Efeito de uma nova técnica de coleta fracionada sobre a composição do plasma seminal e qualidade do sêmen eqüino pós-descongelamento

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1 Efeito de uma nova técnica de coleta fracionada sobre a composição do plasma seminal e qualidade do sêmen eqüino pós-descongelamento CLAUDIO WERMELINGER DA FONSECA UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO CAMPOS DOS GOYTACAZES RJ SETEMBRO

2 Efeito de uma nova técnica de coleta fracionada sobre a composição do plasma seminal e qualidade do sêmen eqüino pós-descongelamento CLAUDIO WERMELINGER DA FONSECA Tese apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para obtenção do título de Doutor em Produção Animal. Orientador : Prof.Dr. José Frederico Straggiotti Silva CAMPOS DOS GOYTACAZES RJ SETEMBRO

3 Efeito de uma nova técnica de coleta fracionada sobre a composição do plasma seminal e qualidade do sêmen eqüino pós-descongelamento Cláudio Wermelinger da Fonseca Tese apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para obtenção do Título de Doutor em Produção Animal Aprovado em 29 de setembro de 2006 Comissão Examinadora: Prof a Monique Albuquerque Lagares (DS. Reprodução Animal)-UFMG Prof. Márcio Manhães Folly ( DS. Microbiologia) Dr. Jose Renato Costa Caiado (DS. Reprodução Animal) Prof. José Frederico Straggiotti Silva (DS. Reprodução Animal) - UENF

4 Comece fazendo o que é necessário, depois o que é possível, e de repente você estará fazendo o impossível. (São Francisco de Assis) ii

5 Aos meus pais, Jairo e Suely, os responsáveis por tudo que sou À minha irmã e irmãos, Bernadete, Roberto e Luciano, pelo estímulo À minha namorada, Fátima Cecília, pela compreensão e paciência DEDICO iii

6 AGRADECIMENTOS À Universidade Estadual do Norte Fluminense (UENF) e ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias (CCTA), pelo oferecimento deste curso. Aos meus pais, pela educação que me dão e pelo amor que me têm dia após dia; Aos meus familiares, irmãos, tios e Cunhado pelo incentivo e compreensão durante esta caminhada; À Fátima, pelo estímulo, incentivo e compreensão; Ao professor Frederico, por me orientar neste trabalho; À Professora Isabel, por estar sempre disposta a ajudar; Ao amigo Guilherme, pela grande ajuda na realização desta tese; Aos amigos da República Boca, Laranjeiras, Ligeiro e Cabelo pelos momentos compartilhados e companheirismo; Aos meus amigos, pelos momentos compartilhados; Aos colegas do laboratório de Melhoramento Genético Animal; Aos técnicos do laboratório de Melhoramento Genético Animal, Dr. José Renato, Dr. Marcus Barreto, Dr. Fausto, Vânia e Thiago; À Maria Luiza Lopes Álvares, por permitir a utilização das dependências do Laboratório de Biologia da Reprodução; Ao professor Cláudio Retamal, e aos demais integrantes do Laboratório de Biologia da Reprodução, pela contribuição para que esta tese se tornasse realidade; Ao professor Antonio Peixoto Albernaz, por permitir a utilização das dependências e dos equipamentos do Laboratório de Sanidade Animal; Ao Técnico Josias Alves Machado por estar sempre pronto a me ajudar nas análises no setor de Doenças infecto-contagiosas e parasitárias; Ao professor Marcio M. Folly, por permitir a utilização das dependências e dos equipamentos do Laboratório de Sanidade animal; À Dra. Gina Nunes Teixeira, por estar sempre pronta a me ajudar nas análises no setor de Bacteriologia; Ao Sr. Washintom Teixeira, proprietário do Haras Lugavi, por prontamente permitir a utilização dos animais, funcionários bem como das dependências do seu haras; Aos amigos da Coordenação de Pós-graduação; A todos que, de alguma forma participaram e contribuíram, direta ou indiretamente, para a realização deste trabalho; A Deus. iv

7 BIOGRAFIA Cláudio Wermelinger da Fonseca, filho de Jairo Roberto Marques da Fonseca e de Suely Wemelinger da Fonseca, nasceu em 30 de outubro de 1971, na cidade de Cordeiro RJ. Em março de 1990, iniciou o curso Técnico de Nível Médio em Agropecuária na Central de Ensino e Desenvolvimento Agrário e Florestal (CEDAF- UFV), onde se formou em dezembro de Em agosto de 1993, iniciou o curso de Medicina Veterinária na Universidade Estadual do Norte Fluminense, onde colou grau em dezembro de Foi admitido, em setembro de 1999, no Curso de Pós-graduação em Produção Animal, Mestrado, Reprodução Animal, da Universidade Estadual do Norte Fluminense (UENF), em Campos dos Goytacazes RJ, submetendo-se à defesa de tese para conclusão do curso em agosto de Em 13 de agosto de 2001 reingressou no Curso de Pós-graduação em nível de Doutorado da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, no Programa de Produção Animal, no setor de Reprodução Animal, submetendo-se à defesa de tese para conclusão do curso em setembro de v

8 CONTEÚDO LISTA DE TABELAS LISTA DE FIGURAS RESUMO ABSTRACT x xii Xv xvii 1 INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA Ejaculação A Célula Espermática Plasma Seminal Proteínas do Plasma Seminal Composição Iônica do Plasma Seminal de Eqüinos Modelos de Vagina Artificial e Coleta do Sêmen Contaminação Bacteriana Avaliação do Sêmen Motilidade Espermática Exames morfológicos Congelamento Diluentes e Diluição para Centrifugação Centrifugação vi

9 2.7.3 Diluidores para Congelamento do Sêmen Diluição para congelamento Acondicionamento do Sêmen Efeito do Congelamento/Descongelamento na Célula Espermática Velocidade de Resfriamento e congelamento do sêmen Velocidade de Descongelamento do sêmen MATERIAL E MÉTODOS Animais Coleta do sêmen Procedimento para coleta com a vagina artificial articulada com dispositivo fracionador Modelos de vagina artificial utilizado Modelo convencional Modelo articulado para coleta fracionado Análise do Sêmen Obtenção de plasma seminal Dosagem dos íons na fração rica e pobre do plasma seminal Determinação da concentração de proteínas Análise eletroforética de proteínas plasmáticas Análise densitométrica Contagem de bactérias em placas pelo método das diluições Congelamento do sêmen Procedimento para a vagina fechada convencional Procedimento para a vagina articulada com dispositivo fracionador Descongelamento Descongelamento convencional vii

