LARISSA GREGÓRIO CANDIDO DO PRADO

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1 PROGRAMA DE APRIMORAMENTO PROFISSIONAL SECRETARIA DE ESTADO DA SAÚDE COORDENADORIA DE RECURSOS HUMANOS FUNDAÇÃO DO DESENVOLVIMENTO ADMINISTRATIVO - FUNDAP LARISSA GREGÓRIO CANDIDO DO PRADO Interação entre antibióticos frente à isolados multisensíveis e multirresistentes (KPC) da bactéria Klebsiella pneumoniae avaliada mediante o uso do teste checkerboard Ribeirão Preto 2012

2 PROGRAMA DE APRIMORAMENTO PROFISSIONAL SECRETARIA DE ESTADO DA SAÚDE COORDENADORIA DE RECURSOS HUMANOS FUNDAÇÃO DO DESENVOLVIMENTO ADMINISTRATIVO - FUNDAP LARISSA GREGÓRIO CANDIDO DO PRADO Interação entre antibióticos frente à isolados multisensíveis e multirresistentes (KPC) da bactéria Klebsiella pneumoniae avaliada mediante o uso do teste checkerboard Monografia apresentada ao Programa de Aprimoramento Profissional/CRH/SES-SP e FUNDAP, elaborada no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo - USP/ Departamento de Microbiologia, sob a orientação do Prof. Dr. Roberto Martinez. Área: Microbiologia/ Controle de Infecção Hospitalar Orientador: Prof. Dr. Roberto Martinez. Supervisora Titular: Rosa Helena A. R. Gironi Ribeirão Preto 2012

3 FICHA CATALOGRÁFICA Prado, Larissa Gregório Candido do Interação entre antibióticos frente à isolados multisensíveis e multirresistentes (KPC) da bactéria Klebsiella pneumoniae avaliada mediante o uso do teste checkerboard. 29 p. Trabalho de Conclusão do Programa de Aprimoramento Profissional/SES, área de Microbiologia Clínica e de Infecção Hospitalar, Hospital das Clínicas da FMRP-USP. Orientador: Martinez, Roberto. 1. Enzima KPC. 2. Klebsiella pneumoniae. 3. Teste de Hodge Modificado. 4. Método de microdiluição em placas. 5. Sinergismo entre antimicrobianos. 6. Teste checkerboard.

4 Agradecimentos Ao meu orientador Professor Dr. Roberto Martinez pelo incentivo e disponibilidade em todos os momentos de execução deste trabalho. A Lúcia Vitali, Érica Nascimento e Letícia Schiave pela orientação e paciência. A todos os profissionais do Laboratório de Microbiologia do HCFMRP-USP pelo auxílio e colaboração. Aos meus colegas e amigos de aprimoramento pela ajuda e cumplicidade. À minha família e ao meu namorado pela motivação e apoio prestado durante a realização deste trabalho.

5 RESUMO Klebsiella pneumoniae é um bacilo Gram-negativo, membro da família Enterobacteriaceae, e sua resistência a antimicrobianos tem se tornado um problema de saúde pública e preocupação em todos os campos da saúde. O objetivo deste trabalho foi verificar a interação entre os antibióticos fosfomicina e amicacina e entre imipenem e amicacina diante de isolados clínicos multisensíveis e multirresistes (KPC) da bactéria Klebsiella pneumoniae de pacientes do HCRP-USP e determinar as Concentrações Inibitórias Mínimas (CIM) das drogas isoladas e em combinação. Foram analisadas 50 amostras isoladas de urina e sangue, sendo 25 isolados multisensíveis e 25 multirresistentes (KPC), estes confirmados através do teste de Hodge modificado. Foi realizado o método de microdiluição em placas segundo recomendações do CLSI e a avaliação do sinergismo entre as drogas foi feita com o teste checkerboard. A interação entre imipenem e amicacina (46%) obteve mais resultados sinérgicos que a interação entre fosfomicina e amicacina (32%) e antagonismo não foi observado para qualquer uma das combinações testadas.

