana, um vazamento do conteúdo citoplasmático, e, consequentemente, a morte das células (MOORE, BATES & HANCOCK, 1986). A resistência cromossômica adquirida ocorre devido à mutação genética em espécies sensíveis a polimixina e é dependente da antibioticoterapia com polimixina. Além disso, é um fenótipo reversível que na ausência da pressão seletiva estabelecida pelo fármaco é eliminada, já a resistência natural é característica de determinadas espécies bacterianas e independe da presença contínua do antimicrobiano (FALAGAS & KASIAKOU, 2005, LIU, WANG, WALSH et al., 2016). 14

32 Resistência à Polimixina por Plasmídeo (MCR-1) Até o momento a resistência às polimixinas eram desenvolvidas apenas por mutação genética cromossômica, porém com a alta utilização deste antimicrobiano em produção agrícola e para combater infecções graves por enterobactérias multirresistentes nos hospitais, as bactérias desenvolveram um mecanismo de resistência por plasmídeo, denominado MCR-1, contra os antimicrobianos polimixina B e colistina (LIU, WANG, WALSH et al., 2016). O gene MCR-1 foi encontrado em um plasmídeo conjugativo em E. coli e desenvolve um novo tipo de resistência à polimixina através da produção de transferase fosfoetanolamina que é transferível interespécies com alta frequência. Esse plasmídeo transfere informações para desenvolvimento de resistente a polimixina. A análise do plasmídeo revelou que ocasionalmente plasmídeos de estrutura semelhante foram detectados em Salmonella typhimurium, K. pneumoniae, E. coli e alguns plasmídeos portadores de MCR-1 também abrigam outros genes de resistência, incluindo ESBL e carbapenemases (SCHWARZ & JOHNSON, 2016) Antimicrobiano Tigeciclina As enterobactérias já desenvolveram resistência a tigeciclina, apesar de ser um antimicrobiano novo aprovado pelo U.S. Food and Drug Administration (FDA) em Vários estudos começaram a demonstrar enterobactérias que inicialmente eram sensíveis, adquiriram mecanismos de resistência à tigeciclina (ALEXOPOULOU, VASILIEVA, AGIASOTELLI et al., 2016). A tigeciclina é um antimicrobiano derivado de minociclina, sendo o único representante do grupo das glicilciclinas. O seu mecanismo de ação consiste na inibição da tradução proteica atuando na subunidade 30S do ribossomo, bloqueando a entrada do RNA transportador. Este antimicrobiano exibe um largo espectro de atividade contra a maioria das bactérias Gram positivas, Gram negativas, anaeróbios e bactérias atípicas (ZHONG, XU, CHEN et al., 2014) Detecção Laboratorial das Carbapenemases Com o surgimento de novos mecanismos de resistência bacteriana que dificilmente são detectados pelos métodos tradicionais de realização do antibiograma, os laboratórios 15

33 de microbiologia estão adotando testes complementares para triagem fenotípica. Os novos perfis de resistência, principalmente nas enterobactérias, ocorreram após o aumento na utilização dos antimicrobianos beta-lactâmicos (LEE & CHUNG, 2015). A detecção de bactérias produtoras de mecanismos de resistência adquiridos como as BLA, ESBL, carbapenemases e MCR-1 é uma questão importante para definição da terapia apropriada e, principalmente, para a implementação de medidas de controle de infecção. Entretanto a detecção dessas bactérias com genes de resistência só é realizada quando estas já exibem resistência nos testes de sensibilidade ao antimicrobiano, pois os testes fenotípicos são baseados nas resistências aos antimicrobianos e os testes moleculares têm alto custo (HAMMOUDI, MOUBARECK & SARKIS, 2014) Testes Fenotípicos Os sistemas automatizados identificam bactérias e realizam testes de sensibilidade através do sistema de detecção óptica. Os testes de sensibilidade são semi-quantitativos, pois avaliam de duas a quatro diluições que representam os limites de sensibilidade e resistência de cada antimicrobiano, sendo assim, não fornecem o resultado exato da CIM da droga (HIRSCH, CHANG, ZUCCHI et al., 2014). Os testes fenotípicos recomendados pelo CLSI 2016 para detectar resistências atípicas nos laboratórios de rotina são utilizados para triar as principais resistências aos carbapenêmicos, KPC e MBLs. O THM, para detecção da KPC e o teste com inibidor e potenciador de crescimento bacteriano, para detecção das MBLs, principalmente NDM (CLSI, 2016). No Brasil, a ANVISA publicou a nota técnica Nº 01/2013 Medidas de prevenção e controle de infecções por enterobactérias multirresistentes -, recomendando a determinação da resistência para os antimicrobianos carbapenêmicos, polimixina B, colistina e tigeciclina através da CIM por métodos quantitativos para guiar o tratamento e o teste complementar com inibidor e potenciador de crescimento bacteriano para definir a carbapenemase KPC e MBL presente no isolado bacteriano Teste de Gradiente de Difusão O teste de gradiente de difusão (TGD) é um método quantitativo, baseado nos conceitos dos testes de difusão e diluição. Como os métodos de CIM, o TGD quantifica diretamente a sensibilidade antimicrobiana e apesar de ser processado como teste de disco 16

34 convencional, difere do método pelo uso de um gradiente pré-formado e estável de antimicrobiano com concentrações crescentes marcadas com uma escala para leitura da elipse formado (Figura 3). O resultado é avaliado através do gradiente de concentração exponencial pré-definido com uma faixa contínua que varia de 0,016 a 256 µg/ml ou 0,002 a 32 µg/ml dependendo do antimicrobiano. A interpretação do resultado é realizada baseada nas CIM definidos pela Nota Técnica 01/2013 ANVISA (PEREZ, 2015). Figura 3. Teste de sensibilidade através TGD de polimixina B CIM 64 µg/ml (Autoria própria) Disco Difusão com Ácido Etilenodiamino Tetra-acético e com Ácido Fenilborônico Um teste fenotípico para detectar as carbapenemases mais encontradas atualmente em enterobactérias (MOELLERING, 2010) em laboratórios clínicos é baseado na capacidade que o ácido fenilborônico (AFB) e o ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA, do inglês Ethylenediamine tetraacetic acid ) têm de potencializar a inibição das bactérias (ANVISA, 2013). O teste é realizado após a realização do antibiograma com resultado resistente a qualquer antimicrobiano carbapenêmico, porém para as bactérias Citrobacter freundii, Enterobacter spp., Serratia spp., Providencia spp., Morganella morganii e Hafnia alvei (grupo CESP) deverão ser considerados apenas os resultados do meropenem e imipenem (Figura 4) (ANVISA, 2013). 17

35 Figura 4. Teste da nota técnica 01/2013 da ANVISA com carbapenêmicos sem aditivo, com 10 µl de AFB e 10 µl de EDTA para avaliar aumento dos halos de inibição dos antimicrobianos (mm). Resultado: espécie avaliada K. pneumoniae, número 1 ertapenem (5 mm), 2 meropenem (5 mm), 3 imipenem (14 mm). Com AFB, números 4 imipenem (18 mm) e 5 meropenem (12 mm). Com EDTA números 6 imipenem (20 mm) e 7 meropenem (12 mm) (Autoria própria) EDTA O EDTA é um ácido aminopolicarboxílico incolor, solúvel em água que exerce um efeito inibidor sobre o crescimento de microrganismos por sequestrar o ferro e outros íons metálicos essenciais. Ele é frequentemente usado como um agente seletivo bacteriano e sua utilidade surge devido ao seu papel como um ligante hexadentado e agente quelante, ou seja, sua capacidade de sequestrar os íons do metal tais como Ca 2+ e ferro (Fe 3+ ). Depois de ser ligado por EDTA, os íons de metais permanecem em solução, mas exibem reatividade diminuída. EDTA também é conhecido por inibir uma variedade de metalopeptidases, o método de inibição ocorre através da quelação do íons metálicos necessários para a atividade catalítica (LEOPOLD & FRICKE, 1997, HATTORI, KAWAMURA & ARAKAWA, 2013) AFB O AFB tem sido utilizado na detecção de BLA classe A mediada por plasmídeo. Esse composto é um inibidor das enzimas do tipo KPC. A sinergia do AFB com os antimicrobianos foi aplicada para a identificação fenotípica dos isolados produtores de KPC. Os resultados positivos apresentam um efeito sinérgico entre os antimicrobianos carbapenêmicos e o AFB, demonstrando uma interação com o sítio ativo das enzimas KPC (PASTERAN, MENDEZ, RAPOPORT et al., 2010, POURNARAS, POULOU & TSAKRIS, 2010). 18

36 Teste de Hodge modificado O THM é baseado na inativação de um antimicrobiano carbapenêmico por uma cepa resistente produtora de carbapenemase de modo que uma cepa sensível seja capaz de crescer em uma região próxima do disco de carbapenêmico quando normalmente não cresceria (Figura 5) (ABIDIN, SULONG, ALFIZAH et al., 2015). A detecção laboratorial de carbapenemase é um desafio, especialmente para os laboratórios sem recursos de diagnóstico molecular, então o THM é uma opção adicional para triar as bactérias produtoras de carbapenemases. O CLSI, a partir de 2009, propôs a detecção fenotípica de carbapenemases do tipo KPC pelo THM para cepas que apresentam sensibilidade diminuída aos carbapenêmicos, porém apesar de ser de fácil execução, existe divergência nos valores de especificidade (CARVALHAES, PICAO, NICOLETTI et al., 2010). Embora o THM apresente sensibilidade elevada, superior a 90% para KPC, a sua interpretação é difícil e subjetiva, muitos estudos demonstraram resultados positivos na presença de outras BLA como ESBL e AmpC acopladas com perda de porina (POURNARAS, POULOU & TSAKRIS, 2010, RIBEIRO, LINHARES, ZAVASCKI et al., 2014). Figura 5. Teste de Hodge modificado para avaliar a produção de KPC (Autoria própria). Notar o halo distorcido em duas semeaduras em traço, número 1 controle positivo com a bactéria K. pneumoniae BAA1705 e número 2 com a bactéria a ser pesquisada, que é indicativo de presença de carbapenemase do tipo KPC. Número 3, controle negativo com a bactéria K. pneumoniae BAA1706 sem distorção do halo e número 4, E. coli ATCC 25922, cepa sensível aos carbapenêmicos. 19

37 Teste de Inativação dos Carbapenêmicos O teste de inativação dos carbapenêmicos (TIC) é um ensaio fenotípico para detectar cepas produtoras de carbapenemases através de hidrólise enzimática dos antimicrobianos. Os genes que codificam carbapenemases estão na maioria das vezes localizados em plasmídeos e são mais susceptíveis à transmissão entre as bactérias, então a distinção entre resistência mediada por carbapenemases plasmidiais e resistência mediada por outros mecanismos é importante para o controle de infecção (VAN DER ZWALUW, DE HAAN, PLUISTER et al., 2015). A vantagem do teste TIC é que ele pode detectar as carbapenemases independentemente da sequência genética que a codifica, porém não identifica qual é a carbapenemase que está presente. Este teste apresenta melhor sensibilidade do que o THM e o teste da nota técnica 01/2013 para detectar as carbapenemases do tipo NDM e OXA- 48 (VAN DER ZWALUW, DE HAAN, PLUISTER et al., 2015). O teste TIC é baseado no consumo do antimicrobiano presente nos discos comerciais para realização do teste de suscetibilidade (Figura 6). A bactéria a ser pesquisada é colocada em alta concentração em uma suspensão com o disco de meropenem por um tempo determinado e ao retirar o disco dessa suspensão, o teste de suscetibilidade com E.coli ATTC conhecidamente sensível aos carbapenêmicos é realizado. A interpretação para o teste é baseada na formação do halo de inibição, se não forma o halo, a bactéria que foi colocada na suspensão consumiu o antimicrobiano presente no disco e o resultado é positivo para carbapenemase (VAN DER ZWALUW, DE HAAN, PLUISTER et al., 2015). Figura 6. Teste de inativação do carbapenêmico para avaliar a produção de carbapenemase (Autoria própria). Os discos numerados de 1 a 10 tiveram o antimicrobiano do disco consumido pela bactéria a ser pesquisada e o resultado é positivo 20

