Contagem automática de unidades formadoras de colônias de bactérias em placas de Petri com o uso do algoritmo Template Matching

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1 Contagem automática de unidades formadoras de colônias de bactérias em placas de Petri com o uso do algoritmo Template Matching Kathiani Souza, Arthur Pinheiro, Willian Amorim, Valguima Odakura Faculdade de Ciências Exatas e Tecnologia (FACET) Universidade Federal da Grande Dourados (UFGD) kathianielisa2@hotmail.com, arthur.siufgd10@gmail.com, willianamorim@ufgd.edu.br, valguimaodakura@ufgd.edu.br Abstract - This paper presents the study of Template Matching algorithm based on Normalized Cross- Correlation as a technique to perform the automatic counting of colony forming units of bacteria in Petri Dishes. We will also present the performance evaluation of the Template Matching algorithm for various aspects of the colonies on the image and comparing the score made by the algorithm and count conducted by a specialist. Resumo - Este artigo apresenta o estudo do algoritmo Template Matching com base em Correlação Cruzada Normalizada como técnica para realizar a contagem automática de unidades formadoras de colônias de bactérias em placas de Petri. Apresentaremos também a avaliação de desempenho do algoritmo Template Matching para vários aspectos das colônias na imagem e a comparação entre a contagem feita pelo algoritmo e a contagem realizada por um especialista. 1. Introdução A infecção das vias urinárias caracteriza-se pela presença e multiplicação de microorganismos no aparelho urinário. A infecção urinária é a segunda causa mais comum de infecção na população em geral. As infecções não complicadas, aquelas em que não existem alterações estruturais ou funcionais das vias urinárias, são causadas principalmente pela bactéria Escherichia coli. Essa infecção é definida pela presença de unidades formadoras de colônias por mililítro de urina (ufc/ml), mas essa quantidade pode mudar de acordo com o estado clínico em que o portador do microorganismo se encontre [7]. O cultivo de microorganismos em meios de cultura é uma das técnicas utilizadas na Microbiologia quando se pretende quantificar ou isolar diferentes grupos de microorganismos. Em muitos casos o isolamento dos microorganismos causadores de doenças tem a finalidade de identificar quantos e quais são os tipos de microorganismos existentes no meio de cultura, como forma de diagnóstico e tratamento médico. Sendo assim, uma das formas de diagnóstico da infecção das vias urinárias é a Urocultura, um exame realizado em laboratório, que isola o agente causador da infecção em uma placa de Petri. Na placa são fornecidos nutrientes e condições favoráveis ao seu crescimento para que as unidades formadoras de colônias possam ser quantificadas para posterior decisão médica sobre um possível tratamento [2]. Em alguns laboratórios de análises clínicas a tarefa de quantificar microorganismos, como os agentes bacterianos causadores da infecção urinária, é realizada manualmente, a exemplo do Laboratório de Análises Clínicas do Hospital Universitário da UFGD - Universidade Federal da Grande Dourados. As colônias na placa de Petri, nem sempre estão separadas, em muitos casos elas ficam aglomeradas como pode-se observar na Figura 1. No entanto, em todos os casos a contagem das colônias é feita manualmente. De acordo com os trabalhos de Osowsky e Gamba [5], Alves [2] e Sovierzoski [8] a contagem manual de colônias de bactérias apresenta várias desvantagens como: A fadiga do laboratorista que realiza a contagem que exige concentração e atenção; Quando há troca de técnicos pode haver um desvio significativo nos resultados; É necessário repetir a contagem para validação dos resultados;

