Genómica e Análise Comparativa de Genomas

Transcrição

1 Genómica e Análise Comparativa de Genomas

2 Genómica Genómica é o estudo do genoma, genes e das suas funções. Permite o conhecimento dos mecanismos moleculares da expressão génica incluindo as relações genes/ambiente.

3 Tamanho de Genomas A quantidade de DNA de um genoma haploide designa-se tamanho do genoma ou Valor C. O valor C é constante dentro de uma espécie mas variável entre espécies 1 kb = 1,000 bp; 1 Mb (or Mbp) = 1,000,000 bp

4 Tamanho de Genomas (haploides) e número de genes Genoma Pares de bases Genes Notas Phi-X virus of E. coli Epstein-Barr (EBV) Causa mononucleose Nanoarchaeum equitans Archaea parasita organismo com o menor genoma Mycoplasma genitalium Procariota com um pequeno genomas E. coli ,290 destes genes codificam proteinas e o resto RNAs Agrobact. tumefaciens Vector para produzir plantas transgénicas Sinorhizobium meliloti O simbionte da alfalfa. Possui 1 cromossoma e 2 grandes plasmídeos

5 Relação entre o nº de genes e o tamanho do genoma Procariota Nº de Genes/Tamanho Genoma Nº de Genes Tamanho Genoma (pb x100) Genes

6 Genomas Procariotas Possuem a informação genética numa só molécula; Têm poucos genes (E.coli tem ~4400); Têm um genoma compacto com poucos ou nenhuns espaços entre os genes; Não têm genes descontínuos, não possuem intrões Têm poucas ou nenhumas sequências repetitivas.

7 Tamanho de Genomas (haploides) de organismos modelo Genoma Pares de bases Genes Notas E. coli ,290 destes genes codificam proteinas e o resto RNAs Sacchromyces cerevisiae Levedura Neurospora crassa Ainda mais 498 genes de RNA C. elegans Nemátodo 1º eucariota multicelular com o genoma completamente sequenciado D. melanogaster Mosca da fruta. Modelo dos trabalhos de Morgan Anopheles gambiae Mosquito Vector da malária Arabidopsis thaliana ~ Angiospérmica- Ddicotiledónea Oryza sativa Arroz

8 Relação entre o nº de genes e o tamanho do genoma Nº de Genes/Tamanho Genoma (Mpb) Nº de Genes x Tamanho do Genoma (Mpb)

9 Tamanho de Genomas (haploides) Genoma Homem Cromossoma 1 Cromossoma Y Rato Lagosta Quercus suber Triticum aestivum Fritilaria Mbp ~ Notas O maior cromossoma humano O menor cromossoma humano Trigo mole Monocotiledónea

10 Genomas Eucariotas Possuem a informação genética em várias moléculas; Tamanhos de genomas muito diferentes (não se relacionam com o número de genes); Muitas sequências repetitivas não codificantes; Genes com muitos intrões.

11 Paradoxo do valor C Não há relação entre a complexidade do organismo e a sua quantidade de DNA. Não há relação entre a quantidade de DNA e o número de genes presentes nesse organismo

12 Porque é que os genomas variam tantas ordens de grandeza em diferentes organismos? Sequências não codificantes. Muitas vezes repetitivas A quantidade de DNA não génico varia muito de espécie para espécie As regiões não codificantes do genoma têm alguma função a nível da espécie? Diferentes níveis de organização da cromatina Controlo da expressão génica

13 Mecanismos de aumento do tamanho do Genoma Duplicação Genómica poliploidia Duplicação Cromossómica Repetição de sequências (tandem ou dispersas) Sequências palindrómicas Sequências muito repetidas pequenas com mais de cópias Sequências repetidas Sequências em cópia única

14 Poliploidização do trigo mole AA T. monococcum X Wild wheat BB species T. searsii? Emmer wheat AB AABB Double genome X ABD DD T. turgidum T. tauschii Double genome AABBDD T. aestivum Modern bread wheat (allohexaploid)

15 DNA muito repetido : DNA satélite (repetições em tandem) DNA satélite clássico minisatélites microsatélites telómeros O DNA satélite clássico foi descoberto em 1970 por estudos de cinética de re-associação. É heterocromatina constitutiva, está condensado ao longo do ciclo celular. É rico em AT e mais leve que o conjunto dos outros fragmentos. Aparece em todos os cromossomas humanos nas regiões pericentroméricas e todo o braço longo do cromossomay. Contribui com 8% do Genoma Humano. É 6x mais abundante que a fracção genómica que codifica proteínas Qual a sua função?