10 3.9.2 Descongelamento ultra-rápido Avaliação do sêmen pós-descongelamento ANÁLISE ESTATÍSTICA RESULTADOS e DISCUSSÃO Comparação entre a vagina artificial convencional e a articulada para coleta de sêmen eqüino Contaminação bacteriana presente no sêmen coletado com vagina artificial articulada e convencional Eficiência do dispositivo fracionador na coleta de sêmen eqüino Comparação da concentração de íons presentes no plasma seminal da fração rica e pobre em espermatozóides do ejaculado eqüino Composição protéica do plasma seminal Efeito de dois métodos de descongelamento no sêmen de garanhão coletado com vagina artificial fechada convencional Efeito de dois métodos de descongelamento no sêmen de garanhão coletado com vagina artificial articulada com dispositivo fracionador Efeito do descongelamento ultra-rápido nas formas de coleta Efeito do descongelamento convencional sobre a forma de coleta CONCLUSÃO REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA ANEXOS viii

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12 LISTA DE TABELAS Tabela 1 Avaliação da aceitação da vagina artificial articulada através da verificação do volume ejaculado (VOL), número total de espermatozóides do ejaculado (NTE), número de saltos necessários à ejaculação e motilidade total e progressiva das células espermáticas Tabela 2 Contagem de colônias bacterianas presentes no sêmen Tabela 3 Parâmetros espermáticos seminais avaliados da fração rica e pobre de células espermáticas, imediatamente após a sua coleta fracionada, utilizando-se a vagina artificial articulada com o dispositivo fracionador do ejaculado Tabela 4 Dosagem de íons nas frações rica e pobre em espermatozóides no sêmen de garanhões Tabela 5 Media da concentração de proteínas Tabela 6 Descrição da área, em percentual, das proteínas encontradas na fração rica e pobre separada pelo peso molecular. Com o número de bandas em cada fração (NBC) e também no ejaculado (NTB) Tabela 7 Tabela 8 Efeito da velocidade do descongelamento convencional e ultra-rápido sobre os parâmetros espermáticos coletados com vagina artificial fechada convencional Efeito da velocidade de descongelamento convencional e ultra-rápido sobre os parâmetros espermáticos do sêmen coletado de forma fracionada x

13 Tabela 9 Efeito do descongelamento ultra-rápido sobre os parâmetros espermáticos do sêmen coletado de forma fracionada e convencional Tabela 10 Efeito do descongelamento convencional sobre os parâmetros espermáticos do sêmen coletado de forma fracionada e convencional xi

14 LISTA DE FIGURAS Figura 1 Figura 2 Figura 3 Figura 4 Figura 5 Ereção: O pênis cai devido ao relaxamento mediado pelos nervos sacrais-parassimpáticos que inervam o músculo corpo trabeculi(a) e retrator do pênis (c). A ereção da bainha e glande do pênis é devido ao relaxamento mediado pelo parassimpático sobre os vasos da corpora cavernosa (a) e corpus spongiosus (b). Secreção pré-ejaculatória: Liberação de pequena quantidade de fluido das glândulas acessórias, principalmente da próstata, devido à contração das glândulas acessórias mediadas pelo reflexo sacral (d)... 6 Emissão: liberação dos espermatozóides e fluidos das glândulas acessórias mediadas pelo reflexo toracolumbar que levam a contração da musculatura lisa dos ductos deferentes (e), ampola (f), glândula vesicular (g), próstata (h) e glândulas bulbouretrais (i). Fechamento do colo vesical: Firme fechamento do colo vesical (j) devido ao reflexo mediado pela contração de sua musculatura lisa... 6 Ejaculação: Expulsão forçada do sêmen a partir da uretra devido ao reflexo mediado pelos nervos sacrais sobre a contração dos músculos bulbocavernoso (k), ischiocavernoso (l) e uretralis (m)... 7 Detumescência: Perda da ereção com recolhimento do pênis devido ao aumento do tônus da musculatura lisa no corpus cavernoso (n), e no corpus spongiosum (o), e contração do retrator do pênis (p) mediado pela inervação sacral simpática... 7 VA modelo Hannover: 1- estrutura de borracha, com válvula para escoar, água 2- mucosa de látex, 3- mucosa plástica interna, 4- presilha das mucosas, 5- capa para copo coletor, xii

15 Figura 6 6- copo coletor com filtro Vagina artificial articulada desenvolvida pelo setor de Biotecnologia de sêmen da UENF Figura 7 Vagina artificial para coleta aberta (parte 1) Figura 8 Parte articulada para fechar a coleta (parte 2) Figura 9 Seguimento eletromecânico fracionador de sêmen (parte 3).. 32 Figura 10 Esquema do fracionador. (1- conexão da curva, 2- bateria, 3- engrenagem que movimenta o funil, 4- motor, 5- funil, 6- bifurcação para separar as frações) Figura 11 Figura 12 Figura 13 Curva Padrão de BSA para determinação da concentração relativa das proteínas Análise eletroforética do plasma seminal da fração, rica e pobre, de sete garanhões numerados de 1 a 7 com as respectivas letras R para fração rica e P para fração pobre Representação gráfica das bandas protéicas encontradas no gel troforético, sendo a linha grossa contínua à fração rica (rico) e a linha fina pontilhada à fração pobre (P) xiii

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17 RESUMO FONSECA, Cláudio Wermelinger; D.S.; Universidade Estadual do Norte Fluminense; setembro de 2006; Efeito de uma nova técnica de coleta fracionada sobre a composição do plasma seminal e qualidade do sêmen eqüino processado; Professor Orientador: José Frederico Straggiotti Silva. Dentre as biotecnologias aplicadas à reprodução animal, a inseminação artificial (IA) é a mais utilizada, possuindo grande importância. Ela possui destacada importância por ser a principal forma de propagação de material genético melhorado e, também, por ser a base para aplicação de outras biotecnologias. A coleta do sêmen é o primeiro passo desta técnica e deve ser realizada com equipamentos adequados e de forma correta. Para isto existem vários modelos de Vagina artificial (VA) que permitem a realização de coleta fechada ou aberta. A coleta aberta proporciona uma coleta mais higiênica e permite fracionar o ejaculado. O objetivo deste estudo foi testar um novo modelo de V.A. que permite realizar coleta fracionada, separando o ejaculado em Fração rica (FR) representada pelos 3 primeiros jatos de sêmen e fração pobre (FP) o restante do ejaculado e analisar a composição iônica e protéica do plasma seminal das frações, além de verificar sua eficiência na redução da contaminação bacteriana e verificar a eficiência no congelamento e também comparar dois métodos de descongelamento (98 o C por 2 seg com o a 37 o C por 30 seg). O sêmen coletado com a vagina articulada com dispositivo fracionador teve boa aceitação pelos garanhões e foi eficiente na separação xv