2 Limitação das análises laboratoriais devido as dificuldades de contagem que podem atrasar o término do processo e a liberação dos resultados. Diante dos problemas encontrados com a contagem manual pode-se perceber a necessidade de ferramentas computacionais que auxiliem no processo de análise de colônias bacterianas e aumentem a velocidade do processo, a confiabilidade e exatidão dos resultados. Aumentando a velocidade do processo, o laboratorista perde menos tempo com esta atividade repetitiva e suscetível de erro e utiliza seu tempo para outras atividades [8]. Sendo assim, o estudo e o desenvolvimento de algoritmos de processamento de imagens aliados a técnicas de processamento de imagens para o desenvolvimento de ferramentas computacionais, podem contribuir para melhorar o processo de contagem de colônias. Esse trabalho apresenta o estudo e a análise de desempenho do algoritmo Template Matching, baseado em Correlação Cruzada Normalizada, na contagem automática de unidades formadoras de colônias de bactérias em placa de Petri. Template Matching é um algoritmo de reconhecimento de padrões que tem como objetivo a detecção de objetos similares em uma imagem. O trabalho de Alves [2] mostra que o algoritmo Template Matching baseado em correlação, pode ser eficiente na contagem de unidades formadoras de colônias. Já no trabalho de Quinta [6] observase que esse algoritmo pode ser uma técnica interessante para o reconhecimento de leveduras, que possuem o formato parecido com o de colônias de bactérias. O trabalho está organizado da seguinte forma. A seção 2 apresenta o funcionamento do algoritmo Template Matching, a seção 3 apresenta os experimentos realizados e os resultados obtidos, a seção 4 apresenta a análise do resultados e por fim a seção 5, apresenta as conclusões obtidas a partir das implementações e experimentos realizados. 2. Template Matching O algoritmo Template Matching baseado em Correlação Cruzada Normalizada é um algoritmo de reconhecimento de padrões que realiza a detecção de objetos similares em uma imagem. Ele tem como entrada uma imagem e o objeto a ser detectado e como saída uma imagem denominada imagem de Correlação em que os pontos mais claros indicam os pontos detectados. Para tal detecção o algoritmo utiliza como medida de similaridade o coeficiente de Correlação Cruzada Normalizada conforme a Equação 1. Esse coeficiente indica o grau de similaridade entre o template (objeto a ser detectado) e a imagem de pesquisa. Ele varia de -1 até 1. O valor 1 indica total correspondência entre o template e a imagem de pesquisa, 0 indica que não houve correspondência e -1 indica que houve correlação inversa, ou seja, total incorrespondência entre o template e a imagem de pesquisa [1]. (xi x)(y i ȳ) r = ( (xi x) 2 )( (1) (y i ȳ) 2 ) O algoritmo Template Matching baseia-se na correspondência entre um modelo T e uma imagem I na qual este modelo possa ser detectado [3]. Seja I a imagem de pesquisa de dimensão m x n e a imagem T o template de dimensão p x q tal que p < m e q < n, então é realizado o cálculo do coeficiente de Correlação Cruzada Normalizada entre cada pixel da imagem I e os pixels da imagem T. A cada variação de pixel na imagem I, o valor do coeficiente é calculado e armazenado em uma imagem denominada imagem de Correlação, na qual os valores próximos a 1 indicam a correspondência entre o template e a imagem de pesquisa. Por outro lado os valores próximos a -1 indicam a divergência entre o template e a imagem de pesquisa. Na imagem de correlação os pontos mais claros indicam o ponto em que houve a detecção do template como mostra a Figura 3(a). Os pixels das bordas da imagem I são desconsiderados, pois a imagem T tem sua posição inicial definida no centro da imagem, enquanto a imagem I possui a sua posição inicial definida no canto superior esquerdo. Desta forma, ao posicionar o centro da imagem T na posição inicial da imagem I têm-se uma perda de informação [2]. 3. Experimentos e Resultados Foi realizada uma visita ao Laboratório de Análises Clínicas do Hospital Universitário da UFGD para a coleta das imagens das colônias de bactérias depositadas na placa de Petri para a realização dos experimentos. Uma imagem da placa de Petri com as colônias de bactérias pode ser vista na Figura 1. A ferramenta utilizada para o processamento e análise das imagens foi o ImageJ 1 baseado em Java, de uso livre e que permite a criação de plugins e a expansão de suas funcionalidades. A IDE, do inglês Integrated Development Environment ou Ambiente Integrado de Desenvolvimento, utilizada para a implementação do algoritmo Template Matching foi o Eclipse Para a aquisição das imagens foi utilizada uma Câmera Digital 14MP 15x Zoom Óptico que fornece imagens com uma dimensão de 2560 x 1920 pixels no formato JPG. Para a realização dos testes de avaliação do desempenho do algoritmo Template Matching, foi criado um banco de imagens com as melhores imagens entre as coletadas, em que foram escolhidas as mais nítidas, com poucos ruídos e reflexos provenientes da luz do ambiente