6 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO Família Enterobacteriaceae Klebsiella pneumoniae Enzima KPC Teste de Hodge Modificado Mecanismo de Resistência Sinergismo entre antimicrobianos OBJETIVOS Objetivo geral Objetivos específicos MATERIAIS E MÉTODOS Amostras Método de Microdiluição em placas RESULTADOS DISCUSSÃO CONCLUSÕES REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 27

7 7 1. Introdução 1.1 Família Enterobacteriaceae Os bacilos Gram-negativos pertencentes à Família Enterobacteriaceae compreendem 50% de todos isolados de infecções hospitalares. São bactérias anaeróbias facultativas ou aeróbias, catalase positiva e oxidase negativa. Caracterizam-se bioquimicamente pela capacidade de reduzir nitratos a nitritos e fermentar a glicose com produção de ácido ou ácido e gás. No gênero Klebsiella, Klebsiella pneumoniae é isolada com maior frequência de amostras clínicas, podendo causar pneumonia, meningite, infecções urinárias e septicemias. 1.2 Klebsiella pneumoniae A Klebsiella pneumoniae é um bacilo Gram-negativo, membro da família Enterobacteriaceae, encontrado em locais com água, solo, plantas e esgoto (PODSCHUM; ULLMANN, 1998). Sua colonização em seres humanos provavelmente ocorre por contato com as diversas fontes ambientais e pode ser encontrada colonizando a orofaringe e o intestino de pessoas sadias; já no organismo de pessoas imunocomprometidas esta bactéria encontra um ambiente propício para seu crescimento, levando aos quadros de infecção (DESIMONI et al., 2004; MARTINEZ et al., 2004). Nos últimos anos, a resistência apresentada por essa bactéria a antimicrobianos se tornou um problema de saúde pública e preocupação em todos os campos da saúde.

8 8 1.3 Enzima KPC Klebsiella pneumoniae KPC sintetiza carbapenemase que é uma enzima produzida por bactérias Gram-negativas (enterobactérias) e sua detecção em isolado bacteriano confere resistência aos antimicrobianos carbapenêmicos (imipenem, meropenem e ertapenem), além de inativar penicilinas, cefalosporinas e monobactâmicos. É importante salientar que os carbapenens compreendem uma classe amplamente utilizada no tratamento de infecções envolvendo Enterobacteriaceae multirresistente. As enzimas KPC são carbapenemases pertencentes à Classe A de Ambler e ao subgrupo 2f de Bush, Jacoby e Medeiros. Essa enzima pode ser produzida por diversos tipos de bactérias e segundo Monteiro et al. (2009) diferenciada em KPC-1 a 4: KPC-1 isolados em Klebsiella pneumoniae; KPC-2 em K. pneumoniae, K. oxytoca, Salmonella enterica e em Enterobacter sp.; KPC-3 em K. pneumoniae e Enterobacter cloacae; KPC-4 em nenhum microorganismo até o momento (CAI et al., 2008). O primeiro membro da família KPC, KPC-1, foi isolado de uma Klebsiella pneumoniae resistente aos carbapenêmicos que foi isolada nos Estados Unidos em (Este isolado foi resistente a imipenem e meropenem (CIMs 16 µg/ml), às cefalosporinas de amplo espectro e ao aztreonam (YIGIT et al., 2001). Segundo dados da ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária), entre 2009 e 2010 foram relatados diversos casos em hospitais do Espírito Santo; Goiás; Minas Gerais; Santa Catarina; Distrito Federal e São Paulo. Devido sua localização em plasmídio, o grupo KPC possui alto potencial de disseminação, sendo mais frequente em bactéria K. pneumoniae que apresenta grande capacidade de acumular e transferir genes de resistência,

9 9 desse modo dificultando o controle de epidemias e proporcionando elevação nas taxas de mortalidade (ANVISA, 2011). Notícias sobre mortes provocadas pela bactéria Klebsiella pneumoniae, produtora da enzima carbapenemase (KPC), provocaram alarde em várias partes do Brasil. Segundo dados do Ministério da Saúde, no Distrito Federal foram feitas 187 notificações de infecção no ano de 2010, sendo registrados 18 óbitos. Em São Paulo, o Hospital das Clínicas registrou 70 casos desde 2008 (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2010). De acordo com infectologistas, a maioria das infecções associadas à enterobactéria produtora da enzima KPC ocorre em pacientes imunodeprimidos hospitalizados e/ou com dispositivos invasivos como cateter, sonda, punção venosa periférica ou em outra situação que possa favorecer a infecção bacteriana (MARCHAIM et al., 2008). Atualmente, KPC constitui importante mecanismo de resistência no contexto hospitalar. Sua pesquisa é relevante a fim de limitar sua disseminação, contribuindo para a redução dos índices de morbidade e mortalidade ligados a diferentes doenças infecciosas, para o que é imprescindível a vigilância microbiológica, juntamente com ação da Comissão de Controle de Infecção Hospitalar (CCIH) (DIENSTMANN et al., 2010). Como medidas preventivas, hábitos simples como lavagem das mãos e aplicação de álcool 70% são bastante eficazes. Tratamento com antibióticos como Polimixina B e Colistina também estão sendo utilizados com bastante sucesso. 1.4 Teste de Hodge Modificado Cepas KPC podem não apresentar resistência in vitro aos carbapenêmicos sendo necessário a realização de um teste alternativo que indique a presença de carbapenemase.

