Silva, A P A 1 ; Dergam J A 1 ;

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1 REGIÃO DE HETEROCROMATINA CONSTITUTIVA EM Geophagus brasiliensis (QUOY E GAIMARD,1824)(PERDIFORMES: CICHLIDAE) DO SISTEMA LACUSTRE DO MÉDIO RIO DOCE (MG) Silva, A P A 1 ; Dergam J A 1 ; 1 Departamento de Biologia Animal, Universidade Federal de Viçosa anapaula-ssdd@hotmail.com Palavras-chave: : Acará, Banda C, Cariótipo, Citogenética. Resumo A família Cichlidae pertence à ordem Perciformes, uma das famílias com maior riqueza de espécies entre os vertebrados. Geophagus brasiliensis é o ciclídeo com maior distribuição nas lagoas do médio rio Doce. Estudos citogenéticos sugerem que esse sistema de lagoas favoreceu a diferenciação citogenética de varias espécies de peixes, num intervalo de tempo relativamente curto. O cariótipo dessa espécie é caracterizado por 2n=48 com blocos de heterocromatinas nas regiões centroméricas em quase todos os cromossomos. O objetivo desse trabalho foi caracterizar a população do médio rio Doce a partir do bandeamento de heterocromatinas. Foram coletados 18 espécimes de G. brasiliensis em três lagoas. O resultado da Banda C apresentou marcações nas regiões centroméricas de quase todos os cromossomos. No braço menor de um cromossomo submetacêntrico observou-se uma marcação apenas nos indivíduos do sexo masculino. Marcações na região intersticial foram encontradas nessa população, sendo essa uma característica exclusiva desse sistema lacustre. Abstract The family Cichlidae belongs to the order Perciformes, and is one of the families with the highest species richness among vertebrates. Geophagus brasiliensis is the cichlid with the widest distribution in the lakes of the middle Rio Doce. Cytogenetic studies suggest that this system of lakes favors the cytogenetic differentiation of various fish species over a relatively short time. The karyotype of this species is characterized by a diploid number of 2n=48, with blocks of heterocrhomatin in the centromeric regions and almost all of the chromosomes. The objective of this work was to characterize the population of the Rio Doce through the use of heterochromatin bandings. 18 specimens of G. brasiliensis were collected in three lakes. The results of C-Banding present markings in the centromeric regions of almost all of the chromosomes. One markings was observed only in the smaller arm of a submetacentric chromosome of male individuals. Markings in the interstitial region were found in this population, this being one of the exclusive characteristics of this lacustrine system. 16

2 1. Introdução Os peixes vivem em quase todo tipo de ambiente aquático, desde os grandes oceanos, os lagos, os rios, riachos e até pequenas poças d água no deserto. Como consequência da adaptação a esses diversos habitats, os peixes possuem grandes variedades morfológicas. A diversidade de espécies de peixes e de habitats nos quais eles vivem oferecem uma gama, sem paralelos, para as variações da história da vida. Essas características fazem com que a compreensão da sua sistemática e história evolutiva seja um tema ainda sujeito a muita discussão, tornando-os os um excelente modelo nos estudos voltados a questões adaptativas, taxonômicas e evolutivas (Pough et. al,, 2003; Nelson, 2006). A citogenética de peixes é utilizada na obtenção de informações que contribuem para uma melhor identificação de diferentes espécies e de suas peculiaridades cromossômicas. Com menor frequência, esta ciência é utilizada em melhoramento de espécies que são cultivadas em programas de piscicultura (Martins et al.,, 2002) e no repovoamento de águas marinhas, lagoas e rios (Nichio e Oliveira, 2006). Um dos primeiros trabalhos relativos à citogenética de peixes neotropicais a aparecer na