18 das FR (4838X10 6 espermatozóides no ejaculado) e FP (1751X10 6 ) e apresentou menor contaminação bacteriana (2 colônias na diluição 10-3 ) que na V.A. convencional (36 colônias na diluição 10-3 ). Com relação à composição das frações, a FR apresentou maior concentração de proteínas (17 mg/ml) que na FP (14,5 mg/ml), já a composição iônica não apresentou diferença entre as frações. Os dois métodos de coleta não apresentaram diferença quando foram descongelados a 37 o C por 30 seg., mas quando foi descongelado de forma ultra-rápido (98 o C por 2 seg), o sêmen coletado de forma convencional apresentou maior taxa de espermatozóides com membrana plasmática intacta e menos reação de acrossoma. E quando o sêmen foi coletado de forma fracionada o método de descongelamento 37 o C por 30 seg. foi mais eficiente na manutenção da integridade de membrana e apresentou menor reação de acrossomo. Foi possível concluir que a vagina artificial articulada com dispositivo fracionador é um equipamento eficiente na separação das frações do sêmen, com maior higiene na coleta, proporcionando baixa contaminação bacteriana. A concentração de íons não diferiu entre as frações e a primeira fração do ejaculado tem uma concentração de proteínas maior que a segunda. Para o sêmen coletado de forma fechada a melhor metodologia de descongelamento foi a ultra-rápida e para o sêmen coletado de forma fracionada a melhor metodologia de descongelado foi a 37 o C por 30 seg. xvi

19 ABSTRACT FONSECA, Cláudio Wermelinger; D.S.; Universidade Estadual do Norte Fluminense; September 2006; Effect of a new technique of fractional collection about the composition of the seminal plasma and quality of the processed equine semen; Professor Advisor: José Frederico Straggiotti Silva. Among the applied biotechnologies to the animal reproduction, the artificial insemination (AI) is the more used, possessing great importance. She possesses outstanding importance for being the main form of propagation of improved genetic material and, also, for being the base for application of other biotechnologies. The collection of the semen is the first step of this technique and it should be accomplished with appropriate equipments and in a correct way. For this several models of artificial Vagina exist (VA) that allow the accomplishment of collection closed or open. The open collection provides a more hygienic collection and it allows to fraction ejaculated. The objective of this study was to test a new model of V.A. that allows to accomplish fractional collection, separating the ejaculated in rich Fraction (FR) acted by the first 3 semen jets and poor fraction (FP) the remaining of the ejaculated and to analyze the ionic composition and protean of the seminal plasma of the fractions, besides to verify the efficiency in the reduction of the bacterial contamination and to verify the efficiency in the freezing and also to compare two unfreezing methods (98oC for 2 sec with the to 37o C for 30 sec). The semen collected with the articulate vagina with device fractionators had good acceptance for the stallions and it was efficient in the separation of FR (4838X106 spermatozoids in ejaculated) and FP (1751X106) and it presented smaller bacterial contamination (2 colonies in the dilution 10-3) that in V.A. conventional (36 colonies in the dilution 10-3). Regarding the composition of the fractions, FR presented larger concentration of proteins (17 mg/ml) that in FP (14,5 mg/ml), already the ionic composition didn't present difference among the fractions. The two collection methods didn't present difference when they were thawed to 37oC by 30 sec., but when it was thawed in an ultra-fast way (98oC xvii

20 for 2 sec), the collected semen in a conventional way presented better membrane integrity and smaller acrossomo reaction. And when the semen was collected in a fractional way the method of unfreezing 37oC for 30 sec. it was more efficient in the maintenance of the membrane integrity and it presented smaller acrossomo reaction. It was possible to end that the articulate artificial vagina with device fractionators was efficient in the separation of the fractions and it presented good acceptance for the stallions. It provided smaller bacterial contamination. The ions concentration didn't differ between the fractions and the first fraction of the ejaculated has a larger concentration of proteins than the second. For the collected semen in a closed way the best unfreezing methodology is the ultra-fast and for the collected semen in a fractional way the best methodology of having thawed is to 37oC for 30 sec. xviii

21 1 1-INTRODUÇÃO Os negócios que envolvem a criação e a utilização do cavalo têm uma destacada importância no contexto mundial. No Brasil, o agronegócio que envolve a criação de cavalos, movimenta mais de 7 bilhões de reais e gera mais de 600 mil empregos diretos (Junior, 2006). E, para atender as necessidades requeridas por este agronegócio, muitos esforços têm sido feitos no intuito de desenvolver, aprimorar e difundir biotecnologias, para que se possa explorá-las, com máxima eficiência. Dentre estas biotecnologias, a inseminação artificial possui destacada importância, por ser a principal forma de propagação de material genético melhorado e, também, por ser a base para aplicação de outras biotecnologias, como a transferência de embriões. Sendo o sucesso destas técnicas altamente dependente do êxito da inseminação. Para o sucesso da inseminação artificial, é necessária a observação cuidadosa de cada passo da técnica. A coleta do sêmen é o primeiro e deve ser realizada com equipamentos adequados e de forma correta, para que o sêmen não sofra injúrias e preserve a capacidade fertilizante. Ela pode ser feita por indução farmacológica, por estímulo manual ou por meio de vagina artificial (VA). Entretanto, o método mais utilizado é o que emprega vagina artificial, sendo este,