10 10 Um teste proposto é o Teste de Hodge Modificado originalmente descrito por Lee et al (2001). Neste teste é feita uma suspensão 0,5 McFarland de E. coli ATCC que é diluída (1:10) e posteriormente inoculada em ágar Mueller-Hinton. No centro da placa é colocado um disco de carbapenêmico e a amostra a ser testada é estriada da borda do disco até a periferia da placa. A presença de uma distorção na zona de inibição de E. coli próximo à borda do inóculo da amostra testada após incubação overnight é interpretado como Teste de Hodge Modificado positivo (Figura 1). Isso se deve a produção de carbapenemases pela amostra testada, que degrada o antimicrobiano fazendo com que a cepa sensível consiga crescer dentro de um halo de um antimicrobiano. Anderson el al (2007) avaliaram o Teste de Hodge Modificado e encontraram 100% de sensibilidade e 100% de especificidade para detecção de resistência mediada por KPC. Figura 1 Resultados do Teste de Hodge Modificado.

11 Mecanismo de Resistência Vários são os mecanismos de resistência que podem impedir a ação de antimicrobianos. A resistência bacteriana é um mecanismo natural de defesa, assim para cada novo fármaco desenvolvido, em algum momento as bactérias irão desenvolver resistência. A bactéria KPC tem um gene chamado SHV-1 que a torna resistente a quase todos os tipos de antimicrobianos, inclusive os carbapenêmicos, específicos para emergências e tratamento de infecções por bactérias multiresistentes. A bactéria pode já ter no seu código genético a informação necessária para o desenvolvimento da resistência, mas este mecanismo não se expressa a não ser que a bactéria entre em contato com o antibacteriano, desencadeando todo o processo, nos casos de resistência induzida, comuns em KPC (DEL PELOSO et al., 2010). Outro mecanismo de resistência surge, ocasionalmente, da combinação de impermeabilidade da membrana com β-lactamase cromossômicas (AmpC) ou de amplo espectro (ESBL) (MARTINEZ et al., 2004). Entre as bactérias Gram-negativas, a produção de β-lactamases é o principal mecanismo de resistência a antibióticos β-lactamâmicos (MEDEIROS, 1997). Essas enzimas são capazes de hidrolisar tais antibióticos, gerando compostos sem atividade antimicrobiana (BUSH, 2001). 1.6 Sinergismo entre antimicrobianos Sinergismo é um tipo de resposta farmacológica obtida a partir da associação de dois ou mais medicamentos, cuja resultante é maior do que a simples soma dos efeitos isolados de cada um deles. O sinergismo pode ocorrer com medicamentos que possuem os mesmos mecanismos de ação (aditivo); que agem por diferentes modos (somação) ou com aqueles que atuam em diferentes receptores farmacológicos (potencialização) (OGA et al., 1994).

12 12 Algumas associações entre antimicrobianos apresentam caráter sinérgico pois possuem melhor efeito quando administrados em conjunto, tendo como objetivo a maximização da eficácia terapêutica. 2. Objetivos 2.1 Objetivo Geral O objetivo desse trabalho foi verificar a interação entre antibióticos frente à bactéria Klebsiella pneumoniae isolados multisensíveis e multirresistentes (KPC) de pacientes atendidos no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - HCRP- USP. 2.2 Objetivos específicos Determinar as Concentrações Inibitórias Mínimas (CIM) das drogas fosfomicina e amicacina, isoladas e em combinação, dos isolados multisensíveis e KPC da bactéria Klebsiella pneumoniae. Determinar as Concentrações Inibitórias Mínimas (CIM) das drogas imipenem e amicacina, isoladas e em combinação, dos isolados multisensíveis e KPC da bactéria Klebsiella pneumoniae. Avaliar a interação entre os antibióticos testados, estabelecendo se houve sinergismo, indiferença ou antagonismo entre eles.

