VIABILIDADE DA CULTURA PROBIÓTICA EM SUCO DE LARANJA ADICIONADO DE OLIGOFRUTOSE OU ÁCIDO ASCÓRBICO E ACEITAÇÃO PELOS CONSUMIDORES

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1 VIABILIDADE DA CULTURA PROBIÓTICA EM SUCO DE LARANJA ADICIONADO DE OLIGOFRUTOSE OU ÁCIDO ASCÓRBICO E ACEITAÇÃO PELOS CONSUMIDORES J.V. de C. Silva 1, J.D. Mingotti 2, G.M. da Costa 3, C. E. Barão 4, S. J. Klososki 5, T. C. Pimentel 6 1- Diretoria de Ensino Pesquisa e Extensão Instituto Federal do Paraná Campus Paranavaí CEP: Paranavaí PR Brasil, Telefone/Fax: (44) josevitor.silva@ifpr.edu.br 2- idem ao 1. jessicamingotti123@gmail.com 3 - idem ao 1. guimamedec@outlook.com 4 - idem ao 1. carlos.barao@ifpr.edu.br 5 - idem ao 1. suellen.jensen@ifpr.edu.br 6 idem ao 1. tatiana.pimentel@ifpr.edu.br RESUMO O objetivo deste trabalho foi adicionar culturas probióticas em suco de laranja e avaliar a sobrevivência destas ao armazenamento refrigerado (4 o C por 28 dias), assim como, o efeito do ácido ascórbico ou da oligofrutose em sua sobrevivência. A aceitação dos produtos foi avaliada por consumidores de suco de laranja. Os probióticos permaneceram viáveis (>10 6 UFC/mL) durante os 28 dias, portanto, os sucos poderiam ser considerados produtos probióticos. A oligofrutose ou o ácido ascórbico não tiveram efeito sobre a sobrevivência da cultura probiótica. Não houve diferença na aceitação para as formulações, indicando que a adição de probiótico não altera o produto convencional. É possível a adição de probióticos em suco de laranja resultando em produtos com quantidades adequadas do probiótico e sem alteração na aceitação. ABSTRACT The objective of this work was to add probiotic cultures in orange juice and evaluate the survival of the probiotic culture in cold storage (4 C for 28 days), as well as, the effect of ascorbic acid or oligofructose in the survival of it. The acceptance of the products was evaluated by orange juice consumers. Probiotics remained viable (>10 6 CFU / ml) for 28 days, therefore, the juices could be considered probiotic products. The oligofructose or ascorbic acid had no effect on the survival of the probiotic culture. There was no difference in acceptance of the formulation, indicating that probiotic addition did not alter the conventional product. It is possible to add probiotic cultures in orange juice resulting in products with appropriated probiotic amounts and no acceptance alteration. PALAVRAS-CHAVE: Lactobacillus paracasei ssp. paracasei, alimento funcional; vida útil. KEYWORDS: Lactobacillus paracasei ssp. paracasei, functional food; shelf life. 1. INTRODUÇÃO Probióticos são micro-organismos vivos que conferem efeito benéfico ao indivíduo, quando administrados em quantidades adequadas (FAO/WHO, 2002). A concentração da cultura probiótica para considerar um alimento como sendo probiótico deve ser superior a 10 6 UFC por mililitro ou

2 grama do produto durante toda sua vida útil (Donkor et al., 2007). No Brasil, a quantidade é especificada na porção diária do produto, sendo requeridos 10 8 a 10 9 UFC (Anvisa, 2008). Há um grande interesse no desenvolvimento de produtos não lácteos probióticos (Antunes et al., 2013). Os produtos não lácteos probióticos poderiam ser úteis em casos de intolerância à lactose, alergias às proteínas do leite, altas taxas de colesterol, vegetarianismo, ou inacessibilidade aos derivados de leite (Bevilacqua et al., 2013). Além disso, seriam uma forma a mais da população em geral obter este tipo de culturas benéficas. Os sucos de fruta podem ser considerados bons veículos carreadores dessas culturas, pois: (1) são considerados bebidas saudáveis e refrescantes; (2) são consumidos por pessoas de todas as faixas etárias; (3) apresentam açúcares e componentes bioativos (minerais, vitaminas, fibras e antioxidantes) em sua composição, os quais poderiam ser utilizados pelos probióticos; (4) são consumidos de forma regular, requisito básico para que os probióticos possam demonstrar