literatura é o de Jin e Toledo (1975). A partir daí, o desenvolvimento de técnicas simplificadas, para obtenção e análise morfológica dos cromossomos de peixes cresceu significativamente, permitindo a produção de diversos trabalhos. Dentro dos Perciformes, com mais de 1300 espécies, a família Cichlidae é uma das mais ricas famílias de vertebrados. Ocorrem na América do Sul e Central, Madagascar e Índia (Kullander, 2003; Salzburger e Meyer, 2004). Os ciclídeos neotropicais não apresentam a mesma diversidade em relação aos africanos, todavia possuem grandes variações morfológicas, comportamentais e ecológicas (Nelson, 2006). Hoje, existem 450 espécies descritas para o neotrópico (Kullander, 2006). Das 450 espécies descritas de ciclídeos neotropicais, em apenas 112 foram realizados estudos citogenéticos. A maioria das descrições citogenéticas foi realizada a partir da década de 70. Nestes estudos, os dados apresentados indicam que a evolução dos cromossomos de ciclídeos neotropicais tem sido bastante conservativa, sugerindo que o seu cariótipo ancestral possui o número diplóide igual a 48 cromossomos telocêntricos. Qualquer variação morfológica ou numérica é interpretada como uma consequência de inversões periféricas ou fusões de centrômeros (Thompson, 1979; Feldberg e Bertollo, 1985). O acará, Geophagus basiliensis, é um ciclídeo adaptado a ambientes lênticos, como lagoas e lagos, e possui uma ampla distribuição em reservatórios no sudeste brasileiro e é uma espécie nativa e amplamente distribuída dentro das lagoas do Médio rio Doce. A bacia hidrográfica do rio Doce está situada na região Sudeste compreendendo uma área de drenagem de cerca de km², dos quais 86% pertencem ao Estado de Minas Gerais e o restante ao Estado do Espírito Santo ( caracterizacao.asp). Semelhantes às outras drenagens costeiras, a bacia do rio Doce possui uma história geomorfológica relacionada às flutuações eustáticas em eras glaciais e interglaciais, as quais determinaram alterações no seu curso em direção a leste do Oceano Atlântico (Bandeira Jr. et al., 1975). No vale do médio rio Doce, as lagoas tiveram origem bastante complexa envolvendo processos de levantamentos de crosta, com formação de montanhas, falhas tectônicas, processos erosivos e deposição de sedimentos, ocasionando a mudança do leito do rio Doce e preenchimento dos paleovales com sedimentos, o que levou a formação de aproximadamente 160 lagos, com sua 17

3 finalização entre a anos atrás (Pflug, 1969; Meis e Monteiro, 1979). As diferenças quanto à composição de espécies em cada lago foram anteriormente interpretadas como evidências de que as lagoas seriam verdadeiras ilhas de comunidades de peixes (Sunaga e Verani, 1983). Godinho e Vieira (1998) identificaram 77 espécies de peixes, sendo 37 endêmicas da bacia do Rio Doce, utilizando critérios morfológicos. Esta diversidade de peixes está ameaçada por alterações em seu habitat, devido a mineração, poluição, assoreamento e a represamentos do rio principal e seus afluentes. Um dos principais fatores biológicos que interfere na diversidade é a introdução de espécies exóticas. Este fator tem eliminado espécies de peixes em 90% dos lagos (Latini, 2005). O grande interesse dessa espécie para estudos citogenéticos é justificado pela sua ampla distribuição (América do Sul: drenagens costeiras do sul e sudeste do Brasil e Uruguai) (Fishbase, 2011). G. brasiliensis apresenta 2n=48, mas o tipo e tamanho dos cromossomos variam entre cada população, assim como o número fundamental. As regiões de heterocromatina constitutiva são identificadas com a técnica de Bandeamento C. Em G. brasiliensis, Martins et al. (1995) indicam que as marcações ocorrem na região pericentromérica em todos os cromossomos, enquanto Ferreira et al. (2008) indicam também a presença de regiões heterocromáticas no braço curto de um par de cromossomos subtelocêntricos em Acarás do Rio das Contas (BA). 