13 13 3. Materiais e Métodos 3.1 Amostras Foram analisadas 50 amostras isoladas de urina e sangue de pacientes do HCRP-USP entre fevereiro de 2011 e fevereiro de 2012, sendo 25 isolados multisensíveis e 25 isolados multirresistentes (KPC). As amostras de urina foram semeadas de forma quantitativa com alça calibrada (10 µl) em placas de Ágar Cled e, em seguida incubadas em estufa bacteriológica a 35 C por horas. Os frascos de sangue positivos no equipamento Bactec 9240 foram semeados em placas de Ágar chocolate com auxílio de uma alça bacteriológica e incubadas em jarra de CO 2 e estufa bacteriológica a 35 C por 24 horas. As amostras clínicas foram identificadas e analisadas quanto à sensibilidade aos antimicrobianos pelo sistema automatizado Vitek 2 e foi utilizado o método de difusão para confirmação dos resultados, além do teste de Hodge Modificado. As amostras foram armazenadas em meio TSB + 20% de glicerol a -20 C e, para a realização do método de microdiluição em placas, foram descongeladas, semeadas em Ágar sangue de carneiro e incubadas em estufa bacteriológica a 35 C por 24 horas. Um segundo repique foi realizado em Ágar sangue para ser utilizado no teste. 3.2 Método de microdiluição em placas O método de microdiluição em placas foi realizado segundo recomendações do CLSI. As drogas foram diluídas em água destilada estéril e armazenadas a -20 C, sendo descongeladas no momento do teste. Foram utilizadas as seguintes drogas: fosfomicina

14 14 (FOSF-SIGMA), imipenem (IMP-ABL) e amicacina (TEUTO) em diferentes concentrações obtidas a partir da solução estoque. Para isolados de Klebsiella pneumoniae multisensível, a faixa de concentração utilizada de amicacina foi de 8 a 0,13 µg/ml e imipenem de 16 a 0,03 µg/ml. Para Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) a faixa utilizada de amicacina e de imipenem foi de 16 a 0,25 µg/ml e de 1024 a 2 µg/ml, respectivamente. A concentração de fosfomicina usada foi de 256 a 0,5 µg/ml tanto para multisensível quanto para KPC. As amostras bacterianas foram diluídas em salina estéril obtendo-se uma turvação 0,5 a 0,63 da Escala de McFarland através da leitura em Densichek biomerieux. Em uma microplaca estéril de 96 orifícios foram adicionados 25 µl de cada droga em diferentes concentrações. A microplaca contém uma coluna destinada aos controles das drogas: 6 orifícios destinados ao controle negativo e 2 destinados ao controle positivo. Foram adicionados 100 µl de caldo Mueller Hinton (MH-Oxoid) em todos os orifícios da placa, água destilada estéril em quantidade para totalizar o volume de 155 µl em cada poço e 5 µl da bactéria nos poços destinados ao teste e ao controle positivo (Figura 2). A leitura do teste foi feita após 24 horas de incubação em estufa microbiológica a 35 C utilizando leitora de placas de teste ELISA, comprimento de onda igual a 492. Considerou-se como a concentração mínima inibitória a menor concentração da droga suficiente para inibir o crescimento bacteriano a 20% ou menos da média dos controles positivos. Usou-se como medida de crescimento a densidade óptica (absorvância) de cada poço.

15 µl MH + 25 droga A + 25 µl H 2 O + 5 µl bactéria µl MH + 55 µl H 2 O A B Bl C- C- 100 µl MH + 25 µl droga A + 30 µl H 2 O C D C- C- 100 µl MH + 25 µl de cada droga + 5 µl H 2 O 100 µl MH + 25 µl droga B + 25 µl H 2 O + 5 µl bactéria E C- F C- 100 µl MH + 25 µl droga B + 30 µl H 2 O G H C+ C+ 100 µl MH + 50 µl H 2 O + 5 µl bactéria 100 µl MH + 25de cada droga + 5 µl bactéria Figura 2 - Apresentação de uma placa utilizada no teste de microdiluição.

