LEDGF/p75: REVISÃO SOBRE RELAÇÃO COM DOENÇAS E INTERAÇÃO COM O SISTEMA IMUNOLÓGICO

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1 LEDGF/p75: REVISÃO SOBRE RELAÇÃO COM DOENÇAS E INTERAÇÃO COM O SISTEMA IMUNOLÓGICO Dailiany Orechio 1 Enios Carlos Duarte 2 Resumo: Autoanticorpos são frequentemente utilizados como marcadores de doenças autoimunes. Através de métodos de detecção, em 1994 foi encontrado um novo padrão nuclear de fluorescência, denominado Pontilhado Fino Denso (PFd/DFS70). Esse anticorpo mostrou-se reativo contra uma proteína correspondente ao fator de transcrição p75 e ao fator de crescimento derivado do cristalino, sendo denominada posteriormente de LEDGF/p75. Além de ser um autoantígeno em várias situações inflamatórias e estar envolvido em algumas doenças autoimunes e alguns tipos de cânceres, é também um fator de crescimento e protege as células contra a morte celular. O anti-ledgf/p75 é um anticorpo encontrado com frequência em indivíduos de aspecto saudável, sem nenhuma injúria 1 Mestranda em Ciências pela Universidade de São Paulo (USP). Graduada em Ciências Biológicas pelo Centro Universitário Adventista de São Paulo (Unasp-SP). dorechio@usp.br 2 Mestre em Ciências pela Universidade de São Paulo e graduação em Ciências com Habilitação Plena em Biologia pelo Centro Universitário Adventista de São Paulo (Unasp-SP). Docente do Centro Universitário Adventista de São Paulo. enios.duarte@ucb.org.br.

2 ACTA SCIENTIA BIOLOGICA aparente. Durante a fase de integração do vírus HIV, existe uma importante interação do LEDGF/p75 com a proteína integrase, o que o torna alvo para terapia viral. Futuros estudos sobre a proteína LEDGF/p75 devem enfatizar todo o mecanismo de atuação tanto em processos celulares naturais como patológicos, a fim de colaborar na elucidação da forma de atuação do sistema imunológico em humanos. Palavras-chave: LEDGF/p75; Autoimunidade; PFd; HIV; Doenças inflamatórias crônicas. 34 Abstract: Autoantibodies are frequently used as markers of autoimmune diseases. Through detection methods, in 1994 a new nuclear fluorescence pattern was found, called nuclear dense fine speckled pattern (PFd/DFS70). This antibody, subsequently called LEDGF/p75, proved to be reactive against a protein corresponding to the transcription factor p75 and to the growth factor derived from the crystalline. It is also a growth factor, an autoantigen in various inflammatory conditions, protects cells against cell death, and additionally is involved in some autoimmune diseases and certain types of cancers. The anti-ledgf/p75 is an antibody often found in apparently healthy individuals. In the HIV virus integration stage, there is a significant interaction of the LEDGF/p75 with the integrase protein, making it a potential target for viral therapy. Future studies on the protein LEDGF/ p75 should emphasize the mechanism of action in both natural and pathological cellular processes in order to help elucidating the behavior of the immune system in humans. Keywords: LEDGF/p75; Autoimmunity; PFd; HIV; Chronic inflammatory diseases. Centro Universitário Adventista de São Paulo - Unasp