2. Objetivo Caracterizar o cariótipo da espécie Geophagus brasiliensis pertencentes á população do médio rio Doce, em relação às regiões de heterocromatina constitutiva. 3. Matérias e Métodos 3.1. Localizações das áreas de coletas Foram coletados 18 indivíduos (12 machos e 6 fêmeas) da espécie Geophagus brasiliensis provenientes de três lagoas do médio rio Doce (Tabela 1). Tabela 1: Local de coleta com suas coordenadas e número de indivíduos coletados. Localidade Cristal Juiz de Fora Lingüiça Coordenadas GPS 19º36 57,11000 S 42º28 06,69000 O 19º41 49,49310 S 42º29 08,29559 O 19º33 26,11000 S 42º29 47,49000 O Tamanho Amostral (Macho/Fêmeas) 2 machos/ 2 fêmeas 1 macho 9 machos/ 4 fêmeas 3.2. Preparação dos cromossomos mitóticos O órgão utilizado para análise citogenética em peixes é o rim cefálico, o qual consiste basicamente em tecido linfóide. No presente estudo foi utilizada a técnica de preparação direta para a obtenção de cromossomos mitóticos descritas por Egozque (1971) e adaptada para peixes por Bertollo (1978). Antes da extração do material foi utilizado agente mitogênico, como o Munolan, para estimular a divisão celular no tecido renal. Um comprimido do mitogênico é dissolvido em 2 ml de água e injetado na cavidade peritoneal em duas doses, com um intervalo de 24 horas entre elas. A proporção de cada dose é 0,3 ml por 100 g do peso total do peixe. 18

4 Extração: 1- Injetar, intra-abdominalmente, abdominalmente, entre as nadadeiras peitorais e ventrais, solução aquosa de colchicina (0,025%) na proporção 1 ml/100 g de peso do animal. 2- Deixar o peixe em aquário bem aerado, por um período de 40 a 50 min. Decorrido esse tempo, sacrificar o animal e retirar o rim cefálico. 3- Lavar rapidamente o rim, em solução hipotônica de KCl (0,075 M). 4- Transferir o material para uma pequena cuba de vidro, contendo 8 a 10 ml de solução hipotônica de KCl (0,075 M). 5- Fragmentar bem o material, com auxílio de pinças de dissecção, completando este processo com uma seringa hipodérmica, desprovida de agulha, a, através de leves movimentos de aspiração e expiração do material, facilitando a separação das células, até obter uma suspensão celular homogênea. 6- Colocar a suspensão obtida a C, durante 20 min. 7- Filtrar a solução em lã de vidro e transferi-la a para um tubo Falcon de 15 ml. 8- Acrescentar gotas de fixador recém preparado (3 vv álcool metílico: 1 v ácido acético) na proporção de uma gota para cada ml de suspensão; ressuspender o material e centrifugar por 10 min a 1000 rpm, descartando o sobrenadante com pipeta Pasteur. Desagregar o botão celular com vibração produzida por batidas leves do dedo indicador no fundo do tubo Falcon. 9- Adicionar, vagarosamente, 5 a 7 ml de fixador recém preparado, deixando-o escorrer pela parede do tubo. 10- Ressuspender o material cuidadosamente, com auxílio de pipeta Pasteur e centrifugar o material por 10 min a 1000 rpm, descartando o sobrenadante. 11- Repetir os itens 9 e 10. Após a última centrifugação e eliminação do sobrenadante, adicionar 1,5 a 2 ml de fixador e ressuspender bem o material. O material pode então ser guardado no refrigerador, acondicionado em pequenos frascos plásticos, tipo Eppendorf, ou trabalhado imediatamente conforme os seguintes passos: 12- Pingar 3 a 4 gotas de suspensão, com pipeta Pasteur, sobre diferentes regiões de uma lâmina bem limpa, aquecida em água destilada a 80 C. 13- Eliminar o excesso de material e fixador, inclinando um pouco a lâmina sobre um papel de filtro. 