38 para a produção de carbapenemase e o disco N é o controle negativo do teste com o halo de inibição Testes Moleculares Os testes moleculares são confirmatórios para detectar a presença de genes de resistência bacteriana. A caracterização molecular dos mecanismos de resistência permite aos programas de vigilância identificar os genes de resistência circulantes e realizar estudos epidemiológicos envolvendo cepas resistentes, inclusive as produtoras de ESBL, carbapenemases e MCR-1 (BONOMO, 2011). A disseminação de clones bacterianos com genes de resistência é uma ameaça para o controle de infecção bacteriana e para a antibioticoterapia. Alguns estudos apontam alguns clones como responsáveis pela disseminação de importantes genes de resistência como a K. pneumoniae ST258 produtora de KPC-2 ou KPC-3 e disseminação de E. coli ST131 produtora de ESBL CTX-M-15. Também, crescentes relatos da detecção da enzima NDM, já preocupa, pois pode se disseminar globalmente por clones específicos e plasmídeos epidêmicos (KITCHEL, RASHEED, PATEL et al., 2009, LEAVITT, CARMELI, CHMELNITSKY et al., 2010, BONOMO, 2011) Reação em Cadeia da Polimerase A pesquisa dos genes de resistência blakpc, blandm e MCR-1 pela técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR, do inglês polymerase chain reaction ) que através da amplificação de DNA permite identificar e caracterizar estes genes em uma grande quantidade de amostras simultaneamente, facilita os estudos epidemiológicos (WOODFORD, TURTON & LIVERMORE, 2011). Os métodos baseados em PCR têm sido amplamente utilizados, pois seu princípio básico consiste em amplificar regiões específicas da molécula do DNA utilizando os oligonucleotídeos e as DNA polimerases tornando possível estudar regiões específicas (CHROMA & KOLAR, 2010). A técnica de PCR permite obter, em apenas algumas horas, um elevado número de cópias de um fragmento específico de DNA a partir de uma quantidade mínima de amostra. Para realizar a PCR, além do fragmento de DNA, é necessário ter uma DNA polimerase termoestável, os quatro desoxirribonucleosídeos trifosfato (datp, dgtp, dctp e dttp, em conjunto, dntps), um par de oligonucleotídeo iniciador específico (Forward sentido 21

39 5 3, e Reverse sentido 3 5 ) e um tampão apropriado para a reação ser realizada. A reação envolve a repetição cíclica (25-30 vezes) de três etapas que correspondem a simples mudanças na temperatura de incubação: desnaturação do DNA, hibridização dos oligonucleotídeos iniciadores e extensão. No final da reação, os produtos de PCR incluem a molécula de DNA de cadeia dupla original e milhões de cópias do fragmento inicial amplificado (BROWN, 2001) Eletroforese em Gel em Campo Pulsado (PFGE) Técnicas com capacidade discriminatória que permitam distinguir cepas de um mesmo clone e mutações pontuais responsáveis pela resistência específica a antimicrobianos, facilitam a implantação de medidas de barreira e podem orientar a conduta da antibioticoterapia de forma mais eficiente e reduzir a prevalência de clones resistentes (JOHNSON, URBAN, WEISSMAN et al., 2012). A eletroforese em gel em campo pulsado (PFGE, do inglês pulsed field gel eletrophoresis ) é uma técnica de eletroforese apropriada para separar grandes fragmentos de DNA, por meio da organização do DNA em gel pela ação de alternados campos elétricos. A eletroforese em gel de agarose é a técnica mais utilizada para separação de moléculas de DNA por tamanho. A matriz formada pela agarose, cuja porosidade é inversamente proporcional à concentração do gel, atua como filtro molecular (FANGMAN, 1978). Durante a eletroforese, e a dificuldade de transpor a matriz de agarose em direção ao polo positivo é inversamente proporcional ao tamanho de cada molécula, com isso moléculas mais pesadas se difundem menos e as menores migram mais rapidamente possibilitando a separação por tamanho ou peso molecular (SMITH & CANTOR, 1987). Com o intuito de se discriminar linhagens bacterianas de uma mesma espécie, o DNA bacteriano total é digerido com enzimas de restrição que clivam o cromossomo em grandes fragmentos. Os fragmentos formados são então separados por PFGE (SLATER, DESRUISSEAUX & HUBERT, 2001). 22

40 2. JUSTIFICATIVA Nos últimos anos a literatura tem evidenciado um número expressivo de genes bacterianos de resistência à diversas classes de antimicrobianos, configurando-se um problema de saúde pública mundial. A dinâmica e disseminação da resistência bacteriana aos antimicrobianos envolvem vários fatores, que interagem e contribuem para a seleção das bactérias. No entanto, o principal fator é a capacidade que as bactérias têm em mobilizar genes de resistência (CARATTOLI, 2009, BAJAJ, SINGH & VIRDI, 2016). Na família Enterobacteriaceae, a resistência aos carbapenêmicos é um fenômeno que tem importância epidemiológica e clínica (MUNOZ-PRICE, POIREL, BONOMO et al., 2013), e no Brasil, não possui um sistema de informação efetivo em resistência bacteriana capaz de unificar e definir as ações necessárias para cada local, com isso, utiliza as informações de outros países por meio de documentos como CLSI (ANDRADE & DARINI, 2015). O hospital do estudo presta um serviço final ao paciente portador de necessidades especiais, com o objetivo de ensinar a família e o paciente a viver com a deficiência adquirida, com isso, quanto menor a quantidade de infecção adquirida, maior o tempo disponível para as atividades de reabilitação, pois os pacientes com infecções não realizam todas as atividades e retardam a alta hospitalar. Então investigar as principais carbapenemases circulantes, ajudará na terapia empírica e na prevenção. Um incentivo ainda maior foi através da Organização Mundial de Saúde que elaborou a primeira lista de patógenos para incentivar pesquisas e buscar novos tratamentos das infecções. A classificação foi de acordo com a capacidade que a bactéria tem em adquirir resistência, e as enterobactérias foram citadas como prioridade crítica. Embora seja relevante, poucos estudos têm relacionado a presença de carbapenemases no estado de Goiás, e conhecer não só essas resistências, mas quais as mais relevantes vão ajudar na definição de tratamento para infecções com esses patógenos. 23

41 3. OBJETIVOS 3.1. Objetivo Geral Caracterização fenotípica e genética de enterobactérias produtoras de carbapenemases em um hospital de Goiânia Objetivos Específicos Identificar a presença de enterobactérias produtoras de carbapenemase do tipo KPC e NDM no hospital do estudo. Verificar a presença dos genes blakpc, blandm e MCR-1 nas bactérias investigadas. Caracterizar a similaridade genética dos isolados clínicos por PFGE. Identificar possíveis clusters responsáveis pela infecção por isolados de K. pneumoniae KPC positivos. 24

42 4. MÉTODOS 4.1. Seleção das amostras e aspectos ético-legais As amostras bacterianas foram obtidas de exame de cultura de secreções, urina, ponta de cateter, hemoculturas entre outras, coletadas dos pacientes do hospital de reabilitação entre os anos de 2012 e 2016 mediante necessidade de investigação de infecção solicitada pelos médicos assistentes, ou quando solicitadas culturas de vigilância, conforme protocolo padrão da instituição. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UFG número (anexo 01) Perfil Clínico do Hospital O hospital do estudo realizado atende especialmente o grande incapacitado, principalmente pacientes com doenças neuromusculares, lesão encefálica adquirida, malformação congênita, lesão medular e paralisia cerebral. Possui 136 leitos divididos em quatro alas de tratamento. Internação 1 com 14 leitos de cuidados semi-intensivos, Internação 2 com 50 leitos cirúrgicos, Internação 3 com 52 leitos de reabilitação e uma UTI com 20 leitos, também, possui o serviço de atendimento domiciliar com uma equipe médica e assistencial que acompanha os pacientes até a sua total recuperação através do serviço ambulatorial. O atendimento oferecido está classificado nos níveis terciário e quaternário, de acordo com os critérios do Sistema Único de Saúde (SUS), sem atendimento emergencial (REIS & BRAZIL. SECRETARIA DE ASSISTE NCIA A SAU DE. DEPARTAMENTO DE CONTROLE E AVALIAÇA O DE SISTEMAS., 2001). O hospital possui um Serviço de Controle de Infecção Hospitalar (SCIH), o qual é responsável em analisar os antimicrobianos administrados e isolar os pacientes com infecções por bactérias multirresistentes (PATERSON & DOI, 2007). 25

43 4.3. Critérios de Inclusão As bactérias provenientes das culturas dos pacientes que apresentaram sensibilidade reduzida a um ou mais carbapenêmicos pelo teste automatizado Vitek II foram incluídas no estudo Critério de Exclusão As bactérias provenientes das culturas dos pacientes que apresentaram perfil de sensibilidade aos carbapenêmicos pelo teste automatizado Vitek II foram excluídas do estudo Isolamento e Identificação Bacteriana O isolamento primário foi de acordo com o sítio anatômico e as amostras de sangue foram inoculadas no sistema de hemocultura do BactAlert (BioMérieux), as amostras de secreções foram semeadas nos meios de crescimento ágar sangue (BioMérieux), ágar chocolate (BioMérieux) e as amostras de urina foram semeadas em ágar cled (Himédia) e todas as culturas positivas foram isoladas em meios específicos para bactérias Gram negativas, ágar MacConkey (BioMérieux). Após semeadura, as placas foram incubadas em estufa a 36ºC e após 24 horas, as culturas positivas foram identificadas e o teste de sensibilidade foi realizado no aparelho VITEK II (biomérieux, Basingstoke, Reino Unido). Este sistema automatizado utiliza cartões com reagentes colorimétricos, que são inoculados com uma suspensão bacteriana. Cada cartão possui 64 poços, cada um contendo um substrato de teste. Estes substratos medem as atividades metabólicas da bactéria, como, alcalinização, hidrólise enzimática e turbidez (BIOMERIEUX, 2014). Para a identificação foi preparada uma diluição da bactéria isolada a 0,5 na escala de Mac Farland em salina a 40% própria do sistema do aparelho VITEK II e para testar a suscetibilidade aos antimicrobianos, 125 µl desta diluição foi dispensada, segundo especificação do fabricante, em 3 ml de salina a 40%. O cartão utilizado para identificação de bactérias Gram negativas foi o GN ID CARD e o cartão para o antibiograma foi o ATS-N239 com antimicrobianos de nível hospitalar. 26

44 Teste de Suscetibilidade aos Antimicrobianos Os painéis utilizados pelo sistema VITEK II contêm os antimicrobianos com pontos de cortes utilizados para determinar o perfil de sensibilidade de acordo com o CLSI 2016 e os seguintes antimicrobianos foram testados: amicacina, ampicilina, ampicilina/sulbactam, cefuroxima, ciprofloxacina, colistina, gentamicina, piperacilina/tazobactam, tigeciclina, ceftriaxone, cefepime, ceftazidima, cefoxitina, imipenem, meropenem e ertapenem Testes Complementares Todas as enterobactérias que apresentaram resistência aos carbapenêmicos foram submetidas aos testes fenotípicos complementares para verificação da presença de carbapenemases Teste de Hodge Modificado Após preparar o inóculo de Escherichia coli ATCC 25922, sensível a todas as classes de antimicrobianos, na escala 0,5 de Mac Farland, em uma placa de ágar Müeller- Hinton (Newprov) esta bactéria foi semeada. Em seguida, foi colocado um disco de meropenem (Cecon) no centro da placa e semeado no sentido extremidade até o disco um traço de Klebsiela pneumoniae ATCC 1706 como controle negativo, um outro traço foi feito com a cepa Klebsiela pneumoniae ATCC 1705 como controle positivo e finalmente um traço com a bactéria a ser pesquisada. Após incubação por 18 horas a 36ºC a carbapenemase foi detectada pela presença de um halo distorcido pela cultura bacteriana inoculada radialmente que permitiu o crescimento da cepa E. coli ATCC nas proximidades do disco de meropenem (CLSI, 2016) Teste com o Inibidor e Potenciador para Detecção de Carbapenemase do Tipo NDM e KPC (ANVISA, 2013). A suspensão bacteriana a ser pesquisada teve a concentração ajustada equivalente a 0,5 da escala de Mac Farland e um swab foi umedecido nesta suspensão e semeado em uma placa de petri com o meio Müeller Hinton. Discos de meropenem (Cecon), imipenem (Cecon) e ertapenem (Cecon) sem aditivos e outros dos mesmos antimicrobianos com 10 µl de EDTA foram colocados sobre o tapete bacteriano recém semeado para pesquisar as 27