3 LEDGF/P75: REVISÃO SOBRE RELAÇÃO COM DOENÇAS E INTERAÇÃO COM SIASTEMA IMUNOLÓGICO Perspectiva histórica A presença de autoanticorpos direcionados contra antígenos intracelulares é a principal característica das doenças autoimunes sistêmicas. Podem ocorrer também em outros tipos de doenças como câncer, doenças atópicas, síndrome da fadiga crônica, cistite intersticial, entre outras (GANAPATHY; CASIANO, 2004; MAHLER; FRITZLER, 2010). A detecção de anticorpos teve início em 1948 através das células LE, descritas por Hargraves. A partir de 1950, Coons e Kaplan desenvolveram uma nova técnica para identificar antígenos teciduais usando anticorpos marcados com fluoresceína em cortes de tecido de roedores (HARGRAVES et al., 1948; COONS; KAPLAN, 1950). Somente décadas depois a técnica de imunofluorescência indireta (IFI) em células da linhagem imortal HEp-2 começou a ser amplamente utilizada na detecção de anticorpos. Na interação antígeno-anticorpo, uma alta especificidade é comumente encontrada, o que facilita sua utilização dos anticorpos como marcadores para o diagnóstico de doenças reumáticas autoimunes de suas condições associadas (GANAPATHY; CASIANO, 2004; BIZZARO et al., 2007). Através do teste para detecção de fator antinúcleo por imunofluorescência (FAN-IFI), um novo padrão nuclear caracterizado por um pontilhado fino denso nas células em interfase e também na placa metafásica foi identificado, e costuma ser alvo de grande interesse por parte da comunidade científica (DELLAVANCE et al., 2007). Em 1994, ao examinar soros de pacientes com cistite intersticial, Ochs et al. (1994) observou esse novo padrão, que foi denominado de nuclear Pontilhado Fino Denso (PFd/DFS70) (Figura 1). Posteriormente, a mesma equipe avaliou amostras de soro com o padrão PFd através da técnica de Western blot (WB) e identificou reatividade contra uma proteína de aproximadamente 75kDa, correspondente ao fator de transcrição p75 e ao fator de crescimento derivado do 35 Acta Scientia Biologica. v. 1, n. 1, p , 2016.

4 ACTA SCIENTIA BIOLOGICA cristalino. Assim, o autoantígeno associado ao padrão PFd foi inicialmente chamado de DFS70, passando mais tarde para LEDGF/p75 (OCHS et al., 2000). 36 Figura 1 - Imunofluorescência indireta em células HEp-2 exibindo o padrão nuclear pontilhado fino denso (PFd). Na célula em mitose, nesta figura demonstrada em metáfase, os antígenos alvos do padrão PFd concentram-se na placa metafásica (Imagem cedida por Keppeke G.D.; Laboratório de Reumatologia, Unifesp, 2011). LEDGF/p75 O gene humano que codifica o fator de crescimento derivado do epitélio da lente localiza-se no cromossomo 9p22.2 e contém aproximadamente 15 éxons e 14 íntrons. Por meio de splicing alternativo são codificadas as proteínas LEDGF/p75 e LEDGF/p52, sendo que esta última parece não relacionar-se a nenhuma doença (SINGH et al., 2000; BIZZARO et al., 2007). Segundo (SHARMA et al., 2003), a proteína LEDGF/p75 é encontrada na maioria das células em divisão, preferencialmente associada à Centro Universitário Adventista de São Paulo - Unasp

5 LEDGF/P75: REVISÃO SOBRE RELAÇÃO COM DOENÇAS E INTERAÇÃO COM SIASTEMA IMUNOLÓGICO cromatina condensada no núcleo, sendo responsável pela sobrevivência celular, regulação de genes ligados ao estresse como, por exemplo, Hsp (HeatShockProtein) 25, Hsp27, Hsp90, αb-cristalina, AOP2. Esse estresse pode ser induzido por fatores ambientais tais como estresse oxidativo, falta de suprimento de soro, entre outros. Devido à capacidade de sobrevivência celular ter sido demonstrada em estudos in vitro com células da lente e em estudos com drogas quimioterápicas, o LEDGF/p75 foi cotado para ser usado como proteína terapêutica em doenças da retina e em alguns cânceres, como o câncer de próstata (THANOS; EMERICH, 2005; MEDIAVILLA-VARELA et al., 2009). Do ponto de vista estrutural o LEDGF/p75 possui 530 aminoácidos e vários domínios funcionais (BROWN-BRYAN et al., 2008)(Figura 2). 37 Figura 2 - Representação esquemática de LEDGF/p75 evidenciando as diferentes regiões da proteína e seus domínios funcionais. Os números correspondem à quantidade de aminoácidos presentes (adaptado de BUENO et al., 2010) Os domínios funcionais sempre estão presentes em fatores de transcrição, ao menos em número de dois, um que se liga ao DNA e outro que se liga à RNA polimerase, a fim de exercer função reguladora, ativando ou reprimindo a transcrição de genes (DAVIDSON, 2006). Na região N-terminal, o domínio PWWP (Pro-Trp-Trp-Pro) funciona como um domínio de interação proteína-proteína e/ou um domínio de ligação ao DNA. Estão também presentes os domínios NLS (Nuclear Acta Scientia Biologica. v. 1, n. 1, p , 2016.