22 2 mais vantajoso do que os demais por ser de fácil execução e também por mimetizar a cópula natural. Existem vários modelos de vagina artificial que permitem a realização de coleta fechada ou aberta. Na coleta fechada, todo o pênis do garanhão fica encoberto e o ejaculado escorre por uma mucosa plástica para um copo coletor. O sêmen coletado, desta forma, apresenta maior contaminação microbiana e também fica mais diluído, pois todo o plasma seminal do ejaculado fica retido no copo coletor. Na coleta aberta, a glande fica descoberta e o sêmen não entra em contato com a VA, proporcionando uma coleta mais higiênica. Este método de coleta permite, também, que o ejaculado seja fracionado. Com isto, torna-se possível coletar os primeiros jatos de sêmen, que são ricos em espermatozóides e melhores para serem armazenados, separadamente dos últimos, que possuem menos espermatozóides e mais plasma seminal. Após a coleta, o sêmen deve ser enviado ao laboratório, o mais rápido possível, para ser avaliado. A análise consiste em avaliar a motilidade, a vitalidade (vigor), a concentração, se há presença de contaminantes e verificação de patologias espermáticas. Após a análise, o sêmen deve ser diluído para minimizar os efeitos deletérios do plasma seminal. Isto pode ser revertido com a remoção, parcial, do plasma, através de coleta fracionada, centrifugação ou por meio de filtração, sendo, a primeira o método que causa menos danos às células espermáticas. Apesar das vantagens deste método de coleta, ele é pouco utilizado por ser de difícil execução ao requerer a sincronia de dois técnicos para este procedimento. Após a diluição, o sêmen pode ser dividido em frações para sua utilização na inseminação artificial, que pode ser logo após a coleta (sêmen fresco) ou ser armazenado por resfriamento ou congelamento. Através do resfriamento é possível preservar o sêmen por um período de até 96 horas, enquanto o congelamento pode preservá-lo por tempo indeterminado. Contudo, o processo de congelamento-descongelamento

23 3 proporciona acentuada perda de fertilidade dos espermatozóides, fazendo com que a técnica de resfriamento, que causa menos danos, seja mais utilizada. Este trabalho teve como objetivo testar um novo protocolo de coleta fracionada, utilizando, para tal, um modelo de vagina artificial articulada desenvolvida pela equipe técnica do Laboratório de Biotecnologia do Sêmen, da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, e analisar a composição iônica e protéica do plasma seminal das porções rica e pobre em espermatozóides, além de verificar sua eficiência na redução da contaminação bacteriana, devido à suas relações com a fertilidade e a melhor ou pior sobrevivência após o processamento para resfriamento ou congelamento. A velocidade de congelamento e descongelamento tem relevante importância no processo de resfriamento e de congelamento das células espermáticas, baseado nesta informação também comparamos duas curvas de descongelamento de sêmen sendo um ultra-rápido (98 o C por 2 segundos e imediatamente submetido a 37 o C por mais 2 segundos), realizado com equipamento desenvolvido pela equipe técnica do Laboratório de Biotecnologia do Sêmen, da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro e outra a 37 o C por 30 segundos, coletado pelos métodos convencional e fracionado.

24 4 2- REVISÃO DE LITERATURA Ejaculação A ejaculação é o processo fisiológico de expulsão do sêmen, que ocorre após um estímulo inicial. Este estímulo faz com que o garanhão inicie o processo de ereção e emissão, que se concluirá com a ejaculação (MCDONNELL, 1992) Normalmente, para estimular a libido do garanhão e proporcionar o estímulo de ereção do pênis é utilizada uma égua em cio ou ovariectomizada e estrogenizada, devidamente contida ou um manequim que mimetiza uma égua (FILHO et al., 1999). Quando o garanhão é estimulado a realizar o ato de cobertura, inicia-se uma resposta humoral que atua na parte sacral do sistema nervoso parassimpático, fazendo que ocorra vasodilatação das artérias do pênis, simultaneamente a um relaxamento dos seus músculos intrínseco, extrínseco e o músculo uretral que comprimem os vasos sanguíneos do mesmo, permitindo assim, que o sangue preencha as lacunas cavernosas do corpo do pênis. Com o preenchimento do corpo cavernoso e esponjoso da uretra, o pênis fica ingurgitado, promovendo o aumento da espessura e tamanho, que irá promover sua saída do prepúcio, até que ele fique completamente rígido (ereto) (MCKINNON e VOSS, 1993).

25 5 Em ereção, o garanhão realiza a monta sobre a égua ou manequim, e faz alguns movimentos de procura, para localizar a abertura vulvar, a fim de realizar a penetração na vagina. Após a penetração o garanhão executa em média sete a oito movimentos de fricção. Os movimentos estimulam a ejaculação que ocorre freqüentemente entre o 5 o e o 8 o movimento de fricção (VALLE e FILHO, 2001). A ejaculação inicia-se com contrações peristálticas da musculatura lisa do pênis, do epidídimo, do ducto deferente e da uretra, causada por impulsos parassimpáticos, fazendo com que o sêmen se desloque para o interior da uretra através do lume da mesma. As contrações também ocorrem nas glândulas anexas da genitália masculina, determinando a expulsão de suas secreções. Este processo denomina-se emissão (ASHDOWN e HAFEZ, 1995). A cópula culmina com dois eventos fisiológicos distintos, conhecidos como emissão e ejaculação. A emissão é a liberação dos espermatozóides e fluidos das glândulas sexuais acessórias no interior da uretra pélvica. A ejaculação é a expulsão forçada do sêmen para fora da uretra. O evento cognitivo-sensorial associado, chamado de orgasmo, não tem sido caracterizado em espécie não humana. O evento neurofisiológico correlato ao orgasmo, ocorre sem dúvida na espécie animal, portanto parece razoável aceitar que os animais percebem alguma forma análoga de satisfação sensorial na cópula. A emissão na cópula se segue após um número e modo espécie-específica de movimento de fricção do pênis. No garanhão sete a nove movimentos de fricções precedem o desencadeamento da emissão. Verifica-se a seguir os eventos chaves na cópula e as inervações responsáveis pela ereção, emissão e ejaculação (MCDONNELL 1994):

26 6 d b a c Figura 1: Ereção: O pênis cai devido ao relaxamento mediado pelos nervos sacrais-parassimpáticos que inervam o músculo corpo trabeculi (a) e retrator do pênis (c). A ereção da bainha e glande do pênis é devido ao relaxamento mediado pelo parassimpático sobre os vasos da corpora cavernosa (a) e corpus spongiosus (b). Secreção pré-ejaculatória: Liberação de pequena quantidade de fluido das glândulas acessórias, principalmente da próstata, devido à contração das glândulas acessórias mediada pelo reflexo sacral (d). Figura 2: Emissão: Liberação dos espermatozóides e fluidos das glândulas acessórias mediadas pelo reflexo toracolombar que levam a contração da musculatura lisa dos ductos deferentes (e), ampola (f), glândula vesicular (g), próstata (h) e glândulas e bulbo uretrais (i). Fechamento do colo vesical: Firme fechamento do colo vesical (j) devido ao reflexo mediado pela contração de sua musculatura lisa.