14- Secar ao ar. 15- Corar com Giemsa, diluído a 5% em tampão fosfato ph 6,8 (3,4 g KH 2 PO 4 ) durante 7-10 min. 16- Lavar a lâmina com água de torneira e deixar secar ao ar Detecções de heterocromatina constitutiva (Banda C) Para o estudo da heterocromatina constitutiva, será utilizada a técnica de Sumner (1972), com pequenas modificações: 1-Tratar o material, preparado segundo a técnica descrita para cromossomos mitóticos, com HCl (0,2N) à 42 C, por 12 min. 2- Lavar em água deionizada e secar ao ar. 3-Colocar a lâmina em 2xSSC, a 62 C por 10 minutos. Lavar em água deionizada e secar ao ar. 4- Incubar a lâmina por 1 min e 35 segundos, em solução de Ba(OH) 2 8H 2 O, a 10%, a 42 o C, recém preparada e filtrada. 5- Lavar rapidamente em solução de HCl (0,2 N). 6- Lavar várias vezes em água deionizada e secar ao ar. 6- Incubar em solução 2X SSC, a 60 o C, por 30 min. 7- Lavar várias vezes em água deionizada e secar ao ar. 8- Corar em Giemsa, diluído a 5% em tampão fosfato ph 6,8, durante 5 a 7 min. 9- Lavar em água corrente e secar ao ar. 4. Resultados Os blocos de heterocromatina foram evidenciados em quase todas as regiões centroméricas dos cromossomos. Dois pares de cromossomos subtelocêntricos apresentaram blocos na região intersticial do braço maior. Outro par de 19

5 cromossomos subtelocêntricos evidenciou uma marcação na região telomérica do braço maior. Em todos os machos, um bloco de heterocromatina se estendeu por todo o braço menor do cromossomo submetacêntrico, sendo a mesma região marcada pelo bandeamento NOR (Figuras 1 e 2). Figura 1: Banda C de um macho de G. brasiliensis; Figura 2: Banda C de uma fêmea de G. brasiliensis; 5. Discussão A técnica de bandeamento C permite de terminar a organização do cromossomo eucarioto, por meio da diferenciação longitudinal dos braços cromossômicos (Sumner, 1972). Atualmente, existem algumas evidências de que a heterocromatina apresenta genes funcionais do DNA, que provavelmente podem ter importantes funções, como as de restabelecer a região telomérica dos cromossomos e funcionar como corpo de guarda protegendo a eucromatina contra agentes mutagênicos (SUMNER, 1972). A presença de blocos de heterocromatina na região centromérica em quase todos os cromossomos é uma característica comum na ordem Perciformes (Brum et al., 1998), fato que foi corroborado nas populações deste estudo. Em trabalhos realizados com outras populações de G. brasiliensis também se verificou associação de alguns blocos de heterocromatina às NORs (Pires et al.,, 2008; Ferreira et al., 2008). Marcações de banda C em regiões intersticiais presentes em dois pares de cromossomos subtelocêntricos foram encontradas em todas as populações, sendo uma característica diagnosticada nas populações da bacia do médio rio Doce (Martins et al.,1995; Pires et al., 2008; Ferreira et al., 2008). 6. Referências AGÊNCIA NACIONAL DE ÁGUAS. Website: bacia/caracterizacao.asp. Consultado em 11/2009. BANDEIRA JR, A. N., PETRI, S & SUGUIO, K Projeto Rio Doce, Relatório Final. Convênio da Petrobrás. Universidade de São Paulo. FELDBERG, E. & BERTOLLO, L. A. C Karyotypes of 10 especies of Neotropical cichlids (Pisces, Perciformes). Caryologia 38: FERREIRA, J. L., REIS, M. A., ALMEIDA, J. S., AFONSO, P. R. A. M. & CARNEIRO, P. L. S Estudo cromossômico em populações de Geophagus brasiliensis (Percifomes, Cichlidae) ao longo da bacia do Rio de Contas (BA). Resumo apresentado durante o 54º Congresso Brasileiro de Genética. FISH BASE Website: SpeciesSummary.php?id=4751. Consultado em 02/11. GODINHO,,A. L. and VIEIRA, F Ictiofauna. In: COSTA, C. (Ed.). Biodiversidade em Minas Gerais: Um atlas para sua conservação. Belo Horizonte: Fundação Biodiversitas. p JIN, S. M. & TOLEDO V Citogenética de Astyanax fasciatus e Astyanax bimaculatus (Characidae, Tetragonopterinae). Ciência Cultural 27:

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