16 16 4. Resultados As tabelas 1 e 2 apresentam os valores de CIM (Concentração Inibitória Mínima) dos antibióticos testados isoladamente e em combinação para as amostras de K. pneumoniae multisensíves e multirresistentes (KPC). Nos isolados 5-R, 13-S, 19-S, 22-S, 31-R, 34-R, 36-S, 60-S e 61-S não houve interação entre fosfomicina e amicacina, pois em conjunto as drogas permaneceram com o mesmo CIM. No caso de imipenem e amicacina, não houve interação para os seguintes isolados: 2-S, 4-S, 18-S, 28-S e 36-S. Tabela 1 - Perfil de suscetibilidade de Klebsiella pneumoniae isolados multisensíveis (S) e multirresistentes (R) para a interação entre fosfomicina e amicacina, através do método de checkerboard. Determinação da CIM para as drogas isoladas e em combinação, onde A representa fosfomicina (em µg/ml) e B representa amicacina (em µg/ml). Isolado CIM (A) CIM (A) [B] CIM (B) CIM (B) [A] 1-R > S > ,25 0,5 0, R S ,5 1 0, R > S ,5 1 0, R S ,5 1 0, R S > ,5 1 0, R 128 0, S , R > S R > S ,25 0,5 0,25 64

17 17 16-R S R > S ,25 0,5 0, R > S , R , S , R > , S , R > S > ,5 1 0, R >256 > S ,5 1 0, R , S >256 0, , R > , S ,5 1 0, R S ,25 0,5 0, R > S 4 0, , R > , S > , R > S , R > , S R > , S , R S > ,25 0,5 0, R > , S ,25 128

18 18 Tabela 2 - Perfil de suscetibilidade de Klebsiella pneumoniae isolados multisensíveis (S) e multirresistentes (R) para a interação entre imipenem e amicacina, através do método de checkerboard. Determinação da CIM para as drogas isoladas e em combinação, onde A representa imipenem (em µg/ml) e B representa amicacina (em µg/ml). Isolado CIM (A) CIM (A) [B] CIM (B) CIM (B) [A] 1-R S 0,25 0,25 0,25 0,5 0,5 0,13 5-R S 0,13 0,03 0,5 1 0,5 0,06 6-R S 0,06 0,06 0, ,03 7-R S 0,13 0,03 0,5 1 0,5 0,06 9-R S 0,13 0,03 0,5 1 0,5 0,06 11-R S 0,5 0,13 0,5 1 0,13 0,25 12-R S 2 0, R S 0, , R S 0,25 0, ,13 17-R S 0,03 0,03 0,5 1 0,13 0,03 21-R S 0,13 0,06 0,5 1 0,13 0,06 25-R , S 0,13 0, ,06 29-R , S 0,25 0, ,13 30-R , S 0,13 0,03 0,5 1 0,5 0,06 31-R , S 0,06 0,03 0,5 1 0,5 0,03

19 19 32-R , S 0,06 0, ,03 33-R , S 0,13 0,06 0,5 1 0,13 0,06 34-R , S 0,06 0,06 0,25 0,5 0,5 0,03 37-R , S 0,06 0, ,03 38-R , S 0,06 0, ,03 39-R , S 0,06 0, ,03 40-R , S 0,5 0, ,25 41-R 0,13 0, ,25 0,06 61-S 0,25 0, ,13 0,13 42-R , S 0,06 0,03 0,25 0,5 0,25 0,03 43-R , S 0,25 0, ,5 0,13 Os dados das tabelas 3 e 4 mostram os resultados (sinergismo, indiferença ou antagonismo) obtidos da interação entre fosfomicina e amicacina e entre imipenem e amicacina, respectivamente, frente os isolados clínicos de K. pneumoniae de acordo com os valores do IFIC (índice da concentração inibitória fracionada) calculado a partir da concentração inibitória fracionada (FIC) das drogas. - Cálculo do IFIC: FIC droga A= nova CIM (em combinação) CIM (isolada) FIC droga B= nova CIM (em combinação) CIM (isolada)