3 Figura 1. Colônias de bactérias depositadas na placa de Petri. Figura 2. (a) A figura da esquerda apresenta a Imagem de Pesquisa em escala de cinza. (b) A figura da direita apresenta o Template em escala de cinza. Para a criação desse banco foi desenvolvido um plugin para o ImageJ, denominado CultImage, com a funcionalidade de nomear as imagens com a quantidade de colônias encontradas na contagem manual e salvá-las em um diretório indicado pelo usuário. Foram escolhidas 34 imagens, entre as coletadas, para serem recortadas que deram origem a novas imagens. O objetivo do recorte das 34 imagens, foi selecionar as imagens em que não apareciam as bordas da placa para aplicar o algoritmo nos experimentos iniciais, e utilizar as imagens que apresentam as bordas em experimentos futuros, visto que ela é detectada pelo algoritmo. Foi realizada a contagem das bactérias nas imagens, como forma de compararmos a contagem realizada pelo especialista e a quantidade de colônias de bactérias encontradas pelo algoritmo Template Matching. Para a aplicação do algoritmo Template Matching na contagem das colônias foi desenvolvido um plugin em Java, que utiliza uma das classes do plugin CreateTemplate do ImageJ, que contém a implementação desse algoritmo. Para falicitar os experimentos, foi utilizado um template fixo para evitar a escolha de um template para cada imagem, como acontece no CreateTemplate. Esse plugin converte uma imagem de pesquisa, representada pela Figura 2(a), e o template, representado pela Figura 2(b), do tipo RGB para escala de cinza antes da aplicação do algoritmo. Ele aplica o algoritmo Template Matching para detecção das colônias e obtém uma imagem de correlação, representada pela Figura 3(a). Depois é aplicado o Threshold na imagem, variando o limiar inferior de 0.4 até 1, mantendo o limiar superior igual a 1. Em seguida, é aplicado o método Analyse da classe Java ParticleAnalyzer, que identifica os pontos que estão no intervalo entre o limiar inferior e superior, como mostra a Figura 3(b). Os resultados são salvos em um arquivo para análise. Figura 3. (a) A figura da esquerda apresenta a Imagem de Correlação em que os pontos mais claros indicam os pontos detectados; (b) A figura da direita apresenta Imagem de Correlação após a aplicação do Threshold e do método Analyse. Foram realizados experimentos com 38 imagens, escolhidas entre as 1.252, nas quais foram aplicadas o algoritmo Template Matching. Essas 38 imagens apresentavam nenhuma aglomeração ou um nível de aglomeração moderado. Elas foram escolhidas inicialmente, para que se pudesse analisar o comportamento do algoritmo, com o Threshold variando de 0.4 a 1, em busca do parâmetro em que houvesse melhor detecção. Depois da aplicação do algoritmo e da análise feita com as imagens de correlação que mostraram os pontos detectados, pode-se observar que em determinadas situações em que as colônias se encontravam na imagem, ocorreu alguns problemas de detecção. Nos pontos da imagem em que as colônias encontravam-se aglomeradas houve falha na detecção, de modo que, algumas foram detectadas e outras não. Nos pontos em que o recorte da imagem ocasionou o recorte de algumas colônias, estas não foram detectadas. Isso acontece porque a colônia recortada é um objeto diferente do template, sendo assim, o coeficiente de correlação não indica um ponto de correspondência. Os resultados obtidos com as 38 imagens, mostraram que, o me-

4 lhor Threshold variou entre 0.4 e 0.7. Diante dessa variação foram analisadas as características das imagens que obtiveram valores iguais para o melhor Threshold e foi constatado que essas imagens tinham características em comum. Sendo assim, percebeu-se a necessidade de classificar as imagens em três categorias de acordo com a intensidade dos problemas que elas apresentavam, para possibilitar a análise do desempenho do algoritmo Template Matching em cada situação. As imagens de cada uma das três categorias podem ser vistas nas figuras 4(a), 5(a) e 6(a). As imagens escolhidas para cada categoria foram cuidadosamente analisadas, de modo que, suas características se ajustassem ao perfil da categoria. Para as categorias 1, 2 e 3 foram selecionadas 10 imagens para realizar os experimentos. Como mostra a Figura 4(a), nas imagens da categoria 1, a maioria das colônias encontram-se separadas, porém alguns problemas como a aglomeração e o recorte de colônias ainda podem ser encontrados, mesmo que em menor intensidade. A Tabela 1 apresenta a quantidade de colônias detectadas pelo algoritmo em cada limiar e a quantidade de colônias quantificadas pelo laboratorista, representada pela letra L. A Tabela 1 mostra também que o valor do limiar em que houve melhor detecção foi entre 0.7 e 1 e que em todos os casos o resultado da contagem indicou um número menor de colônias do que realmente existia. Através da análise das imagens de correlação geradas pelo algoritmo pode-se observar que houve a detecção de todas as colônias que estavam totalmente separadas e íntegras como mostra a Figura 4(b). Imagem L Tabela 1. Resultado do experimento com as imagens da categoria 1 mostra os valores encontrados em cada limiar. blema na detecção, de modo que, não foram reconhecidas. A Tabela 2 apresenta a quantidade de colônias encontradas pelo especialista, representada pela letra L, e o valor do limiar em que houve melhor detecção, que foi entre 0.5 e 1. Figura 5. (a) A figura da esquerda apresenta a imagem da categoria 2;(b) A figura da direita apresenta a imagem de Correlação. Figura 4. (a) A figura da esquerda apresenta uma imagem da categoria 1;(b) A figura da direita apresenta a imagem de Correlação em que os pontos vermelhos indicam as colônias detectadas. Como mostra a Figura 5(a) nas imagens da categoria 2 a maioria das colônias se encontravam separadas, mas apresentavam um índice mais elevado de colônias aglomeradas e recortadas que nas imagens da categoria 1. Conforme a Figura 5(b) nos pontos de aglomeração e recorte houve pro- Nas imagens da categoria 3 a maioria das colônias se encontravam aglomeradas e algumas foram recortadas como mostra a Figura 6(a). As imagens dessa categoria apresentaram maior número de colônias aglomeradas e recortadas que nas categorias 1 e 2. Algumas colônias que estavam aglomeradas e recortadas não foram detectadas como mostra a Figura 6(b). A Tabela 3 mostra a quantidade de colônias encontradas pelo especialista, representado pela letra L, e o limiar em que houve melhor detecção, que foi entre 0.4 e Análise dos Resultados Durante a realização dos experimentos com as imagens da categoria 1, todas as imagens de correlação foram analisadas e como mostra a Figura 4(b), todas as colônias separadas e íntegras foram corretamente detectadas.

5 Imagem L Tabela 2. Resultado do experimento com as imagens da categoria 2 mostra os valores encontrados em cada limiar. Figura 6. (a) A figura da esquerda apresenta a imagem da categoria 3;(b) A figura da direita apresenta a imagem de Correlação. Como pode-se perceber, o nível de problemas apresentados nas imagens foi aumentando a cada categoria. Para a análise do desempenho do algoritmo em cada categoria foi realizado o cálculo do erro médio de colônias conforme a Equação 2, onde ce indica o número de colônias presentes na imagem, cd indica o número de colônias detectadas pela técnica e n o número total de imagens. Imagem L Tabela 3. Resultado do experimento com as imagens da categoria 3 mostra os valores encontrados em cada limiar. Categoria erro mínimo erro médio erro máximo Tabela 4. Média de erros mínimo, médio e máximo para cada categoria. n i=img1 ce i cd i ME = (2) n Como mostra a Tabela 4 a média de erros na contagem foi gradativa de acordo com a disposição das colônias nas imagens, isto significa que, o desempenho do algoritmo diminui a medida que aumenta a intensidade dos problemas nas imagens. Além disso, o limiar também foi gradativo com os valores 0.7, 0.5 e 0.4 para as categorias 1, 2 e 3 respectivamente. Outra forma encontrada para analisar o desempenho do algoritmo foi o cálculo F-Score conforme a Equação 3: F = 2 precision recall precision + recall O F-Score é uma medida de desempenho que varia de 0 a 1, sendo que 1 indica alto desempenho. Ela é calculada através do Precision e Recall conforme as Equações 4 e 5 onde: (3) hy é o número de colônias corretamente detectadas pela técnica, visto que, pode ocorrer a detecção de objetos presentes na imagem que não são colônias; hc é o total de colônias detectadas pela técnica; ty é o número de colônias encontradas na imagem. Recall = hy ty P recision = hy (5) hc Foi realizado o cálculo do F-Score para as 10 imagens de cada categoria, para todos os valores de Threshold. A tabela 5 apresenta a média do F-Score para cada categoria em cada Threshold. Ela mostra que os Thresholds nos quais o algoritmo apresentou o melhor desempenho foi de 0.4, 0.5 e 0.7 para as categorias 1, 2 e 3 respectivamente. Isso pode mostrar que os resultados obtidos conforme as tabelas 1, 2 e 3 são realistas. Como mostra a Tabela 5 o melhor desempenho do algoritmo ocorreu com a imagem da categoria 1 e o pior com a imagem da categoria 3. Isso mostra que o desempenho do algoritmo na contagem de unidades formadoras de colônias diminui de acordo com a disposição das colônias na imagem (4)

6 Categoria ,357 0,528 0,708 0,856 0,637 0, ,720 0,8264 0,8262 0,705 0,467 0, ,590 0,510 0,323 0,134 0,066 0,001 Tabela 5. Cálculo do F-Score para cada categoria em cada Threshold. e que ele pode ser eficiente na contagem de unidades formadoras de colônias que se encontram separadas e íntegras. 5. Conclusão Neste trabalho foi apresentado o estudo do algoritmo Template Matching como técnica para contagem de unidades formadoras de colônias de bactérias em placa de Petri e a análise de seu desempenho em várias situações. Através da análise dos resultados dos experimentos e das imagens de correlação, verificou-se que o algoritmo foi eficiente na contagem de colônias separadas e íntegras. Nos casos em que houve erro de detecção pela técnica, as imagens apresentavam problemas de aglomeração e recorte das colônias. Apesar da Tabela 4 mostrar que para a categoria 1 o Template Matching ainda apresentou erros de detecção, cabe lembrar que, como foi dito anteriormente, as imagens da categoria 1 ainda apresentavam problemas de aglomeração e recorte, mesmo que em menor grau que as outras categorias. Sendo assim, o algoritmo pode ser eficiente na contagem de colônias que estejam separadas e íntegras. Outro problema a ser resolvido é o aparecimento de ruídos nas imagens, adquiridos no momento da aquisição das mesmas. Para o cálculo da média do F-Score foi necessário calcular a média do Precision. O Precision indica a precisão do algoritmo. Nenhuma das médias do Precision, para o melhor Threshold, foi igual a 1. Isso significa que houve detecção de falsos-positivos. Sendo assim, um sistema de iluminação pode resolver esse problema, sendo utilizado no momento da aquisição das imagens. Os trabalhos futuros visam o estudo de técnicas que resolvam os problemas de aglomeração, ruídos e recorte das imagens. Uma das técnicas propostas para resolver o problema de aglomeração é a Segmentação. Dessa forma, o algoritmo Template Matching, em conjunto com outras técnicas, poderá realizar a contagem de colônias das imagens das categorias 1, 2 e 3, aumentando a velocidade do processo de contagem e a confiabilidade e exatidão dos resultados. [1] H. A. Al-Mamun, N. Jahangir, M. S. Islam, and A. M. Islam. Eye detection in facial image by genetic algorithm driven deformable template matching. International Journal of Computer Science and Network Security, 9(8), Agosto [2] G. M. Alves. Método fundamentado em processamento digital de imagens para contagem automática de unidades formadoras de colônias. Master s thesis, Universidade Federal de São Carlos, São Carlos, SP, [3] J. C. M. Bateira. Caracterização e visualização de movimento para aplicações em biomecânica. Universidade do Porto, Porto, Portugal, [4] C. Goutte and E. Gaussier. A probabilistic interpretation of precision, recall and f-score, with implication for evaluation. Proceedings of the 27th European Conference on Information Retrieval, [5] J. G. Osowsky and H. R. Gamba. Sistema automático para contagem de colônias em placas de petri. Revista Brasileira de Engenharia Biomédica, 17(3): , Dezembro [6] L. N. B. Quinta. Desenvolvimento de um sistema de visão computacional para o controle microbiano em processos de produção de etanol. Universidade Católica Dom Bosco, Campo Grande, MS, [7] J. S. Roriz-Filho, F. C. Vilar, L. M. Mota, C. L. Leal, and P. C. B. Pisi. Infecção do trato urinário. Revista da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto e do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, 43(2), Junho [8] M. A. Sovierzoski. Contagem automática de unidades formadoras de colônias em placas de petri com uso de processador digital de sinais e técnicas de processamento digital de imagem. Master s thesis, Centro Federal de Educação Tecnológica do Paraná, Curitiba, PR, Referências