27 7 Figura 3: Ejaculação: Expulsão forçada do sêmen a partir da uretra devido ao reflexo mediado pelos nervos sacrais sobre a contração dos músculos bulbo cavernoso (k), ischiocavernoso (l), e uretralis (m). Figura 4: Detumescência: Perda da ereção com recolhimento do pênis devido ao aumento do tônus da musculatura lisa no corpus cavernoso (n), e corpus spongiosum (o), e contração do retrator do pênis (p) mediado pela inervação sacral simpática. Durante a emissão o cólon da vesícula urinária contrai simultaneamente mantendo o meato urinário da bexiga firmemente fechado. A emissão e o fechamento do colo da bexiga são primariamente mediados por estímulos alfa-

28 8 adrenérgicos. O aspecto eferente do reflexo da emissão envolve fibras préganglionares simpáticas, que deixam a coluna vertebral, em seu segmento lombosacral, com conexão principal no plexo mesentérico caudal na trajetória à genitália tubular (MCDONNELL 1994). A ejaculação é o resultado da contração rítmica dos músculos isquiocavernoso, bulbo esponjoso, uretral e outros músculos estriados da pelve. Simultaneamente o esfíncter anal contrai ritmicamente. No garanhão a ejaculação ocorre como jatos (5 a 8) de sêmen, sendo que a pressão de expulsão decresce gradativamente do primeiro ao último jato. O reflexo da ejaculação é mediado via nervo pudendo e segmento sacral da coluna vertebral. Parece que o processo da emissão precede e age no desencadeamento do reflexo ejaculatório. (MCDONNELL 1994). TISCHNER E KOSINIAK (1992), relatam em seu trabalho que a ejaculação ocorre em jatos, que podem variar de 4 a 13, com média de oito (8). Estes jatos de sêmen são subdivididos em fração rica e pobre em espermatozóides, sendo que os três primeiros jatos representam a porção rica, contendo 80% dos espermatozóides do ejaculado. Na medida em que os jatos vão ocorrendo, a quantidade de espermatozóides vai diminuindo juntamente com o volume de plasma seminal, correspondendo à fração pobre em espermatozóides (LINDEBERG et al., 1998). Durante a ejaculação a primeira fração do sêmen é composta pelas secreções do epidídimo que se mistura com as secreções da glândula bulbo uretral e com o fluido prostático, que apresenta um aspecto fluido e translúcido, e contém muito pouco ou nenhum espermatozóide. Seguido esta fração, tem-se a fração rica em espermatozóides, composta pelas secreções do epidídimo, da glândula bulbo uretral, da próstata e um pouco de secreção da glândula vesicular. A última porção é composta principalmente pela secreção da vesícula seminal ou glândula vesicular, responsável pela produção da fração gelatinosa e pela secreção da ampola, contendo ou não uma pequena quantidade de espermatozóides (VARNER et al., 1987, TISCHNER E KOSINIAK et al e SANZ, E et al., 2002).

29 9 O volume ejaculado varia enormemente, entre 30ml a 250ml, dependendo de alguns fatores como: idade, freqüência de coleta, excitação do animal e da estação do ano. Em média este volume varia de 60 a 80 ml sem a fração gelatinosa, que pode chegar a 40 ml no ejaculado. A concentração do ejaculado pode variar de 100x10 6 a 200x10 6 de espermatozóides por mililitro, variar em função da idade, da freqüência de ejaculação, da estação do ano (DAVIES MOREL, 1999a) A Célula Espermática O espermatozóide é uma célula que necessita possuir atributos em quantidade suficiente para participar do processo de fertilização de um oócito (HAFEZ, 1995). Durante a espermatogênese e principalmente os processos de resfriamento e congelamento, as células espermáticas sofrem danos. Tais danos podem acarretar perda parcial ou total, de atributos necessários para manutenção do potencial fertilizante (SQUIRES et al, 1998). Sendo assim, torna-se necessária a avaliação de múltiplos atributos para se verificar a fertilidade do sêmen (HAFEZ, 1995). Alguns destes atributos são conhecidos, outros ainda são desconhecidos. Contudo, uma lista parcial deles inclui a motilidade, a integridade de membrana plasmática e a integridade de acrossoma (KIRK, 2001). A estimativa da percentagem de células espermáticas, exibindo movimento progressivo, é a avaliação mais utilizada durante a análise seminal e deve ser superior a 70% (FONSECA et al., 1998). No entanto, esta avaliação é considerada, em geral, mais como uma forma de avaliar a viabilidade da célula espermática do que a predição de sua fertilidade (CARVALHO e FILHO, 2001), pois, os espermatozóides podem perder sua capacidade de fertilizar, antes mesmo de perder a motilidade (HAFEZ, 1995). A membrana plasmática da célula espermática recobre todo o espermatozóide e sua integridade é fundamental para a sobrevivência da mesma,

30 10 entretanto, durante o processo de resfriamento e congelamento do sêmen ocorrem danos a esta estrutura (VALLE e FILHO, 2001). Estes danos, causados pela criopreservação, provocam a perda de capacidade de controle osmótico, resultante da perda da capacidade de controlar os canais iônicos (WILHELM et al., 1996). Assim sendo, os métodos de avaliar a integridade da membrana, envolvem sua capacidade de impedir a passagem de forma passiva de diversas substâncias pela membrana (BORG et al., 1997 e NEILD et al., 2003). A perda de estabilidade da membrana plasmática também provoca alterações no acrossomo, denominadas reação de acrossomo (NEILD et al., 2005).

31 Plasma Seminal O plasma seminal é a fração líquida do sêmen, que é secretada pelo epidídimo e glândulas sexuais acessórias do aparelho reprodutor masculino, composto principalmente de proteína, glicose, ácido lático e cítrico, minerais, fosfolipídeos e enzimas (PESCH et al., 2006, DAVIES MOREL, 1999a). Este apresenta várias funções, atuando como diluente e veículo para os espermatozóides, controlador de osmolaridade, fornecedor de energia, agente antioxidante de compostos bioquímicos, além de exercer um efeito estimulante na motilidade. Participa na modulação da capacitação espermática, possui efeito imuno-modulatório e age também como agente bactericida (PESCH et al., 2006, LACKEY et al., 2002, FALCI et al., 2002). Apesar da grande importância do plasma seminal na fertilidade espermática, existem vários trabalhos relatando, que, durante a preservação do sêmen, ele apresenta efeito deletério para motilidade, sugerindo, que este deve ser parcialmente removido e substituído por um diluente (RIGBY et al., 2001, SCHMITT et al., 2003 e MATOS et al., 2003). Seu efeito deletério para os espermatozóides, durante a conservação, pode estar relacionado com sua alta concentração de íons Cloro e Sódio, que podem afetar a osmolaridade durante o processo de conservação do sêmen (DAVIES MOREL, 1999d) e também com a presença de alguns tipos de proteínas nele existentes (FAGUNDES, 2003, FALCI et al., 2002, VIANNA, 2001) Proteínas do Plasma Seminal O plasma seminal eqüino possui em sua composição em torno de 10 mg/ml de proteínas com peso molecular variando de 11 a 112 kda. Entretanto, estas proteínas se agregam e formam complexos multiprotéicos que podem chegar a 800 KDa (TÖPFER-PETERSEN et al., 2005, FRAZER e BUCCI, 1996). A concentração destas proteínas varia de garanhão para garanhão. Existe, também, variação na presença de algumas proteínas entre animais e entre ejaculados de