20 20 IFIC= FIC droga A + FIC droga B - Interpretação do IFIC: IFIC 0,5 Sinergismo 0,5-4,0 Indiferença 4,0 Antagonismo Tabela 3 - Avaliação da interação entre fosfomicina e amicacina determinada através do IFIC sobre amostras de Klebsiella pneumoniae. Isolado FIC IFIC Interpretação FOSFOMICINA AMICACINA 1-R 0,25 0,25 0,5 Sinergismo 2-S 0,125 0,5 0,625 Indiferente 5-R Indiferente 3-S 0,5 0,5 1 Indiferente 6-R 0,5 0,5 1 Indiferente 4-S 0,5 0,5 1 Indiferente 7-R 0,125 0,5 0,625 Indiferente 8-S 0,25 0,25 0,5 Sinergismo 9-R 0,5 0,25 0,75 Indiferente 10-S 0,0312 0,25 0,2812 Sinergismo 11-R 0, ,0039 Indiferente 13-S Indiferente 12-R 0,125 0,5 0,625 Indiferente 14-S 0,0625 0,25 0,3125 Sinergismo 15-R 0,125 0,5 0,625 Indiferente 18-S 0,5 0,5 1 Indiferente 16-R 0,5 0,5 1 Indiferente 19-S Indiferente 17-R 0,125 0,5 0,625 Indiferente 20-S 0,5 0,5 1 Indiferente

21 21 21-R 0,5 0,5 1,0 Indiferente 22-S Indiferente 25-R 0,5 0,25 0,75 Indiferente 23-S 0,5 0,25 0,75 Indiferente 29-R 0,25 0,125 0,375 Sinergismo 24-S 0,0078 0,065 0,0728 Sinergismo 30-R 0,25 0,5 0,75 Indiferente 26-S 0,25 0,5 0,75 Indiferente 31-R Indiferente 27-S 0,125 0,25 0,375 Sinergismo 32-R 0,5 0,25 0,75 Indiferente 28-S 0,0001 0,0312 0,0313 Sinergismo 33-R 0,25 0,25 0,5 Sinergismo 35-S 0,5 0,5 1 Indiferente 34-R Indiferente 36-S Indiferente 37-R 0,5 0,5 1 Indiferente 56-S 0,125 0,065 0,19 Sinergismo 38-R 0,0625 0,25 0,3125 Sinergismo 59-S 0,0625 0,25 0,3125 Sinergismo 39-R 0,0625 0,5 0,5625 Indiferente 44-S 0,25 0,125 0,375 Sinergismo 40-R 0,5 0,125 0,625 Indiferente 60-S Indiferente 41-R 0,0625 0,125 0,1875 Sinergismo 61-S Indiferente 42-R 0,5 0,5 1 Indiferente 65-S 0,5 0,5 1 Indiferente 43-R 0,0312 0,125 0,1562 Sinergismo 66-S 0,25 0,0625 0,3125 Sinergismo

22 22 Tabela 4 - Avaliação da interação entre imipenem e amicacina determinada através do IFIC sobre amostras de Klebsiella pneumoniae. Isolado FIC IMIPENEM AMICACINA IFIC Interpretação 1-R 0,25 0,25 0,5 Sinergismo 2-S 0,25 0,5 0,75 Indiferente 5-R 0,0625 0,125 0,1875 Sinergismo 3-S 0,23 0,5 0,73 Indiferente 6-R 0,125 0,5 0,625 Indiferente 4-S Indiferente 7-R 0,0625 0,5 0,5625 Indiferente 8-S 0,23 0,5 0,73 Indiferente 9-R 0,016 0,25 0,266 Sinergismo 10-S 0,23 0,5 0,73 Indiferente 11-R 0,25 0,25 0,5 Sinergismo 13-S 0,26 0,13 0,39 Sinergismo 12-R 0,125 0,5 0,625 Indiferente 14-S 0,015 0,25 0,265 Sinergismo 15-R 0,25 0,5 0,75 Indiferente 18-S Indiferente 16-R 0,125 0,5 0,625 Indiferente 19-S 0,12 0,25 0,48 Sinergismo 17-R 0,031 0,5 0,531 Indiferente 20-S 1 0,13 1,13 Indiferente 21-R 0,125 0,5 0,625 Indiferente 22-S 0,46 0,13 0,59 Indiferente 25-R 0,125 0,125 0,25 Sinergismo 23-S 0,46 0,5 0,96 Indiferente 29-R 0,25 0,25 0,5 Sinergismo 24-S 0,24 0,5 0,74 Indiferente 30-R 0,25 0,25 0,5 Sinergismo 26-S 0,23 0,5 0,73 Indiferente 31-R 0,0625 0,125 0,1875 Sinergismo 27-S 0,5 0,5 1 Indiferente