6 ACTA SCIENTIA BIOLOGICA Localization Signal), AT-hooke, na região C-terminal, o domínio de ligação à integrase (IBD) (ENGELMAN; CHEREPANOV, 2008; VAN MAELE et al., 2006; BUSSCHOTS et al., 2009). Anti-LEDGF/p75 38 De acordo com Ganapathy et al. (2003), durante o processo de apoptose, quer seja desencadeado por fatores extrínsecos ou intrínsecos, ocorre a clivagem de LEDGF/p75 em sítios específicos por caspases, enzimas responsáveis pela ativação dos processos que culminam na condensação e fragmentação do núcleo e externalização de fosfolipídeos, e posterior fagocitose por macrófagos, gerando fragmentos de 58 e 65kDa (Figura 3). Estes fragmentos podem migrar para células viáveis impedindo a ação dos mecanismos de sobrevivência. Podem ainda resultar em condições pró-inflamatórias, aumentando ainda mais a apoptose (GRIVICICH et al., 2007). Figura 3 - Esquema representando os cinco possíveis sítios clivados por caspases em LEDGF/p75. O número de aminoácidos dos fragmentos da proteína está entre parênteses (adaptado de WU et al., 2002) Centro Universitário Adventista de São Paulo - Unasp

7 LEDGF/P75: REVISÃO SOBRE RELAÇÃO COM DOENÇAS E INTERAÇÃO COM SIASTEMA IMUNOLÓGICO Apoptose induzida e privação de soro em células normais ocasionou uma alta expressão de LEDGF/p75 e subsequente proteção celular, enquanto que células onde apenas o fragmento de 65kD foi expresso falharam nessa função (WU et al., 2002). As formas de indução de anti- -LEDGF/p75 ainda não estão elucidadas. Elas podem ser causadas por apoptose anormal junto com clivagem da proteína, gerando fragmentos responsáveis pelo aumento da imunogenicidade, inativação do fator de sobrevivência e consequente morte celular acentuada. A proteína LEDGF/p75 e seus fragmentos podem ser apresentados aos linfócitos T autorreativos, produzindo os autoanticorpos anti-ledgf/p75 (GANA- PATHY et al., 2003) (Figura 4). Relevância clínica do autoantígeno LEDGF/p75 Há evidências de que esses autoanticorpos são encontrados com considerável frequência e altas concentrações em indivíduos saudáveis. De fato, Mariz et al. (2011) estudaram 918 indivíduos saudáveis, dos quais, 118 foram positivos para fatores antinucleares (FAN), sendo que 39 (33,1% dos FANs positivos em indivíduos saudáveis) apresentaram o padrão PFd. Esse padrão foi exclusivo de indivíduos não portadores de doenças autoimunes reumáticas, em uma série de 153 pacientes com diversas doenças reumáticas autoimunes o padrão não foi encontrado. Em estudo anterior conduzido por Watanabe et al. (2004) com 597 trabalhadores saudáveis de um hospital japonês, a positividade para FAN foi observada em 20% dos indivíduos e, destes, 64 apresentaram o padrão PFd. 39 Acta Scientia Biologica. v. 1, n. 1, p , 2016.