16 DNA muito repetido repetições em tandem minisatélites microsatélites telómeros DNA satélite clássico Minisatélites = Nº variável de repetições em tandem entre bp. Grupos de ,000 bp, tendem a aparecer perto dos telómeros. Diferentes pessoa possuem diferentes números. Tendem a ser muito heterozigóticos fingerprinting. um locus heterozigótico

17 DNA muito repetido repetições em tandem microsatélites telómeros DNA satélite clássico minisatélites Os microsatélites são muito pequenos não tendo mais de 2-4 bases Estão espalhados por todo o genoma em tandem. São raros em regiões codificantes e nos telómeros. O microsatélites mais comum no genoma humano é o dinucleótido repetido (CA)n CACACACACACACACACACACA GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT..CACACACACACACA..GTGTGTGTGTGTGT um locus heterozigótico

18 DNA repetido repetições em tandem telómeros classic satellite DNA minisatellites microsatellites Os telómeros selam as extremidades dos cromossomas. Longas cadeias em tandem da sequência TTAGGG. Nas células somáticas há cerca de repetições desta sequência na extremidade de cada cromossoma. Esta sequência encontra-se em mais de 100 espécies de vertebrados (mamíferos, pássaros, réteis e peixes). TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG AATCCCAATCCCAATCCCAATCCC Os telómeros têm uma função O número de repetições pode variar

19 Enzimas para manipulação de DNA Nucleases Degradam moléculas de DNA quebrando as ligações fofodiéster que ligam um nucleótido ao seguinte. Podem ser endonucleases ou exonucleases Enzimas de restrição cortam as moléculas de DNA em posições específicas

20 Enzyme Recognition sequence Type of ends End sequences AluI 5 -AGCT-3 Blunt 5 -AG CT-3' 3' -TCGA-5 3' -TC GA-5 Sau3AI 5 -GATC-3' Sticky, 5 overhang 5' - GATC-3' 3' -CTAG-5' 3' -CTAG -5' HinfI 5' -GANTC-3' Sticky, 5' overhang 5' -G ANTC-3' 3' -CTNAG-5' 3' -CTNA G-5' BamHI 5' -GGATCC-3' Sticky, 5' overhang 5' -G GATCC-3' 3' -CCTAGG-5' 3' -CCTAG G-5' BsrBI 5' -CCGCTC-3' Blunt 5' - NNNCCGCTC-3' 3' -GGCGAG-5' 3' - NNNGGCGAG-5' EcoRI 5' -GAATTC-3' Sticky, 5' overhang 5' -G AATTC-3' 3' -CTTAAG-5' 3' -CTTAA G-5' PstI 5' -CTGCAG-3' Sticky, 3' overhang 5' -CTGCA G-3' 3' -GACGTC-5' 3' -G ACGTC-5' NotI 5' -GCGGCCGC-3' Sticky, 5' overhang 5' -GC GGCCGC-3' 3' -CGCCGGCG-5' 3' -CGCCGG CG-5' BglI 5' -GCCNNNNNGGC-3' Sticky, 3' overhang 5' -GCCNNNN NGGC-3' 3' -CGGNNNNNCCG-5' 3' -CGGN NNNNCCG-5' N = any nucleotide. Note that most, but not all, recognition sequences have inverted symmetry: when read in the 5' 3 direction, the sequence is the same in both strands.

21 Mapas de restrição

22 Mapas de restrição

23 Enzimas para manipulação de DNA DNA polimerases enzimas que sintetizam novos polinucleótidos complementares a uma cadeia molde de DNA ou de RNA

24 Enzimas para manipulação de DNA Ligases enzimas que ligam moléculas de DNA sintetizando ligações fosfodiéster entre nucleótidos das duas extremidades de um única molécula

25 Caracterização Genómica Bibliotecas Genómicas Biblotecas de C-DNA

26 Bibliotecas Genómica Extracção Quebra mecânica ou digestão enzimática Linkers + DNA ligase Tecido DNA Genómico Fragmentos de DNA Vectores Transformação com vectores recombinantes

27 Clones de DNA Genómico Estes clones possuem fragmentos de DNA genómico. Obter a estrutura dos genes Identidficar regiões envolvidas na regulação génica Mapear e analisar alterações no genoma. Sequenciar o genoma

28 Bibliotecas de cdna Extracção Transcriptase reversa + primer + dntps RNase H + DNA polimerase + dntps Linkers + DNA ligase Tecido mrna Híbrido cdna-rna cdna dupla hélice Vector Transformação com vector recombinante

29 Transcrição e Processamento

30 Análise de fragmentos de DNA - PCR As análises moleculares de DNA necessitam de grandes quantidades de moléculas a analisar A técnica de PCR permite ter grandes quantidades de um determinado fragmento. O seu inventor foi galardoado com o prémio Nobel da Química de É um método rápido e relativamente económico de amplificar pequenos segmentos de DNA.