23 23 32-R 0,0625 0,125 0,1875 Sinergismo 28-S Indiferente 33-R 0,125 0,125 0,25 Sinergismo 35-S 0,46 0,13 0,59 Indiferente 34-R 0,125 0,016 0,141 Sinergismo 36-S Indiferente 37-R 0,0625 0,125 0,1875 Sinergismo 56-S 0,5 0,5 1 Indiferente 38-R 0, ,125 0,15625 Sinergismo 59-S 0,5 0,5 1 Indiferente 39-R 0,125 0,25 0,375 Sinergismo 44-S 0,5 0,5 1 Indiferente 40-R 0,25 0,125 0,375 Sinergismo 60-S 0,5 0,5 1 Indiferente 41-R 0,23 0,125 0,355 Sinergismo 61-S 0,12 0,065 0,185 Sinergismo 42-R 0,125 0,25 0,375 Sinergismo 65-S 0,5 0,5 1 Indiferente 43-R 0, ,25 0,28125 Sinergismo 66-S 0,12 0,125 0,24 Sinergismo A avaliação da interação entre os antibióticos mostrou indiferença para a maioria dos isolados de Klebsiella pneumoniae testados. A combinação de fosfomicina e amicacina resultou em sinergismo para 32% dos isolados, sendo a maioria representada pelos isolados multisensíveis (Tabela 5). Os resultados obtidos com a interação de imipenem e amicacina demonstraram que houve sinergismo para 46% dos isolados, onde predominaram os multirresistentes (KPC) (Tabela 6).

24 24 Tabela 5 - Resultados da interação in vitro entre fosfomicina e amicacina, de acordo com os isolados de K. pneumoniae - multirresistentes (KPC) ou multisensíveis (S). Grupo de K. pneumoniae Tipo de Interação Sinergismo Indiferença Totais (%) KPC S Totais (%) 16 (32%) 34 (68%) 50 (100%) Tabela 6 - Resultados da interação in vitro entre imipenem e amicacina, de acordo com os isolados de K. pneumoniae - multirresistentes (KPC) ou multisensíveis (S). Grupo de K. pneumoniae Tipo de Interação Sinergismo Indiferença Totais (%) KPC S Totais (%) 23 (46%) 27 (54%) 50 (100%) 5. Discussão Souli M. et al. (Antimicrob Agents Chemother, 2011) investigaram as interações de fosfomicina com meropenem ou colistina ou gentamicina contra 17 isolados de Klebsiella pneumoniae multirresistentes (KPC) e observaram sinergismo de 64,7% e 11,8% das amostras com meropenem ou colistina, respectivamente, enquanto a combinação com gentamicina resultou em indiferença. Elemam, Rahimian e Dovmaz (J Clin Microbiol, 2010) avaliaram o sinergismo do antibiótico polimixina B contra 12 isolados clínicos de Klebsiella pneumoniae carbapenemase através do método de microdiluição em caldo. A polimixina B foi estudada em combinação com cefazolina, ceftriaxona, cefepime, imipenem, gentamicina, tigeciclina, doxiciclina e

25 25 rifampicina. Foi observado sinergismo com a combinação de rifampicina e polimixina B, bem como com polimixina B e doxiciclina. Observou-se sinergismo menos pronunciado com a tigeciclina e polimixina B e não obteve sinergia em concentrações fisiológicas com os outros antimicrobianos. Tasaka, Ishida e Chinzei (Jpn J Antibiot, 2002) investigaram o efeito in vitro combinado de imipenem ou meropenem com amicacina contra mais de 20 isolados de Pseudomonas aeruginosa. Na combinação de imipenem e amicacina, o sinergismo foi observado em 8 (40%) isolados, enquanto na combinação de meropenem e amicacina em 14 amostras (70%). Antagonismo não foi observado para qualquer uma das combinações testadas. Hotta, T. el al (Jpn J Antibiot, 1991) conduziram um estudo onde imipenem/cilastatina de sódio (IPM/CS) e amicacina sulfato (AMK) foram administradas a pacientes com doenças hematológicas graves e avaliaram a interação sinérgica entre os antibióticos contra isolados clínicos (6 estirpes), utilizando a técnica de tabuleiro de xadrez. Efeitos sinérgicos e aditivos foram observados em 66,7% e 33,3% das amostras, respectivamente. Portanto, concluíram que IPM / CS com AMK é considerado como sendo uma combinação útil de antibiótico para o tratamento de distúrbios hematológicos graves. 6. Conclusões A interação entre imipenem e amicacina obteve mais resultados sinérgicos que a interação entre fosfomicina e amicacina. A interação entre fosfomicina e amicacina teve mais eficácia para os isolados de K. pneumoniae multisensíveis.

