M. Sc. Nadia Batoreu Dr Martin Bonamino Dr Etel Gimba. Ana Emília Goulart, Bio-Manguinhos/ Fiocruz
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- Martín Peixoto Brandt
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1 Investigação dos mecanismos moleculares pelos quais o PCA3 modula a sobrevivência de células de câncer de próstata. LATER/ PBIO Bio-manguinhos/ FIOCRUZ goulart@bio.fiocruz.br M. Sc. Nadia Batoreu Dr Martin Bonamino Dr Etel Gimba
2 Câncer de Próstata Estimativa INCa, 2014
3 PCA3 (Prostate Cancer Antigen 3) RNA não codificante (ncrna) - Alta densidade de stop codons ; - Nenhuma ORF (fase aberta de leitura); - Tradução in vitro; - Nenhuma similaridade entre possível polipeptídeo e sequências em bancos de dados. Funções desempenhadas por ncrnas: -Silenciamento de genes; -Desmetilação de DNA/ remodelamento de cromatina; -Regulação da transcrição (ativação e repressão) -Modulação da atividade de proteínas.
4 PCA3 (Pal e cols, 2013; Kok e cols, 2002, Bussemakers e cols, 1999)
5 PCA3 Aplicado como Biomarcador para diagnóstico de CaP (EUA e Canadá); Kit diagnóstico Progensa PCA3 que detecta RNAm em células da próstata liberadas na urina após massagem prostática intensa ou exame de toque retal; O emprego do PCA3 no diagnóstico evita biópsias desnecessárias; (Qiu e cols, 2013) Klecka et al., 2010 Neves et al, 2008
6 PCA3 Feldman e Feldman, 2001
7 PCA3 Thiery e cols, 2006
8 EMT x via do AR EMT Via do AR
9 Objetivos Investigar os mecanismos moleculares pelos quais o PCA3 controla a sobrevivência das células de CaP. Verificar se diversos genes relacionados ao câncer podem estar envolvidos no processo de resposta ao silenciamento do PCA3; Promover o silenciamento estável do PCA3 através da construção de um vetor lentiviral baseado em shrna, vislumbrando estratégias terapêuticas para o CaP.
10 Estratégia Experimental RNAi Transfecção Transdução celular Análise da expressão do PCA3 Análise da expressão do PCA3 PCR ARRAY qrt-pcr Microscopia confocal Citometria de Fluxo Azul de Tripan Expressão de diversos genes relacionados ao câncer Sobrevivência celular e N células viáveis
11 Resultados Análise da expressão de co-reguladores da via do AR
12 Resultados Gene Função Nível de expressão relativa de RNAm MAP2K1 Molécula de Transdução de Sinal e Fator de Transcrição -4,5 ERBB2 Molécula de Transdução de Sinal e Fator de Transcrição 3,63 TERT Apoptose e Senescência celular -3,55 MTSS1 Adesão 3,08 PIK3R1 Molécula de Transdução de Sinal e Fator de Transcrição 2,99 BRCA1 Reparo de DNA -2,78 MTA2 Invasão e metástase 2,77 FOS Molécula de Transdução de Sinal e Fator de Transcrição -2,72 IFNB1 Angiogênese -2,48 COL18A1 Angiogênese 2,46 JUN Molécula de Transdução de Sinal e Fator de Transcrição 2,32 VEGFA Angiogênese 2,24 PLAUR Invasão e metástase -2,23 BAD Apoptose e Senescência celular 2,21 ITGB1 Adesão 2,09 TNFRSF25 Apoptose e Senescência celular 1,97
13 Resultados Análise da expressão de marcadores da EMT E-caderina Claudina-3 Citoqueratina-18 Claudina-4 Citoqueratina-8
14 Resultados Análise da expressão de marcadores da EMT Vimentina Snail Twist Slug
15 Resultados Análise da expressão da proteína vimentina
16 Resultados Transdução celular com vetor lentiviral shrna GFP
17 Resultados Análise do % de células GFP+
18 Resultados Análise da expressão do PCA3 Análise do número de células viáveis
19 Conclusão: Adesão ITGB1/ MTSS1 Apoptose e Senescência celular TERT/ TNFRSF25/ BAD Angiogênese VEGFA/ IFNB1 / COL18A1 Reparo de DNA BRCA1 PCA3 Invasão e Metástase PLAUR/ MTA2 Transição Epitelial Mesenquimal TWIST / SLUG / SNAIL /VIM / E-CADERINA/ CLAUDINA 3/ CLAUDINA 4 /CITOQUERATINA 8/ CITOQUERATINA 18 Co-reguladores da via do AR ARA54/ ARA70/ SMAD 3/ EBP1/ SMAD 4/ CICLINA D1 Transdução de Sinal e/ou Fator de Transcrição ERBB2/ FOS/ JUN/ PIK3R1/ MAP2K1
20 Se, a princípio, a idéia não é absurda, então não há esperança para ela. (Albert Einstein)
21 Agradecimentos Diretoria de Bio-Manguinhos Artur Couto Marcos Freire Gerente do Programa de Biofármacos Nadia Batoreu Equipe de Biofármacos Gerente do Laboratório de Tecnologia Recombinante Marco Medeiros Equipe do LATER Etel Gimba - INCA e seu grupo de pesquisa Martin Bonamino - INCA e seu grupo de pesquisa
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23 O ncrna PCA3 é um bom alvo terapêutico, já que é capaz de modular a sobrevivência de células de CaP, além de assumir um papel regulador na transcrição gênica, modulando diversas vias de sinalização relacionadas ao câncer.
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26 Perspectivas Proposta para estudos de prova de princípio in vivo para validação do uso do ncrna PCA3 como alvo terapêutico.
27 Delivery Vetor ideal: integrar o transgene de modo estável no genoma da célula hospedeira. RETROVÍRUS vetores mais amplamente utilizados em terapia gênica de doenças hereditárias e câncer Onco-retrovírus taxa ineficiente de transdução e de expressão do transgene; só transduz célula em divisão. Lentivírus transduz células quiescentes; pode-se inserir sequências relativamente grandes; complexo de pré-integração mais estável. HIV-1 é o + usado pq: tem seu genoma bem conhecido; aceita fragmentos de 3-4 Kb; permite a pseudotipagem.
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