8 ACTA SCIENTIA BIOLOGICA 40 Figura 4 - Modelo da possível contribuição da clivagem de LEDGF/p75 para a patogênese de doenças inflamatórias e distúrbios associados a apoptose desregulada e imunidade humoral a esta proteína (GANAPATHY et al., 2003) Outro estudo avaliou amostras positivas para FAN obtidas de um Laboratório de Patologia Clínica localizado em São Paulo; destas, 5081 (38%) eram positivas para PFd, das quais 39% estavam relacionadas a condições autoimunes e 61% a condições não autoimunes. O padrão PFd esteve presente em pacientes com as mais diferenciadas causas não autoimunes. Entre os pacientes autoimunes, tiroidite autoimune representou 13 casos em 81, ou seja, 16%. Considerando-se que a proteína LEDGF/75 é induzida por estresse oxidativo, é possível que autoanticorpos anti-ledgf/75 representem uma resposta à expressão aumentada da proteína no contexto de diversas condições inflamatórias crônicas dentre as quais as tiroidites autoimunes (DELLAVANCE et al., 2005). Centro Universitário Adventista de São Paulo - Unasp

9 LEDGF/P75: REVISÃO SOBRE RELAÇÃO COM DOENÇAS E INTERAÇÃO COM SIASTEMA IMUNOLÓGICO Um estudo feito pelo Laboratório do Grupo de Estudos sobre Doenças Autoimunes da Sociedade Italiana de Medicina avaliou a prevalência de anticorpos anti-ledgf/p75 em pacientes encaminhados para testes de FAN e em 334 pacientes com diferentes tipos de neoplasia. O objetivo foi determinar se o tecido da lente ocular seria um substrato adequado para a detecção de anticorpos específicos para proteínas das lentes, considerando que o teste convencional de FAN é feito com células Hep-2. Foram encontrados 172 (0,8%) de positividade para o padrão PFd entre os pacientes enviados para teste de FAN, e 6 de 334 (1,8%) no grupo de pacientes com doenças neoplásicas (BIZZARO et al., 2007). Além de estar presente em condições inflamatórias e relacionado à autoimunidade, o LEDGF/p75 é um importante cofator durante a fase de integração no processo de replicação do vírus HIV. A integrase liga-se ao domínio IBD na região C-terminal do LEDGF/p75, que atua como receptor para as partículas do PIC (Complexo de pré-integração). Tal ligação aumenta a atividade de transferência da cadeia de DNA por parte da integrase e a direciona para um locus específico. O encaixe do LEDGF/p75 na cromatina acontece nos domínios NLS e AT-hook, ligando-se diretamente ao DNA, e/ou pode ligar-se à cromatina através dos domínios PWWP e AT-hook por meio de interações proteína-proteína com as histonas ou outros fatores celulares ainda desconhecidos (VAN MAELE et al., 2006). O PIC é capaz de interagir com o DNA alvo mesmo na ausência de LEDGF/ p75. Desta forma, é possível afirmar que a integração não é completamente dependente da presença desse cofator. Porém, estudos apontam que ao reduzir os níveis endógenos de LEDGF/p75, grande parte da integrase é redirecionada para o citoplasma, além de perder a capacidade de associação ao cromossomo (DELLAVANCE et al., 2005; ENGELMAN; CHEREPANOV, 2008). 41 Acta Scientia Biologica. v. 1, n. 1, p , 2016.