32 12 um mesmo individuo (FRAZER e BUCCI, 1996) e nas diferentes frações do sêmen. Na pré-secreção, a concentração é muito baixa, na fração rica em espermatozóide ela é máxima e a fração pobre apresenta menor concentração do que na fração rica (KOSKINEN et al., 2002). A função das proteínas presentes no plasma seminal ainda não é completamente conhecida, mas sabe-se que algumas delas têm ação negativa na fertilidade e que outras possuem ação benéfica (BRANDON et al., 1999). Suas funções podem ser relacionadas com prevenção contra choque térmico, manutenção da integridade de membrana, manutenção da motilidade total e progressiva, no processo de maturação, controle da capacitação espermática, nos eventos imuno -moduladores no trato genital feminino e também na fertilização do óvulo (TÖPFER-PETERSEN et al., 2005, PÉREZ-PÉ et al., 2001 AURICH et al., 1996). A adição de proteínas no diluente de congelamento mostrou uma tendência a melhorar a integridade de membrana, assim como melhorou a motilidade das células espermáticas pós-descongelamento. Porém, quando o sêmen foi congelado com proteínas de baixo peso molecular adicionado ao diluente de congelamento, a motilidade mostrou redução, quando comparada ao método convencional (FAGUNDES, 2003) Composição Iônica do Plasma Seminal de Eqüinos Dentre os elementos do plasma seminal eqüino descrito na literatura podemos encontrar o Cálcio (Ca 2+ ), o Cloro (Cl), o Fósforo (P), o Magnésio (Mg 2+ ), o Potássio (K + ), o Ferro (Fe), o Zinco (Zn) e o Cobre (Cu) (PESCH et al., 2006). A concentração destes íons apresenta variação entre ejaculados e entre garanhões. Devido a grande variação da motilidade pós-descongelamento entre ejaculados e garanhões, torna-se difícil fazer qualquer inferência da participação destes íons na sobrevivência destas células entre garanhões que apresentam boas ou baixas congelabilidade do sêmen (BARRIER-BAUTTUT et al., 2002). A concentração dos íons também pode ser influenciada pela freqüência das coletas (KAYA et al., 2002), ou ainda pela estação do ano (RIBAS, 2006).

33 13 Alguns trabalhos encontraram valores médios para os íons Cálcio, Sódio, Potássio, Cloro, Fósforo e Magnésio de 1,7 mmol/l (0,5 a 8,9), 110 mmol/l (69 a 126), 22,1 mmol/l (2,1 a 53), 114,5 mmol/l (84 a 129), 1,1 mmol/l (0,4 a 59) e 3,1 mmol/l (0,5 a 4,2) (PESCH et al., 2006, RIBAS, 2006, BARRIER-BATTUT et al., 2002) Modelos de Vagina Artificial e Coleta do Sêmen O primeiro passo do processamento sêmen é a coleta. Para tal, utiliza-se, preferencialmente, uma vagina artificial para realizá-la. O método utilizando vagina artificial é o que imita melhor, a cópula natural (HAFEZ, 1995). A vagina artificial precisa preencher, fundamentalmente, duas condições. A primeira é a aceitação por parte do garanhão e a segunda é não prejudicar o sêmen coletado. Estas condições variam de acordo com o material, a construção e a técnica de manuseio (DAVIES MOREL, 1999a). Os modelos de vagina artificiais desenvolvidos para o princípio de estruturação e funcionamento são os mesmos, sendo constituídos por três porções principais que são: tubo rígido, mucosa de látex interna e copo coletor, dispostos de tal maneira que entre o tubo rígido e a mucosa interna que encontra um espaço que será preenchido com água aquecida de maneira que a parte interna da vagina artificial esteja a 42 a 45 o C durante a coleta. O que se diferencia, basicamente, entre os diferentes modelos é o material utilizado na fabricação e a sua dimensão (TISCHNER et al. 1986). O modelo de vagina artificial proposto por TISCHNER et al. (1986) diferencia-se dos modelos Missouri, Colorado, Hannover e Botucatu apenas pelo fato de ser mais curta, permitindo a exposição da glande do pênis do garanhão, que ao ejacular propicia uma coleta fracionada do sêmen por um segundo técnico que apanha os pulsos ejaculatórios em diversos copos. Este método de coleta é denominado coleta do tipo aberta, enquanto os métodos que utilizam as vaginas artificiais modelos Missouri, Colorado, Hannover e Botucatu são denominados de fechada.

34 14 Os modelos fechados são os mais utilizados, devido a sua praticidade durante a coleta. Nesta metodologia, coleta -se todo o ejaculado em um único recipiente. No entanto, com a vagina artificial para coleta aberta, é possível realizar a coleta fracionada, que consiste em separar as diferentes frações do ejaculado de garanhões (TISCHNER e KOSINIAK, 1992). A coleta fracionada, realizada por meio de vagina artificial aberta, apresenta algumas vantagens em relação à fechada, pois este método de coleta proporciona uma menor contaminação microbiana e possibilita separar a porção gelatinosa do sêmen da porção rica em espermatozóides. Além disto, há evidencias de que a porção rica em espermatozóides, ou seja, a primeira fração é mais tolerante ao resfriamento do que o ejaculado total (LINDEBERG et al., 1998, VARNER et al., 1987). Entretanto, este método de coleta não é freqüentemente utilizado porque não é muito prático, exigindo a sincronia de dois técnicos para coleta e, ainda, existe o risco de perda de parte do sêmen (TISCHNER e KOSINIAK, 1992). Para se realizar uma boa coleta, a vagina artificial deve propiciar, na base do pênis, pressão e temperatura (TISCHNER e KOSINIAK, 1992). A temperatura da vagina artificial, no momento da coleta, deve ser de 42 C a 45 C (HAFEZ, 1995, SQUIRES, 1998; DAVIES MOREL, 1999b) e proporcionar uma pressão de 66 mm/hg (TISCHNER e KOSINIAK, 1992; KATILA, 1997). Durante a coleta os espermatozóides não podem ser expostos a danos mecânicos, luz direta ou temperaturas muito baixas ou altas (LINDEBERG et al., 1998). Todo o material que entra em contato com os espermatozóides deve ser previamente lavado, seco, estar aquecido e sem substâncias tóxicas (resíduos de sabão ou detergentes) (LINDEBERG et al., 1998; LOPES et al., 1997). Também deve ser dada atenção ao material utilizado, pois estes podem ser tóxicos aos espermatozóides (Lopes et al., 1997).