45 bactérias produtoras de metalo-beta-lactamase. A placa foi incubada por 24 horas em estufa a 36ºC. Os isolados que obtiveram diferença maior que 5 mm entre o diâmetro do halo de inibição com os discos dos antimicrobianos adicionados de EDTA comparados ao diâmetro do halo de inibição do disco sem EDTA foram considerados potenciais produtores de metalo-beta-lactamase que posteriormente foram confirmados por teste molecular. Para o teste das bactérias produtoras de KPC, foram colocados discos de imipenem e meropenem com AFB e os isolados que obtiveram uma diferença maior que 5mm entre o diâmetro do halo de inibição comparados aos discos dos antimicrobianos sem aditivos foram considerados potenciais produtores de KPC. As cepas controles K. pneumoniae ATCC 1705 produtora de KPC foi utilizada como controle positivo para o teste com AFB e como controle negativo foi utilizado a cepa K. pneumoniae ATCC Para o teste com EDTA o controle positivo foi utilizado as cepas K. pneumoniae de referência nº de linhagem CCBH15668 e Enterobacter cloacae de referência nº de linhagem CCBH (anexo 2) e controle negativo E. coli ATCC e K. pneumoniae Teste de Inativação do Carbapenêmico Foi preparada uma suspensão bacteriana com a amostra a ser testada bem concentrada em 400 µl de água estéril utilizando uma alça de 10 µl da colônia em um tubo de 1,5 ml de polipropileno. Foi adicionado um disco de meropenem de 10 µg nesta suspensão e então foi incubado a 36 C. Após 2 horas o disco foi retirado da suspensão e colocado em uma placa de ágar Müeller-Hinton com E. coli ATCC semeada na escala de 0,5 de Mac Farland. Em seguida, a placa foi incubada a 36 C por 24 horas (VAN DER ZWALUW, DE HAAN, PLUISTER et al., 2015). Os discos que produziram um halo de inibição mostram um resultado negativo para produção de carbapenemase, pois a enzima não hidrolisou o antimicrobiano presente no disco. Os discos que não produziram um halo de inibição mostram um resultado positivo para carbapenemase, pois a enzima hidrolisou o antimicrobiano, inativando o fármaco que quando colocado com cepa sensível E. coli ATCC não apresentou atividade. Para controle positivo do TIC foi utilizado a cepa K. pneumoniae ATCC 1705 produtora de KPC e controle negativo E. coli ATCC

46 Teste de Gradiente de Difusão para Polimixina e Tigeciclina Os isolados que apresentaram resistência aos antimicrobianos polimixina e tigeciclina pelo método automatizado Vitek II foram testados pelo método TGD para confirmação da resistência. Após preparar uma suspensão bacteriana na escala 0,5 da escala de Mac Farland, em uma placa de ágar Müeller Hinton (Newprov) a bactéria foi semeada. Em seguida, foi colocado a tira Etest de polimixina (biomérieux) para as bactérias com resistência a polimixina e uma tira Etest de tigeciclina (biomérieux) para as bactérias resistentes a tigeciclina no centro da placa e após incubação por 24 horas a 36ºC foi analisada a elipse de inibição bacteriano formado e a interpretação foi feita com base nos dados da Nota Técnica 01/2013 (ANVISA, 2013) Condições de Armazenamento Os isolados bacterianos produtores de carbapenemases foram ressemeados em ágar Müeller-Hinton e colocados em estufa a 36ºC por 24 horas. Após o crescimento toda a massa bacteriana foi retirada com a alça descartável estéril e colocada em um tubo de polipropileno de 1,5 ml com solução de caldo tripticaseina de soja (TSB, do inglês trypitic soy broth ) com 20% de glicerol e estocadas em freezer -20ºC para preservação da mesma Extração de DNA Genômico Bacteriano As amostras congeladas em caldo TSB a 20% de glicerol foram reativadas em 3 ml de caldo TSB e incubadas em estufa a 36ºC durante 24 horas para extração do DNA genômico (VAN SOOLINGEN, DE HAAS, HAAGSMA et al., 1994). Após crescimento, 1 ml da cultura foi transferida para tubos de 1,5 ml de polipropileno, logo em seguida foram centrifugados a g por 5 minutos. O sobrenadante foi descartado e acrescentou-se 400 µl de tampão TE (10 mm Tris, 1 mm EDTA, ph 8,0) contendo 3 µl de lisozima a 20 mg/ml e incubou-se a 37ºC por 1 hora e 30 minutos. Em seguida, 70 µl de SDS a 10% e 12 µl de proteinase K a 20 mg/ml foram adicionados e incubou-se a 56ºC por 10 minutos. Após incubação, adicionou-se 100 µl de NaCl a 5,0 M e 80 ml de solução a 10% CTAB e 0,73 M NaCl, agitou-se até atingir um aspecto leitoso, e então incubou-se a 65ºC por 10 minutos. Em seguida acrescentou-se

47 µl de clorofil (clorofórmio: álcool isoamílico 24:1, v/v) e agitou-se por 30 segundos. O material foi centrifugado a g por 5 minutos e o sobrenadante foi transferido para outro tubo, adicionando-se 400 µl de isopropanol gelado seguido de homogeneização. Incubou-se a -20ºC por 24 horas e centrifugou-se a g a 4ºC por 20 minutos, descartou-se o sobrenadante e o sedimento foi lavado com 1 ml de álcool etílico à 70% gelado. Deixou-se o sedimento secar e o mesmo foi suspendido em 50 µl de água miliq Extração do DNA Plasmidial Bacteriano As amostras congeladas em caldo TSB a 20% de glicerol foram reativadas em 3 ml de caldo TSB e incubadas em estufa a 36ºC durante 24 horas para extração do DNA plasmidial (BIRNBOIM & DOLY, 1979). Após crescimento bacteriano 1 ml da cultura foi transferida para tubo de 1,5 ml de polipropileno, logo em seguida foram centrifugados a g por 10 minutos. O sobrenadante foi descartado e o sedimento foi suspendido com 210 µl de solução I composta de 150 mm Tris HCl, 10 mm EDTA ph 8,0, acrescentou-se 10 µl de RNAse em cada amostra e em seguida acrescentou-se 210 µl da solução alcalina II composta de 200mM NaOH, 1% de SDS, então as amostras foram homogeneizadas lentamente e incubadas por 5 minutos a temperatura ambiente. Adicionou-se 280 µl da solução III composta de acetato de sódio 3M, ácido acético 2M, ph 4,8-5,0, e misturou-se imediatamente por inversão por 10 vezes e então foram centrifugadas por 10 minutos a g. Após esta etapa, o sobrenadante foi transferido para outro tubo de 1,5 ml de polipropileno e adicionou-se 560 µl de isopropanol gelado. Logo em seguida, as amostras foram homogeneizadas por inversão e incubadas por 10 minutos a temperatura ambiente. Após esse tempo, centrifugou-as por 15 minutos a g. O sobrenadante então foi descartado e o sedimento foi lavado com 500 µl de etanol a 70% gelado, os tubos então foram colocados para secar e logo em seguida suspendidos com 30 µl de água miliq Condições de Amplificação do DNA As amplificações foram realizadas para os seguintes genes: blakpc, blandm e MCR-1 com os oligonucleotídeos iniciadores para cada alvo (Tabela 2). O método de PCR convencional foi o escolhido. As condições para amplificação dos genes bla e MCR-1 foram, desnaturação inicial a 94ºC por 3 minutos, seguidos de 30 ciclos de desnaturação a 95ºC por 30 segundos, 30

48 anelamento de acordo com o alvo descrito (Tabela 2) por 1 minuto e extensão a 72ºC por 1 minuto seguido de extensão final a 72ºC por 4 minutos. Os reagentes do mix e derivados que foram utilizados foram, 9,3 µl de água mili Q, 2,5 µl de oligonucleotídeos iniciadores forward, 2,5 µl de oligonucleotídeos iniciadores reverse, 5 µl de tampão concentração: 5X (100 mm Tris-HCL (ph 8.0), 0.05 mm EDTA, 0,5 mm DTT, 25% (v/v) glicerol, 2,5 µl de dntps, 0,2 µl de enzima Taqpolymerase Invitrogen e 3 µl de DNA bacteriano. Tabela 2. Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para realização dos PCR Oligonucleotídeos Gene alvo Sequência dos oligonucleotídeos (sentido 5-3 ) Tamanho dos produtos em pares de bases Temperatura de Anelamento ºC KPC Fw KPC Rv blakpc TGT CAC TGT ATC GCC GTC CTC AGT GCT CTA CAG AAA ACC 1009bp 58 NDM Fw NDM Rv blandm TGC CGA GCG ACT TGG CCT TG ACC GAT GAC CAG ACC GCC CA 379bp 62 MCR-1 Fw MCR-1 Rv MCR-1 CGG TCA GTC CGT TTG TTC CTT GGT CGG TCT GTA GGG 309bp 58 Fonte: gene blakpc (TENOVER, KALSI, WILLIAMS et al., 2006), gene blandm (GHAZAWI, SONNEVEND, BONNIN et al., 2012), gene MCR-1 (LIU, WANG, WALSH et al., 2016). As cepas controles utilizadas para as reações de PCR foram, K. pneumoniae ATCC como controle negativo para KPC, K. pneumoniae ATCC 1705 como controle positivo para KPC. K. pneumoniae cepa de referência CCBH15668 e E. cloacae cepa de referência CCBH10892 (anexo 2) como controle positivo para NDM e K. pneumoniae ATCC como controle negativo para NDM. Para pesquisar o gene MCR-1 não conseguimos adquirir cepa para controle positivo, então foi realizado apenas com o controle negativo cepas K. pneumoniae ATCC e K. pneumoniae ATCC Eletroforese em Gel de Agarose Após a realização da reação de PCR foi realizada a eletroforese em gel de agarose a 1,5%, contendo 0,5 µg/l de brometo de etídeo, durante 2 horas a 120 volts. No gel foi 31

49 aplicado um marcador de peso molecular de DNA 1KB Ladder plus (Invitrogen ) para ser usado de padrão de comparação dos tamanhos esperados das amplificações. Em seguida o gel foi fotografado no sistema Molecular Imager GelDoc XR(Bio-Rad) para análise Eletroforese em Gel em Campo Pulsado (PFGE) A bactéria foi inoculada em placas com meio de cultura TSA (Tryptic Soy Agar) durante horas. Em seguida, com um swab umedecido com tampão de suspensão (100 mm Tris, 100 mm EDTA ph 8.0), as colônias foram transferidas para um tubo de ensaio contendo 2 ml de tampão de suspensão. A concentração das células foi ajustada para em comprimento de onda de 610 nm em espectrofotômetro (RIBOT, FAIR, GAUTOM et al., 2006). A suspensão das bactérias foi utilizada para confecção dos blocos de agarose. Os blocos de agarose foram preparados com 200 µl de suspensão de bactérias, 10 µl de proteinase K 20 mg/ml e 200 µl de agarose de corrida para PFGE 1,0% e 1% de SDS em tampão TE (10 mm Tris, 1 mm EDTA, ph 8,0). Os blocos de agarose foram submetidos à lise e desproteinização em 5 ml de tampão de lise (50 mm Tris, 50 mm EDTA ph 8.0; 1,0% sarcosil e 0,1 mg/ml de proteinase K), com incubação a 54ºC durante 2 horas em banho maria com agitação ou shaker 10 g. Após a incubação, os blocos de agarose foram lavados inicialmente com 10 ml de água tipo I esterilizada, em seguida, foram lavados quatro vezes com 10 ml com tampão TE (10 mm Tris, 1 mm EDTA, ph 8.0) esterilizado e pré-aquecido a 50ºC. Após a última lavagem os blocos de agarose foram estocados em tampão TE sob refrigeração. O DNA contido nos blocos de agarose foi digerido com 20U de enzima de restrição XbaI (Invitrogen ) a 37ºC durante 15 horas e a separação dos fragmentos de DNA foi feita em gel de agarose 1,0% em 2 litros de tampão TBE 0,5X (Tris 50 mm, ácido bórico 45 mm e EDTA 2 mm), por eletroforese em gel em campo pulsado no sistema CHEF DRII (Bio-RadLaboratories, CA EUA) nas seguintes condições: 20 h; 6,0 V-cm; 14ºC; switch 5 55 s. Em seguida, o gel foi corado com brometo de etídeo 0,5 mg/ml durante 30 minutos para ser visualizado e fotografado em fotodocumentador sob iluminação ultravioleta com o sistema Molecular Imager GelDoc XR (Bio-Rad). Foi utilizado como padrão de peso molecular Lambda DNA ladder PFGE (Bio-Rad). 32

50 Os géis de PFGE foram utilizados como imagens branco e preto, invertidas de oito bits e processados pelo programa BioNumerics versão 5.1. O dendrograma construído para avaliar a relação genética entre as cepas foi feito utilizando o coeficiente de similaridade de Dice, baseado na posição e presença das bandas e no algoritmo de análise filogenética UPGMA (Unweighted Pair-Groups Method with Arithmetic mean) através de agrupamentos por médias não ponderadas. Os parâmetros de otimização e tolerância foram utilizados com os respectivos valores, 0,9 e 2,0%. Cada cluster foi definido como um agrupamento de perfis (n > 2) com 80 % ou mais de coeficiente de similaridade (CARRICO, PINTO, SIMAS et al., 2005) Análises Estatísticas Para análise estatísticas dos dados referentes ao perfil de suscetibilidade, foi utilizado o Teste Qui-Quadrado ou Teste Exato de Fisher, quando n<50 e mais de 20% das caselas com valores esperados < 5. Para todos os testes, foi considerado um nível de significância de 5% (p-valor <0,05). Utilizou-se o programa de estatística de código aberto OpenEpi (DEAN et al., 2013). 33