31 PCR - Polymerase Chain Reaction Requer o conhecimento da sequência de DNA numa região de interesse À medida que vai havendo mais informação, a técnica de PCR vai sendo cada vez mais utilizada Com primers apropriados podemos amplificar as regiões desejadas a partir de uma quantidade ínfima de DNA Não está dependente da distribuição dos locais de restricção

32 Replicação do DNA

33 PCR, Ciclo - 1 Template Cycle 1 1. Denature Primer 1 Primer 2 2. Anneal primers 3. Synthesize new DNA with polymerase

34 PCR, Ciclo - 2 Cycle 2 1. Denature 2. Anneal primers 3. Synthesize new DNA with polymerase

35 PCR, Ciclo - 3 Cycle 3 (focus on DNA segments bounded by primers) 1. Denature 2. Anneal primers 3. Synthesize new DNA with polymerase 2 moléculas duplas do produto que se prentende

36 PCR, Ciclo - 4: aumento exponencial do produto Cycle 4: Denature, anneal primers, and synthesize new DNA: 6 moléculas duplas do produto que se prentende

37 PCR, Ciclo - 5: aumento exponencial do produto Cycle 5: Denature, anneal primers, and synthesize new DNA: 14 moléculas duplas do produto que se prentende

38 PCR: Produz grandes quantidades das moléculas pretendidas O número de moléculas do fragmento de DNA que se encontra entre os primers aumenta 2 vezes em cada ciclo Se n= nº de ciclos, a amplificação é de cerca de [2 (n-1) ]-2 Depois de 21 ciclos temos o nosso fragmento amplificado cerca de 1 milhão de vezes Uma amostra com 0.1 pg do fragmento de interesse, pode ser amplificado até 0.1 µg

39 PCR - Polymerase Chain Reaction

40 Estabilidade da molécula de DNA Na molécula de DNA, a temperatura necessária à desnaturação da molécula aumenta com o tamanho da molécula e com o seu conteúdo em C+G. Fórmula simples para calcular a temperatura de desnaturação Tm Tm = 4(G + C) + 2(A + T) ºC.

41 Temperatura de emparelhamento e desenho do primer A temperatura de emparelhamento (Ta = Temperatura de annealing) depende directamente do tamanho e da composição dos primers. Deve ser cerca de 5ºC inferior à temperatura de desnaturação. Ta muito baixos em relação ao ideal para o par de primers usado, levará a emparelhamentos em zonas de menor homologia com a consequente amplificação de zonas não específicas e baixa do rendimento

42 Temperatura de emparelhamento e desenho do primer (Cont.) Ta muito altos em relação ao ideal para o par de primers usado produzirá pouco produto Pares de primers com Ta muito diferentes poderão nunca dar bons rendimentos e poderão levar à amplificação de uma só cadeia A fase de emparelhamento não deverá durar muito tempo. A maioria dos primers emparelha completamente em 30s. Excepto se Ta for muito perto de Tm ou se os primers forem muito longos.

43 Temperatura de emparelhamento Amplificação do vírus do papiloma Humano. A amostra de DNA foi retirada de uma biópsia e foi amplificado com primers específicos para este vírus e com diferentes temperaturas de emparelhamento. Especificidade a 50ºC

44 Tamanho do primer Os primers devem ter uma sequência complexa de modo que a probabilidade de emparelharem com outras sequências para além da escolhida seja bastante baixa. Probabilidade de encontrar uma das 4 bases no DNA - ¼ Probabilidade de encontrar um dinucleótido qualquer - 1/16 Probabilidade de encontrar uma qualquer sequência de 4 bases - 1/256 Probabilidade de encontrar uma qualquer sequência de 16 bases 1/ Um oligonucleótido maior que 17 pares de bases é extremamente específico.

45 Temperatura de polimerização (extenção) e sua duração Normalmente 70 72ºC durante 30s 3min Paradoxo: como é que a extenção (actividade da polimnerase) se dá a temperaturas superiores à do emparelhamento??? A polimerização ocorre desde o início do emparelhamento dos primers A actividade da polimerase é optima a 70ºC e a polimerização ocorre até 100 bases/sec. Cerca de 1 min para sequências de 2Kb

46 Regras simples para desenho de primers Deverão ter entre bases de tamanho A composição deverá ter entre 50-60% de G+C Os primers deverão terminar na posiçãp 3' num G ou C, ou CG ou GC: aumenta a estabilidade do emparelhamento Tms deverão ser entre 55-80ºC As extremidades 3 dos primers não devem ser complementares de modo a não formarem preferencialmente dímeros de primers Não deve haver complementaridade (possibilidade de se formarem estruturas tipo gancho de cabelo.

47 cdna PCR Estratégia utilizada para ampliar fragmentos de c- DNA: Mistura de fragmentos 21-meros com 20 resíduos de Timina + sequência aleatória de bases (por ex. A, G ou C na posição 3 ) 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT(A,G,C)-3'