35 Contaminação Bacteriana Muitas bactérias comensais colonizam-se no exterior do pênis de garanhões saudáveis e se localizam principalmente nas criptas do prepúcio e na pele do pênis. Estas regiões da genitália promovem a contaminação do sêmen durante o coito ou coleta, tornando impossível se obter sêmen sem contaminação na coleta convencional (THIBIER e GUERIN, 2000). Contudo, apesar do sêmen ser contaminado, no momento de sua ejaculação, por uma grande diversidade de microorganismos, apenas poucos são patogênicos, sendo apenas algumas cepas responsáveis por causar algum tipo de patologia (Metcalf, 2001). Porém, quando o equilíbrio da flora normal se quebra, bactérias patogênicas oportunistas se desenvolvem podendo causar infecção e prolongada inflamação do aparelho reprodutor masculino e feminino (RIDEOUT et al., 1982). Além disto, os garanhões podem conter bactérias patogênicas e, no entanto, estar assintomático (MADSEN e CHRISTENSEN, 1995). A carga microbiana presente no sêmen pode ser reduzida, com lavagens do pênis antes da coleta ou cópula. Entretanto, a sucessiva lavagem, principalmente, se for utilizado sabão para esta operação, pode favorecer o crescimento de bactérias patogênicas (VARNER et al., 1998). A utilização de vagina artificial aberta vem, também, sendo descrito como uma forma de reduzir a carga microbiana no sêmen (TISCHNER e KOSINIAK, 1992, LINDEBERG et al., 1998). Adicionalmente, a estes procedimentos, a utilização de antibióticos nos meios destinados à diluição do sêmen destinado à inseminação a fresco, resfriamento ou ao congelamento, tem sido eficaz na prevenção do crescimento bacteriano em amostras seminais (VARNER et al., 1998).

36 Avaliação do Sêmen Motilidade Espermática A avaliação, da motilidade espermática é, freqüentemente, realizada por meio visual, utilizando para tal, um microscópio óptico (VARNER et al., 1991), o que faz deste método o mais simples de ser executado (HAFEZ, 1995). Para a realização deste método, coloca-se uma pequena gota da amostra seminal, a ser analisada, entre lâmina e lamínula, em seguida faz-se a observação no microscópio, que deve conter uma platina (placa) aquecedora mantida a 37 C (HAFEZ, 1995). Este método permite obter uma estimativa do percentual de espermatozóides com motilidade e vigor dos movimentos. Na determinação do vigor estima-se a intensidade dos movimentos, ou seja, a velocidade, que varia de 1 escore sem movimentos até 5 com movimento muito intenso (MIES FILHO, 1975). Tal fato faz com que as avaliações da motilidade e vigor por meio visual sejam consideradas como um método subjetivo, mesmo quando feita por técnicos bem treinados, que apresentam uma boa repetibilidade e confiança nas avaliações (ROTA et al., 2004). Atualmente, têm sido utilizados métodos mais objetivos que se emprega um microcomputador para realizar a avaliação da cinética espermática. À associação da videocâmara e do computador para esta análise dá-se o nome de CASA (Computer-Aided Sperm Analysis). Os métodos que utilizam a fotomicrografia com tempo de exposição, fotomicrografia com múltipla exposição, microcinematografia, videomicrografia e a análise de imagem com auxílio de computador, permitem a avaliação da cinética dos movimentos espermáticos assim como sua velocidade de forma mais objetiva (Boyers et al., 1989; Mortimer, 1997).

37 Exames morfológicos As alterações morfológicas dos espermatozóides podem ser detectadas de muitas formas. Freqüentemente, são utilizados métodos que utilizam corantes para visualização da célula ou das organelas celulares (MALMGREN, 1997; KIRK, 2001; DAVIES E MOREL, 1999c). Métodos empregando corantes fluorescentes (fluorocromos) também têm sido bastante utilizados. Esta técnica aumenta a possibilidade de uma análise mais criteriosa da integridade estrutural dos espermatozóides (ARRUDA, 2000; KIRK, 2001; LOVE, 2003). Podendo ser associada a citometria de fluxo, tornando possível uma rápida e eficaz quantificação das patologias espermáticas (KIRK, 2001). Com o surgimento do microscópio de fluorescência e da citometria de fluxo, vários corantes fluorescentes foram desenvolvidos. O substrato fluorescente mais utilizado é o diacetato de carboxifluoreceína (CFDA), que pode ser associado ao iodeto de propídio (PI) (GARNER et al., 1986 e HARRISON e VICKERS, 1990). Contudo, outros fluorocromos têm sido utilizados, tais como, o isotiocianato fluorescinado (FITC), o PSA - aglutinina Pisum sativum e o PNA - aglutinina Arachis hypogea. O isotiocianato fluorescinado (FITC) pode ser associado a uma lecitina, que é uma proteína ou uma glicoproteína isolada de semente de plantas. As lectinas mais utilizadas são o PSA - aglutinina Pisum sativum oriunda da ervilha e o PNA - aglutinina Arachis hypogea originária do amendoim. Estas lectinas associadas ao FITC se ligam aos glicoconjugasdos da membrana acrossomal externa e da matriz acrossomal respectivamente, os tornado fluorescentes (CUNHA, 2002; ARRUDA, 2000 e CELEGHINI,2004). O CFDA é um fluoróforo penetrante à membrana plasmática, que ao penetrar na célula é esterificado e torna-se fluorescente e incapaz de passar pela membrana. Uma vez esterificado, o CFDA apresenta uma cor verde fluorescente, corando o citoplasma da célula (GARNER et al., 1986). O iodeto de propídio (PI) é um fluorocromo que se liga ao DNA da célula. A membrana plasmática é impermeável a este fluorocromo, corando apenas as células que possuem danos na membrana plasmática (HARRISON e VICKERS, 1990). Como resultados deste