51 5. RESULTADOS 5.1. Seleção das amostras Durante o período de estudo, foram identificadas bactérias da espécie K.pneumoniae, de E. coli e 261 de E. aerogenes. Neste período, um total de 180 isolados de enterobactérias resistentes ou com resistência intermediária aos carbapenêmicos foram identificados pelo método automatizado Vitek II. Os isolados recuperados para esse estudo foram 167 sendo 107 (64,1%) K. pneumoniae, 13 (7,8%) E. coli, 44 (26,3%) E. aerogenes e 3 (1,8%) de outras espécies (Figura 7). A B P ro d u to ra s d e C a rb a p e n e m a se s T o ta l= % N ã o P ro d u to r d e C a rb a p e n e m a s e % P ro d u to r d e C a rb a p e n e m a s e T o ta l= % K p n e u m o n ia e % E. a e r o g e n e s % E. c o li % O u tr a s e s p é c ie s % N ã o re c u p e ra d a s Figura 7 Frequência de isolados de enterobactérias produtores de carbapenemases (A) e distribuição por espécie (B). Em relação ao período de isolamento, foi observado que os isolados produtores de carbapenemases foram identificados entre julho 2012 a abril 2016, havendo um maior isolamento das espécies no ano de 2013 (58%, n=97) (Figura 8). 34

52 Figura 8 Número de amostras produtoras de carbapenemases isoladas, de acordo com as espécies bacterianas e por mês de estudo. * Nestes meses foram isolados uma amostra das seguintes espécies jan/2014, C. koseri, abril/2014, C. freundii e junho/2014 E. cloacae Perfil das 167 Amostras dos Pacientes Infectados por Enterobactérias Resistentes aos Carbapenêmicos do Hospital de Reabilitação As 167 amostras de enterobactérias resistentes aos carbapenêmicos foram adquiridas de infecções e colonizações dos pacientes internados em um hospital de reabilitação. As amostras foram provenientes de 98 pacientes com idade entre 06 a 91 anos. Analisando os dados clínicos, observa-se que 60 (61,22%) destas amostras foram obtidas de pacientes do sexo masculino. Os 167 isolados bacterianos produtores de carbapenemases foram recuperados de amostras de urinas= 81, secreção traqueal= 33, sangue= 14, úlcera de pressão sacral (UPS)= 12, ponta de cateter= 9 e outros sítios= 18 como: swabs de vigilância= 13, fragmento de tecido= 2, líquido pleural= 2 e fragmento ósseo 1= (Tabela 3). 35

53 Tabela 3. Frequência das espécies bacterianas produtoras de carbapenemases isoladas durante o período de estudo relacionadas ao material clínico. Espécie Urina Sec. Traqueal Material Clínico * Sangue U.P.S P.C. Outros sítios K. pneumoniae (n=107) 52 (64,2%) 19 (57,6%) 9 (64,3%) 8 (66,6%) 6 (66,7%) 13 (72,2%) E. aerogenes (n=44) 18 (22,2%) 13 (39,4%) 5 (35,7%) 2 (16,7%) 2 (22,2%) 4 (22,2%) E. coli (n=13) 11 (13,6%) (16,7%) - - C. freundii (n=1) (11,1%) - C. koseri (n=1) - 1 (3,0%) E. cloacae (n=1) (5,6%) Total (n=167) 81 (100%) 33 (100%) 14 (100%) 12 (100%) 9 (100%) 18 (100%) * U.P.S = Úlcera de Pressão Sacral; P.C.= Ponta de Cateter; outros sítios = Swab de vigilância, fragmento de tecido, fragmento ósseo, líquido pleural. A maioria dos isolados de K. pneumoniae foi proveniente da ala de internação nº 2, correspondendo a 95,1% (39/41) do total isolado neste local. A maioria dos isolados de E. aerogenes foi proveniente da UTI, correspondendo a 72,1% (31/43) do total de isolados neste local. Com relação a origem dos isolados, o serviço de internação 1 com 46 isolados, foi o local que mais teve isolados resistentes aos carbapenêmicos, seguido da UTI com 43 e internação 2 com 41 (Tabela 4). Tabela 4. Frequência das espécies bacterianas produtoras de carbapenemases isoladas durante o período de estudo relacionadas a origem. Espécies Frequência (%) Int 1 14 leitos Int 2 50 leitos Origem* Int 3 52 leitos UTI 20 leitos K. pneumoniae (n=107) 64,1 32 (69,5%) 39 (95,1%) 21 (77,8%) 11 (25,6%) 4 (40,0%) Amb E. aerogenes (n=44) 26,3 8 (17,4%) 2 (4,9%) 0 31 (72,1%) 3 (30,0%) E. coli (n=13) 7,8 4 (8,7%) 0 5 (18,5%) 1 (2.3%) 3 (30,0%) E. cloacae (n=1) 0, (3,7%) 0 0 C. freundii (n=1) 0,6 1 (2,2%) C. koseri (n=1) 0,6 1 (2,2%) Total (n=167) (100%) 41 (100%) 27 (100%) 43 (100%) 10 (100%) *Amb Ambulatório, Int Internação Teste de susceptibilidade aos antimicrobianos De acordo com os pontos de corte do CLSI 2016 e da nota técnica da ANVISA 01/2013, todas as amostras apresentaram um fenótipo resistente a múltiplas classes in vitro 36

54 pelo método do VITEK II, ou seja, se mostraram resistentes a três ou mais classes de antimicrobianos testados (MAGIORAKOS, SRINIVASAN, CAREY et al., 2012). Considerando os resultados intermediários como resistentes, foram encontrados altos percentuais de resistência à maioria dos antimicrobianos testados. Em relação aos carbapenêmicos, 94,0% das amostras apresentaram resistência ao ertapenem (95,5% não sensíveis), 73,6% ao meropenem (76,3% não sensíveis), 80,8% ao imipenem (89,8% não sensíveis). Em relação aos beta-lactâmicos, 89,8% foram resistentes à ceftazidima (98,8% não sensíveis), 96,4% à cefotaxima (98,8% não sensíveis) e 88% ao cefepime (99,4% não sensíveis). Em relação a piperacilina/tazobactam foi observado um percentual de 98,8% de amostras resistentes e nenhuma com resistência intermediária (Figura 9). Os isolados apresentaram um menor percentual de resistência aos antimicrobianos, polimixina (9,0%), seguido da tigeciclina (9,0%). A classe aminoglicosídeos foi a que apresentou maior sensibilidade, amicacina (3,0%) e gentamicina (54,5%) (Figura 9). 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% ERT MEM IPM CAZ CTX CEF PIP/TAZ GEN AMI TIG POL Resistente Intermediário Sensível Figura 9 Susceptibilidade aos antimicrobianos dos 167 isolados de enterobactérias produtores de carbapenemases. ERT= Ertapenem, MEM= Meropenem, IPM= Imipenem, CAZ= Ceftazidima, CTX= Ceftriaxone, CEF= Cefepime, PIP/TAZ= Piperacilina / Tazobactam, GEN= Gentamicina, AMI= Amicacina, TIG= Tigeciclina, POL= Polimixina. Analisando as espécies com maior número de amostras (K. pneumoniae, E. aerogenes e E. coli), foi observado que, no geral, apresentaram uma resistência maior ao ertapenem. Os isolados de K. pneumoniae (n= 107) tiveram uma diferença estatisticamente significativa (p<0,05) de resistência para cefepime (95,3%), meropenem (93,5%) e 37

55 imipenem (82,2%) em relação a E. aerogenes e E. coli. A resistência ao cefepime nos isolados de E. coli foi significativamente menor do que nos isolados de E. aerogenes (Tabela 5). Tabela 5. Frequência de isolados resistentes aos diferentes antimicrobianos de acordo com a espécie bacteriana estudada determinado pelo sistema automatizado Vitek II. Espécie Antimicrobianos * CEF MER IMI ERT TIG POL K. pneumoniae 102 (95,3%) a 100 (93,5%) c 88 (82,2%) d 99 (92,5%) 15 (14,0%) 14 (13,1%) N= 107 E. aerogenes 40 (90,9%) b 29 (65,9%) 23 (52,3%) 43 (97,7%) 0 1 (2,3%) N= 44 E. coli 7 (53,8%) 12 (92,3%) 10 (76,9%) 13 (100%) 0 0 N= 13 E. cloacae 1 (100%) 1 (100%) 1 (100%) 1 (100%) 0 0 N= 1 C. freundii 1 (100%) 1 (100%) 1 (100%) 1 (100%) 0 0 N= 1 C. koseri N= 1 1 (100%) (100%) 0 0 *CEF Cefepime, MER Meropenem, IMI Imipenem, ERT Ertapenem, TIG Tigeciclina, POL Polimixina B. ª Diferença estatisticamente significativa entre K. pneumoniae e E. coli (p= 0,0003). ᵇ Diferença estatisticamente significativa entre E. aerogenes e E. coli (p= 0,0119). ᶜ Diferença estatisticamente significativa entre K. pneumoniae e E. aerogenes (p= 0,00009). ᵈ Diferença estatisticamente significativa entre K. pneumoniae e E. aerogenes (p= 0,0005) Determinação da concentração inibitória mínima De acordo com os critérios estabelecidos pela nota técnica de ANVISA nº 01/2013, foi observado que 36 (21,5%) amostras apresentaram-se não sensíveis a tigeciclina (resultados resistentes e intermediários), sendo que de todas as amostras, apenas uma era de E. coli e uma de E. aerogenes, as outras 34 eram da espécie K. pneumoniae. Com relação à polimixina B, foi encontrado um percentual de resistência de 9,0%, sendo uma amostra de E. coli e as outras 14 de K. pneumoniae. Para confirmar a resistência a estas drogas foi utilizado o TGD e todas as amostras mostraram-se igualmente resistentes com pequenas variações no valor de CIM determinado por cada teste, segundo a ANVISA, 2013 (Figuras 10 e 11). 38

56 C IM u g /m L A 3 G 5 G 8 G 1 H 4 H 6 H 9 H 2 I 5 I 3 J 9 J 1 K 4 K 5 K 7 K 1 0 K 1 L 1 M 5 M 5 N 6 N 7 N 8 N 3 O 7 O 2 P 3 P 4 P 6 P 7 P 1 Q 4 Q 5 Q 7 Q 8 Q V ite k II T G D Figura 10 Concentrações inibitórias mínimas (CIM) determinada para tigeciclina realizados pelo método automatizado (Vitek II, barras pretas) e pelo TGD (barras cinzas) com a interpretação segundo a ANVISA 01/2013. Sensível: CIM < 1 µg/ml, intermediário: CIM = 2 µg/ml e resistente: CIM > 4 µg/ml. Figura 11 Concentrações inibitórias mínimas (CIM) determinada para polimixina B realizados pelo método automatizado (Vitek II, barras pretas) e pelo TGD (barras cinzas) com a interpretação segundo a ANVISA 01/2013. Sensível: CIM < 2 µg/ml e resistente: CIM > 4 µg/ml. 39

57 5.5. Testes Fenotípicos para Detecção de Carbapenemases Resultado da Nota Técnica 01/2013 da ANVISA Dos 167 isolados que obtiveram nos testes, com carbapenêmicos, sensibilidade reduzida a qualquer um dos antimicrobianos dessa classe, foi realizado o teste segundo a nota técnica 01/2013 (ANVISA, 2013) utilizando inibidores e potenciador para detecção de carbapenemases. A interpretação dos resultados depende de cada espécie. Para as espécies K. pneumoniae e E. coli segue a mesma interpretação utilizando o resultado de imipenem, meropenem e ertapenem, já para as espécies E. aerogenes, E. cloacae e C. freundii a interpretação é baseada nos resultados de imipenem e meropenem. No total, foram identificadas 74,3% (n= 124) das amostras positivas para KPC, 0,6% (n= 01) para MBL e 25,1% (n=42) o resultado foi inconclusivo, o halo de sensibilidade foi igual ou superior a 5 mm para os dois inibidores (EDTA e AFB), não sendo possível caracterizar o tipo de resistência. (Tabela 6). Tabela 6. Teste com o Inibidor e Potenciador para Detecção de Carbapenemase do Tipo NDM e KPC (ANVISA, 2013). Espécies Potencial produtor de Inconclusivo KPC e/ou MBL (%) KPC (%) MBL (%) K. pneumoniae (n=107) 82 (76,6%) 0 25 (23,4%) E. coli (n=13) 10 (76,9%) 1 (7,7%) 2 (15,4%) E. aerogenes (n=44) 29 (65,9%) 0 15 (34,1%) E. cloacae (n=1) 1 (100%) 0 0 C. freundii (n=1) 1 (100%) 0 0 C. koseri (n=1) 1 (100%) 0 0 Total (n=167) 124 (74,3%) 1 (0,6%) 42 (25,1%) Teste de Hodge Modificado O teste de Hodge modificado foi realizado para todas as amostras que tiveram a sensibilidade reduzida aos carbapenêmicos. Das 167 amostras testadas, 119 (71,2%) foram positivas para o teste. 40