seus efeitos à saúde; (5) não contém culturas iniciadoras, que competiriam por nutrientes com as culturas probióticas; (6) são geralmente adicionados de componentes antioxidantes (como o ácido ascórbico), os quais reduzem a quantidade de oxigênio no meio, auxiliando na manutenção da viabilidade da cultura probiótica; (7) não possuem alergênicos em potencial, como a lactose, caseína e algumas proteínas da soja; e (8) por ser líquido, o tempo de residência no estômago é curto, não expondo por longo tempo os probióticos à acidez deste órgão (Sheehan et al., 2007; Ding & Shah, 2008). No entanto, a adição de culturas probióticas a sucos de frutas é mais complexa do que em produtos lácteos, pois: (1) apresentam baixo ph e alta concentração de oxigênio dissolvido, sendo a maioria dos probióticos sensível a essas condições; (2) apresentam quantidades insuficientes de peptídeos e aminoácidos livres necessários ao desenvolvimento das culturas; e (3) as culturas probióticas podem alterar as características sensoriais dos produtos mais do que a de produtos lácteos, principalmente o aroma e o sabor. Sucos probióticos foram caracterizados como tendo sabor lácteo, medicinal, ácido, salgado, amargo, adstringente, artificial ou de terra (Luckow & Delahunty, 2004a,b; Granato et al., 2010). A adição de vitaminas, oligofrutoses ou componentes com capacidade antioxidante, como o ácido ascórbico a sucos de fruta pode proteger as culturas probióticas das condições ambientais, aumentando sua sobrevivência durante a estocagem (Ying et al., 2013). Não há no mercado brasileiro sucos adicionados de culturas probióticas. Sendo assim, o objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito da adição de culturas probióticas (L. casei-01) nas características físico-químicas, microbiológicas e sensoriais de suco de laranja. O efeito da adição de ácido ascórbico ou oligofrutose no aumento da sobrevivência do probiótico também foi avaliado. 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1 Ativação da Cultura Probiótica Uma alçada da cultura foi inoculada em 5mL de suco de laranja e incubada a 37ºC por 15h. Percorrido este tempo, 1% (v/v) foi novamente inoculado em 10mL de suco e incubado a 37ºC por 15h (pré-inóculo). Após isso, 1% (v/v) do pré-inóculo foi transferido para 300mL de suco e incubado nas mesmas condições. Então, 2% deste meio foram inoculados no suco de laranja. 2.2 Preparo das Formulações Seis formulações de sucos de laranja foram preparadas conforme Tabela 1.

3 Tabela 1 Formulações de suco de laranja Formulação Probiótico Oligofrutose Ácido ascórbico PURE PRO 20mL/L - - ACID g/L PRE - 20 g/l - PRO-ACID 20mL/L g/L SIMB 20mL/L 20 g/l - Para a obtenção dos sucos, as laranjas foram lavadas em água corrente, sanitizadas (6mL/L de desinfetante para hortifrutícolas Pury Vitta, 0,96% p/p cloro ativo), descascadas e trituradas em processador de frutas. As formulações com ácido ascórbico (3 e 4), foram adicionadas deste componente (0,024%) (Shah et al., 2010), assim como as adicionadas de oligofrutose (5 e 6). Todas as formulações foram acondicionadas em frascos de vidro, pasteurizadas a 80 o C por 20 minutos em banho Maria e resfriadas em banho de gelo até 37 o C. As formulações com culturas probióticas (2 e 4) foram adicionadas de 2% (v/v) da cultura probiótica ativada. Os sucos de laranja foram armazenados a 4 o C por 28 dias. 2.3 Avaliação Microbiológica Um mililitro de cada formulação de suco de laranja foi diluído em 9 ml de solução salina 0,1% (p/v) esterilizada e agitado uniformemente com um agitador. As diluições seriadas foram realizadas e o número de micro-organismos viáveis da cultura probiótica enumerado usando a técnica de pour plate. A contagem de Lactobacillus paracasei ssp. paracasei foi feita em ágar MRS e incubação anaeróbica a 37 o C por 72 horas (Tharmaraj & Shah, 2003). 