10 ACTA SCIENTIA BIOLOGICA 42 É de vital importância que futuros estudos sejam realizados usando-se maiores populações de pacientes e de diferentes países, além de se fazer comparações da prevalência e títulos desse autoanticorpo entre os vários grupos étnicos existentes. Além disso, a exclusão dos falsos positivos e negativos usando vários métodos de detecção de anticorpo também se faz relevante. Segundo Dellavance et al. (2007) o aumento na sensibilidade do teste de FAN-IFI resultou na Síndrome do Anticorpo Idiopático, caracterizada por uma alta frequência de resultados positivos do teste FAN em indivíduos saudáveis ou com manifestações clínicas vagas. Há necessidade de utilização de critérios rígidos de solicitação e de interpretação do teste, com o propósito de evitar diagnósticos equivocados. Segundo Bizzaro et al. (2007), é possível que o padrão PFd compreenda vários anticorpos com alvos diferentes. No estudo realizado usando cortes de olho de roedor, o antígeno LEDGF/p75 é encontrado apenas no epitélio da córnea, mas houve positividade nas fibras reticulares e nos núcleos de células da lente. Alguns autores apontam o padrão PFd como uma alternativa na diminuição de custos de exames. Pacientes com resultados positivos para esse padrão seriam excluídos de diagnósticos para doenças reumáticas autoimunes sistêmicas (MAHLER; FRITZLER, 2010). O uso de inibidores de LEDGF/p75 em terapia viral tem-se mostrado um novo possível aliado no tratamento contra o vírus HIV, o que reforça a significância desta proteína em um amplo contexto patológico (TSIANG et al., 2009). Futuros estudos sobre a proteína LEDGF/p75 devem enfatizar a significância clínica dos anticorpos, a contribuição dos seus domínios estruturais e funções de sobrevivência. A interação gene-alvo, os mecanismos pelos quais a clivagem de LEDGF/p75 por caspases alteram a imunogenicidade e seu papel na patogênese de várias doenças atópicas e inflamatórias Centro Universitário Adventista de São Paulo - Unasp

11 LEDGF/P75: REVISÃO SOBRE RELAÇÃO COM DOENÇAS E INTERAÇÃO COM SIASTEMA IMUNOLÓGICO também são pontos importantes a serem abordados mais profundamente. Concomitantemente, estudos que enfoquem uma análise molecular da interação antígeno-anticorpo para determinar uma possível causa do anti- -LEDGF/p75 ser um anticorpo relativamente comum em indivíduos aparentemente saudáveis serão importantes para um maior esclarecimento de como o sistema imunológico atua na autoimunidade. Referências BIZZARO, N.; TONUTTI, E.; VISENTINI, D.; ALESSIO, M.; PLATZGUMMER, S.; MOROZZI, G.; ANTICO, A.; VILLALTA, D.; PILLER-RONER, S.; VIGEVANI, E. Antibodies to the lens and cornea in anti-dfs70-positive subjects. Annals of the New York Academy of Sciences, v. 1107, p , BROWN-BRYAN, T. A.; LEOH, L. S.; GANAPATHY, V; PACHECO, F. J.; MEDIAVILLA- VARELA, M.; FILIPOVA, M.; LINKHART, T. A.; GIJBERS, R.; DEBYSER, Z.; CASIANO, C. A. Alternative splicing and caspase-mediated cleavage generate antagonistic variants of the stress oncoprotein LEDGF/p75. Molecular cancer research (MCR), v. 6, n. 8, p , BUENO, M. T.; GARCIA-RIVERA, J. A.; KUGELMAN, J. R.; MORALES, E.; ROSAS- ACOSTA, G.; LLANO, M. Sumoylation of the lens epithelium-derived growth factor/p75 attenuates its transcriptional activity on the heat shock protein 27 promoter. Journal of Molecular Biology, v. 399, n. 2, p , BUSSCHOTS, K.; RIJCK, J. D.; CHRIST, F.; DEBYSER, Z. In search of small molecules blocking interactions between HIV proteins and intracellular cofactors. Molecular biosystems, v. 5, n. 1, p , Acta Scientia Biologica. v. 1, n. 1, p , 2016.