58 5.5.3 Teste de Inativação do Carbapenêmico Outro teste fenotípico realizado foi o teste TIC que é baseado na presença ou ausência do antimicrobiano no disco de papel. Das 167 amostras, 162 (97,0%) apresentaram resultado positivo para carbapenemase Testes Moleculares Detecção dos Genes Codificadores das Carbapenemases KPC e NDM A técnica de PCR evidenciou que 80 (47,9%) dos 167 isolados continham o gene blakpc, e o gene blandm não foi identificado em nenhum dos isolados. Todos os isolados de E. cloacae, C. freundii e C. koseri; 48,6% dos isolados de K. pneumoniae; 46,2% de E. coli e 43,2% de E. aerogenes foram positivos para o gene blakpc (Tabela 7, Figura 12 e 13). Tabela 7. Amostras positivas para os genes blakpc, blandm e MCR-1 Espécie Gene blakpc Gene blandm Gene MCR-1 Positivo Positivo Positivo K. pneumoniae n= (48,6%) - - E. coli n=13 6 (46,2%) - - E. aerogenes n=44 19 (43,2%) - - E. cloacae n=1 1 (100%) - - C. freundii n=1 1 (100%) - - C. koseri n=1 1 (100%) - - Total n= (47,9%)

59 Figura 12. Eletroforese do produto do PCR para o gene blakpc de 13 amostras da espécie K. pneumoniae. CN: Controle negativo K. pneumoniae ATCC , CP: Controle Positivo K. pneumoniae ATCC 1705, M: marcador de peso molecular 1009 pb. Figura 13. Eletroforese em gel de agarose dos produtos da PCR para o gene blandm de 9 amostras das espécies K. pneumoniae e E. coli. CN: Controle negativo K. pneumoniae ATCC , CP: Controle Positivo K. pneumoniae cepa de referência CCBH15668 NDM positivo, M: marcador de peso molecular Detecção do Gene MCR-1 Nesse estudo, procuramos o gene de resistência MCR-1 em todos os isolados, inclusive nos que apresentaram resistência à colistina pelo método automatizado Vitek II e pelo método de TGD, porém em nenhum isolado foi identificado o gene MCR-1. (Figura 14). 42

60 Figura 14. Eletroforese em gel de agarose da PCR para o gene MCR-1 para pesquisa de resistência plasmidial à poliximina em 15 amostras. CN: Controle negativo K. pneumoniae ATCC , M: Marcador de peso molecular 309 pb Testes Fenotípicos e Genéticos Realizados com Resultados Positivos para KPC Analisando todos os testes positivos, foi observado que os testes fenotípicos apresentaram um maior número de isolados positivos quando comparado a técnica de PCR para blakpc. O teste TIC foi o que apresentou uma maior sensibilidade (100%) comparado ao demais testes (TH 86% e teste da Nota Técnica 80,5%). O teste de Hodge e o teste da Nota Técnica tiveram resultados semelhantes. Tabela 8. Percentual de amostras produtoras de blakpc associadas aos testes fenotípicos. Espécie Total de Isolados PCR blakpc (%) Teste de Hodge Positivo (%) Nota Técnica para KPC (%) TIC (%) K. pneumoniae (48,6) 79 (73,8) 82 (76,6) 103 (96,3) E. aerogenes (43,2) 27 (61,4) 29 (65,9) 43 (97,7) E. coli 13 6 (46,2) 10 (76,9) 10 (76,9) 13 (100) 5.8. Determinação do polimorfismo genético por eletroforese de campo pulsado em gel de agarose (PFGE) Para a análise da clonalidade foram incluídas todas as amostras produtoras de KPC da espécie K. pneumoniae. Dentre as 52 amostras analisadas observamos grande diversidade genética entre todas os isolados estudados, um total de 13 clusters, com prevalência do cluster A (23,1%; n= 12) encontrado em amostras isoladas da UTI, Internação 1, 2 e 3 entre julho de 2012 a abril de 2014, seguido do cluster C (19,23%; n= 10) encontrado em amostras da UTI, Internação 1 e Ambulatório, isolados entre março de 2013 até outubro de 2013 e cluster I 43

61 (17,30%; n= 9) amostras da UTI, Internação 1, Internação 2 e Internação 3, isoladas setembro de 2013 a janeiro de 2015 (Figura 15). A maioria das amostras foram isoladas em infecções do trato urinário (48,1% n=25), seguido de amostras de secreção traqueal (25,0% n=13). O ano que apresentou maior número de isolados foi o de 2013 (55,8% n=29) Dentre as amostras não sensíveis a tigeciclina (resultados intermediários e resistentes), 22 apresentaram blakpc e estiveram presentes em todos os clusters (Figura 15). Dentre as amostras resistentes a polimixina B, 10 apresentaram blakpc em 7 tipos clonais diferentes (Figura 15). Dos 52 isolados, 9 (17,31%) isolados apresentaram resistência tanto a tigeciclina quanto a polimixina B (Figura 15). 44

62 Figura 15 Dendrograma representativo dos 13 perfis de fragmentação de DNA cromossomal encontrado nas 52 amostras de K. pneumoniae produtoras de KPC. *Amostras resistentes à tigeciclina; # Amostras resistentes à polimixina B. 45

63 6. DISCUSSÃO No presente estudo foram avaliadas 167 enterobactérias resistentes aos carbapenêmicos isoladas de amostras de pacientes de um hospital de reabilitação entre 2012 e Muitos estudos evidenciaram que a frequência das espécies de enterobactérias produtoras de carbapenemases está cada vez maior, principalmente em pacientes hospitalizados. Este fato ocasiona maior tempo de internação e utilização de antimicrobianos mais potentes e tóxicos como polimixina B e tigeciclina (MUNOZ- PRICE, POIREL, BONOMO et al., 2013, RUPPE, WOERTHER & BARBIER, 2015). Um estudo realizado com dados de 36 países da Europa, Ásia, África e América Latina envolvendo 422 UTI s analisaram infecções associadas a utilização de dispositivos invasivos, como sondas e cateteres e mostrou que apesar de ser semelhante a quantidade de utilização de dispositivos em países em desenvolvimento com os países da Europa, a quantidade de infecção em pontas de cateteres, associada a ventilação mecânica e a utilização de sondas urinárias foi muito maior em países em desenvolvimento (ROSENTHAL, BIJIE, MAKI et al., 2012). Como o hospital do estudo realizado atende principalmente pacientes com doenças neuromusculares, lesão encefálica adquirida, malformação congênita, lesão medular e paralisia cerebral, a utilização de dispositivos invasivos como sondas e cateteres é alta e isso, aumenta a frequência de infecções no sistema urinário, respiratório e circulatório (QUEENAN & BUSH, 2007, LAVIGNE, SOTTO, NICOLAS-CHANOINE et al., 2012, BORAH, SAIKIA, CHANDRA et al., 2016). No nosso estudo, 48,5% (n=81) das amostras foram obtidas de infecções no sistema urinário, seguidos de amostras de secreção traqueal 33 (19,7%), sangue 14 (8,4%), úlcera de pressão sacral (UPS) 12 (7,2%) e ponta de cateter 9 (5,4%). Com exceção da UPS que ocorre devido a uma interrupção sanguínea em uma determinada área em virtude de mudanças degenerativas da pele e tecido subcutâneo, todas essas amostras são adquiridas de sítios anatômicos com dispositivos invasivos. O serviço que teve a maior incidência de infecções por agentes multirresistentes foi a Internação 1 seguido do serviço da UTI. Um estudo realizado na Alemanha entre os anos de 2001 a 2008 em 53 UTI s mostrou que a quantidade de utilização de antimicrobianos não aumentou durante estes anos, porém a quantidade de ESBL nas espécies K. pneumoniae e E. coli aumentaram drasticamente, o que duplicou a utilização de carbapenêmicos e consequentemente 46

64 aumentou a quantidade de bactérias resistentes a estes antimicrobianos (MEYER, SCHWAB, SCHROEREN-BOERSCH et al., 2010). Em nosso estudo não pudemos avaliar a evolução do uso de antimicrobianos pelo serviço de saúde, no entanto o uso de carbapenêmicos vem aumentando significativamente. Com o aumento da utilização de carbapenêmicos, aumentou também a resistência das bactérias a estes antimicrobianos, então, em nosso estudo investigamos a presença de carbapenemases por testes fenotípicos, teste da Nota Técnica e THM, que quando comparados apresentaram dados semelhantes para as espécies K. pneumoniae, E. aerogenes e E. coli, porém em comparação com o teste TIC, este apresentou um maior número de isolados positivos, mostrando que este teste possui uma sensibilidade maior para triar as enterobactérias produtoras de carbapenemases. Dados da literatura mostram que os testes fenotípicos apresentam elevada sensibilidade, porém verificou-se que utilizar apenas um teste não é recomendado para confirmar a presença de carbapenemases, visto que quando utilizado dois ou mais testes fenotípicos houve melhora da especificidade, apesar de não excluir a necessidade da análise molecular (BAYRAMOGLU, ULUCAM, GENCOGLU OZGUR et al., 2016). No nosso estudo, realizamos três testes fenotípicos, teste da Nota Técnica, teste de Hodge e TIC para todas as enterobactérias que apresentaram resistência a pelo menos um carbapenêmico pelo teste de sensibilidade automatizado Vitek II. Analisando o teste da Nota Técnica que realiza a detecção fenotípica de carbapenemases utilizando bloqueadores enzimáticos, em nosso estudo, apresentou um resultado positivo para MBL em uma amostra de E. coli, e, apesar da resistência mais frequente dessa classe ser a NDM, o resultado para a pesquisa do gene blandm foi negativo, então este teste pode estar caracterizando a resistência IMP ou VIM, porém não foram pesquisadas. Para a pesquisa de KPC, o teste da Nota Técnica apresentou uma quantidade de amostras positivas superior 74,3% (n= 124) quando comparado ao teste genético, 47,9% (n=80). Em uma parte das amostras, 25,1% (n=42) o resultado apresentado foi inconclusivo, não conseguindo definir o tipo de carbapenemase, pois os halos de inibição foram > 5 mm tanto para meropenem e imipenem com AFB (identificar KPC) quanto para meropenem e imipenem com EDTA (identificar MBL). As bactérias resistentes aos carbapenêmicos em virtude da expressão de mecanismos que não envolvam a produção de carbapenemases, como hiper expressão de ESBL ou AmpC com perda de porina, também podem apresentar resultados falso-positivos 47

65 para a produção de carbapenemase quando testadas pelos testes fenotípicos THM e teste da Nota Técnica (CARVALHAES, PICAO, NICOLETTI et al., 2010). Comparando os resultados dos testes fenotípicos e genéticos, o teste TIC 97% (n= 162), apresentou o maior percentual de positividade para carbapenemase em comparação aos outros testes fenotípicos, mostrando a capacidade de identificar as enterobactérias produtoras de carbapenemases independentemente da base molecular. Este método de rastreio de carbapenemase possui baixo custo e como não exige equipamentos especializados para sua realização pode ser aplicado em todos os laboratórios clínicos. Além disso, pode triar as carbapenemases que ainda não foram pesquisadas / identificada. Um estudo realizado na Holanda mostrou que o TIC é capaz de triar as bactérias Gram negativas produtoras de NDM, KPC, VIM, IMP, OXA-48 e OXA-23 permitindo a distinção entre a resistência ao carbapenêmico devido a atividade de beta-lactamase e de permeabilidade reduzida. Os resultados obtidos nesse estudo tiveram alta concordância (100% para Enterobacteriaceae e 98,8% para os não fermentadores) entre os PCR s que detectaram o gene de resistência e a detecção da atividade da carbapenemase pelo TIC (VAN DER ZWALUW, DE HAAN, PLUISTER et al., 2015). A investigação de KPC por métodos fenotípicos e genéticos foi realizada para identificar as mais frequentes carbapenemases circulantes para enterobactérias no mundo (MUNOZ-PRICE, POIREL, BONOMO et al., 2013, ZMARLICKA, NAILOR & NICOLAU, 2015) e verificar a presença dessas enterobactérias no ambiente hospitalar, pois após o primeiro relato de KPC em 2006 no Brasil (MONTEIRO, SANTOS, ASENSI et al., 2009), vários casos foram identificados em hospitais brasileiros (ANDRADE, CURIAO, FERREIRA et al., 2011, D'ANDREA, AMISANO, GIANI et al., 2014, ROSSI GONCALVES, FERREIRA, ARAUJO et al., 2016). As enzimas do tipo KPC são encontradas em diferentes espécies de Enterobacteriaceae, porém é predominantemente descrita em K. pneumoniae (CANTON, AKOVA, CARMELI et al., 2012, ANDRADE, VITALI, GASPAR et al., 2014). Em nosso estudo, encontramos o gene blakpc em 5 espécies de Enterobacteriaceae: K.pneumoniae, E. aerogenes, E. clocae, E.coli e C. freundii. Essas 80 amostras produtoras de KPC representam 47,90% de um total de 167 amostras de Enterobacteriaceae, exibindo susceptibilidade reduzida aos carbapenêmicos, identificadas durante o período de julho 2012 até abril A investigação de NDM foi realizada, pois esta carbapenemase tem alto risco de disseminação, tendo em vista que após o primeiro relato de NDM no mundo (YONG, 48