2.4 Avaliação Sensorial O teste de aceitação de atributos (cor, aroma, sabor, textura e impressão geral), utilizando escala hedônica de 9 pontos (1 = desgostei muitíssimo; 9 = gostei muitíssimo) (Stone & Sidel, 2004) foram realizados por uma equipe de 70 julgadores não treinados no primeiro dia de armazenamento dos produtos. Os julgadores avaliaram as seis formulações em uma sessão de avaliação, selecionadas de forma aleatória e codificadas, sendo avaliadas à temperatura de 4 o C, uma de cada vez, em ordem aleatorizada. Água potável à temperatura ambiente e biscoitos cream cracker foram disponibilizados para a limpeza da boca antes e entre as avaliações das formulações. 2.5 Análise Estatística O experimento completo foi repetido duas vezes em um delineamento inteiramente casualizado. Para a contagem da cultura probiótica utilizou-se o esquema em parcelas subdivididas, onde o tratamento principal foi a formulação e o secundário o tempo de armazenamento. Para a aceitabilidade o delineamento foi de blocos completos casualizados, onde os tratamentos foram as formulações e os blocos os julgadores. Os dados foram submetidos à Análise de Variância (ANOVA), teste F de Snedecor e teste de comparação de médias de Tukey (α=5%). As análises estatísticas foram realizadas usando o programa Statistical Analysis System (SAS)

4 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO Na Figura 1 está apresentada a viabilidade da cultura probiótica durante o armazenamento refrigerado. Para que produtos alimentícios sejam considerados probióticos devem apresentar contagens acima de 10 6 UFC/mL (Donkor et al., 2007) ou 10 8 a 10 9 UFC na porção diária do produto (200mL para suco) (Anvisa, 2008), portanto todos os sucos com adição de probióticos (PRO, PRO-ACID e SIMB) avaliados no presente estudo poderiam ser considerados probióticos durante os 28 dias de armazenamento refrigerado. Durante o período de armazenamento refrigerado (comparando-se os produtos com 1 e 28 dias) houve manutenção da viabilidade das culturas probióticas (p > 0,05), mesmo em condições ácidas e de presença de oxigênio no meio, o que indica que o probiótico utilizado (Lactobaciilus paracasei ssp paracasei) é uma cepa resistente e que o suco de laranja foi um meio adequado para a inoculação. A adição de oligofrutose (SIMB) ou ácido ascórbico (PRO-ACID) não teve influência (p>0,05) na viabilidade das culturas probióticas. Figura 1 Viabilidade da cultura probiótica durante armazenamento refrigerado *As barras de erro representam o desvio padrão (n=6). Formulações: PRO (probiótico), PRO-ACID (probiótico + ácido ascórbico) e SIMB (probiótico + oligofrutose) Os resultados da aceitação dos produtos pelos consumidores estão apresentados na Tabela 2. Tabela 2 Atributos sensoriais das formulações produzidas Parâmetro Formulação PURO PRO ACID PRE PRO-ACID SIMB Aparência 7.03±1.85a 7.35±1.37a 7.26±1.40a 7.37±1.51a 7.62±1.45a 7.03±1.68a Aroma 6.64±1.81a 6.72±1.43a 6.44±1.77a 6.91±1.83a 7.05±1.47a 6.48±1.72a Sabor 5.36±2.34a 5.94±1.81a 5.11±2.06a 5.91±2.21a 5.97±2.19a 5.44±1.86a Textura 6.01±1.92a 6.55±1.85a 6.08±1.99a 6.85±1.72a 6.91±1.70a 6.66±1.64a Geral 5.64±2.33a 6.16±1.96a 5.55±1.99a 6.22±1.95a 6.28±2.06a 5.93±1.88a A presença de oligofrutose, cultura probiótica ou ácido ascórbico não interferiu (p > 0,05) na aceitação (aparência, aroma, sabor, textura e avaliação geral) dos sucos de laranja puros. A não alteração da aceitabilidade dos produtos com a adição de probióticos e/ou prebióticos é importante, pois os consumidores não estão interessados em consumir bebidas funcionais se os ingredientes