12 ACTA SCIENTIA BIOLOGICA COONS, A. H.; KAPLAN, M. H. Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. The Journal of Experimental medicine, v. 91, n. 1, p. 1 13, DAVIDSON, E. H. The regulatory genome: gene regulatory networks in development and evolution. 1. ed. Nova Iorque: N.A. Press., DELLAVANCE, A.; VIANA, V. S.; LEON, E. P; BONFA, E. S.; ANDRADE, L. E.; LESER, P.G. The clinical spectrum of antinuclear antibodies associated with the nuclear dense fine speckled immunofluorescence pattern. Journal of Rheumatology, v. 32, n. 11, p , DELLAVANCE, A; LESER, P. G.; ANDRADE, L. E. C. Relevance of the immunofluorescence pattern for interpretation of the ANA test--the case of the dense fine speckled pattern. Revista da Associacao Medica Brasileira, v. 53, n. 5, p , ENGELMAN, A.; CHEREPANOV, P. The lentiviral integrase binding protein LEDGF/p75 and HIV-1 replication. PLoS Pathogens, v. 4, n. 3, p , GANAPATHY, V.; CASIANO, C. A. Autoimmunity to the Nuclear Autoantigen DFS70 (LEDGF): What Exactly Are the Autoantibodies Trying to Tell Us? Arthritis and Rheumatism, v. 50, n. 3, p , GANAPATHY, V.; DANIELS, T.; CASIANO, C. A. LEDGF/p75: A novel nuclear autoantigen at the crossroads of cell survival and apoptosis. Autoimmunity Reviews, v. 2, n. 5, p , GRIVICICH, I.; REGNER, A.; ROCHA, A. B. D. Morte Celular por Apoptose. Revista Brasileira de Cancerologia, v. 53, n. 3, p , Centro Universitário Adventista de São Paulo - Unasp

13 LEDGF/P75: REVISÃO SOBRE RELAÇÃO COM DOENÇAS E INTERAÇÃO COM SIASTEMA IMUNOLÓGICO HARGRAVES, M. M.; RICHMOND, H; MORTON, R. Presentation of two bone marrow elements; the tart cell and the L.E. cell. Mayo Clinic proceedings, v. 23, n. 2, p , MAHLER, M.; FRITZLER, M. J. Epitope specificity and significance in systemic autoimmune diseases. Annals of the New York Academy of Sciences, v. 1183, p , MARIZ, H. A.; SATO, E.; BARBOSA, S. H.; RODIGUES, S. H.; DELLAVANCE, A.; ANDRADE, L. E. Pattern on the antinuclear antibody-hep-2 test is a critical parameter for discriminating antinuclear antibody-positive healthy individuals and patients with autoimmune rheumatic diseases. Arthritis and Rheumatism, v. 63, n. 1, p , MEDIAVILLA-VARELA, M.; PACHECO, F. J.; ALMAGUEL, F; PEREZ, J.; SAHAKIAN, E.; DANIELS, T. R.; LEOH, L. S.; PADILLA, A.; WALL, N. R.; LILLY, M. B.; LEON, M. D.; CASIANO,. A. Docetaxel-induced prostate cancer cell death involves concomitant activation of caspase and lysosomal pathways and is attenuated by LEDGF/p75. Molecular cancer, v. 8, p. 68, OCHS, R. L.; STEIN, T. W.; PEEBLES, C.; GITTES, R. F.; TAN, E. M. Autoantibodies in interstitial cystitis. The Journal of urology, v. 151, n. 3, p , OCHS, R. L.; YUANZHENG, S. I.; YOSHINAO, M.; TAN, M. E. Autoantibodies to DFS 70 kd/transcription coactivator p75 in atopic dermatitis and other conditions. Journal of Allergy and Clinical Immunology, v. 105, n. 6 I, p , SHARMA, P.; SHINOHARA, R.; FATMA, N.; KUBO, E.; CHYLACK, L. T.; SINGH, U. Lens epithelium-derived growth factor relieves transforming growth factor-beta1-induced transcription repression of heat shock proteins in human lens epithelial cells. The Journal of biological chemistry, v. 278, n. 22, p , Acta Scientia Biologica. v. 1, n. 1, p , 2016.

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