66 TOLEMAN, GISKE et al., 2009) vários casos foram identificados em diversos países (BERRAZEG, DIENE, MEDJAHED et al., 2014). No Brasil após a identificação do primeiro caso que ocorreu em Porto Alegre (CARVALHO-ASSEF, PEREIRA, ALBANO et al., 2013), o número de identificação de NDM em bactérias Gram negativas está aumentando (CARVALHO-ASSEF, PEREIRA, ALBANO et al., 2014, PILLONETTO, AREND, VESPERO et al., 2014, ROZALES, RIBEIRO, MAGAGNIN et al., 2014, PEREIRA, ALBANO, ASENSI et al., 2015) e esse sucessivo aumento de identificação em várias espécies pode ocasionar a disseminação nacional de NDM. Nos isolados analisados deste estudo em Goiânia, não foi encontrado nenhuma enterobactéria produtoras de NDM, mas em Brasília, Faria e colaboradores (2016) relataram sete isolados de enterobactérias produtoras de NDM (FARIA-JUNIOR, 2016). Apesar de não ter encontrado nenhum isolado produtor de NDM, a pesquisa dessa carbapenemase deve ser contínua para evitar surtos drásticos como aconteceu no continente indiano (NORDMANN, POIREL, WALSH et al., 2011, NORDMANN & POIREL, 2014). Além das resistências aos carbapenêmicos, a resistência clínica à polimixina B em isolados de bactérias da família Enterobacteriaceae principalmente em K. pneumoniae é extremamente preocupante considerando que os antimicrobianos polimixina B e colistina são os últimos recursos para o tratamento de infecções devido à resistência aos carbapenêmicos (YAO, DOI, ZENG et al., 2016). No estudo realizado, 9% dos isolados (n= 15) apresentaram resistência à polimixina B tanto por métodos automatizados como pelo TGD e estes isolados foram submetidos ao PCR para pesquisa do MCR-1, porém nenhum isolado possuía o plasmídeo contendo esse gene. Com isso, a resistência apresentada para polimixina B por estas enterobactérias pode ter ocorrido mediada pela alteração no LPS da membrana externa bacteriana com a adição de moléculas de L-Ara4-N e PEtN (FALAGAS, RAFAILIDIS & MATTHAIOU, 2010). Estas alterações são mediadas por mutações em vários genes envolvidos em modificações lipídicas e mais comumente as mutações no gene mgrb. (PRAGASAM, SHANKAR, VEERARAGHAVAN et al., 2016). Esse tipo de resistência induzível não é capaz de ser transmitida para outras linhagens bacterianas e é reversível na ausência do antimicrobiano polimixina B (HALABY, AL NAIEMI, KLUYTMANS et al., 2013, SAMPAIO & GALES, 2016). Com o surgimento do plasmídeo MCR-1 que confere resistência transferível à polimixina, o tratamento com esse antimicrobiano se tornou mais delicado, pois além da 49

67 resistência induzível, existe a possibilidade de surtos com transferência plasmidial (HU, LIU, LIN et al., 2016, ZHANG, HUANG, CHAN et al., 2016). Como a identificação dessa resistência descoberta no final de 2015 só é possível até o momento por métodos moleculares, a identificação das bactérias com plasmídeo MCR-1 pode estar subestimada. Estudo retrospectivos estão sendo realizados em todo o mundo para verificar desde que ano esse plasmídeo está circulando (IRRGANG, ROSCHANSKI, TENHAGEN et al., 2016, SCHWARZ & JOHNSON, 2016). No Brasil, o primeiro relato do plasmídeo contendo MCR-1 foi identificado em E. coli (FERNANDES, MCCULLOCH, VIANELLO et al., 2016). Independentemente do padrão de resistência, Enterobacteriaceae são capaz de causar infecções hospitalares importantes, incluindo infecções urinárias e da circulação sanguínea em pacientes com cateteres, pneumonia (VAN DUIN, KAYE, NEUNER et al., 2013). Estudos mostram que pacientes idosos e com comorbidades além de ter infecções graves, complicações no tratamento, a taxa de mortalidade pode variar de 30% em pacientes com infecções sem bacteremia a 72% em pacientes com infecções sanguíneas (NEUNER, YEH, HALL et al., 2011, TUMBARELLO, VIALE, VISCOLI et al., 2012). A espécie K. pneumoniae tem liderado a dispersão mundial de genes blakpc que ocorre em grande parte impulsionada pela expansão de linhagens clonais (DORTET, CUZON & NORDMANN, 2014). Diante da detecção de cepas produtoras de KPC, o perfil de PFGE foi determinado com o intuito de verificar a existência de clones envolvidos na dispersão desse gene entre os isolados. Para esta análise, foram incluídos todos os isolados de K.pneumoniae positivos para blakpc obtidos entre os anos de 2012 e No presente estudo, através de PFGE da espécie K. pneumoniae KPC (n=52), foi encontrada uma grande diversidade clonal, com prevalência de 13 clusters distintos. O cluster com maior número foi o A com 23,07% (12 isolados), seguindo do grupo clonal C com 19,23% (10 isolados) e do grupo clonal I com 17,30% (9 isolados). Estes achados corroboram com o descrito por (AIRES, PEREIRA, DE ARAUJO et al., 2017), onde foi observada grande diversidade clonal entre as amostras de K. pneumoniae KPC positivas isoladas no Rio de Janeiro, Brasil. Os demais grupos clonais não tiveram um número significativo de representantes, assim, os resultados obtidos mostram que não houve a presença de surtos com disseminação clonal nos serviços do hospital. Através da tipagem molecular por PFGE, pudemos observar que a disseminação de KPC pelo hospital não ocorreu por um clone prevalente. O ano com maior número de isolamento de K. pneumoniae KPC foi o de

68 com 55,8% (n=29) das amostras. Esse fato pode estar relacionado com a abertura do serviço de UTI que ocorreu no segundo semestre de 2012, ampliando o atendimento aos pacientes mais graves e debilitados e consequentemente mais propícios a infecções bacterianas. A disseminação de microrganismos multirresistentes em nível mundial ocorre devido a facilidade de movimentação que as pessoas têm hoje em dia, seja pela ocorrência de guerra, turismo, trabalho, entre outros e estas viagens internacionais são fatores importantes para aquisição e disseminação de enterobactérias multirresistentes, principalmente quando as viagens ocorrem para locais endêmicos (VAN DER BIJ & PITOUT, 2012). Portanto, é necessário implementar medidas de controle e entender melhor de que forma está ocorrendo a dispersão de genes de resistência, para assim, poder controlá-la. Através deste estudo, pudemos evidenciar que o gene blakpc consegue se disseminar de forma muito eficiente entre espécies de enterobactérias, com sua presença em plasmídeos e transposons, além disso, pode estar sendo carreado com outros determinantes de resistência, dificultando ainda mais o tratamento do ambiente hospitalar. Portanto dados epidemiológicos locais e regionais devem ser feitos para conhecer as principais bactérias circulantes, principalmente pelo Brasil não possui um sistema de informação efetivo em resistência bacteriana. Os hospitais não conseguem definir ações coordenadas para estabelecer planos de contingência e controle, com isso, o risco dos pacientes de adquirirem infecções por bactérias pan-resistêntes está cada vez mais frequente. 51

69 7. CONCLUSÕES Foram identificadas 80 bactérias produtoras de KPC e nenhuma produtora de NDM pelos testes moleculares. Não foi identificado nenhum isolado com os genes NDM e MCR-1. O teste TIC apresentou maior sensibilidade em triar as bactérias produtoras de carbapenemases. Foram observados 13 grupos clonais entre as bactérias K. pneumoniae KPC positivas. 52

70 REFERÊNCIAS ABIDIN N. Z. et al. Screening for New Delhi metallo-beta-lactamase-1 in Enterobacteriaceae: Is there a role for the modified Hodge test? Pak J Med Sci, v. 31, n. 6, p , Nov-Dec, AIRES C. A. et al. Multiclonal expansion of Klebsiella pneumoniae isolates producing- NDM-1 in Rio de Janeiro, Brazil. Antimicrob Agents Chemother, Feb 06, ALEXOPOULOU A. et al. Extensively drug-resistant bacteria are an independent predictive factor of mortality in 130 patients with spontaneous bacterial peritonitis or spontaneous bacteremia. World J Gastroenterol, v. 22, n. 15, p , Apr 21, AMBLER R. P. The structure of beta-lactamases. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, v. 289, n. 1036, p , May 16, ANDRADE L. N. et al. Dissemination of blakpc-2 by the spread of Klebsiella pneumoniae clonal complex 258 clones (ST258, ST11, ST437) and plasmids (IncFII, IncN, IncL/M) among Enterobacteriaceae species in Brazil. Antimicrob Agents Chemother, v. 55, n. 7, p , Jul, ANDRADE L. N.; DARINI, A. L. Response to detection of New Delhi metallo-betalactamase-producing bacteria, Brazil. Emerg Infect Dis, v. 21, n. 6, p , Jun, ANDRADE L. N. et al. Expansion and evolution of a virulent, extensively drug-resistant (polymyxin B-resistant), QnrS1-, CTX-M-2-, and KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae ST11 international high-risk clone. J Clin Microbiol, v. 52, n. 7, p , Jul, ANVISA. Nota Ténica 01/2013. Medidas de Prevenção e Controle de Infecções por Enterobactérias Multirresistentes. Série BAJAJ P.; SINGH, N. S.; VIRDI, J. S. Escherichia coli beta-lactamases: What Really Matters. Front Microbiol, v. 7, p. 417, BANERJEE R.; HUMPHRIES, R. Clinical and laboratory considerations for the rapid detection of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae. Virulence, p. 1-13, May 11, BAYRAMOGLU G. et al. [Comparison of the modified Hodge test and the Carba NP test for detection of carbapenemases in Enterobacteriaceae isolates]. Mikrobiyol Bul, v. 50, n. 1, p. 1-10, Jan, BERRAZEG M. et al. New Delhi Metallo-beta-lactamase around the world: an ereview using Google Maps. Euro Surveill, v. 19, n. 20, BIOMERIEUX. Manual Utilização do Sistema VITEK II. v., n., p.,

71 BIRNBOIM H. C.; DOLY, J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res, v. 7, n. 6, p , Nov 24, BONOMO R. A. New Delhi metallo-beta-lactamase and multidrug resistance: a global SOS? Clin Infect Dis, v. 52, n. 4, p , Feb 15, BORAH V. V. et al. New Delhi metallo-beta-lactamase and extended spectrum betalactamases co-producing isolates are high in community-acquired urinary infections in Assam as detected by a novel multiplex polymerase chain reaction assay. Indian J Med Microbiol, v. 34, n. 2, p , Apr-Jun, BOUHSS A. et al. The biosynthesis of peptidoglycan lipid-linked intermediates. FEMS Microbiol Rev, v. 32, n. 2, p , Mar, BROWN T. A. Gene Cloning and DNA analysis. 4º ed BUSH K.; JACOBY, G. A. Updated functional classification of beta-lactamases. Antimicrob Agents Chemother, v. 54, n. 3, p , Mar, BUSH K.; JACOBY, G. A.; MEDEIROS, A. A. A functional classification scheme for beta-lactamases and its correlation with molecular structure. Antimicrob Agents Chemother, v. 39, n. 6, p , Jun, CANTON R. et al. Rapid evolution and spread of carbapenemases among Enterobacteriaceae in Europe. Clin Microbiol Infect, v. 18, n. 5, p , May, CARATTOLI A. Resistance plasmid families in Enterobacteriaceae. Antimicrob Agents Chemother, v. 53, n. 6, p , Jun, CARRER A. et al. Spread of OXA-48-encoding plasmid in Turkey and beyond. Antimicrob Agents Chemother, v. 54, n. 3, p , Mar, CARRICO J. A. et al. Assessment of band-based similarity coefficients for automatic type and subtype classification of microbial isolates analyzed by pulsed-field gel electrophoresis. J Clin Microbiol, v. 43, n. 11, p , Nov, CARVALHAES C. G. et al. Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae: be aware of false positive results. J Antimicrob Chemother, v. 65, n. 2, p , Feb, CARVALHO-ASSEF A. P. et al. Isolation of NDM-producing Providencia rettgeri in Brazil. J Antimicrob Chemother, v. 68, n. 12, p , Dec, CARVALHO-ASSEF A. P. et al. Detection of NDM-1-, CTX-M-15-, and qnrb4- producing Enterobacter hormaechei isolates in Brazil. Antimicrob Agents Chemother, v. 58, n. 4, p , CHROMA M.; KOLAR, M. Genetic methods for detection of antibiotic resistance: focus on extended-spectrum beta-lactamases. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub, v. 154, n. 4, p , Dec,

72 CLINICAL LABORATORY STANDARDS INSTITUTE. Performance standard for antimicrobial susceptibility testing. Document M100 S19 CLSI, Wayne, PA, CLINICAL LABORATORY STANDARDS INSTITUTE. Performance standard for antimicrobial susceptibility testing. Document M100 S21 CLSI, Wayne, PA, CLINICAL LABORATORY STANDARDS INSTITUTE. Performance standard for antimicrobial susceptibility testing. Document M100 S26 CLSI, Wayne, PA, CUZON G. et al. Worldwide diversity of Klebsiella pneumoniae that produce betalactamase blakpc-2 gene. Emerg Infect Dis, v. 16, n. 9, p , Sep, D'ANDREA M. M. et al. Diversity of capsular polysaccharide gene clusters in Kpcproducing Klebsiella pneumoniae clinical isolates of sequence type 258 involved in the Italian epidemic. PLoS One, v. 9, n. 5, p. e96827, DANEL F. et al. OXA-17, a further extended-spectrum variant of OXA-10 beta-lactamase, isolated from Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother, v. 43, n. 6, p , Jun, DAVIES R. B.; ABRAHAM, E. P. Metal cofactor requirements of beta-lactamase II. Biochem J, v. 143, n. 1, p , Oct, DE MAIO CARRILLHO C. M. et al. Colistin-resistant Enterobacteriaceae infections: Clinical and molecular characterization and analysis of in vitro synergy. Diagn Microbiol Infect Dis, Nov 15, DORTET L.; CUZON, G.; NORDMANN, P. Dissemination of carbapenemase-producing Enterobacteriaceae in France, J Antimicrob Chemother, v. 69, n. 3, p , Mar, DRAWZ S. M.; BONOMO, R. A. Three decades of beta-lactamase inhibitors. Clin Microbiol Rev, v. 23, n. 1, p , Jan, FALAGAS M. E.; KASIAKOU, S. K. Colistin: the revival of polymyxins for the management of multidrug-resistant gram-negative bacterial infections. Clin Infect Dis, v. 40, n. 9, p , May 1, FALAGAS M. E. et al. Antibiotic treatment of infections due to carbapenem-resistant Enterobacteriaceae: systematic evaluation of the available evidence. Antimicrob Agents Chemother, v. 58, n. 2, p , FALAGAS M. E.; RAFAILIDIS, P. I.; MATTHAIOU, D. K. Resistance to polymyxins: Mechanisms, frequency and treatment options. Drug Resist Updat, v. 13, n. 4-5, p , Aug-Oct, FANGMAN W. L. Separation of very large DNA molecules by gel electrophoresis. Nucleic Acids Res, v. 5, n. 3, p , Mar,

73 FARIA-JUNIOR C. NDM-Producing Enterobacteriaceae Strains among Hospitals in Brasília, Brazil. Journal of Microbiology & Experimentation, v. Volume 3 n. 2, FEDLER K. A.; BIEDENBACH, D. J.; JONES, R. N. Assessment of pathogen frequency and resistance patterns among pediatric patient isolates: report from the 2004 SENTRY Antimicrobial Surveillance Program on 3 continents. Diagn Microbiol Infect Dis, v. 56, n. 4, p , Dec, FERNANDES M. R. et al. First Report of the Globally Disseminated IncX4 Plasmid Carrying the mcr-1 Gene in a Colistin-Resistant Escherichia coli ST101 isolated from a Human Infection in Brazil. Antimicrob Agents Chemother, Aug 8, FISHER J. F.; MEROUEH, S. O.; MOBASHERY, S. Bacterial resistance to beta-lactam antibiotics: compelling opportunism, compelling opportunity. Chem Rev, v. 105, n. 2, p , Feb, GHAZAWI A. et al. NDM-2 carbapenemase-producing Acinetobacter baumannii in the United Arab Emirates. Clin Microbiol Infect, v. 18, n. 2, p. E34-6, Feb, HALABY T. et al. Emergence of colistin resistance in Enterobacteriaceae after the introduction of selective digestive tract decontamination in an intensive care unit. Antimicrob Agents Chemother, v. 57, n. 7, p , Jul, HAMMOUDI D.; MOUBARECK, C. A.; SARKIS, D. K. How to detect carbapenemase producers? A literature review of phenotypic and molecular methods. J Microbiol Methods, v. 107, p , Dec, HATTORI T.; KAWAMURA, K.; ARAKAWA, Y. Comparison of test methods for detecting metallo-beta-lactamase-producing Gram-negative bacteria. Jpn J Infect Dis, v. 66, n. 6, p , HAWKEY P. M. Molecular epidemiology of clinically significant antibiotic resistance genes. Br J Pharmacol, v. 153 Suppl 1, p. S406-13, Mar, HIRSCH E. B. et al. An evaluation of multiple phenotypic screening methods for Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC)-producing Enterobacteriaceae. J Infect Chemother, v. 20, n. 3, p , Mar, HU Y. et al. Dissemination of the mcr-1 colistin resistance gene. Lancet Infect Dis, v. 16, n. 2, p , Feb, IRRGANG A. et al. Prevalence of mcr-1 in E. coli from Livestock and Food in Germany, PLoS One, v. 11, n. 7, p. e , JOHNSON J. R. et al. Molecular epidemiological analysis of Escherichia coli sequence type ST131 (O25:H4) and blactx-m-15 among extended-spectrum-beta-lactamaseproducing E. coli from the United States, 2000 to Antimicrob Agents Chemother, v. 56, n. 5, p , May,

74 KATTAN J. N.; VILLEGAS, M. V.; QUINN, J. P. New developments in carbapenems. Clin Microbiol Infect, v. 14, n. 12, p , Dec, KIFFER C. et al. Antimicrobial susceptibility of Gram-negative bacteria in Brazilian hospitals: the MYSTIC Program Brazil Braz J Infect Dis, v. 9, n. 3, p , Jun, KITCHEL B. et al. Molecular epidemiology of KPC-producing Klebsiella pneumoniae isolates in the United States: clonal expansion of multilocus sequence type 258. Antimicrob Agents Chemother, v. 53, n. 8, p , Aug, KONEMAN, E. W.; ALLEN, S. D.; JANDA, W. M.; SCHRECKENBERGER, P. C.; WINN, W. C. Diagnóstico Microbiológico. 5 Ed. Rio de Janeiro: Medisi; KONG K. F.; SCHNEPER, L.; MATHEE, K. Beta-lactam antibiotics: from antibiosis to resistance and bacteriology. APMIS, v. 118, n. 1, p. 1-36, Jan, KRISHNAN N. P. et al. Inhibition of Klebsiella beta-lactamases (SHV-1 and KPC-2) by Avibactam: A Structural Study. PLoS One, v. 10, n. 9, p. e , LANDMAN D. et al. Evolution of antimicrobial resistance among Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii and Klebsiella pneumoniae in Brooklyn, NY. J Antimicrob Chemother, v. 60, n. 1, p , Jul, LAVIGNE J. P. et al. Membrane permeability, a pivotal function involved in antibiotic resistance and virulence in Enterobacter aerogenes clinical isolates. Clin Microbiol Infect, v. 18, n. 6, p , Jun, LEAVITT A. et al. Molecular epidemiology, sequence types, and plasmid analyses of KPC-producing Klebsiella pneumoniae strains in Israel. Antimicrob Agents Chemother, v. 54, n. 7, p , Jul, LEE D. et al. Novel Computational Protocols for Functionally Classifying and Characterising Serine Beta-Lactamases. PLoS Comput Biol, v. 12, n. 6, p. e , Jun, LEE M.; CHUNG, H. S. Different antimicrobial susceptibility testing methods to detect ertapenem resistance in Enterobacteriaceae: VITEK2, MicroScan, Etest, disk diffusion, and broth microdilution. J Microbiol Methods, v. 112, p , May, LEOPOLD I.; FRICKE, B. Inhibition, reactivation, and determination of metal ions in membrane metalloproteases of bacterial origin using high-performance liquid chromatography coupled on-line with inductively coupled plasma mass spectrometry. Anal Biochem, v. 252, n. 2, p , Oct 15, LI J. et al. Evaluation of colistin as an agent against multi-resistant Gram-negative bacteria. Int J Antimicrob Agents, v. 25, n. 1, p , Jan, LIU D. et al. Intravenous combined with aerosolised polymyxin versus intravenous polymyxin alone in the treatment of pneumonia caused by multidrug-resistant pathogens: 57

75 a systematic review and meta-analysis. Int J Antimicrob Agents, v. 46, n. 6, p , Dec, LIU Y. Y. et al. Emergence of plasmid-mediated colistin resistance mechanism MCR-1 in animals and human beings in China: a microbiological and molecular biological study. Lancet Infect Dis, v. 16, n. 2, p , Feb, LIVERMORE D. M. beta-lactamases in laboratory and clinical resistance. Clin Microbiol Rev, v. 8, n. 4, p , Oct, Defining an extended-spectrum beta-lactamase. Clin Microbiol Infect, v. 14 Suppl 1, p. 3-10, Jan, LIVERMORE D. M.; WOODFORD, N. The beta-lactamase threat in Enterobacteriaceae, Pseudomonas and Acinetobacter. Trends Microbiol, v. 14, n. 9, p , Sep, MAGIORAKOS A. P. et al. Multidrug-resistant, extensively drug-resistant and pandrugresistant bacteria: an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance. Clin Microbiol Infect, v. 18, n. 3, p , Mar, MASSOVA I.; MOBASHERY, S. Kinship and diversification of bacterial penicillinbinding proteins and beta-lactamases. Antimicrob Agents Chemother, v. 42, n. 1, p. 1-17, Jan, MEYER E. et al. Dramatic increase of third-generation cephalosporin-resistant E. coli in German intensive care units: secular trends in antibiotic drug use and bacterial resistance, 2001 to Crit Care, v. 14, n. 3, p. R113, MOELLERING R. C., JR. NDM-1--a cause for worldwide concern. N Engl J Med, v. 363, n. 25, p , Dec 16, MOHR J. F., 3RD. Update on the efficacy and tolerability of meropenem in the treatment of serious bacterial infections. Clin Infect Dis, v. 47 Suppl 1, p. S41-51, Sep 15, MONTEIRO J. et al. First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae strains in Brazil. Antimicrob Agents Chemother, v. 53, n. 1, p , Jan, MOORE R. A.; BATES, N. C.; HANCOCK, R. E. Interaction of polycationic antibiotics with Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide and lipid A studied by using dansylpolymyxin. Antimicrob Agents Chemother, v. 29, n. 3, p , Mar, MUNOZ-PRICE L. S. et al. Clinical epidemiology of the global expansion of Klebsiella pneumoniae carbapenemases. Lancet Infect Dis, v. 13, n. 9, p , Sep, NEUNER E. A. et al. Treatment and outcomes in carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae bloodstream infections. Diagn Microbiol Infect Dis, v. 69, n. 4, p , Apr, NICOLAU D. P. Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of meropenem. Clin Infect Dis, v. 47 Suppl 1, p. S32-40, Sep 15,

76 NORDMANN P.; POIREL, L. Emerging carbapenemases in Gram-negative aerobes. Clin Microbiol Infect, v. 8, n. 6, p , Jun, The difficult-to-control spread of carbapenemase producers among Enterobacteriaceae worldwide. Clin Microbiol Infect, v. 20, n. 9, p , Sep, NORDMANN P. et al. The emerging NDM carbapenemases. Trends Microbiol, v. 19, n. 12, p , Dec, OSANO E. et al. Molecular characterization of an enterobacterial metallo beta-lactamase found in a clinical isolate of Serratia marcescens that shows imipenem resistance. Antimicrob Agents Chemother, v. 38, n. 1, p. 71-8, Jan, OZTURK H.; OZKIRIMLI, E.; OZGUR, A. Classification of Beta-lactamases and penicillin binding proteins using ligand-centric network models. PLoS One, v. 10, n. 2, p. e , PAPP-WALLACE K. M. et al. Inhibitor resistance in the KPC-2 beta-lactamase, a preeminent property of this class A beta-lactamase. Antimicrob Agents Chemother, v. 54, n. 2, p , Feb, PAPP-WALLACE K. M. et al. Variants of beta-lactamase KPC-2 that are resistant to inhibition by avibactam. Antimicrob Agents Chemother, v. 59, n. 7, p , Jul, PASTERAN F. et al. Controlling false-positive results obtained with the Hodge and Masuda assays for detection of class a carbapenemase in species of enterobacteriaceae by incorporating boronic Acid. J Clin Microbiol, v. 48, n. 4, p , Apr, PATERSON D. L.; BONOMO, R. A. Extended-spectrum beta-lactamases: a clinical update. Clin Microbiol Rev, v. 18, n. 4, p , Oct, PATERSON D. L.; DOI, Y. A step closer to extreme drug resistance (XDR) in gramnegative bacilli. Clin Infect Dis, v. 45, n. 9, p , Nov 01, PEREIRA P. S. et al. Draft genome sequences of three NDM-1-producing Enterobacteriaceae species isolated from Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz, v. 110, n. 4, p , Jun, PEREZ L. R. Evaluation of polymyxin susceptibility profile among KPC-producing Klebsiella pneumoniae using Etest and MicroScan WalkAway automated system. APMIS, v. 123, n. 11, p , Nov, PFEIFER Y.; CULLIK, A.; WITTE, W. Resistance to cephalosporins and carbapenems in Gram-negative bacterial pathogens. Int J Med Microbiol, v. 300, n. 6, p , Aug, PICAO R. C. et al. Diversity of beta-lactamases produced by ceftazidime-resistant Pseudomonas aeruginosa isolates causing bloodstream infections in Brazil. Antimicrob Agents Chemother, v. 53, n. 9, p , Sep,

77 PILLONETTO M. et al. First report of NDM-1-producing Acinetobacter baumannii sequence type 25 in Brazil. Antimicrob Agents Chemother, v. 58, n. 12, p , Dec, POIREL L. et al. Molecular analysis of metallo-beta-lactamase gene bla(spm-1)- surrounding sequences from disseminated Pseudomonas aeruginosa isolates in Recife, Brazil. Antimicrob Agents Chemother, v. 48, n. 4, p , Apr, POURNARAS S.; POULOU, A.; TSAKRIS, A. Inhibitor-based methods for the detection of KPC carbapenemase-producing Enterobacteriaceae in clinical practice by using boronic acid compounds. J Antimicrob Chemother, v. 65, n. 7, p , Jul, PRAGASAM A. K. et al. Molecular Mechanisms of Colistin Resistance in Klebsiella pneumoniae Causing Bacteremia from India-A First Report. Front Microbiol, v. 7, p. 2135, QUEENAN A. M.; BUSH, K. Carbapenemases: the versatile beta-lactamases. Clin Microbiol Rev, v. 20, n. 3, p , table of contents, Jul, RAHMAN M. et al. Prevalence and molecular characterisation of New Delhi metallo-betalactamases NDM-1, NDM-5, NDM-6 and NDM-7 in multidrug-resistant Enterobacteriaceae from India. Int J Antimicrob Agents, v. 44, n. 1, p. 30-7, Jul, RASMUSSEN B. A.; BUSH, K. Carbapenem-hydrolyzing beta-lactamases. Antimicrob Agents Chemother, v. 41, n. 2, p , Feb, REIS J. O. G. D.; BRAZIL. SECRETARIA DE ASSISTE NCIA A SAU DE. DEPARTAMENTO DE CONTROLE E AVALIAÇA O DE SISTEMAS. Assiste ncia a sau de no SUS : me dia e alta complexidade, Brasiĺia, DF: Ministe rio da Sau de, Secretaria de Assiste ncia a Sau de, Departamento de Controle e Avaliaça o de Sistemas, p. p. ISBN RHOMBERG P. R.; JONES, R. N. Summary trends for the Meropenem Yearly Susceptibility Test Information Collection Program: a 10-year experience in the United States ( ). Diagn Microbiol Infect Dis, v. 65, n. 4, p , Dec, RIBEIRO V. B. et al. Carbapenem-resistant GES-5-producing Klebsiella pneumoniae in Southern Brazil. Braz J Infect Dis, v. 18, n. 2, p , Mar-Apr, RIBEIRO V. B. et al. Performance of quantification of Modified Hodge Test: an evaluation with Klebsiella pneumoniae carbapenemase-producing Enterobacteriaceae isolates. Biomed Res Int, v. 2014, p , RIBOT E. M. et al. Standardization of pulsed-field gel electrophoresis protocols for the subtyping of Escherichia coli O157:H7, Salmonella, and Shigella for PulseNet. Foodborne Pathog Dis, v. 3, n. 1, p , Spring, RICCIO M. L. et al. Characterization of the metallo-beta-lactamase determinant of Acinetobacter baumannii AC-54/97 reveals the existence of bla(imp) allelic variants 60

78 carried by gene cassettes of different phylogeny. Antimicrob Agents Chemother, v. 44, n. 5, p , May, ROSENTHAL V. D. et al. International Nosocomial Infection Control Consortium (INICC) report, data summary of 36 countries, for Am J Infect Control, v. 40, n. 5, p , Jun, ROSSI F. et al. Emergence of colistin resistance in the largest university hospital complex of Sao Paulo, Brazil, over five years. Braz J Infect Dis, Nov 08, ROSSI GONCALVES I. et al. Outbreaks of colistin-resistant and colistin-susceptible KPC-producing Klebsiella pneumoniae in a Brazilian intensive care unit. J Hosp Infect, v. 94, n. 4, p , Dec, ROZALES F. P. et al. Emergence of NDM-1-producing Enterobacteriaceae in Porto Alegre, Brazil. Int J Infect Dis, v. 25, p , Aug, RUPPE E.; WOERTHER, P. L.; BARBIER, F. Mechanisms of antimicrobial resistance in Gram-negative bacilli. Ann Intensive Care, v. 5, n. 1, p. 61, Dec, SADER H. S. et al. Dissemination and diversity of metallo-beta-lactamases in Latin America: report from the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program. Int J Antimicrob Agents, v. 25, n. 1, p , Jan, SADER H. S. et al. Pathogen frequency and resistance patterns in Brazilian hospitals: summary of results from three years of the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program. Braz J Infect Dis, v. 5, n. 4, p , Aug, SADER H. S. et al. Comparative evaluation of the in vitro activity of three combinations of beta-lactams with beta-lactamase inhibitors: piperacillin/tazobactam, ticarcillin/clavulanic acid and ampicillin/sulbactam. Braz J Infect Dis, v. 4, n. 1, p. 22-8, Feb, SAMAHA-KFOURY J. N.; ARAJ, G. F. Recent developments in beta lactamases and extended spectrum beta lactamases. BMJ, v. 327, n. 7425, p , Nov 22, SAMPAIO J. L.; GALES, A. C. Antimicrobial resistance in Enterobacteriaceae in Brazil: focus on beta-lactams and polymyxins. Braz J Microbiol, v. 47 Suppl 1, p , Dec, SCHEFFERS D. J.; PINHO, M. G. Bacterial cell wall synthesis: new insights from localization studies. Microbiol Mol Biol Rev, v. 69, n. 4, p , Dec, SCHWARZ S.; JOHNSON, A. P. Transferable resistance to colistin: a new but old threat. J Antimicrob Chemother, Jun 24, SLATER G. W.; DESRUISSEAUX, C.; HUBERT, S. J. DNA separation mechanisms during electrophoresis. Methods Mol Biol, v. 162, p ,

79 SMITH C. L.; CANTOR, C. R. Purification, specific fragmentation, and separation of large DNA molecules. Methods Enzymol, v. 155, p , SUAREZ C.; GUDIOL, F. [Beta-lactam antibiotics]. Enferm Infecc Microbiol Clin, v. 27, n. 2, p , Feb, TENOVER F. C. et al. Carbapenem resistance in Klebsiella pneumoniae not detected by automated susceptibility testing. Emerg Infect Dis, v. 12, n. 8, p , Aug, THADEN J. T.; POGUE, J. M.; KAYE, K. S. Role of newer and re-emerging older agents in the treatment of infections caused by carbapenem-resistant Enterobacteriaceae. Virulence, p. 1-14, Jul 6, TUMBARELLO M. et al. Predictors of mortality in bloodstream infections caused by Klebsiella pneumoniae carbapenemase-producing K. pneumoniae: importance of combination therapy. Clin Infect Dis, v. 55, n. 7, p , Oct, VAN DER BIJ A. K.; PITOUT, J. D. The role of international travel in the worldwide spread of multiresistant Enterobacteriaceae. J Antimicrob Chemother, v. 67, n. 9, p , Sep, VAN DER ZWALUW K. et al. The carbapenem inactivation method (CIM), a simple and low-cost alternative for the Carba NP test to assess phenotypic carbapenemase activity in gram-negative rods. PLoS One, v. 10, n. 3, p. e , VAN DUIN D. et al. Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae: a review of treatment and outcomes. Diagn Microbiol Infect Dis, v. 75, n. 2, p , Feb, VAN SOOLINGEN D. et al. Use of various genetic markers in differentiation of Mycobacterium bovis strains from animals and humans and for studying epidemiology of bovine tuberculosis. J Clin Microbiol, v. 32, n. 10, p , Oct, VOLLMER W.; BERTSCHE, U. Murein (peptidoglycan) structure, architecture and biosynthesis in Escherichia coli. Biochim Biophys Acta, v. 1778, n. 9, p , Sep, VOLLMER W.; BLANOT, D.; DE PEDRO, M. A. Peptidoglycan structure and architecture. FEMS Microbiol Rev, v. 32, n. 2, p , Mar, WALSH T. R. Emerging carbapenemases: a global perspective. Int J Antimicrob Agents, v. 36 Suppl 3, p. S8-14, Nov, WALSH T. R. et al. Metallo-beta-lactamases: the quiet before the storm? Clin Microbiol Rev, v. 18, n. 2, p , Apr, WALTHER-RASMUSSEN J.; HOIBY, N. Class A carbapenemases. J Antimicrob Chemother, v. 60, n. 3, p , Sep,

80 WIDMANN M.; PLEISS, J.; OELSCHLAEGER, P. Systematic analysis of metallo-betalactamases using an automated database. Antimicrob Agents Chemother, v. 56, n. 7, p , Jul, WILKE M. S.; LOVERING, A. L.; STRYNADKA, N. C. Beta-lactam antibiotic resistance: a current structural perspective. Curr Opin Microbiol, v. 8, n. 5, p , Oct, WILLIAMS J. D. Beta-lactamases and beta-lactamase inhibitors. Int J Antimicrob Agents, v. 12 Suppl 1, p. S3-7; discussion S26-7, Aug, WOODFORD N.; TURTON, J. F.; LIVERMORE, D. M. Multiresistant Gram-negative bacteria: the role of high-risk clones in the dissemination of antibiotic resistance. FEMS Microbiol Rev, v. 35, n. 5, p , Sep, XIAO J. et al. Identification and Validation Novel of VIM-2 Metallo-beta-lactamase Tripeptide Inhibitors. Mol Inform, v. 34, n. 8, p , Aug, YAO X. et al. Carbapenem-resistant and colistin-resistant Escherichia coli co-producing NDM-9 and MCR-1. Lancet Infect Dis, v. 16, n. 3, p , Mar, YIGIT H. et al. Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase, KPC-1, from a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumoniae. Antimicrob Agents Chemother, v. 45, n. 4, p , Apr, YONG D. et al. Characterization of a new metallo-beta-lactamase gene, bla(ndm-1), and a novel erythromycin esterase gene carried on a unique genetic structure in Klebsiella pneumoniae sequence type 14 from India. Antimicrob Agents Chemother, v. 53, n. 12, p , Dec, ZHANG R. et al. Dissemination of the mcr-1 colistin resistance gene. Lancet Infect Dis, v. 16, n. 3, p , Mar, ZHONG X. et al. First emergence of acrab and oqxab mediated tigecycline resistance in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae pre-dating the use of tigecycline in a Chinese hospital. PLoS One, v. 9, n. 12, p. e115185, ZMARLICKA M. T.; NAILOR, M. D.; NICOLAU, D. P. Impact of the New Delhi metallo-beta-lactamase on beta-lactam antibiotics. Infect Drug Resist, v. 8, p ,

81 ANEXOS Anexo 1. Parecer do Comitê de Ética. 64

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