38 18 método têm os espermatozóides íntegros, apresentando apenas fluorescência verde e os espermatozóides com lesão na membrana plasmática apresentaram o núcleo vermelho fluorescente (HARRISON e VICKERS, 1990) Congelamento Diluentes e Diluição para Centrifugação Diluentes a base de leite desnatado (LEIPOLD et al., 1998; BRAUN et al., 1995; BLOTTNER et al., 2001; SQUIRES et al., 1998) e a base de leite desnatado com modificações (LAGARES et al., 2001, BEDFORD, et al., 1994 e SOUZA, et al. 2001), o citrato-edta e a Glicose-EDTA, (CONCHRAN et al., 1984) têm sido utilizados para minimizar o efeito nocivo do processo de conservação do sêmen. A proporção de uma parte de sêmen para uma a duas de diluente tem sido utilizada em praticamente todos os protocolos, que utilizam a centrifugação para concentrar e retirar o plasma seminal (SQUIRES et al., 1998). Tubos de 15 a 50 ml freqüentemente são utilizados para centrifugação, no entanto, alguns trabalhos sugerem que volume inferior a 15 ml preserva melhor a motilidade espermática (DAVIES MOREL, 1999c). Volumes maiores (40 ml) de sêmen diluído podem promover perdas maiores de espermatozóides do que em volumes inferiores a 20 ml (CONCHRAN et al., 1984). Estas perdas ocorrem após a centrifugação, quando o plasma seminal é retirado, restando apenas o sedimento. Esta perda de espermatozóides pode variar de mais ou menos 13% (DELL Aqua e PAPA, 2001), a uma perda em torno de 25% (CONCHRAN et al., 1984). Entretanto, DAVIES MOREL (1999d), relata que a utilização de um sistema de duas centrifugações pode promover uma melhor recuperação de espermatozóides pós-centrifugação, isto é, uma re-centrifugação do sobrenadante Centrifugação O principal método para retirada do plasma seminal é a centrifugação, que vem sendo amplamente utilizada, e em conseqüência disto ocorre a concentração de células espermáticas. Apesar de muito utilizada, a centrifugação pode exercer

39 19 efeitos deletérios para o sêmen, causando redução da motilidade e alterações morfológicas nos espermatozóides (COCHRAN et al., 1984, e COTTORELLO e HENRY, 2002). Estes efeitos podem ser reduzidos pela diminuição da força e também do tempo de centrifugação (DAVIES MOREL, 1999d). As forças gravitacionais e o tempo de centrifugação apresentam grande variação nos protocolos de congelamento, podendo variar de 200G por 10 minutos (BLOTTNER et al., 2001) a 900 a 1000G por 15minutos (BORG et al., 1997). Estes efeitos podem ser minimizados, pela introdução de uma solução concentrada ( travesseiro ) no fundo do tubo do sêmen diluído no diluente para centrifugação. Esta técnica também permite uma maior recuperação do sêmen ao final deste processo (DELHOMME et al., 2004). Contudo, a maioria dos protocolos utiliza forças gravitacionais entre 400 e 700 G por um tempo de 10 a 15 minutos. Para as forças gravitacionais maiores são utilizados tempos menores, assim como, para forças menores utilizam-se tempos maiores (SAMPER e MORRIS, 1998 e DELL AQUA JÚNIOR e PAPA, 2001). Através da coleta fracionada, que consiste em aproveitar os primeiros jatos de sêmen, excluindo parte do plasma seminal (TISCHNER e KOSINIAK, 1992), da filtração em lã de vidro, após diluição, e, por meio de coluna de separação de sephadex, também é possível remover o plasma seminal. Todos os três métodos apresentam uma significante melhora na motilidade espermática, comparado com o sêmen centrifugado, após ser mantido a 5 C por 72 horas. Entretanto, quando o sêmen se destina ao congelamento, o método de coleta fracionada apresenta uma desvantagem, ocasionada pelo volume final que se torna muito grande, devido à presença de ainda boa parte de plasma seminal e do diluente de congelamento. Já o método de filtração promove redução na motilidade espermática após congelamento (DAVIES MOREL, 1999d). A escola alemã preconiza que o ejaculado que apresentar uma concentração acima de 300 x 10 6 sptz./ml não necessita de centrifugação em seu processo de congelamento. Já outras escolas, como a de Colorado, que utilizam uma concentração final da dose inseminante de 1,6 x10 9 sptz./ml não elimina esta etapa (SQUIRES et al. 1998).

40 Diluidores para Congelamento do Sêmen Após a centrifugação, aspira-se o sobrenadante (plasma seminal diluído no diluente de centrifugação) e o sedimento (formado pelos espermatozóides) deve ser ressuspendido em diluente para congelamento, a fim de se obter a concentração final desejada (COTTORELLO e HENRY, 2002). O meio diluidor de congelamento deve conter lipoproteínas (DAVIES MOREL, 1999c), açúcares, crioprotetor (SQUIRES, 1998), além de EDTA, detergente, tampão e antibióticos (COTTORELLO e HENRY, 2002). Segundo Arruda (2000), as lipoproteínas atuam como agente crioprotetor não penetrante, e estão presentes na gema de ovo e no leite. Estes ingredientes estão presentes em quase todos os diluentes de congelamento em uma quantidade que varia de 2 a 20% (VIDAMENT et al., 2001). Os açúcares, tais como a glicose, a lactose, a rafinose, a frutose e a sacarose, atuam como crioprotetores não penetrantes à membrana plasmática (DOEBBLER, 1966) e freqüentemente estão associados a um crioprotetor penetrante. O glicerol é o crioprotetor penetrante mais utilizado nos diluentes de congelamento de sêmen eqüino. Entretanto, outros crioprotetores, tais como o etilenoglicol, propilenoglicol, acetamida, 1,2 propilenoglicol, dimetilsulfóxi (DMSO) e dimetil-formamida, têm se mostrado eficiente no congelamento de espermatozóides eqüinos (SNOECK et al., 2001, SNOECK et al., 2002). Contudo, ALVARENGA et al. (2004), concluíram que a dimetil-formamida é mais eficiente que o glicerol, e que promove melhorias na qualidade do sêmen de garanhões que não apresentam boa congelabilidade. O EDTA é uma substância que retira cálcio do meio (quelante), para evitar que este entre nas células espermáticas, já que seu excesso intracelular causa danos na membrana espermática durante o congelamento. Os detergentes são utilizados para solubilizar as lipoproteínas e os lipídeos, a fim de aumentar a interação destes com a membrana. Os tampões são necessários para manter estável o ph do diluente. Antibióticos, são adicionados ao diluidor para evitar o crescimento bacteriano (ARRUDA, 2000).