26 26 A interação entre imipenem e amicacina teve mais eficácia para os isolados de K. pneumoniae multirresistentes (KPC). Não foram observados resultados antagônicos para as combinações testadas.

27 27 7. Referências Bibliográficas ANDERSON, K.F. et al. Evaluation of methods to identify the Klebsiella pneumoniae carbapenemase in Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol, v.45, n.8, p , BUSH, K. New beta-lactamases in gram-negative bacteria: diversity and impact on the selection of ant imicrobial therapy. Clin Infect Dis, v.32, n.7, p , CAI, J. C. et al. Emergence of Serratia marcescens, Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli possessing the plasmid-mediated carbapenem-hydrolyzing {beta}- lactamase KPC-2 in intensive care units from a Chinese hospital. Antimicrob Agents Chemother, DIENSTMANN, Rosabel et al. Avaliação fenotípica da enzima Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar. J. Bras. Patol. Med. Lab. vol.46, n.1, pp.23-27, DEL PELOSO, Pedro Fernandez; BARROS, Matheus Felipe Leal de and SANTOS, Fernanda Abreu dos. Sepse por Serratia marcescens KPC. J. Bras. Patol. Med. Lab. vol.46, n.5, pp , DESIMONI, M.C., ESQUIVEL, G.P., MERINO, L.A. Fecal colonization by extendedspectrum betalactamase- producing Klebsiella pneumoniae in a neonatal intensive care unit. Enferm Infecc Microbiol Clin. v.22, n.9, p , ELEMAM, A., RAHIMIAN, J., DOYMAZ, M. In vitro evaluation of antibiotic synergy for polymyxin B-resistant carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae. J Clin Microbiol, 2010.

28 28 GUIMARÃES, D. O., MOMESSO, L. S., PUPO, M. T. Antibióticos: importância terapêutica e perspectivas para a descoberta e desenvolvimento de novos agentes. Quimica Nova, vol. XY, No. 00, 1-13, HOTTA, T., MORISHIMA, Y., SAITO, H., KODERA, Y., HIRABAYASHI, N., TANAKA, M., MIZUNO, H., SUZUKI, H., KATO, Y., MORISHITA, Y. et al. Laboratory and clinical studies on imipenem/cilastatin sodium plus amikacin sulfate in patients with severe infections complicating hematological disorders. Jpn J Antibiot, KONEMAN, E. et al. Diagnóstico microbiológico. 5 ed.rio de Janeiro: Guanabara Koogan, MARCHAIM, D., et al. Isolation of imipenem-resistant Enterobacter species; emergence of KPC-2 carbapenemase, molecular characterization, epidemiology, and outcomes. Antimicrob. Agents Chemother. n.52, p , MARTINEZ, J., et al. How are gene sequence analyses modifying bacterial taxonomy? The case of Klebsiella. Int Microbiol. v.7, n.4, p.261-8, MS, Ministério da Saúde. Secretaria de Ciência, Tecnologia e Insumos Estratégicos. Departamento de Assistência Farmacêutica e Insumos Estratégicos. Formulário terapêutico Nacional 2010: Rename ed. Brasília, Ministério da Saúde, MONTEIRO, J. et al. First report of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae strains in Brazil. Antimicrob Agents Chemother, v.53, n.1, p.333-4, OGA, S.; BASILE, AC. Medicamentos e suas interações. São Paulo, Atheneu, 1994.

29 29 PODSCHUM, R.; ULLMANN, U. Klebsiella spp. as nosocomial phathogens: epidemiology, taxonomy, typing methods, and pathogenicity factors. Clin. Microbiol. Rev., n.11, p , ROSSI, F.; ANDREAZZI, D. B. Resistência bacteriana: interpretando o antibiograma. São Paulo: Atheneu, SOULI, M. el al. In vitro interactions of antimicrobial combinations with fosfomycin against KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae and protection of resistance development. Antimicrob Agents Chemother, Tasaka K, Ishida A, Chinzei T. Antimicrobial activity of carbapenems and the combined effect with aminoglycoside against recent clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa. Jpn J Antibiot, Yigit H, Queenan AM, Andérson GJ, Domenech-Sanchez A, Biddle JW, Steward CD, Alberti S, Bush K, Tenover FC. Novel carbapenen-hydrolyzing β-lactamase, KPC-1, from a carbapenem-resistant straim of Klebsiella pneumoniae. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2001.