5 adicionados ocasionarem aromas e sabores estranhos ou desagradáveis nos produtos, mesmo levando em consideração os benefícios à saúde (Tuorila & Cardello, 2002). Os escores de aceitação para aparência, aroma e textura estiveram entre 6 e 7 em uma escala hedônica de 9 pontos, indicando que os consumidores gostaram de ligeiramente a moderadamente dos produtos. No caso do sabor e da avaliação geral, os escores se situaram entre 5 e 6, indicando que os consumidores foram indiferentes ou gostaram ligeiramente dos mesmos. A baixa aceitação dos produtos pode ser justificada pelo processamento tecnológico utilizado, ou seja, os sucos foram submetidos a um tratamento térmico em banho Maria (80 o C/20 min), prejudicando o sabor dos produtos. Além disso, no Brasil, os consumidores estão acostumados a consumir sucos de laranja in natura e, portanto, o tratamento térmico deve ser sutil, a fim de não comprometer demasiadamente as características sensoriais finais. Os problemas tecnológicos poderiam ser facilmente resolvidos em escala industrial, onde se dispõe de trocadores de calor para esta finalidade, utilizando temperaturas mais altas e tempos de retenção bem mais baixos (segundos), mantendo as propriedades sensoriais dos sucos. 4. CONCLUSÃO É possível produzir sucos de laranja adicionados de probióticos com viabilidade até 28 dias após a fabricação e sensorialmente aceitáveis. 5. AGRADECIMENTOS Ao CNPq e ao Instituto Federal do Paraná pelo apoio financeiro ao projeto por meio da concessão de bolsas aos estudantes na modalidade PIBIC-AF, PIBITI e PIBIS, e auxilio financeiro ao projeto por meio do PIAP. 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Antunes, A.E.C.; Liserre, A.M.; Coelho, A.L.A.; Menezes, C.R.; Moreno, I.; Yotsuyanagi, K. & Azambuja, N.C. (2013). Acerola néctar with added microencapsulated probiotic. LWT-Food Science and Technology, 54: Anvisa. (2008). Alimentos com alegações de propriedades funcionais ou de saúde, novos alimentos/ingredientes, substâncias bioativas e probióticos: lista de alegações de propriedade funcional aprovadas. Atualizado em julho, Bevilacqua, A.; Campaniello, D.; Corbo, M.R.; Maddalena, L.; & Sinigaglia, M. (2013). Suitability of Bifidobacterium spp. and Lactobacillus plantarum as probiotics intended for fruit juices containing citrus extracts. Journal of Food Science, 78(11):M1764-M1771. Ding, W.K. &Shah, N.P. (2008). Survival of free and microencapsulated probiotic bacteria in orange and apple juices. International Food Research Journal, 15(2): Donkor, O.N; Nilmini, S.L.I; Stolic, P.; Vasiljevic, T. & Shah, N.P. (2007). Survival and activity of selected probiotic organisms in set-type yoghurt during cold storage. International Dairy Journal, 17(6):

6 FAO/ WHO. (2002). Guidelines for the evaluation of probiotics in food. Report of a Joint Food and Agriculture Organization of the United Nations, World Health Organization Working Group of Drafting Guidelines for the Evaluation of Probiotic in food, Ontario, Canadá. Disponível em: ftp://ftp.fao.org/es/esn/food/wgreport2.pdf. Granato,D.; Branco, G.F.; Nazzaro, F.; Cruz, A.G. & Faria, J.A.F. (2010). Functional foods and nondairy probiotic food development: trends, concepts and products. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 9(3): Luckow, T.; & Delahunty, C. (2004). Which juice is healthier? A consumer study of probiotic nondairy juice drinks. Food Quality and Preference, 15(7-8): Shah, N.P.; Ding, W.K.; Fallourd, M.J. & Leyer, G. (2010). Improving the stability of probiotic bacteria in model fruit juices using vitamins and antioxidants. Journal of Food Science, 75(5):M278- M282. Sheehan, V.M.; Ross, P. & Fitzgerald, G.F. (2007). Assessing the acid tolerance and the technological robustness of probiotic cultures for fortification in fruit juices. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 8(2): Stone, H.; Sidel, J. (2004). Sensory evaluation practices. 3 ed. New York: Academic Press. Tharmaraj, N. & Shah, N.P. (2003). Selective enumeration of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus, Bifidobacteria, Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus, and Propionibacteria. Journal of Dairy Science, 86(7): Ying, D.; Swander, S.; Weerakkody, R.; Sanguansri, L.; Gantenbein-Demarchi, C. & Augustin, M.A. (2013). Microencapsulated Lactobacillus rhamnosus GG in whey protein and resistant starch matrices: Probiotic survival in fruit juice. Journal of Functional Foods, 5: