INFLUÊNCIA DO SOLO DE CULTIVO NOS METABÓLITOS DAS CASCAS E SEMENTES DOS FRUTOS DAS JABUTICABEIRAS

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1 UFG IQ UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS INSTITUTO DE QUÍMICA G U S T A V O INFLUÊNCIA DO SOLO DE CULTIVO NOS METABÓLITOS DAS CASCAS E SEMENTES DOS FRUTOS DAS JABUTICABEIRAS A M O R I M S A N T O S GUSTAVO AMORIM SANTOS ORIENTADOR: PROF. DR. PEDRO HENRIQUE FERRI TESE DE DOUTORADO 2019 GOIÂNIA- 2019

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3 Influência do Solo de Cultivo nos Metabólitos das Cascas e Sementes dos Frutos das Jabuticabeiras Tese apresentada ao Programa de Doutorado em Química do Instituto de Química da Universidade Federal de Goiás, como requisito parcial para a obtenção do Título de Doutor em Química. Área de concentração: Química de Produtos Naturais. Aluno: Gustavo Amorim Santos Orientador: Prof. Dr. Pedro Henrique Ferri Goiânia, março/2019

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6 Aos meus pais Saulo e Silvânia.

7 Agradecimentos Quando penso nas informações que adquiri, no tempo e no espaço de confecção dessa obra, recordo o famoso trecho de Marcel Proust: E mal reconheci o gosto do pedaço de madalena molhado em chá que minha tia dava (embora ainda não soubesse, e tivesse de deixar para muito mais tarde tal averiguação, por que motivo aquela lembrança me tornava tão feliz), eis que a velha casa cinzenta, de fachada para a rua, onde estava o seu quarto, veio aplicar-se, como um cenário de teatro, ao pequeno pavilhão que dava para o jardim e que fora construído para meus pais aos fundos da mesma (esse truncado trecho da casa que era só o que eu recordava até então)... E, como nesse divertimento japonês de mergulhar numa bacia de porcelana cheia de água pedacinhos de papel, até então indistintos e que, depois de molhados se estiram, se delineiam, se colorem e se diferenciam, tornam-se flores, casas, personagens consistentes e reconhecíveis, assim agora todas as flores do nosso jardim e as do parque do sr. Swann, e as ninféias do Vovonne, e a boa gente da aldeia e suas pequenas moradias e a igreja e toda Combray e seus arredores, tudo isso que toma forma e solidez saiu, cidade e jardins, da minha taça de chá. De forma análoga, durante meus estudos futuros de novas e velhas ferramentas de análise multivariada de dados, lembrar-me-ei das pessoas que participaram nos alicerces da construção desse tipo de conhecimento na minha mente. Assim agradeço a minha mãe, Dra. Silvânia B. de Amorim, ao meu pai, Saulo J. P. dos Santos, por estarem sempre comigo trazendo equilíbrio, convivência familiar e exemplos. Agradeço aos professores Dr. Luciano Morais Leão e Dr. Christian Gonçalves Alonso pela gentileza no aproveitamento de algumas disciplinas. Agradeço a professora Dra. Suzana da Costa Santos pelo apoio, pela amizade, pelos trabalhos de congresso que partilhamos e pelos dados gentilmente cedidos para confecção dessa obra. Agradeço ao professor Dr. Pedro Henrique Ferri, também pela amizade, por dedicar tempo e paciência em diversos trabalhos desenvolvidos nesse período e, principalmente, pelo valioso conhecimento e experiências que foram divididas comigo. E nesse momento devo enfatizar que esse conhecimento não tem preço. Por fim, sempre será inevitável recordar favoravelmente desse período e dessas pessoas quando for necessário reconhecer o gosto dos pedaços de madalena molhados na minha taça de chá. A todos muito obrigado. Gustavo Amorim Santos

8 Sumário Página Lista de Figuras iii Lista de Tabelas iv Lista de Abreviaturas v Resumo Vi Abstract Vii Capítulo 1. Influência do Solo de Cultivo nos Metabólitos das Cascas e Sementes dos Frutos de Jabuticabeiras (Myrciaria cauliflora (Mart.) O. Berg Introdução Objetivo Geral Objetivos Específicos Experimental Amostragem e Análises Químicas Análises Estatísticas Resultados Análise das Amostras das Sementes e das Cascas Análise das Amostras das Sementes Análise das Amostras das Cascas Discussão 1.7. Considerações Finais 1.8. Conclusão 1.9. Referências Capítulo 2. A Influência do Espaço na Variabilidade Química nos Pomares de Jabuticabas Introdução Objetivos Experimental Resultados e Discussão 2.5. Considerações Finais Conclusão Agradecimentos 2.8. Referências ii

9 Lista de Figuras Página Figura 1 Elagitaninos (1-4), ácidos fenólicos (5, 6) e antocianinas (7, 8) de jabuticaba. 3 Figura 2 Plano da RDA com os metabólitos (setas azuis) das cascas (quadrados) e 12 sementes (círculos) de jabuticabas explicadas pela parte do fruto (semente), seus nutrientes minerais (K + ), além dos do solo (Mn 2+ ), representados por um triângulo e setas vermelhas. As amostras foram obtidas de frutos cultivados no solo S1 (cinza), S2 (marrom), S3 (azul), S4 (preto) e S5 (verde). Figura 3 Frações puras (a c) e de sobreposição de efeitos (d g) do particionamento 13 da variação dos metabólitos de M. cauliflora nos subconjuntos preditores. Figura 4 Plano da RDA com os metabólitos (setas azuis) das sementes de frutos de 14 M. cauliflora explicados pelos seus nutrientes minerais (Cu 2+ e Mn 2+ ), além dos do solo (Mn 2+ ), representados por setas marrons. As amostras foram obtidas de frutos cultivados no solo S1 S5. Figura 5 Gráfico de silhueta e de ordenação das amostras com base nos metabólitos 15 das sementes de frutos de M. cauliflora cultivados nos solos S1 S5 de acordo com a técnica de c-means nebulosa. Figura 6 Distribuição das sementes de M. cauliflora nas classes definidas pela análise 16 de discriminante com as variáveis representadas por vetores a partir da origem. As cruzes representam os baricentros das classes, definidas de acordo com o solo de origem das amostras. Figura 7 Plano da RDA com 22 metabólitos (setas azuis) das cascas dos frutos de M. 18 cauliflora explicados pelos seus nutrientes minerais (P e Mn 2+ ), além dos do solo (Mn 2+ ), representados por setas vermelhas. As amostras foram obtidas de frutos cultivados no solo S1 S5. Figura 8 Gráfico de silhueta e de ordenação das amostras das cascas dos frutos de 19 M. cauliflora cultivados nos solos S1 S5 de acordo com a técnica de c- means nebulosa. Figura 9 Distribuição das cascas dos frutos de M. cauliflora nas classes pela análise 20 de discriminante com as variáveis representadas por vetores a partir da origem. As cruzes representam os baricentros das classes, definidas de acordo com o solo de origem das amostras (S1 S5). Figura 10 Variograma com indicadores da variância estruturada no espaço ao longo da 42 distância. Figura 11 Correlação entre matrizes de distância dos metabólitos (sementes) e 44 geográfica. Figura 12 Variações nos metabólitos, nos parâmetros de cor e nos nutrientes minerais 45 da semente de jabuticaba em função dos solos, além dos preditores espaciais na área de estudo. Figura 13 Autovetores dos MEM de acordo com a classe geradora. 47 Figura 14 Triplot da RDA dos metabólitos das sementes nos locais S1-S5 com as 47 variáveis explicativas e preditores espaciais, MEM e polinomial (X 3 ). Figura 15 Triplot do primeiro e teceiro eixo da RDA dos metabólitos das sementes nos 48 locais S1-S5 com as variáveis explicativas e preditores espaciais, MEM. Figura 16 Frações do particionamento da variação dos metabólitos da semente de 49 jabuticaba pelos preditores dos nutrientes e polinomial. Figura 17 Frações do particionamento da variação dos metabólitos da semente de jabuticaba pelos preditores dos nutrientes e MEM. 50 iii

10 Figura 18 Variogramas da RDA1 e RDA2 das sementes de jabuticaba modeladas pelos 52 MEM. Figura 19 (A) Mapas de distribuição espacial dos metabólitos de jabuticaba de acordo 53 com os modelos ajustados provenientes das RDA1 e RDA2. (B) Mapas dos MEM nos sítios de coleta. Figura 20 Validação dos modelos por meio de da técnica de validação cruzada. 55 Figura 21 Imagem aérea do local de amostragem na Fazenda e Vinícola Jabuticabal. 55 Figura 22 Variograma multivariado da variância total dos metabólitos da semente. 57 Figura 23 Variograma multivariado dos metabólitos explicados pelos nutrientes das 58 sementes e dos solos. Figura 24 Variograma multivariado dos metabólitos explicados pelos nutrientes das 59 sementes e dos solos e dos MEM. Figura 25 Variograma multivariado dos metabólitos explicados pelos nutrientes das sementes e dos solos, após a remoção da estrutura espacial explicada pelos MEM e pelo monômio X Lista de Tabelas Página Tabela 1 Parâmetros físico-químicos dos solos de cultivo dos frutos de M. cauliflora. 9 Tabela 2 Teores a químicos de parte dos frutos de M. cauliflora de acordo com o solo 10 de cultivo das jabuticabeiras na Fazenda e vinícula Jabuticabal, Nova Fátima/GO. Tabela 3 Teores a dos minerais das sementes e cascas dos frutos de M. cauliflora. 11 Tabela 4 Sumário do particionamento da variação dos metabólitos das cascas e 13 sementes de frutos de M. cauliflora por meio de RDAs parciais. Tabela 5 Sumário da análise de discriminante para as amostras de sementes dos 16 frutos de M. cauliflora. Tabela 6 Sumário do particionamento da variação dos metabólitos das sementes dos 17 frutos de M. cauliflora. Tabela 7 Sumário da análise de discriminante das cascas dos frutos de M. cauliflora. 20 Tabela 8 Sumário do particionamento da variação dos metabólitos das cascas dos 21 frutos de M. cauliflora. Tabela 9 ANOVA dos metabólitos a da casca e semente de jabuticabas de acordo com 22 as classes. Tabela 10 ANOVA dos nutrientes da casca e semente de jabuticabas de acordo com as 22 classes. Tabela 11 ANOVA dos nutrientes do solo dos locais amostrados de acordo com as 23 classes. Tabela 12 Classes de geração de mapas de autovalores de Moran (MEM). 41 Tabela 13 MEM selecionados com base no critério de AIC de acordo com a classe 46 geradora. Tabela 14 Parâmetros modelados para os variogramas dos metabólitos das sementes de M. cauliflora. 51 iv

11 Lista de Abreviaturas AIC c Akaike information criterion (critério de informação de Akaike corrigido) ANOVA Analysis of variance (análise de variância) CA Correspondence analysis (análise de correspondência) CCA Canonical correspondence analysis (análise de correspondência canônica) CDA Canonical discriminant analysis (análise de discriminante canônica) CTC Capacidade de troca catiônica D Distância dmax Distância máxima DCA Detrended correspondence analysis (análise de correspondência destendenciada) 2 D E Distância Euclidiana quadrática dbmem Distance-based eigenvector maps (mapas de autovetores baseados em distância) F Razão de Fisher-Snedecor G/F Razão glicose/frutose GL Graus de liberdade HCA Hierarchical cluster analysis (análise de agrupamento hierárquica) HDL High density lipoprotein (lipoproteína de alta densidade) HPLC-DAD High performance liquid chromatography-diode array detector (cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por arranjo de diodos) LC-TOF/MS Liquid chromatography-time of flight/mass spectrometry (cromatografia líquida com detecção por espectrometria de massas por tempo de vôo) MEM Moran s eigenvector maps (mapas de autovetores de Moran) MO Matéria orgânica MSO Multiscale ordenation (ordenação em multiescala) P Nível de significância PCA Principal component analysis (análise de componentes principais) PCNM Principal coordinates of neighbour matrices (coordenadas principais de matrizes vizinhas prda Partial redundancy analysis (análise de redundância canônica parcial) Q Variância estrutural (no espaço) R 2 adj Coeficiente de determinação ajustado RDA Redundancy analysis (análise de redundância canônica) SD Standard deviation (desvio padrão) Ton Tonelada UTM Universal transversa de Mercator (sistema de coordenadas geográficas métricas) VIF Variance inflaction factor (fator de inflação da variância da variável) v

12 Resumo Variações na composição química de metabólitos podem ser explicadas por fatores genéticos ou ambientais. No entanto, processos como o crescimento, reprodução, dispersão, evolução, relação predador-presa, herbivoria, entre outros, podem influenciar na distribuição de metabólitos ao longo do espaço (coordenadas geográficas). Essas características espaciais são geralmente negligenciadas, apesar da importância do espaço em processos químico-ecológicos. Assim a estrutura espacial pode afetar a disponibilidade nutricional, o teor e qualidade de metabólitos ao longo de um gradiente geográfico, afetando a utilização de subprodutos derivados de plantas os quais podem apresentar características químicas de alto valor agregado. Estudos prévios indicaram uma forte influência ambiental nos teores fenólicos, enquanto que a influência genética dominou a variação de óleos essenciais em jabuticabas. Neste trabalho foram avaliadas as influências do solo de cultivo e de nutrientes minerais das sementes e cascas de frutos de jabuticabeiras, importantes para as propriedades sensoriais do vinho e outros produtos da cadeia produtiva da jabuticaba. Os frutos foram coletados em cinco tipos de solos da Fazenda Jaboticabal, em Nova Fátima/GO. As sementes e cascas dos frutos foram analisadas quanto aos metabólitos primários, teores de compostos fenólicos, além de nutrientes minerais, em adição à textura e nutrientes do solo de cultivo das amostras. Os resultados indicaram que os metabólitos são mais adequadamente explicados quando analisados separadamente, para sementes e cascas, o que reflete diferenças marcantes na qualidade e teor de alguns metabólitos nas partes dos frutos. O Mn 2+ se destacou entre os nutrientes minerais tanto do solo de cultivo quanto no tipo de amostra, enquanto o Cu 2+ e o fósforo tiveram destaques diferenciados na explicação dos metabólitos das sementes e cascas, respectivamente. Os parâmetros nutricionais foram os mais importantes na explicação da variabilidade dos metabólitos nas sementes, enquanto que os minerais relacionados aos solos de cultivo apresentaram maior influência para as cascas. Em ambos os casos as amostras conduziram à formação de três agrupamentos, porém com diferenças de acordo com o solo de cultivo dos frutos. Uma maior variação nos teores dos metabólitos entre as classes foram observados em amostras de cascas (77%), quando comparadas às de sementes (47%). Os solos mais arenosos (valor médio de areia, 490 g/kg) com baixos níveis de nutrientes apresentaram altos teores (g/100 g fruto seco) de taninos (0,69), antocianinas (0,54) e fenóis totais (2,91), além de pedunculagina (0,04), enquanto as sementes provenientes de solos com maior ph e níveis mais elevados de P (4,6 mg/dm 3 ), Ca 2+ (1,7 cmol c/dm 3 ), Mg 2+ (0,4 cmol c/dm 3 ), Fe 3+ (215,4 mg/dm 3 ), Mn 2+ (37,0 mg/dm 3 ) e Zn 2+ (1,4 mg/dm 3 ) apresentaram os maiores teores (g/100 g fruto seco) em ácido elágico (0,09), vescalagina (2,9) e castalagina (2,4). Dessa forma, os frutos produzidos nos solos arenosos mais pobres se mostraram adequados para a fabricação de vinhos e sucos por conterem propriedades sensoriais valorizados como altos teores de pigmentos (antocianinas), fenóis totais e taninos nas cascas, enquanto as sementes de frutos cultivados em solos arenosos-argilosos, mais ricos em nutrientes, são indicadas como matéria-prima para a indústria farmacêutica ou alimentícia, como fonte de ingredientes funcionais por apresentarem os maiores teores de vescalagina e castalagina. Esses resultados mostram que a distribuição dos metabólitos do fruto pode mudar drasticamente de acordo com o órgão ou tecido envolvido, além do tipo de solo de cultivo das amostras. A influência espacial também se mostrou um importante preditor na variabilidade dos metabólitos, explicando aproximadamente 16% de influência pura e 45%, quando sobreposta a outros efeitos explicativos da variabilidade química. A divergência espacial entre os locais de coleta para as sementes foi correlacionada com a distância geográfica, sugerindo ecótipos diferentes. Dessa forma, as agroindústrias familiares rurais devem concentrar esforços nas condições locais de cultivo e no padrão nutricional das jabuticabeiras para uma melhor qualidade química de subprodutos derivados de frutos de jabuticaba. vi

13 Palavras-chave: Myrciaria cauliflora; Análise Multivariada; Variabilidade Química;Polifenóis. Abstract Variations in the metabolite compositions can be explained by genetic or environmental factors. However, natural processes such as growth, dispersion, reproduction, evolution, predatorprey relationship, herbivory among others, can influence the spatial distribution of metabolites (geographic coordinates). These spatial characteristics are generally neglected, despite the importance of space in chemical-ecological processes. These factors affecting the plants derived products which may have potential chemical characteristics. Previous studies indicated a strong environmental influence on phenolic contents, while essential oils mainly reflected a genetic influence on jabuticaba. This work investigated the influence of mineral nutrients from soils, seeds and fruit peels of jabuticaba, important for the sensorial properties of wine and other products of the jabuticaba productive chain. The fruits were collected in five soil types of Jaboticabal Farm, in Nova Fatima/GO. Seeds and fruit peels were analyzed for primary metabolites, phenolic contents, and mineral nutrients, in addition to soil texture and nutrients. The results indicated that metabolites are more adequately explained when analyzed separately for seeds and peels, which reflects marked differences in the quality and metabolites contents in the fruit parts. Among the mineral nutrients the Mn 2+ was important for both soil and fruit parts, while Cu 2+ and phosphorus had different influences in the seeds and fruit peels metabolites, respectively. The nutritional parameters were the most important in explaining the metabolite variability in the seeds, while for the peels, the minerals related to the cultivated soils presented greater influence. In both cases, each type of sample led to the formation of three clusters, but with differences according to the soil origin of the fruits. A higher variation in metabolite content was observed in fruit peels (77%) when compared to seed samples (47%). Tannins (0.69 g/100 g dry fruit), anthocyanins (0.54) and total phenols (2.91), as well as pedunculagin (0.04) were the most metabolites in sandy soils (average value of sand, 490 g/kg) with low levels of nutrients, while seeds from soils with higher ph and higher levels of de P (4,6 mg/dm 3 ), Ca 2+ (1,7 cmol c/dm 3 ), Mg 2+ (0,4 cmol c/dm 3 ), Fe 3+ (215,4 mg/dm 3 ), Mn 2+ (37,0 mg/dm 3 ) and Zn 2+ (1,4 mg/dm 3 ) showed high contents (g/100 g dry fruit) of ellagic acid (0.09), vescalagin (2.9), and castalagin (2.4). Thus, fruits produced in the poorer sandy soils proved to be suitable for the wines and juices production because they contain valued sensorial properties as high pigment (anthocyanins), total phenols and tannins in the peels, while the fruit seeds cultivated in sandy-loamy soils rich in nutrients are indicated as raw material for the pharmaceutical or food industry as a source of functional ingredients according to highest levels of vescalagin and castalagin. These results show that the distribution pattern of the fruit metabolites can change drastically according to the organ or tissue involved (seeds and peels), as well as the soil cultivation type. Spatial influence was also important in predicting the content and metabolite variability, explaining approximately 16% of pure influence and 45% when superimposed on other explaining effects of the chemical variability. This chemical divergence between the sampling sites is correlated with the geographical distance for the fruit s seeds, suggesting different ecotypes. Thus, the rural agroindustries should concentrate efforts on the local cultivation conditions and nutritional characteristics of the jabuticabeiras for a better chemical quality of products derived from jabuticaba. Keywords: Myrciaria Cauliflora; Multivariate Analysis; Chemical Variability; Polyphenols vii

14 Capítulo 1 Influência do Solo de Cultivo nos Metabólitos das Cascas e Sementes dos Frutos de Jabuticabeiras (Myrciaria cauliflora (Mart.) O. Berg) 1

15 1.1. Introdução A jabuticabeira (Myrciaria cauliflora (Mart.) O. Berg, M. jaboticaba (Vell.) O. Berg; Myrtaceae) é uma árvore nativa do Brasil e encontrada principalmente na região centro-sul (Oliveira et al., 2003), mas já se encontram cultivos na Flórida/EUA e em países das Américas Central e do Sul (Balerdi et al., 2006). Os frutos contêm uma polpa suculenta de sabor doce e pouco adstringente, apropriados para o consumo in natura, produções artesanais e utilizações industriais diversas como na fabricação de sucos, sorvetes, licores, aguardente, geleias, vinhos, vinagre, compotas e outros (Wu et al., 2013). Como o fruto é altamente perecível, decorridos dois dias do amadurecimento, iniciam-se os processos de alterações em seu sabor e aparência, ocorrendo perdas intensas de água, deterioração e fermentação da polpa (Lima et al., 2008). Devido a esses fatores o aproveitamento da jabuticaba, durante anos, foi realizado em um curto período pós-colheita. Essa situação ainda persiste, embora tecnologias como a liofilização no processamento do fruto e/ou da casca, na forma de pó, têm permitindo o consumo em qualquer época do ano (Faria et al., 2016), ou na obtenção de extratos secos (spray-drying) de cascas e sementes residuais como fonte alternativa de ingredientes na indústria de alimentos (Borges et al., 2017; Souza et al., 2017). Uma grande quantidade de frutos é produzida em todo país e apenas a Companhia de Entrepostos e Armazéns Gerais de São Paulo (Ceagesp) registrou um aumento de 900 ton/ano para 4 milhões ton/ano entre os anos de 1980 e 1988 (Donadio, 2000). Dados mais recentes apontam uma comercialização de 2,5 milhões de ton/ano, movimentando cerca de R$ 20 milhões (Watanabe & Oliveira, 2014). Apesar desses ganhos, a comercialização ainda gera uma grande quantidade de frações desperdiçadas especialmente da casca e da semente e que juntas podem representar quase 50% do fruto (Crozier et al., 2009; Morales et al., 2016). Com respeito à composição química dos frutos foram isolados depsídeos e antocianinas (Reynertson et al., 2006; Wu et al., 2013). Nos últimos cinco anos, sete taninos hidrolizáveis (elagitaninos) foram detectados e tentativamente identificados com base em LC-TOF/MS (Alezandro et al., 2013; Plaza et al., 2016), embora não tenham apresentado consistência com outros estudos que utilizaram técnicas tradicionais de isolamento e identificação (Pereira et al., 2017; Wu et al., 2012; Wu et al., 2013). Em outro estudo, oito elagitaninos, incluindo a inédita cauliflorina (1), e seis polifenóis foram isolados e identificados (Pereira et al., 2017). Na jabuticaba os polifenóis estão relacionados a benefícios para a saúde, devido ao grande potencial anti-inflamatório e ação antioxidante; em aumentar os níveis de colesterol HDL e melhorar a resistência à insulina em estudos in vivo; apresentar efeito antiproliferativo frente a células tumorais e demonstrar atividade anticâncer, antibacteriana, bem como ação hepatoprotetora e em induzir maior resistência à degradação de colágeno (Wu et al., 2013). Devese destacar que o extrato liofilizado dos frutos apresentou ação hipoglicemiante e redução do estresse oxidativo em ratos diabéticos do tipo 2 (Hsu et al., 2016). 2

16 Estudos prévios indicaram que as alterações na composição química em polifenóis foram influenciadas mais pela parte do fruto do que pelo seu grau de maturidade (Pereira et al., 2017). Os elagitaninos pedunculagina (2), castalagina (3) e vescalagina (4) (Figura 1), bem como os ácidos gálico (5) e elágico (6) concentraram-se principalmente nas sementes, enquanto cauliflorina (1) e antocianinas (7 e 8) acumularam-se nas cascas. Figura 1. Elagitaninos (1-4), ácidos fenólicos (5, 6) e antocianinas (7, 8) de jabuticaba. HO HO HO 6' O 1' OH C OH OH O O HO HO Ácido gálico (5) 6' 5' COOH OH B A 1' 1' OH 3' 3' HO O O O HO Cauliflorina (1) O O OH O O OH Ácido elágico (6) 6 O OH O 1 OH OH HO HO HO HO HO OH OH OH HO O O HO O O Pedunculagina (2) O O O O OH O OHHO Glicose OH R O O OH OH OH HO HO HO HO OH HO O O O O OH HO OH Cianidina-3-glicose (7) R = H Delfinidina-3-glicose (8) R = OH O O O OH O O OH O HO OH R2 R1 OH OH Castalagina (3) R1 = H, R2 = OH Vescalagina (4) R1 = OH, R2 = H Esses resultados demonstram o potencial químico-biológico dessas partes dos frutos, ainda negligenciadas, e a importância de estudos adicionais acerca da variabilidade desses constituintes em diferentes condições de cultivo da espécie. As cascas de jabuticabas são utilizadas na medicina popular no tratamento de hemoptises, inflamação de garganta, tosse, bronquites e asma (Wu et al., 2013). Embora não sejam amplamente consumidas, as cascas apresentam teores elevados de compostos da classe dos flavonoides, polifenóis e antocianinas, cuja produção pelas plantas é frequentemente relacionada à disponibilidade de luz e nutrientes (Murugesan et al., 2012). A coloração da casca da jabuticaba se deve à presença de antocianinas (Figura 1), especialmente cianidina-3-glicose (7) e delfinidina- 3-glicose (8), as quais atraem diferentes animais que dispersam as sementes, garantindo a continuidade e perpetuação da espécie, o que evidencia a sua importância químico-ecológica (Kong et al., 2003). Algumas metodologias têm sido introduzidas para melhorar o aproveitamento da casca da jabuticaba, como na forma de ingrediente em leites fermentados probióticos, devido à riqueza em fibras e de compostos antioxidantes (Faria et al., 2016). Compostos polifenólicos das cascas, identificados por meio de LC/MS, alteraram o metabolismo da glicose em ensaios clínicos piloto em decorrência da ação antioxidante (Plaza et al., 2016). A casca também contém em sua composição lipídeos, proteínas, carboidratos e metais como cobre, ferro, magnésio, zinco, fósforo, potássio, cálcio e manganês (Duarte, 2009; Fortes et al., 2012; Pereira et al., 2017). 3

17 Por outro lado, as sementes de jabuticaba apresentam elagitaninos com um alto potencial anti-inflamatório e que também auxiliam na prevenção contra a obesidade (Cunha, 2016). O extrato parcialmente purificado das sementes apresentou pronunciada atividade antimicrobiana frente a bactérias Gram-positivas e Gram-negativas (Hacke et al., 2016). Em adição, o extrato aquoso das sementes, rico em vescalagina, catalagina e pedunculagina, apresentou ação quimiopreventiva e reparadora de danos no DNA, induzida por ciclofosfamida, em ensaios de genotoxicidade em ratos (Silva et al., 2016). A pedunculagina, isolada das sementes, apresentou tanto ação antigenotóxica quanto estimuladora do sistema de reparo do DNA. A menor dosagem para a observação desses efeitos seria equivalente ao consumo de 332 g de jabuticabas para uma pessoa de 70 kg. As sementes também apresentam consideráveis teores de lipídeos, sendo economicamente vantajosas para extração de óleos fixos que podem ser utilizados na fabricação de produtos farmacêuticos e cosméticos de forma análoga às sementes de maracujá e goiaba (Kobori & Jorge, 2005). Os teores de carboidratos nas sementes de jabuticabas permitem a sua incorporação nas farinhas fabricadas para o enriquecimento de pães, biscoitos e outros produtos (Ferreira et al., 2012). Similar às cascas, as sementes também são ricas em metais como manganês, ferro, zinco, cobre, potássio, cálcio e fósforo, entre outros. Esses elementos são componentes estruturais e estão envolvidos em uma série de funções metabólicas. De forma geral, os metais são encontrados em todo o fruto de jabuticaba e o consumo de 100 g de polpa fresca pode contribuir com 17% do requerido para Mg 2+, 15% de K + e de 4% do Ca 2+ para a dieta de um adulto (Seraglio et al., 2018). Além de seus aspectos nutricionais, os minerais estão relacionados às rotas de síntese de muitos metabólitos especiais, atuando, por exemplo, como cofatores enzimáticos na biossíntese de compostos polifenólicos e terpenos dos óleos essenciais dos frutos (Duarte et al., 2010; 2012; Picaud et al., 2005; Picaud et al., 2006). Neste trabalho, polifenóis e outros metabólitos, além dos constituintes da composição centesimal e parâmetros de coloração das cascas e sementes dos frutos de jabuticaba foram investigados quanto ao padrão de variabilidade química, inclusive espacial, por meio de métodos estatísticos uni e multivariados. Espera-se que um melhor conhecimento acerca das influências ambientais e espaciais na composição e variabilidade química dos metabólitos das cascas e sementes de jabuticaba possa permitir um maior aproveitamento dos rejeitos da agroindústria, como fonte potencial de compostos biologicamente importantes, seja como ingredientes funcionais em alimentos ou como nutracêuticos derivados de frutos, até o momento de pouco destaque na cadeia produtiva dessa fruta Objetivo Geral Correlacionar a variabilidade de metabólitos, teores nutricionais e parâmetros físicoquímicos, obtidos de cascas e sementes de frutos de jabuticaba, com a composição química do 4

18 solo de cultivo das amostras coletadas na Fazenda e Vinícola Jabuticabal, no município de Nova Fátima/GO Objetivos Específicos Analisar o padrão de variabilidade química nos teores de fenóis, taninos, flavonoides e antocianinas totais; de sete polifenóis (castalagina, vescalagina, pedunculagina, ácidos gálico e elágico, cianidina-3-glicose e delfinidina-3-glicose), em adição a quatro metabólitos primários (sacarose, glicose, frutose e ácido cítrico), de sete constituintes da composição centesimal (lipídeos, proteínas, carboidratos, fibras solúveis e insolúveis, cinzas e umidade), além de dois parâmetros físico (índice de cor e tonalidade) nas cascas e sementes dos frutos de M. cauliflora, cultivadas em cinco tipos de solos na Fazenda Jabuticabal, em Nova Fátima/GO. Correlacionar os teores das classes químicas e metabólitos, nas cascas e sementes dos frutos de jabuticaba, com a textura e os nutrientes minerais dos solos de cultivo das amostras. Pretende-se, efetuar o particionamento da variação total explicada da composição química em três conjuntos de variáveis preditoras: nutrientes minerais da parte do fruto (descritor químico), nutrientes minerais do solo (descritor ambiental) e um conjunto de variáveis representando a localização geográfica das amostras nos pomares da Fazenda Jabuticabal (descritor espacial) Experimental Amostragem e Análises Químicas Parte dos dados utilizados na análise multivariada neste trabalho foi gentilmente cedido pela Profa. Dra. Luciane Dias Pereira do Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia de Goiás, Campus Anápolis, Anápolis/GO, como parte da Tese de Doutorado em Química do Instituto de Química da Universidade Federal de Goiás, IQ/UFG (Pereira, 2016). Outra parte dos dados foi gentilmente cedida pela Profa. Dra. Suzana da Costa Santos do IQ/UFG. Resumidamente, as amostras de cascas e sementes foram obtidas de frutos, da safra de 2013, provenientes de cinco jabuticabeiras cultivadas em cada um dos cinco pomares, de características edáficas distintas, da Fazenda Jabuticabal, em Nova Fátima/GO. As cascas e sementes foram trituradas, liofilizadas e extraídas com EtOH:HCl (9:1) e MeOH:H 2O (1:1), respectivamente, em banho de ultrassom. Os extratos foram analisados quanto aos teores de fenóis totais, taninos, flavonóides e antocianinas totais, índice de cor e tonalidade. As análises quantitativas dos elagitaninos e ácidos fenólicos foram realizadas por meio de cromatografia líquida de alta eficiência com detecção de arranjo de diodos, HPLC-DAD (Pereira et al., 2017). Para a determinação da composição química centesimal as cascas e as sementes foram secas, trituradas e analisadas quanto aos parâmetros de umidade e teores de lipídeos, cinzas, proteínas, níveis de fibras alimentares (solúvel e insolúvel) e carboidratos, segundo as recomendações da Association of Official Analytical Chemists (2006). Açúcares (glicose, frutose e 5

19 sacarose) e ácido cítrico foram quantificados pela técnica de RMN 1 H quantitativo descrito em Pereira et al. (2017). Para a análise dos macro e micronutrientes das amostras foi utilizada a espectrometria de absorção atômica (Ca 2+, Mg 2+, Cu 2+, Fe 3+, Mn 2+ e Zn 2+ ), espectrometria na região do visível (P) e espectrometria de emissão em chama (K + ). A análise dos nutrientes utilizou a metodologia da EMBRAPA (1997) e foi realizada no Laboratório de Análise de Solos da Escola de Agronomia da Universidade Federal de Goiás-EA/UFG. Amostras de solo de cinco pomares da Fazenda Jabuticabal foram secas e peneiradas (2 mm) separadamente e a porção mais fina (< 2 mm) foi submetida à análise físico-química. A textura do solo (argila, silte e areia), matéria orgânica (MO), capacidade de troca catiônica (CTC) e o potencial de acidez (H+Al) foram determinados pelos métodos habituais (Silva, 1999). O ph foi determinado em um volume de água-solo na razão 1:1. Os íons Ca 2+, Mg 2+ e Al 3+ foram extraídos com KCl 1,0 mol L -1, enquanto que P, K +, Cu 2+, Fe 3+, Mn 2+ e Zn 2+ foram extraídos com solução Mehlich. As análises foram realizadas de forma similar ao dos nutrientes foliares no Laboratório de Análise de Solos da EA/UFG Análises Estatísticas Os valores das médias em todas as análises foram comparados utilizando-se a análise de variância (ANOVA). A homocedasticidade das variâncias foi verificada com o uso do teste de Hartley. Nos casos em que se revelaram desvios significativos da hipótese nula as variáveis foram submetidas a alguma transformação (angular, log(y+1), y ½ ou pela ordem dos mesmos). Onde as diferenças entre as médias foram estabelecidas na ANOVA, aplicou-se o teste de Tukey para a comparação das médias dos tratamentos. Os resultados são apresentados como valores médios e desvio padrão em alguns casos. Valores de p < 0,05 foram considerados significativos. As análises foram efetuadas no programa SAS (Statistical Analysis Systems, versão 6.12, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA, 1996). Para a análise multivariada os dados químicos foram organizados, inicialmente, em duas matrizes: resposta e explicativa. A matriz de resposta (30 24) foi formada pelas 30 amostras (15 amostras por parte do fruto) nas linhas e os 24 teores químicos, como variáveis, nas colunas. A matriz explicativa (30 24) conteve as mesmas 30 amostras de cascas e sementes nas linhas e os nutrientes do solo (14 parâmetros) e das partes do fruto (oito parâmetros), em adição a uma variável categórica dicotômica (parte do fruto: semente ou casca), nas colunas. Para escolha do método de análise (linear ou unimodal) utilizou-se o comprimento do gradiente das variáveis da matriz explicativa em unidades de desvio padrão (SD), obtido por meio da análise de correspondência destendenciada (DCA). Essa análise avalia a magnitude da dispersão na matriz resposta em relação à matriz explicativa ao longo do primeiro eixo de ordenação multivariado. Neste estudo, obteve-se o valor de gradiente igual a uma (1,0) unidade 6

20 de desvio padrão, sendo considerado uniforme (linear). Dessa forma, utilizou-se a análise de redundância canônica (RDA), a qual se assemelha a uma análise de componentes principais (PCA) condicionada, onde a matriz de dados explicativa condiciona o posicionamento das variáveis na matriz resposta (Lepš & Šmilauer, 2007). Os testes de permutação de Monte Carlo irrestritos (999 permutações) foram utilizados para avaliar a significância dos autovalores ou eixos canônicos obtidos pela RDA. Em todas as análises, o coeficiente de determinação ajustado pelos graus de liberdade (R 2 adj) e o fator de inflação da variância da variável (VIF = 1/(1-R 2 ajustado)) foram utilizados para guiar a seleção das variáveis explicativas, evitando-se a multicolinearidade nas regressões multivariadas. Valores de VIF 20 foram considerados multicolineares (Lepš & Šmilauer, 2007). Em decorrência do primeiro eixo de ordenação captar a grande maioria da variação total dos dados (96,3%), separando as amostras provenientes das cascas e das sementes, optou-se por efetuar a RDA por parte do fruto, para uma melhor caracterização de fatores secundários que influenciam na variabilidade química das amostras. Dessa forma, cada matriz original foi desmembrada de acordo com a parte do fruto. Os dados das cascas forneceram uma matriz de resposta (15 22) formada pelas 15 amostras nas linhas e os 22 teores químicos, como variáveis nas colunas. A matriz explicativa (15 22) conteve as mesmas 15 amostras de cascas, nas linhas, e os nutrientes do solo (14 parâmetros) e das cascas (oito parâmetros), nas colunas. Alternativamente, as amostras das sementes conduziram a uma matriz de resposta (15 17) formada pelas 15 amostras nas linhas e os 17 teores químicos, como variáveis nas colunas e uma matriz explicativa (15 22) com as mesmas 15 amostras de sementes nas linhas e os nutrientes do solo (14 parâmetros) e das sementes (oito parâmetros), nas colunas. Ambas as matrizes respostas foram submetidas à RDA em decorrência do comportamento linear nas DCAs. O algoritmo de lógica nebulosa (fuzzy) c-means (Rousseeuw, 1987; Kaufman & Rousseeuw, 1990) foi utilizado para detectar o agrupamento natural das amostras e suas relações intra e intergrupos. Esta técnica baseia-se na minimização da soma dos quadrados dos desvios das observações dentro dos agrupamentos em relação a uma amostra representativa mais próxima. O coeficiente de partição normalizado (coeficiente de Dunn) foi utilizado para medir o grau de partição do conjunto. Para avaliar a consistência interna da composição dos agrupamentos, cada amostra foi associada a uma pequena "estrela" cujos segmentos são proporcionais ao seu coeficiente de associação. O gráfico de silhueta foi utilizado como metodologia de interpretação da consistência dentro das classes formadas pelo algoritmo c- means. O valor da silhueta é uma medida de como o objeto é semelhante à própria classe em relação a outras classes (Rousseeuw, 1987). A validação da técnica de agrupamento foi baseada na análise de discriminante canônica (CDA), com os agrupamentos (classes) como a variável de resposta e os teores químicos como 7

21 variáveis explicativas. A capacidade preditiva das funções discriminantes foi avaliada pela técnica de reamostragem de Jackknife. Em adição às técnicas anteriores, o particionamento da variação explicada foi obtido por meio de RDA parciais (prdas), utilizando cada matriz explicativa reordenada em três conjuntos de variáveis preditoras: nutrientes minerais da parte do fruto (químico), nutrientes do solo de origem das amostras (ambiental) e a parte do fruto (casca ou semente), ou em certas ocasiões, a localização geográfica das amostras nos pomares (influência espacial). Os dados espaciais consistiram das coordenadas geográficas métricas do sistema Universal Transverso de Mercator (UTM; norte, leste e altitude) das amostras, os quais foram sumarizados pelos dois primeiros eixos fatoriais de uma PCA, e que representaram as novas coordenadas x (este) e y (norte). A superfície espacial foi obtida com essas novas coordenadas x e y, com a adição de todos os termos de uma equação polinomial de terceiro grau completa (x 3 +x 2 +x+y 3 +y 2 +y+x 2 y+xy 2 +xy), sumarizarando as tendências de gradientes espaciais lineares e de superficies complexas que exigem os termos quadráticos e cúbicos. Os parâmetros significativos em cada conjunto de variáveis preditoras foram selecionados pelo procedimento de seleção progressiva de variáveis, com o nível de significância ajustado pela correção de Bonferroni (k = 0,05/n, onde n o número de variáveis e k a significância ajustada) e utilizando o VIF da variável como critérios para avaliar a multicolinearidade nas regressões múltiplas (Lepš & Šmilauer, 2007; Ter Braak & Šmilauer, 2012). O particionamento da variação explicada resultou em diferentes frações de variação sem ou com a sobreposição entre os conjuntos preditores (Borcard et. al., 1992; Legendre & Legendre, 2003). Antes da análise multivariada, os dados foram pré-processados: a matriz resposta foi transformada para log(x+1) e centrada na média, enquanto a matriz explicativa foi autoescalonada com a finalidade de transformar as variáveis explicativas em preditoras adimensionais. As análises multivariadas foram conduzidas no programa Canoco (Canonical Community Ordination, versão 5.0, Biometrics, The Netherlands, 2012) e no programa R, versão (R Core Team, 2014) Resultados Análise das Amostras das Sementes e das Cascas Inicialmente foi conduzida a análise de variância dos dados obtidos utilizando a parte do fruto (casca e semente) e os cinco solos de cultivo (Tabela 1) como fatores na ANOVA. O solo S1 (Franco-Argiloso), pouco fértil e com alto teor de Al 3+, apresentou apenas a sacarose, exclusivamente nas sementes, como variável de destaque (Tabela 2). Os solos S2 (Franco-Argiloso-Arenoso) e S3 (Argilo-Arenoso) com altos teores de areia, Fe 3+ e Mn 2+, mas com baixo K +, apresentaram teores elevados em metabólitos primários nas cascas e elagitaninos nas sementes (Tabela 2). Por outro lado, os solos argilosos S4 e S5, com mais baixos níveis de Mg 2+ e 8

22 Fe 3+, mais rico em K +, conduziram a teores mais elevados em compostos fenólicos totais, relacionados às funções adaptativas frente a situações de estresses bióticos ou abióticos. Tabela 1. Parâmetros físico-químicos dos solos de cultivo dos frutos de M. cauliflora. Constituinte Solo de Cultivo S1 S2 S3 S4 S5 Argila (g/dm 3 ) Silte (g/dm 3 ) Areia (g/dm 3 ) Matéria orgânica (g/dm 3 ) 9,0 7,0 15,0 16,0 7,0 ph 4,0 4,2 4,7 4,2 4,0 Ca 2+ (cmol c/dm 3 ) 0,6 0,7 2,7 0,8 0,2 Mg 2+ (cmol c/dm 3 ) 0,3 0,3 0,5 0,2 0,1 K + (cmol c/dm 3 ) 0,09 0,07 0,07 0,09 0,09 K + (mg/dm 3 ) 36,0 29,0 29,0 34,0 36,0 P (mg/dm 3 ) 1,4 2,9 6,2 0,8 2,6 Cu 2+ (mg/dm 3 ) 1,3 1,1 2,2 1,3 1,9 Fe 3+ (mg/dm 3 ) 111,3 235,7 195,0 67,3 71,2 Mn 2+ (mg/dm 3 ) 20,2 27,2 46,8 3,8 27,0 Zn 2+ (mg/dm 3 ) 0,4 1,1 1,6 1,3 0,3 Al 3+ (cmol c/dm 3 ) 0,7 0,3 0 0,4 0,3 H+Al 3+ (cmol c/dm 3 ) 6,6 8,1 4,8 7,3 3,9 CTC (cmol c/dm 3 ) 7,6 9,2 8,1 8,4 4,3 A análise de variância dos dados obtidos utilizando a parte do fruto (casca e semente) e o solo de cultivo (S1-S5), sugeriu uma distinção qualitativa e quantitativa dos metabólitos das cascas e das sementes da jabuticaba (Tabela 2). As cascas apresentaram teores mais elevados do que nas sementes principalmente nas variáveis do metabolismo primário (lipídeos, proteínas, carboidratos, fibras, cinzas, glicose, frutose e ácido cítrico) além dos fenóis totais. Algumas variáveis, associadas ao metabolismo especial, ocorreram unicamente nesta parte do fruto, como as antocianinas, incluindo cianidina e delfinidina-3-glicose, além dos índices de cor e tonalidade. Neste estudo o ácido gálico e a pedunculagina foram detectados apenas nas cascas, apesar de também ocorrem nas sementes (Pereira et al., 2017). As sementes, por sua vez, se destacaram pelos teores mais elevados de umidade e metabólitos especiais como os taninos, ácido elágico e vescalagina, enquanto castalagina praticamente só ocorreu nesta parte do fruto. Resultados anteriores mostraram a preponderância de taninos e ácidos fenólicos nas sementes da jabuticaba (Pereira et al., 2017). Os teores de flavonoides totais foram quantificados somente nas sementes e sacarose só foi detectada nesta parte do fruto. As variáveis com ocorrências tanto nas cascas quanto nas sementes apresentaram diferenças significativas na interação entre os dois fatores, na ANOVA. Assim, em relação às cascas, os teores mais elevados de proteínas foram provenientes dos solos S2 e S4 (6,26 e 6,23 g/100 g, respectivamente); lipídeos (0,50 g/100 g) e fibras solúveis (5,49 g/100 g) preponderaram no solo S2; glicose (39,47 e 39,93 g/100 g), frutose (45,37 e 48,23 g/100 g) e ácido cítrico (28,65 e 9

23 Tabela 2. Teores 1 químicos das cascas e sementes de jabuticabas de acordo com o solo de cultivo dos frutos na Fazenda e vinícula Jabuticabal, Nova Fátima, Goiás. Constituinte Parte do Solo de Cultivo Fruto S1 S2 S3 S4 S5 Lipídeos 2 Semente 0,47 Ba 0,47 Ba 0,45 Bb 0,45 Bb 0,46 Bb Casca 0,48 Ac 0,50 Aa 0,47 Ad 0,46 Ad 0,49 Ab Proteínas 3 Semente 0,50 Ba 0,48 Bb 0,49 Bab 0,49 Bab 0,49 Bab Casca 5,64 Aab 6,26 Aa 5,76 Aab 6,23 Aa 5,15 Ab Carboidratos Semente 11,99 Bc 14,72 Ba 13,36 Bb 13,52 Bb 12,88 Bbc Casca 55,81 Ac 53,03 Ad 58,69 Aa 57,23 Ab 57,82 Aab Fibras solúveis Semente 0,50 Ba 0,49 Bc 0,50 Bb 0,49 Bb 0,50 Bb Casca 5,45 Ad 5,49 Aa 5,48 Ab 5,47 Ac 5,47 Ac Fibras insolúveis Semente 22,89 Bc 22,94 Ba 22,89 Bd 22,90 Bb 22,85 Be Casca 23,12 Ab 23,06 Ad 23,11 Ac 23,03 Ae 23,20 Aa Sacarose 4 Semente 2,78 a 1,45 c 1,20 c 2,11 b 2,33 ab Casca Cinzas 3 Semente 0,98 Bbc 0,98 Bd 0,99 Ba 0,99 Bab 0,98 Bcd Casca 4,74 Ac 4,80 Ab 4,80 Aa 4,87 Aa 4,71 Ac Glicose 4 Semente 3,67 Bbc 4,09 Bb 4,13 Bb 3,33 Bc 5,74 Ba Casca 32,13 Ab 39,47 Aa 39,93 Aa 21,80 Ac 37,00 Aa Frutose 2 Semente 3,14 Bbc 3,72 Bbc 4,27 Bb 2,83 Bc 6,84 Ba Casca 38,00 Ab 45,37 Aa 48,23 Aa 24,07 Ac 43,97 Aa Ácido cítrico 3 Semente 1,49 Bbc 1,57 Bab 1,59 Bab 1,19 Bd 2,31 Ba Casca 23,42 Aab 28,65 Aa 26,37 Aab 8,89 Ac 21,24 Abc Fenóis totais Semente 0,76 Bd 0,91 Bc 0,67 Be 1,57 Ba 1,42 Bb Casca 2,63 Ad 2,84 Ab 2,42 Ae 2,73 Ac 2,98 Aa Taninos totais Semente 0,77 Ad 0,96 Ac 0,66 Ae 1,27 Aa 1,06 Ab Casca 0,53 Bd 0,66 Bb 0,43 Be 0,58 Bc 0,72 Ba Flavonoides totais Semente 4,43 d 4,84 c 4,02 e 6,44 a 5,67 b Casca NA NA NA NA NA Antocianinas totais Semente Casca 0,43 c 0,51 b 0,39 d 0,43 c 0,56 a Ácido elágico Semente 0,06 Ad 0,08 Ab 0,10 Aa 0,08 Ab 0,07 Ac Casca 0,02 Bb 0,02 Bb 0,03 Bb 0,04 Ba 0,03 Bb Ácido gálico Semente Casca 0,01 b 0,01 b 0,01 a 0,01 b 0,01 b Vescalagina Semente 1,70 c 2,76 a 3,01 a 2,38 b 2,26 b Casca 0,01 b - 0,01 ab 0,01 a - Castalagina Semente 1,72 d 2,27 b 2,45 a 2,04 c 2,05 c Casca ,04 - Pedunculagina 2 Semente NA NA NA NA NA Casca 0,02 bc 0,03 b 0,02 bc 0,01 c 0,04 a Delfinidina-3- glicose 2 Semente Casca 0,06 c 0,14 a 0,06 bc 0,07 bc 0,09 b Cianidina-3- glicose 2 Semente Casca 0,27 b 0,53 a 0,32 b 0,34 b 0,37 b Umidade 3 Semente 24,74 Ad 27,97 Ab 31,01 Aa 27,14 Ac 14,52 Be Casca 18,35 Bb 20,48 Ba 15,63 Bd 15,24 Bd 16,88 Ac Índice de cor 3 Semente Casca 0,81 d 0,95 b 0,63 e 0,91 c 1,20 a Tonalidade Semente Casca 0,93 b 0,55 d 1,07 a 0,75 c 0,33 e 1 Baseado nos valores originais em triplicata (g/100 g massa seca). 2 Transformado pela raiz quadrada, 3 ordem dos mesmos (rank) ou 4 logaritmo na ANOVA. NA = não analisado. = não detectado. Médias seguidas pelas mesmas letras minúsculas nas linhas e letras maiúsculas nas colunas não diferem ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey. 10

24 26,37 g/100 g) apresentaram teores elevados nos solos S2 e S3; carboidratos (58,69 g/100 g) ocorreram principalmente no solo S3. Maiores teores de cinzas (4,80 e 4,87 g/100 g) concentraram-se em cascas dos solos S3 e S4, enquanto que as fibras insolúveis (23,20 g/100 g) e fenóis totais (2,98 g/100 g) preponderaram nas cascas dos frutos provenientes do solo S5, pobre em matéria orgânica e com mais baixa capacidade de troca catiônica (CTC). Entre as variáveis com ocorrência restrita às cascas, destacam-se a cianidina-3-glicose (0,14 g/100 g), preponderante no solo S2; ácido gálico (0,01 g/100 g) e tonalidade (1,07 g/100 g) no solo S3, enquanto que antocianinas totais (0,56 g/100 g), pedunculagina (0,04 g/100 g), índice de cor (1,20 g/100 g) e delfinidina-3-glicose (0,04 g/100 g) foram principalmente encontradas nas cascas provenientes do solo S5. Em relação às sementes, os teores de vescalagina (3,01 g/100 g), castalagina (2,45 g/100 g), ácido elágico (1,10 g/100 g) e umidade (31,01 g/100 g) foram predominantes em frutos cultivados no solo S3, enquanto que fenóis totais (1,57 g/100 g), taninos (1,27 g/100 g) e flavonoides (6,44 g/100 g) preponderaram naqueles originados do solo S4. Sacarose foi observada apenas nessa parte do fruto e principalmente nas sementes provenientes do solo S1 (2,78 g/100 g). Quanto aos nutrientes minerais presentes nos tecidos das amostras, K +, Mg 2+, Cu 2+ e Mn 2+ variaram de acordo com a parte do fruto e do solo de origem (Tabela 3). Tabela 3. Teores 1 dos minerais das sementes e cascas dos frutos de M. cauliflora. Mineral Parte do Fruto Solo S1 S2 S3 S4 S5 Ca 2+, 2 Semente 0,11 Ab 0,11 Aa 0,11 Ab 0,10 Ab 0,10 Ab Casca 0,12 Ab 0,13 Aa 0,12 Ab 0,10 Ab 0,11 Ab K +, 2 Semente 0,64 Bab 0,67 Bab 0,43 Bb 0,51 Bab 0,71 Aa Casca 1,41 Aa 1,21 Aa 1,26 Aa 0,70 Ab 0,85 Ab Mg 2+, 2 Semente 0,10 Aa 0,10 Aa 0,10 Aa 0,10 Aa 0,10 Aa Casca 0,06 Bab 0,07 Ba 0,07 Ba 0,05 Bb 0,05 Bb P 2 Semente 2,57 Aab 2,75 Aa 2,07 Aab 1,86 Ab 1,91 Aab Casca 1,70 Bab 1,94 Ba 1,74 Bab 1,43 Bb 1,86 Bab Cu 2+, 3 Semente 7,00 Ab 10,00 Aa 10,00 Aa 7,00 Ab 8,00 Ab Casca 2,33 Bc 4,00 Bb 4,33 Bab 5,67 Ba 5,00 Bab Fe 3+, 3 Semente 51,33 Bbc 61,00 Ba 60,33 Ba 54,67 Bab 53,33 Bc Casca 55,67 Abc 61,67 Aa 60,67 Aa 62,67 Aab 52,67 Ac Mn 2+, 3 Semente 17,33 Bc 25,00 Bb 22,00 Bb 30,67 Ba 8,00 Bd Casca 49,00 Ab 57,33 Aa 45,00 Ab 55,00 Aa 55,33 Aa Zn 2+, 3 Semente 15,60 Ab 16,90 Aa 17,80 Aab 13,77 Ab 16,10 Ab Casca 16,00 Ab 20,77 Aa 17,17 Aab 15,53 Ab 15,03 Ab 1 Baseado nos valores originais em triplicata. 2 (g/kg massa seca). 3 (mg/kg massa seca). Médias seguidas pela mesma letra minúscula nas linhas e maiúsculas nas colunas não diferem ao nível de 5% pelo teste de Tukey. Potássio e Mn 2+ destacaram-se nas cascas, principalmente dos frutos cultivados nos solos S1/S2/S3 e S4/S5, respectivamente, enquanto que os teores de Cu 2+ e Mg 2+ foram maiores nas 11

25 sementes, com o Cu 2+ ocorrendo principalmente nos solos S2 e S3. Não se observou qualquer influência do solo de cultivo para os teores de Mg 2+ nas sementes. Fósforo e Fe 3+ destacaram-se nas sementes e cascas, respectivamente, com ambos os nutrientes com os maiores teores no solo S2. Por sua vez, Ca 2+ e Zn 2+ não apresentaram diferenças significativas entre as partes do fruto, embora tenham ocorrido principalmente nos solos S4 e S2, respectivamente. O padrão multivariado dos metabólitos das amostras foi obtido pela análise de redundância canônica (RDA) dos teores químicos (matriz resposta, 30 24), condicionados pelos nutrientes minerais do solo e das partes do fruto (matriz explicativa; 30 24). Os resultados da RDA (Figura 2) indicaram que as correlações foram altas, entre as duas matrizes, para os dois primeiros eixos canônicos (R 1 = 0,998 e R 2 = 0,901) e com fatores de inflação da variância das variáveis considerados baixos (VIF < 2,44), sugerindo ausência de multicolinearidade no modelo de regressão multivariada (Lepš & Šmilauer, 2007). Figura 2. Plano da RDA com os metabólitos (setas azuis) da casca (quadrados) e semente (círculos) de jabuticaba explicado pela parte do fruto (semente) e de seus nutrientes minerais (K + ), além dos do solo (Mn 2+ ), representados por triângulo e setas vermelhas. Os frutos foram cultivados nos solos S1 (cinza), S2 (marrom), S3 (azul), S4 (preto) e S5 (verde). A variância explicada foi de 97,5% (R 2 adj = 97,3%; F-Fisher = 345; p = 0,001), com a RDA1 responsável pela quase totalidade dessa variação (96,3%; F = 681; p = 0,001) e representando a separação entre as duas partes dos frutos. A RDA2 (1,0%; F = 9,5; p = 0,001) separou as amostras em função do solo de cultivo. Apesar de a RDA contribuir significativamente para a compreensão dos dados, sugerindo uma forte influência da parte do fruto, seguida pelo efeito secundário do solo de cultivo, pouco se 12

26 pode deduzir sobre a importância de cada um deles para a variância explicada, ou seja, aqueles que envolvem as matrizes resposta e explicativa. Um método desenvolvido por Borcard et al. (1992) e aprimorado por Peres-Neto et al. (2006) conduziu ao particionamento da variação, avaliando a importância de cada subconjunto, com o auxílio de covariáveis e testando a significância dos eixos canônicos por permutações. No particionamento da variação pode-se excluir a influência de covariáveis antes de se avaliar a influência de outras variáveis explicativas, resultando em efeitos parciais. Neste trabalho, o particionamento foi realizado entre três subconjuntos preditores: parte do fruto (semente), nutrientes minerais das amostras (K + ) e do solo (Mn 2+ ), por meio de RDAs parciais (Figura 3). Figura 3. Frações puras (a c) e de sobreposição de efeitos (d g) do particionamento da variação dos metabólitos de M. cauliflora nos três subconjuntos preditores. Os resultados indicaram que a variação explicada na matriz resposta (97,5%; fração [a g], Tabela 4) forneceu um pequeno resíduo (2,5% ([h]). Tabela 4. Sumário do particionamento da variação dos metabólitos das cascas e sementes de frutos de M. cauliflora por meio de RDAs parciais. Efeitos e variáveis Covariáveis Fração da variação F P 1 Variação explicada (%) Efeito total Parte do fruto, nutriente mineral, solo de cultivo [a g] 97, ,01 Efeitos parciais Parte do fruto Nutriente mineral, [a] 37, ,01 solo de cultivo Parte do fruto [a+d+f+g] 95, ,01 Nutriente mineral Parte do fruto, [b] 0,6 5,9 0,01 solo de cultivo Nutriente mineral [b+d+e+g] 59,1 40,3 0,01 Solo de cultivo Parte do fruto, [c] 1,0 10,2 0,01 nutriente mineral Solo de cultivo [c+e+f+g] 1,4 0,4 0,56 Efeitos conjuntos Parte do fruto e nutriente mineral [d] 58,4 Solo de cultivo e nutriente mineral [e] 0,4 Parte do fruto e solo de cultivo [f] 0,3 Parte do fruto, nutriente mineral, solo de cultivo [g] 0,3 Resíduos [h] 2,5 1 Baseado sobre o teste de Monte Carlo (999 permutações). Preditores: Parte do fruto (semente); nutriente mineral da Parte do fruto (K + ) e do Solo de cultivo (Mn 2+ ). 13

27 Entre as contribuições puras, sem sobreposição, destacou-se a parte do fruto (37,3%; [a]). As outras duas, envolvendo os nutrientes minerais do solo (1,0%; [c]) e das partes do fruto (0,6%; [b]), embora com pequenas contribuições, apresentaram-se significativas (p = 0,01). No entanto, a contribuição total do nutriente mineral do solo (1,4%; [c+e+f+g]) não foi significativo (p = 0,56). Esse resultado está de acordo com a pequena influência do solo de cultivo observado na RDA2, em decorrência da dominância da parte do fruto, representada pela RDA1. Dessa forma, a estratégia de análise foi conduzida separadamente para cada parte do fruto, afim de melhor estabelecer a influência do solo de cultivo na variabilidade dos metabólitos das amostras Análise das Amostras das Sementes A modelagem das amostras de sementes por meio da RDA (Figura 4) resultou em correlações significativas entre as duas matrizes para os dois primeiros eixos canônicos (R 1 = 0,953 e R 2 = 0,974). Os parâmetros baixos de VIF < 4,23 e a alta variância explicada (R 2 = 79,6%; R 2 adj = 74,0%; F = 14,3; p = 0,001), indicaram ausência de multicolinearidade nas regressões (Lepš & Šmilauer, 2007). Figura 4. Plano da RDA com os metabólitos (setas azuis) das sementes de frutos de M. cauliflora explicados pelos seus nutrientes minerais (Cu 2+ e Mn 2+ ), além dos do solo (Mn 2+ ), representados por setas marrons. As amostras foram obtidas de frutos cultivados no solo S1 S5. A RDA1 foi responsável por 46,7% da variação explicada (F = 9,7; p = 0,002) e separou as sementes com baixos teores de Mn 2+ e umidade, provenientes dos frutos do solo S5, principalmente devido ao acúmulo de açúcares monoméricos (glicose e frutose) e ácido cítrico. Os maiores valores da RDA2 (27,7%; F = 11,9; p = 0,001) correlacionaram-se às sementes dos solos 14

28 pobres em Mn 2+ (S1 e S4) e acumularam majoritariamente polifenóis (fenóis, flavonoides e taninos totais) e sacarose. Valores negativos da RDA2 correlacionaram-se a teores elevados de alguns nutrientes minerais das sementes (Cu 2+ ) e do solo (Mn 2+ ), importantes na caracterização das amostras que se apresentaram ricas em ácido elágico e elagitaninos (vescalagina e castalagina), procedentes dos solos S2 e S3. A análise de agrupamento pelo algoritmo de c-means com lógica nebulosa confirmou a tendência de agrupamento das amostras de acordo com o plano da RDA. Nesse procedimento, o valor consideravelmente alto, próximo da unidade, do coeficiente de partição normalizado de Dunn (0,96) indicou que o agrupamento das amostras não se apresenta difuso, pelo contrário, aproxima-se de uma partição próxima de um conjunto rígido e, consequentemente, em uma nítida alocação das amostras nos agrupamentos, sem sobreposição (Figura 5). Figura 5. Gráficos silhueta e ordenação das amostras com base nos metabólitos das sementes de frutos de M. cauliflora cultivados nos solos S1 S5 de acordo com a técnica de c-means nebulosa. Gráfico em Silhueta - Agrupamento/Fuzzy SS12 SS41 SS11 SS42 SS13 SS43 SS33 SS32 SS31 SS21 SS22 SS23 SS52 n = 15 3 clusters C j j : n j ave i Cj s i 1 : : Dim SS51 SS53 SS52 Classe 1 Classe 2 Classe 3 SS41 SS42 SS43 SS12 SS11 SS13 SS23 SS22 SS21 SS53 3 : SS33 SS51 SS Silhouette width s i Dim1 Esses resultados estão em concordância com a silhueta das amostras nas classes, cujos valores de largura médios (0,36; 0,60 e 0,82) indicam as dispersões intra e interclasses na partição. As amostras nas classes também se encontram no gráfico de ordenação, onde se observa uma maior homogeneidade na classe 1, com sementes de frutos cultivados nos solos S1 e S4. Uma maior heterogeneidade foi observada na classe 2, especialmente daquelas provenientes de frutos cultivados no solo S2. A validação foi conduzida pela análise de discriminante canônica (CDA), com os teores de vescalagina, flavonoides e glicose como variáveis discriminantes (Tabela 5). Os resultados indicaram uma excelente classificação das amostras utilizando as três classes (agrupamentos) como variáveis de resposta e os teores de vescalagina, flavonoides e glicose como variáveis explicativas. 15

29 Tabela 5. Sumário da análise de discriminante para as amostras de sementes de M. cauliflora. Função canônica Autovalor Percentual relativo Correlação canônica Lambda de Wilks F GL 1 P CD1 15,350 65,3 0,969 0,007 37,5 6; 20 0,001 CD2 8,166 34,7 0,944 0,109 44,9 2; 11 0,001 Coeficientes Flavonoide Vescalagina Glicose CD1 0,87 0,42 1,08 CD2 0,98 1,27 0,27 Escores Classe 1 Classe 2 Classe 3 CD1 1,75 1,76 7,01 CD2 2,86 2,86 0,01 Validação Classe 1 Classe 2 Classe 3 Total (Jackniffe) 100% 100% 100% 100% 1 Graus de liberdade. Número de amostras = 15; Classe 1 (n = 6), classe 2 (n = 6); classe 3 (n = 3). Os valores baixos dos lambdas de Wilks (Λ 1 = 0,007; Λ 2 = 0,109) representam a medida multivariada da grande diferença entre os grupos. Quanto mais próximo de zero estiver este valor, maior o poder de discriminação da análise, com o valor unitário indicando ausência de poder discriminante das variáveis explicativas. O modelo mostrou uma forte correlação entre os conjuntos de variáveis (R 1 = 0,969; R 2 = 0,944) e a primeira função discriminante (CDA1) acumulou 65,3% da variabilidade e separou (F = 37,5; GL = 6 e 20; p = 0,001) a classe 3, contendo as sementes de frutos dos solos S5, principalmente pelo escore positivo (1,08) da glicose (Figura 6). Figura 6. Distribuição das sementes de M. cauliflora nas classes definidas pela análise de discriminante com as variáveis representadas por vetores a partir da origem. As cruzes representam os baricentros das classes, definidas de acordo com o solo de origem das amostras. CDA vescalagina classe 1 S1 S3 classe 2 S2 0,0 S4 classe 3 1,0 glicose S5 flavonoide 1,5 0-1, CDA1 A CDA2, por sua vez, discriminou (37,5%; F = 44,9; GL = 2 e 11; p = 0,001) a classe 2, formada por sementes originários de frutos dos solos S2 e S3, devido ao escore positivo (1,27) 16

30 para vescalagina. Valores negativos de CDA2 correlacionaram-se ao aumento do teor de flavonoides ( 0,98), especialmente na classe 1 de sementes dos solos S1 e S4. Todas as amostras foram classificadas corretamente pelas técnicas de reamostragem por Jackniffe e validação cruzada. A importância dos fatores ambientais, associados aos nutrientes minerais, na produção de constituintes químicos pelas sementes sugere que os fabricantes de produtos derivados destes frutos devem concentrar seus esforços em condições ambientais locais, as quais são estruturadas espacialmente. Tradicionalmente, os estudos da variabilidade química têm se restringido às influências bióticas, associadas à defesa química, influência genética ou fisiológica, como fenologia, além das abióticas, frequentemente relacionada às variações edafo-climáticas (Duarte et al., 2009; 2010). Estudos sobre a influência espacial na variabilidade química é muito restrito na literatura (Cortell et al., 2005; Covelo & Gallardo, 2009; Baluja et al., 2012) e tem sido objeto de estudos recentes, por parte dos autores. Esta estratégia permitiu a detecção, quantificação, predição e validação de padrões de variabilidade de óleos essenciais e compostos fenólicos de espécies nativas do Cerrado, como a cagaiteira (Eugenia dysenterica DC., Myrtaceae), pitangueira (E. uniflora L.) e de jabuticabeira, ao longo de gradientes espaciais (Duarte et al., 2012; Vilela et al., 2012, 2013). Os resultados permitiram descrever a estrutura química espacial, bem como a forma como os indivíduos se adaptam em uma escala espacial local, demonstrando a viabilidade dessa nova ferramenta para a conservação e uso racional da espécie com base unicamente em dados químicos. Neste trabalho incluiu-se a influência espacial, do local de coleta das amostras, por meio da seleção de monômios entre os nove parâmetros de um polinômio completo de ordem três, seguido do particionamento da variação explicada, os quais estão sumarizados na Tabela 6. Tabela 6. Sumário do particionamento da variação dos metabólitos das sementes dos frutos de M. cauliflora. Efeitos e variáveis Covariáveis Fração da variação F P 1 Variação explicada (%) Efeito total Nutriente mineral, solo e espacial [a g] 95,7 56 0,001 Efeitos parciais Solo Nutriente mineral, espacial [a] 4,3 10 0,002 Solo [a+d+f+g] 27,0 4,8 0,003 Nutriente mineral Solo, espacial [b] 16,7 20 0,001 Nutriente mineral [b+d+e+g] 66,4 12 0,001 Espacial Nutriente mineral, solo [c] 16,1 38 0,001 Espacial [c+e+f+g] 51,9 14 0,002 Efeitos conjuntos Nutriente mineral e solo [d] 22,7 Solo e espacial [e] 35,9 Nutriente mineral e espacial [f] 8,8 Nutriente mineral, solo e espacial [g] 9,0 Resíduos [h] 4,3 1 Baseado sobre o teste de Monte Carlo (999 permutações). Preditores: Solo de cultivo (Mn 2+ ); Nutriente mineral da semente (Mn 2+ e Cu 2+ ) e influência espacial (x 3 ). 17

31 Das frações com maior contribuição pura, destacaram-se a de nutrientes das sementes (16,7%; [b]) e da localização espacial das amostras (16,1%; [c]), altamente significativas (p = 0,001). Apesar da menor contribuição do solo das amostras (4,3%; [a]), ela foi significativa (p = 0,002). A contribuição total dos nutrientes das sementes correspondeu a 66,4% ([b+d+e+g]; p = 0,001), enquanto que o preditor espacial ([c+e+f+g]; p = 0,002) explicou 51,9% da variabilidade. A menor contribuição foi observada para o preditor solo (27,0%; [a+d+f+g]; p = 0,003). Das frações de sobreposição, a maior contribuição foi para o solo-espacial (35,9%; [e]). A contribuição negativa devida aos três subconjuntos ( 9,0%; [g]) se deve a esses efeitos serem obtidos por diferença e não por estimativa nos modelos de regressão e significa uma maior importância dos subconjuntos isolados do que no efeito conjunto (Legendre & Legendre, 2003). Os resultados do particionamento da variação total indicaram que 66,4% da variação explicada podem ser modeladas pelo conteúdo nutricional mineral nas amostras, ou seja, as variações nos metabólitos das sementes dos frutos de M. cauliflora são principalmente determinadas pela translocação dos nutrientes nesta parte da planta Análise das Amostras das Cascas A modelagem da RDA para as amostras de cascas dos frutos resultou em correlações significativas para os dois primeiros eixos canônicos (R 1 = 0,889 e R 2 = 0,876); valores de VIF < 2,0 e variância explicada (R 2 = 71,9%; R 2 adj = 64,2%; F = 17,4; p = 0,002) que suportaram uma forte associação entre as matrizes resposta e explicativa (Figura 7). Figura 7. Plano da RDA com 22 metabólitos (setas azuis) da casca de jabuticaba explicado pelos seus nutrientes minerais (P e Mn 2+ ), além dos do solo (Mn 2+ ), representados por setas vermelhas. As amostras foram obtidas de frutos cultivados no solo S1 S5. 18

32 A RDA1 foi responsável por 61,2% da variação explicada (F = 17,4; p = 0,002) e separou as cascas, com teores baixos de P e Mn 2+, provenientes de frutos do solo arenoso/argiloso do tipo cascalho com pouco nutriente e pobre em Mn 2+ (S4), principalmente devido ao acúmulo ácido elágico e castalagina. Quanto a RDA2 (10,3%; F = 4,0; p = 0,048), os seus maiores valores correlacionaram-se às cascas de frutos com maior tonalidade, provenientes dos solos ricos em Mn 2+ (S1 e S3) e que acumularam majoritariamente vescalagina, carboidratos e ácido gálico. Por outro lado, valores negativos da RDA2 correlacionaram-se aos maiores teores de Mn 2+ e P nas amostras e foram importantes na caracterização das cascas, ricas em taninos, fenóis, antocianinas totais, incluindo cianidina e delfinidina-3-glicose, e índice de cor, procedentes de frutos cultivados nos solos S2 e S5, ambos com baixo equilíbrio de nutrientes. Assim, a RDA1 descreve a influência de fatores nutricionais do solo, enquanto a RDA2 contribui para os nutrientes minerais das amostras. A análise de agrupamento utilizando o algoritmo de c-means nebuloso confirmou a tendência de agrupamento das amostras, o qual apresentou um alto coeficiente normalizado de Dunn (0,91) indicando a alocação das amostras nos agrupamentos, sem sobreposição (Figura 8). Figura 8. Gráfico de silhueta e de ordenação das amostras das cascas dos frutos de M. cauliflora cultivados nos solos S1 S5 de acordo com a técnica de c-means nebulosa. CS33 CS31 CS32 CS11 CS13 CS12 CS53 CS51 CS52 CS21 CS22 CS23 CS43 CS41 CS42 Gráfico em Silhueta - Agrupamento/Fuzzy n = 15 3 clusters C j j : n j ave i Cj s i 1 : : : Dim CS22 CS21 CS23 CS31 CS32 CS33 CS52 CS53 CS51 CS11 CS12 CS13 Classe 1 Classe 2 Classe 3 CS43 CS42 CS Silhouette width s i Dim1 O perfil de silhueta das amostras (larguras médias = 0,41; 0,35 e 0,95) indicaram a menor dispersão intraclasse para os membros da classe 3 (cascas do solo S4) e não apresentou nenhuma amostra mal classificada. Isto pode ser observado no gráfico de ordenação das amostras, onde se observa uma maior homogeneidade na classe 3, seguida das outras com similar variabilidade intraclasse. A validação foi conduzida pela análise de discriminante canônica (CDA), com os teores de ácido elágico e pedunculagina como variáveis discriminantes (Tabela 7). 19

33 Tabela 7. Sumário da análise de discriminante das cascas dos frutos de M. cauliflora. Função canônica Autovalor Percentual relativo Correlação canônica Lambda de Wilks F GL 1 P CD1 37,058 99,8 0,981 0,024 29,88 4; 22 0,001 CD2 0,087 0,2 0,288 0,920 1,04 1; 12 0,327 Coeficientes Pedunculagina Ácido elágico CD1 0,78 1,11 CD2 0,84 0,28 Escores Classe 1 Classe 2 Classe 3 CD1 1,01 4,24 10,50 CD2 0,32 0,25 0,14 Validação Classe 1 Classe 2 Classe 3 Total (Jackniffe) 100% 100% 100% 100% 1 Graus de liberdade. Número de amostras = 15; Classe 1 (n = 6), classe 2 (n = 6); classe 3 (n = 3). Os resultados indicaram uma excelente classificação e o valor baixo do lambda de Wilks (Λ 1 = 0,034) indicou o grande poder de discriminação das amostras utilizando apenas as duas variáveis discriminantes. O modelo apresentou uma forte correlação (R 1 = 0,981) na primeira função discriminante (CDA1), responsável pela maioria da variabilidade (99,7%; F = 29,88; GL = 4 e 22; p = 0,001), e que separou as três classes pelos escores negativo ( 1,11) e positivo (0,78) para a pedunculagina e ácido elágico, respectivamente (Figura 9), sem qualquer amostra mal classificada. Figura 9. Distribuição das cascas dos frutos de M. cauliflora pela análise de discriminante com as variáveis representadas por vetores a partir da origem. As cruzes representam os baricentros das classes, definidas de acordo com o solo de origem das amostras (S1 S5) pedunculagina 1.0 CDA2 1 0 ácido elágico x classe 3 classe 1 classe 2 x x CDA1-1.0 O particionamento da variação total explicada foi conduzido com a introdução das coordenadas geográficas dos locais de coleta das amostras, como um conjunto de variáveis 20

34 preditoras, em adição aos subconjuntos de nutrientes minerais das cascas e dos solos de cultivo. O particionamento da variação conduziu aos efeitos parciais e conjuntos, os quais se encontram sumarizados na Tabela 8. Tabela 8. Sumário do particionamento da variação dos metabólitos das cascas dos frutos de M. cauliflora. Efeitos e variáveis Covariáveis Fração da variação F P 1 Variação explicada (%) Efeito total Nutriente mineral, solo e espacial [a g] 92,3 30 0,001 Efeitos parciais Solo Nutriente mineral, espacial [a] 32,8 42 0,001 Solo [a+d+f+g] 65,5 25 0,001 Nutriente mineral Solo, espacial [b] 7,4 4,8 0,009 Nutriente mineral [b+d+e+g] 40,3 4,0 0,032 Espacial Nutriente mineral, solo [c] 16,4 21 0,001 Espacial [c+e+f+g] 41,7 9,3 0,007 Efeitos conjuntos Nutriente mineral e solo [d] 10,4 Solo e espacial [e] 2,9 Nutriente mineral e espacial [f] 2,8 Nutriente mineral, solo e espacial [g] 19,5 Resíduos [h] 7,7 1 Baseado sobre o teste de Monte Carlo (999 permutações). Preditores: Solo de cultivo (Mn 2+ ); Nutriente mineral da semente (Mn 2+ e Cu 2+ ) e influência espacial (y 2 ). A fração com maior contribuição pura foi a de nutriente mineral do solo (32,8%; [a]), seguido pela localização espacial das amostras (16,4%; [c]), todas significativas (p = 0,001). Apesar da contribuição menor dos nutrientes minerais das amostras (7,4%; [b]), ela também se mostrou significativa (p = 0,009). Em adição, a contribuição total do subconjunto nutriente mineral do solo correspondeu a 65,5% ([a+d+f+g]; p = 0,001), enquanto o preditor espacial (41,7%; [c+e+f+g]; p = 0,007) e o dos nutrientes minerais das cascas (40,3%; [b+d+e+g]; p = 0,032) contribuíram de forma similar para a variabilidade. Das frações resultantes de sobreposição dos efeitos conjuntos, a maior contribuição foi atribuída aos três subconjuntos (19,5%; [g]), seguida dos nutrientes minerais das cascas e do solo (10,4%; [d]). Dessa forma, a maior parte (65,5%) da variação pode ser modelada pelo conteúdo nutricional dos solos e o regime de adubação é determinante para explicar a variabilidade dos metabólitos nas cascas dos frutos de M. cauliflora. A comparação dos metabólitos nas duas partes do fruto, por meio de ANOVA (Tabela 9), demonstrou mais claramente a influência do solo de cultivo na discriminação entre as classes para as amostras de cascas, relativamente àquelas das sementes. Enquanto que para as cascas, as diferenças significativas ocorreram para 77% dos teores dos metabólitos, essas diferenças restringiram-se a apenas 47% dos metabólitos para as sementes. Os teores de glicose, frutose, ácidos cítrico e elágico, vescalagina, castalegina e de umidade apresentaram diferenças significativas em pelo menos uma classe para ambas as partes do fruto. 21

35 Tabela 9. ANOVA dos metabólitos 1 da casca e semente de jabuticabas de acordo com as classes. Metabólitos Classes nas Cascas Classes nas Sementes 1 (S1/S3) 2 (S2/S5) 3 (S4) 1 (S1/S4) 2 (S2/S3) 3 (S5) Glicose 2 36,033 a 38,233 a 21,800 b 3,503 c 4,107 b 5,743 a Frutose 2 43,117 a 44,667 a 24,067 b 2,983 c 3,995 b 6,840 a Ácido cítrico 3 24,893 a 24,945 a 8,890 b 1,337 b 1,580 b 2,310 a Ácido elágico 0,024 b 0,023 b 0,038 a 0,070 b 0,09 a 0,069 b Vescalagina 0,005 b - 0,007 a 2,042 b 2,884 a 2,261 b Castalagina - - 0,038 1,881 b 2,357 a 2,048 b Umidade 16,994 ab 18,680 a 15,236 c 25,938 b 29,488 a 14,516 c Sacarose ,448 a 1,323 b 2,330 a Lipídeos 2 0,474 b 0,491 a 0,464 b Cinzas 4,770 b 4,758 b 4,870 a Fenóis totais 2 2,524 c 2,912 a 2,734 b Taninos totais 2 0,481 c 0,691 a 0,576 b Antocianinas 0,405 b 0,535 a 0,428 b Pedunculagina 0,022 b 0,034 a 0,009 c Delfinidina-3-glicose 3 0,061 b 0,117 a 0,072 b Cianidina-3-glicose 0,295 b 0,451 a 0,340 ab Índice de cor 2 0,720 c 1,076 a 0,907 b Tonalidade 2 1,002 a 0,437 c 0,746 b Baseado nos valores originais (g/100 g fruto seco). 2 Transformado pela ordem dos mesmos (rank) ou 3 logaritmo na ANOVA. Médias seguidas pelas mesmas letras minúsculas nas linhas não diferem ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey. As cascas pertencentes à classe 2 (solos S2/S5), de solos arenosos com baixos níveis de nutrientes, apresentaram altos teores de metabólitos primários (glicose, frutose, ácido cítrico e lipídeos) e especiais (fenóis totais, taninos, antocianinas, pedunculagina, delfinidina e cianidina-3- glicose), além do desejável índice de cor elevado e tonalidade baixa, importantes para propriedades sensoriais de vinhos de jabuticabas. Por outro lado, as sementes dos solos S2/S3 (classe 2) apresentaram-se adequadas como matéria-prima de elevado teor em metabólitos especiais bioativos como o ácido elágico, vescalagina e castalagina. Na ANOVA para os nutrientes das amostras (Tabela 10), observou-se os maiores teores nos micronutrientes Zn 2+, Fe 3+, Cu 2+ e Mn 2+ em sementes da classe 2, que por sua vez apresenta os teores mais elevados em macronutrientes (P, Ca 2+ e Mg 2+ ) nas cascas. Tabela 10. ANOVA dos nutrientes da casca e semente de jabuticabas de acordo com as classes. Nutrientes (mg/dm 3 ) Classes nas Cascas Classes nas Sementes 1 (S1/S3) 2 (S2/S5) 3 (S4) 1 (S1/S4) 2 (S2/S3) 3 (S5) Zn ,7 b 17,4 a 16,1 ab Fe ,0 b 60,7 a 53,3 b Cu 2+ 3,3 b 4,5 ab 5,7 a 7,0 c 10,0 a 8,0 b Mn 2+ 47,0 b 56,3 a 55,0 a 24,0 a 23,5 a 8,0 b P 1,7 ab 1,9 a 1,4 b K + 1,3 a 1,0 b 0,7 b Ca 2+, 1 0,12 a 0,12 a 0,10 b Mg 2+, 1 0,07 a 0,06 ab 0,05 b cmolc/l. Médias seguidas pelas mesmas letras minúsculas nas linhas não diferem ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey. 22

36 Também para os nutrientes dos solos de cultivo (Tabela 11) em função das classes, observou-se que os solos com maiores teores de nutrientes pertencem a classe 2 (S2 e S3), sugerindo uma absorção e armazenamento eficientes desses nutrientes pelas sementes de frutos originados dessa classe. Essas sementes se destacaram pelos metabólitos de maior atividade biológica (vescalagina, castalagina e ácido elágico), com importantes propriedades antioxidantes, antitumorais, entre outras (Pereira et al., 2017). Tabela 11. ANOVA dos nutrientes do solo dos locais amostrados de acordo com as classes. Nutrientes/Solo (mg/dm 3 ) Classes nas Cascas Classes nas Sementes 1 (S1/S3) 2 (S2/S5) 3 (S4) 1 (S1/S4) 2 (S2/S3) 3 (S5) Silte 1 19,0 a 16,0 b 16,0 b Argila 1 37,0 b 35,0 b 46,0 a 41,0 a 32,0 b 43,0 a Areia 1 44,0 ab 49,0 a 38,0 b 40,0 b 51,0 a 42,0 b ph ,1 b 4,5 a 4,0 b Matéria orgânica 1 1,2 a 0,7 b 1,6 a K ,0 a 29,0 b 36,0 a P 3,8 a 2,8 a 0,8 b 1,1 b 4,6 a 2,6 ab Ca 2+, 2 1,7 a 0,5 b 0,8 ab 0,7 ab 1,7 a 0,2 b Mg 2+, 2 0,4 a 0,2 b 0,2 b 0,3 b 0,4 a 0,1 c Mn 2+ 33,5 a 27,1 a 7,8 b 12,0 b 37,0 a 27,0 ab Fe ,3 b 215,4 a 71,2 b Zn ,9 ab 1,4 a 0,3 b H+Al ,0 a 6,5 a 3,9 b 1 %; 2 cmolc/l. Médias seguidas pelas mesmas letras minúsculas nas linhas não diferem ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey. Por outro lado, a maior concentração de MO, P, Ca 2+, Mg 2+ e Mn 2+ (classe 1, S1/S3) nas cascas podem ter favorecido os elevados teores em metabólitos primários (açúcares, lipídeos e ácido cítrico) nessa classe. Já nos solos argilosos, ricos em MO (classe 3, S4), as cascas apresentaram os maiores teores de ácido elágico, vescalagina e castalagina (Tabelas 9 e 11) Discussão A qualidade dos produtos processados de jabuticaba ainda é alvo de investigações, pois podem ocorrer alterações químicas indesejáveis durante o processamento e armazenamento dos frutos (Fortes et al., 2012; Wu et al., 2013). Ao longo dos processos de desenvolvimento e amadurecimento, os frutos também sofrem mudanças bioquímicas, fisiológicas e estruturais que determinam sua qualidade e afetam propriedades químico-biológicas, influindo no uso industrial. As alterações nos teores químicos da jabuticaba têm sido descritas ao longo de sua maturação, as quais evidenciaram variações em carboidratos, ácidos orgânicos e compostos fenólicos (Alezandro et al., 2013; Fortes et al., 2011; Magalhães et al., 1996; Pereira et al., 2017). As sementes e/ou cascas de jabuticaba foram recentemente investigadas permitindo o isolamento 23

37 e elucidação estrutural de compostos fenólicos utilizando as técnicas espectroscópica tradicionais (Pereira et al., 2017) ou na identificação por espectrometria de massas (Wu et al., 2012). Os açúcares e os ácidos orgânicos contribuem sensivelmente para o sabor das frutas e nas sementes e cascas de jabuticaba a fração de carboidratos solúveis consistiu principalmente em frutose, glicose e sacarose (Tabela 1). Os níveis mais elevados de frutose no fruto maduro já tinham sido descritos em frutos de jabuticabeira (Alezandro et al., 2013; Lima et al., 2011). As variações nos teores desses açúcares são influenciadas pelas atividades de enzimas relacionadas ao metabolismo de carboidratos, como invertase e sacarose fosfato sintase (Srivastava, 2002). A sacarose é transportada no floema para os frutos, onde pode ser acumulada e/ou hidrolisada em glicose e frutose pela invertase, mas a glicose também pode ser formada por degradação de amido que ocorre em células da polpa da jabuticaba durante a maturação (Barros et al., 1996). Dessa forma, a quantidade de glicose aumenta a uma taxa mais rápida que a frutose, de modo que a proporção de glicose/frutose (G/F) será proporcional ao grau de maturidade do fruto (Sabir et al., 2010). Por exemplo, durante o processo de maturação de uvas houve uma variação na relação G/F de 0,98 a 1,05 (Artés-Hernández et al., 2003). Os principais ácidos orgânicos não aromáticos analisados na jabuticaba foram os ácido cítrico e málico. Estes ácidos são responsáveis pela acidez do fruto e qualidade final do vinho de jabuticaba. Ao contrário de outros estudos (Jham et al., 2007; Lima et al., 2011), o ácido succínico não foi detectado nas sementes, cascas e polpas, enquanto o ácido málico foi observado apenas na polpa dos frutos provenientes da Fazenda Jabuticabal (Pereira et al., 2017). Essa diferença pode ser devido a fatores como fertilidade do solo, irrigação, intensidade solar, cultivar e temperatura, que influenciam no conteúdo de ácidos orgânicos em frutas (Davey et al., 2000). As antocianinas ocorreram apenas nas cascas e as concentrações dos dois principais pigmentos, cianidina- e delfinidina-3-o-glicose, aumentaram até a fase final de amadurecimento do fruto (Pereira et al., 2017), embora os teores possam variar de acordo com as condições climáticas (Leite-Legatti et al., 2012). Os níveis desses pigmentos assemelharam-se aos obtidos de jabuticabas cultivadas em outros locais do país (Alezandro et al., 2013), 12,3 e 2,35 mg/10 g, mas inferior àquelas cultivadas nos EUA (43,3 e 81,0 mg/10 g) (Reynertson et al., 2008). Os fatores climáticos, como a temperatura, podem ser responsáveis por essa diferença, já que a acumulação de antocianinas é influenciada pela temperatura, particularmente pela variação da temperatura diurna (Treutter, 2010). Como já descrito para morangos, os dias quentes e noites frias aumentam a produção de antocianinas (Wang & Zheng, 2001). O ph neutro na extração desses compostos, afim de evitar hidrólise de compostos ácido-sensíveis, também podem diminuir o teor desses pigmentos, pois eles são menos estáveis nesse meio (Montes et al., 2005). Os teores de antocianina em jabuticabas maduras são cruciais para a produção de vinho, uma vez que quantidades maiores de antocianinas extraídas irão melhorar as propriedades de cor e efeito antioxidante do vinho (Tuberoso et al., 2007). Em um estudo comparativo com 13 24

38 compostos de diferentes classes de flavonoides (flavonas, flavonóis, flavanonas, isoflavonas, flavan-3-ols e antocianidinas), a cianidina foi a mais eficaz na inibição da α-glucosidase (Tadera et al., 2006). Portanto, as antocianinas presentes nas cascas de jaboticaba parecem ter um papel importante na atividade inibitória de todo o fruto. Esses resultados são relevantes, uma vez que ambas as enzimas, α-glucosidase e α-amilase, estão diretamente envolvidas na digestão de carboidratos em humanos e o controle dessas enzimas pode efetivamente retardar a digestão de carboidratos, a absorção de glicose e supressão da hiperglicemia (Plaza et al., 2016). Diferentemente dos pigmentos, observa-se uma diminuição do conteúdo de taninos totais ao longo do desenvolvimento da jabuticaba, cuja tendência é comum em outras frutas como mirta e caqui (Del Bubba et al., 2009; Fadda & Mulas, 2010). Este comportamento pode resultar da complexação de taninos com pectinas solúveis formadas durante a maturação dos frutos (Magalhães et al., 1996), bem como da dimerização e polimerização subsequente, gerando taninos de alto peso molecular que podem se ligar às paredes celulares (Salminen et al., 2004). Quanto aos elagitaninos, Pereira et al. (2017) observaram que os teores diminuíram nos estádios de desenvolvimento e maturação dos frutos de jabuticaba, mas os níveis de pedunculagina caíram 57% da primeira para a segunda fase de crescimento do fruto, enquanto a castalagina e a vescalagina não apresentaram diferenças significativas no mesmo período. Alezandro et al. (2013) observaram que as sementes de jabuticaba possuem altas concentrações de elagitaninos e proantocianidinas, enquanto que a casca apresentou as maiores quantidades de antocianinas e flavonoides derivados de quercetina. Além disso, extratos das cascas de jabuticaba também exibiram um efeito positivo sobre o perfil lipídico em ratos com diabetes induzida e os polifenóis (antocianinas e elagitaninos) das cascas também aumentaram a atividade antioxidante do soro, além de diminuir o conteúdo de insulina em humanos saudáveis (Plaza et al., 2016). Os ácidos polifenólicos como os ácidos gálico e elágico, e os elagitaninos pedunculagina e a vescalagina foram detectados em todas as partes do fruto de jabuticaba, e em maiores quantidades nas sementes (Pereira et al., 2017). Os níveis de castalagina foram ainda superiores aos de vescalagina tanto em sementes quanto em polpas do fruto. Uma das maiores diferenças entre sementes e cascas de jabuticaba se deve à concentração maciça de castalagina e vescalagina, bem como o alto teor de elágico em sementes, de forma similar ao observado para camu-camu, M. Dubia L. (Fracassetti et al., 2013). Esta variação pode ser devida à translocação dessas substâncias entre semente e celulose ou à biotransformação de pedunculagina (Quideau, 2009). Castalagina e vescalagina são epímeros cuja única diferença estrutural é a posição da hidroxila no carbono C-1. Apesar da similaridade estrutural, estes elagitaninos diferem em reatividade química. A vescalagina é mais susceptível de sofrer reações de substituição nucleofílica em C-1, e acredita-se que seja o precursor de vários oligômeros, além de reagir com (+)-catequina, formando flavono-elagitaninos (Quideau, 2009). Portanto, em espécies vegetais com ambos compostos, a concentração de 25

39 castalagina é geralmente maior do que a vescalagina, como observado nas sementes de M. dubia, onde a proporção de castalagina para vescalagina foi de 3:2 (Fracassetti et al., 2013). Castalagina e vescalagina ocorrem em grandes quantidades em carvalho (Quercus robur L. e Q. petraea) e são encontrados em vinhos de uva envelhecidos em tonéis dessa madeira. Uma análise do vinho tinto de Bordéus, envelhecido por 18 meses em tonéis de carvalho, mostrou que esses elagitaninos tinham uma concentração de cerca de 10 mg/l e contribuem para as propriedades sensoriais do vinho, incluindo sabor e cor (Quideau, 2009). Glabasnia e Hofmann (2006) observaram que a castalagina, vescalagina e seus derivados conferem uma sensação de revestimento bucal adstringente em concentrações notavelmente baixas em vinhos tintos envelhecidos em tonéis de carvalho. Vescalagina também pode influenciar a cor do vinho ao reagir com antocianinas e formar novos pigmentos (Chassaing et al., 2010). Nem todas as etapas da biossíntese de elagitaninos são conhecidas, mas é aceita a proposta da pedunculagina como intermediário chave na formação desses compostos (Quideau, 2009). As variações nos níveis de pedunculagina podem decorrer de biotransformação, que por sua vez podem fornecer dímeros, trímeros e polímeros. Pedunculagina também dimeriza diretamente com elagitaninos, como em folhas do carvalho (Salminen et al., 2004). Estudos recentes mostraram que uma grande proporção de elagitaninos permanece limitada às paredes celulares e a outras macromoléculas do fruto (García-Villalba et al., 2015). De forma geral, a quantificação e caracterização estrutural de elagitaninos e ácido elágico em alimentos, como frutas nativas brasileiras, são pontos de partida para potenciais benefícios para a saúde, incluindo atividades antioxidantes, antivirais e anticancerígenas (Gasperotti et al., 2010). As alterações no metabolismo vegetal estão no cerne do desenvolvimento das plantas, afetando aquelas mais sensíveis ao ambiente (Brunetti et al., 2013). Fatores ambientais além de causarem mudanças no crescimento, também afetam a quantidade e a qualidade de metabólitos de defesa (Sardashti et al., 2012). Por exemplo, interações iônicas e salinidade afetam monoterpenos e diterpenos de alecrim, Rosmarinus officinalis, (Tounekti et al., 2011), enquanto que metais do solo, como Mg 2+ e Mn 2+, que podem afetar o grau de fotossíntese da planta, também podem interferir na biossíntese de compostos polifenólicos (Farzadfar et al., 2017). As propriedades físico-químicas dos solos são devidas principalmente à alta superfície específica e reatividade da fração argila (minerais secundários, óxidos de ferro e alumínio, e matéria orgânica). Do ponto de vista de fertilidade, solos argilosos, em especial com alto teor de matéria orgânica são desejados, por terem CTC elevada e, com isso, maiores quantidades de cátions podem ser armazenadas e cedidas aos vegetais por meio de troca iônica. Os sítios de amostragem diferem consideravelmente em textura e nutrientes minerais. As texturas variaram de franco-arenoso (S1), franco-argiloso-arenoso (S2), argilosos (S4 e S5) e argilo-arenoso (S3). Nesse último a adubação ocorreu com adubo orgânico. Os solos S2 e S5 apresentaram o menor equilíbrio de nutrientes, com S2 tendo considerável quantidade de ferro. O 26

40 Mn 2+ está presente principalmente no solo argiloso S3. Nos nutrientes minerais das partes do fruto o manganês acumulou-se nas cascas (solo S2), enquanto que as sementes foram mais ricas em cobre (solos S2 e S3) e fósforo, embora que este último não tenha mostrado dependência com o tipo de solo (Pereira, 2016). Dessa forma, não foi surpresa a observação da forte separação entre sementes e cascas na RDA1 (Figura 2, Tabela 1). O potássio tem sido relatado como o mineral mais abundante nos frutos de jabuticaba Paulista e Sabará (Lima et al., 2011). As frutas são fontes geralmente ricas de potássio, que é principalmente encontrada na casca. Sua baixa afinidade pelos quelantes torna-o altamente móvel nas plantas, o que explica sua alta concentração nos tecidos. Vários estudos demonstraram a participação de Cu 2+ e Mn 2+ na rota do ácido chiquímico, que conduz a flavonóides, taninos e lignina (Diaz et al., 2001; Guangqiu et al., 2007). Em plantas com deficiência de Cu 2+ e Mn 2+, a lignificação é prejudicada e os compostos fenólicos se acumulam nos tecidos (Lin et al., 2005). Isto se deve em parte à queda na atividade da fenolase e lacase, dependentes e Cu 2+, enzimas-chave na lignificação. O efeito do Cu 2+ na biossíntese de taninos foliares tem sido descrita em Aegiceras corniculatum (L.) Blanco (Myrsinaceae) (Guangqiu et al., 2007). Inicialmente, a quantidade de tanino diminui com a oferta de cobre. Porém, quando ele atinge níveis tóxicos, o teor de tanino aumenta. Esses resultados mostraram que a biossíntese de polifenóis é dependente dos níveis de Cu 2+ e Mn 2+ : a lignificação é inibida em tecidos deficientes e a produção de outros fenólicos é aumentada, o que provavelmente ocorre em sementes do solo S1 e S4. Quando Cu 2+ e Mn 2+ atingem níveis suficientes, a biossíntese de lignina é aumentada, provavelmente usando outros derivados fenólicos como intermediários. Em relação ao fósforo, ele ocorre principalmente em sementes sob a forma de ácido fítico (fitatos), um composto funcionando como reservatório de fósforo durante a germinação (Mengel & Kirkby, 1987). Na jabuticaba ele se encontra em quantidade relativa alta nas cascas provenientes do solo S2 e S5, o que pode ter contribuído para a separação dessas amostras (Figura 7). O fósforo é um elemento essencial para o crescimento, sendo componente de compostos fosfatados que encerram energia (ATP e ADP), ácidos nucléicos, várias coenzimas e fosfolipídeos, e participando também de várias etapas da rota biossintética, como terpenos (Raven, 2001). Estudos com Mentha piperita L. (Lamiaceae) (David et al., 2006), mostraram a influência marcante dos níveis de fósforo no conteúdo e rendimento de óleo essencial. Também para amostras de cagaiteira (E. dysenterica DC.), coletadas na estação seca, observou-se uma forte correlação com fósforo no solo. Durante esse período ocorre a emissão de novas folhas, exigindo uma grande quantidade de carbono e macronutrientes, especialmente N e P para síntese de proteínas e RNA (Sano et al., 1995), e favorecendo a capacidade de biossíntese de óleos essenciais como fator de proteção ao aumento de herbivoria nesta época (Dicke et al., 2003; Duarte et al., 2010). Os resultados revelaram que fatores edáficos foram determinantes para o perfil químico principalmente das cascas da Jabuticaba. Isto sugere uma correlação significativa entre local de 27

41 amostragem com a distância geográfica, de tal forma que as variações químicas ocorreram em uma escala local, sugerindo ecótipos diferentes. Observou-se uma influência espacial pura similar na explicação da variabilidade química nas cascas (16,4%) e sementes (16,1%), com uma contribuição total de 41,7% e 51,9% da variação explicada, respectivamente (Tabelas 5 e 7). Alguns autores têm descrito a influência de fatores ambientais espacialmente distribuídos na composição química (Ali et al., 2010; Andrew et al., 2007; Brenes-Arguedas & Coley, 2005; Broz et al., 2010; Covelo & Gallardo, 2009; 2004). Por exemplo, a disponibilidade de luz mostrou autocorrelação espacial e pode induzir um padrão espacial no conteúdo dos compostos fenólicos (Cordell & Kennedy, 2006; Hagen et al., 2007; Ingersoll et al., 2010). Os resultados sugerem que a estrutura química espacial não se origina de um único fator, pelo contrário, diversos fatores bióticos ou abióticos podem operar simultaneamente a favor ou contra a divergência química. Os resultados sugerem uma forte influência da parte do fruto nos metabólitos, os quais podem ser explicado por diferentes funções: enquanto a cor das cascas, devido a antocianinas, promovem um sinal visual para a atração de agentes de dispersão de sementes, os taninos estão envolvidos na proteção contra patógenos e predadores (Agrawal et al., 2012), similar aos aquênios em morangos e sementes de camu-camu, que acumulam compostos fenólicos de defesa, incluindo elagitaninos (Fait et al., 2008; Fracassetti et al., 2013). No presente estudo a pequena variação inexplicada (semente: 4,3%; cascas: 7,7%) indica que as quimiovariações também podem ser devido ao clima (luz solar e temperatura), condição hídrica e controle hormonal (Conde et al., 2007). Finalmente, as informações obtidas com sementes e cascas abrem possibilidades para novos estudos envolvendo substâncias isoladas para um melhor aproveitamento de derivados de jabuticaba Considerações Finais A jabuticabeira é uma das frutíferas cujos estudos devem ser intensificados pelo potencial de utilização e qualidade dos frutos, seja no consumo in natura, seja na industrialização de subprodutos até o momento sem destaque em sua cadeia produtiva, como as cascas e sementes. Com interesse de se agregar valor científico e econômico, técnicas de análises estatísticas univariadas e multivariadas foram empregadas para avaliar os padrões de variabilidade química de metabólitos primários e especiais das cascas e sementes dos frutos de M. cauliflora cultivados em cinco pomares da Fazenda Jabuticabal-Nova Fátima/GO. Os resultados indicaram que os metabólitos são mais adequadamente explicados quando analisados separadamente, por parte do fruto, o que reflete diferenças marcantes na qualidade e teor de alguns metabólitos nas sementes e cascas. O Mn 2+ se destacou entre os nutrientes minerais tanto do solo de cultivo quanto das partes do fruto, enquanto o Cu 2+ e o fósforo tiveram destaques diferenciados na explicação dos metabólitos das sementes e cascas, respectivamente. 28

42 Em ambos os casos, as amostras conduziram a três agrupamentos de acordo com os metabólitos, porém com diferenças entre o solo de cultivo dos frutos. Teores mais elevados de vescalagina, ácido gálico e carboidratos totais nas cascas ocorreram em solos com maior concentração de nutrientes como matéria orgânica (MO), P, Mn 2+, Ca 2+ e Mg 2+, enquanto que solos mais arenosos e com baixos níveis de nutrientes apresentaram altos teores de taninos, antocianinas e fenóis totais, além de pedunculagina. As sementes provenientes de solos com maior ph e níveis mais elevados de P, Ca 2+, Mg 2+, Fe 3+, Mn 2+, Zn 2+ apresentaram os maiores teores em ácido elágico, vescalagina, castalagina e carboidratos totais. Por sua vez, aquelas com altos teores de taninos, flavonoides e fenóis totais originaram-se principalmente de solos argilosos com características nutricionais intermediárias Conclusão O padrão de distribuição dos metabólitos alterou-se drasticamente de acordo com o órgão envolvido (sementes e cascas), além do tipo de solo de cultivo (pobre ou rico em nutrientes). Os parâmetros nutricionais foram os mais importantes na variabilidade química das sementes, enquanto que os minerais relacionados aos solos de cultivo apresentaram maior influência para as cascas. Esses resultados são relevantes, pois a qualidade dos vinhos de jabuticaba está principalmente associada à composição química da polpa e da casca dos frutos, enquanto que as propriedades associadas às sementes são de importância como matéria-prima para a indústria farmacêutica ou alimentícia, como fonte potencial de ingredientes funcionais. Dessa forma, o manejo do solo e o conteúdo nutricional dos frutos destacam-se como importantes parâmetros para a melhoria da qualidade desses subprodutos para a cadeia produtiva da jabuticaba Referências Agrawal, A.A., Hastings, A.P., Johnson, M.T.J., Maron, J.L., Salminen, J.-P., Insect herbivores drive real-time ecological and evolutionary change in plant populations. Science 338, 113, Akter, M.S., Oh, S., Eun, J.-B., Ahmed, M., Nutritional compositions and health promoting phytochemicals of camu-camu (Myrciaria dubia) fruit: a review. Food Res. Int. 44, 1728, Alezandro, M.R., Dubé, P., Desjardins, Y., Lajolo, F.M., Genovese, M.I., Comparative study of chemical and phenolic compositions of two species of jaboticaba: Myrciaria jaboticaba (Vell.) Berg and Myrciaria cauliflora (Mart.) O. Berg. Food Res. Int. 54, 468, Ali, G.A., Roy, A.G., Legendre, P., Spatial relationships between soil moisture patterns and topographic variables at multiple scales in a humid temperate forested catchment. Water Resour. Res. 46, W10526,

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50 Capítulo 2 A Influência do Espaço na Variabilidade Química nos Pomares de Jabuticabas 37

51 2.1. Introdução A distribuição dos seres vivos não é randômica nem homogênea no meio ambiente, mas organizada por processos internos como o crescimento, dispersão, reprodução e morte, além de outros externos, como a topografia, relação predador-presa, disponibilidade de alimentos, parasitismo, manejo de plantio, mudanças históricas no ambiente, entre outros (Legendre & Legendre, 2012). Esses processos possuem características (variáveis) que podem ser mensuradas, tais como o teor de carboidratos ou fenóis em diferentes pomares de jabuticaba (Pereira et al., 2017), ou o número de diferentes espécies vegetais em uma área de florestas (Resende et al., 2018). Essas variáveis podem estar correlacionadas a outras ou autocorrelacionadas, ou seja, correlacionadas a elas próprias ao longo de um gradiente espacial ou temporal. O espaço, onde na maioria das vezes ocorre a estruturação, seria análogo a um manto ou capa que cobre tridimensionalmente todo objeto de estudo, guardando informações sobre o passado e o presente, permitindo supor e planejar o futuro. A autocorrelação é uma das famílias de mecanismos que geram estruturação espacial de variáveis e esse fenômeno pode ser aproveitado na coleta e manejo populacional. Os processos naturais ocorrem em uma determinada localização espacial que pode ser representada por coordenadas geográficas, as quais podem ser utilizadas para avaliar as tendências de variáveis de resposta, y = F(X,Y), em função da latitude (X) e longitude (Y) dos locais de amostragem, representada por funções polinomiais ajustadas por meio de regressão polinomial (Gosset, 1914). Essas modelagens permitem encontrar a estruturação das variáveis no ambiente e as tendências de estruturações espaciais quanto a serem lineares, cúbicas, de terceira ordem ou superiores, de forma simples e poderosa. Porém, essas funções polinomiais são apropriadas para fenômenos que ocorrem em larga escala, sendo que para àquelas de curta escala, técnicas utilizando autofunções são mais adequadas (Griffith & Peres-Neto, 2006), por permitirem representar estruturações em todas as distâncias entre os locais de coleta. As autofunções são famílias de métodos de análise multiescala para respostas uni ou multivariadas (Griffith & Peres-Neto, 2006). A técnica consiste em construir autovetores de matrizes espaciais e usá-los como preditores em modelos lineares. Alguns desses autovetores são chamados PCNM (Principal Coordinates of Neighbour Matrices) e outros de MEM (Moran s Eigenvector Maps). Os PCNM são atualmente denominados dbmem (distance-based Eigenvector Maps) e foram detalhadamente descritos por Borcard & Legendre (2002) e Borcard et al. (2004). Eles são capazes de identificar a escala em que ocorre a autocorrelação espacial, o que permite a elaboração de modelos que possam ser decompostos em submodelos de diferentes escalas, facilitando a interpretação e o entendimento das relações entre variáveis de resposta e explicativas. Dray et al. (2006) verificaram que os PCNM poderiam ser obtidos por meio de operações matemáticas aplicadas ao produto de Hadamard de duas matrizes com informações de 38

52 conectividade e distância. Esse processo conduziu a uma formulação algébrica geral para construção dos MEM que permitiu a construção das matrizes separadamente (Dray et al., 2006; Legendre & Legendre, 2012): a) uma matriz de conectividade (B), representada por qualquer tipo de grafo, mas frequentemente utilizando algoritmos de árvore de custo mínimo (Minimum Spanning Tree), grafos de Gabriel e triangulação de Delaunay, entre outros, dos pontos de coordenadas espaciais (Sedgewick, 2003); b) uma matriz de pesos (A) que traduza uma noção de distância entre amostras vizinhas mas que pode ser substituída por diferentes relações, como a similaridade, e que estabeleça trocas de matéria ou energia entre vizinhos e com maior ou menor facilidade. Dessa forma, os PCNM são atualmente MEM baseados em distâncias e por isso denominado de dbmem. Os MEM possibilitaram o estudo da estrutura espacial (e temporal) em diferentes campos do conhecimento, como na genética e evolução, epidemiologia, antropologia, demografia, economia, etc. e, na maioria das vezes, utilizam autofunções binárias ou transformações em distâncias geográficas. Atualmente vários trabalhos são descritos desde a identificação de padrões na morfologia animal (Magnus et al., 2018) até estruturações espaciais em florestas inteiras (Liu et al., 2018; Queiroz et al., 2018; Resende et al., 2018; Zhang et al., 2018). Uma vez encontrada a tendência das variáveis no espaço é possível utilizar essa informação em técnicas multivariadas como agrupamento (HCA), análise de redundância canônica (RDA) e no particionamento da variação total por prda do conjunto de variáveis de resposta em função de preditores ambientais e espaciais em processos estacionários, ou seja, processos independentes da localização absoluta e da direção no espaço. Nas condições estacionárias, a média e a variância são as mesmas em qualquer direção e isso, para a análise espacial, é tão importante quanto assumir independência entre as observações na estatística paramétrica. A geoestatística fornece outras propostas de análise de variância espacial, como por exemplo, na construção dos variogramas (Ver Hoef et al., 1993). Nessas ferramentas gráficas, a ordenada é representada pela semivariância, (h), e a abscissa pelas distâncias entre os locais de coleta, denominadas classes (lag). A semivariância é a medida da variância amostral dependente da distância e indica a correlação espacial entre as amostras. Essas ferramentas são amplamente utilizadas e podem ser modeladas em formatos lineares, exponenciais, esféricas e gaussianas, principalmente. No caso dos metabólitos da jabuticaba seria uma representação gráfica das funções de distribuição dos teores químicos, expressando o aumento da variância com o incremento da distância no conjunto de amostragem. Os variogramas podem ser uni ou multivariado, sendo esse último descrito por Wagner (2003; 2004), na proposição de métodos de ordenação multiescalares. Esses métodos integraram as conhecidas técnicas de ordenação (PCA, RDA, CA, CCA) aos variogramas clássicos com testes de significância estatística por meio de permutações de Monte Carlo. Dessa forma, as 39

53 matrizes dos variogramas foram usadas como extensões geoestatísticas da ordenação multiescalar, permitindo a integração das estruturas espaciais de uma ampla variedade de processos e em diferentes níveis de organização (Alvarez et al., 2018; Flanagan et. al., 2018). A técnica permite o uso de interpolações e regressão (krigagem) e, assim, aproximar ou interpolar dados, construindo mapas que estruturam variáveis em função de posições não amostradas (Cressie, 1991). Enquanto os variogramas fornecem informações de natureza preponderantemente unidirecional, os mapas são multidirecionais e permitem uma visão mais abrangente da distribuição das variáveis ao longo de determinada área. A interpolação e a construção de mapas de distribuição de probabilidades foram utilizadas por pesquisadores desse grupo (Vilela et al., 2013) na descrição da variabilidade espacial dos constituintes químicos dos óleos essenciais em populações de E. dysenterica DC. (cagaiteira) do sudeste goiano e ainda é incipiente na área de Química de Produtos Naturais Objetivos Neste trabalho a dinâmica dos metabólitos das sementes e cascas de jabuticabas resultou de fatores bióticos e abióticos, incluindo espaciais. A fim de se associar a variabilidade química e a escala geográfica, ou seja, a influência espacial pretende-se: a. Avaliar a presença de correlação espacial multivariada ao longo dos locais de amostragem. b. Aplicar os modelos de representação espacial como funções polinomiais não-ortogonais e ortogonais, além de autofunções MEM (Moran's Eigenvector Maps). c. Aplicar técnicas de ordenação e particionamento da variação com autofunções MEM. d. Modelar e predizer os teores de metabólitos por meio de variogramas e mapas de interpolação. e. Aplicar técnicas multiescala por meio de variogramas multivariados, permitindo avaliar a dependência da escala geográfica na variabilidade dos metabólitos das partes dos frutos de jabuticaba Experimental Os metabólitos da jabuticaba podem se distribuir no ambiente obedecendo algum tipo de orientação. A evidência de uma estrutura química espacial foi obtida, inicialmente, pela correlação entre as matrizes de distância Euclidiana das coordenadas geográficas dos locais de amostragem e dos constituintes químicos das partes do fruto. Este é o teste geral de Mantel (Legendre & Fortin, 1989), baseado na randomização, e utilizado para determinar a presença de uma associação linear entre matrizes de distância. Para a descrição da influência espacial utilizou-se, primeiramente, da construção de equações polinomiais para representar as tendências por meio de superfícies de respostas. Os polinômios foram obtidos a partir das coordenadas geográficas bidimensionais UTM (X,Y) dos 40

54 locais de amostragem. Três conjuntos de polinômios foram obtidos, seja pelas coordenadas centradas, não ortogonais, ou ortogonalizados pela PCA ou por algoritmos para polinômios ortogonais. Em cada conjunto foram organizados polinômios de terceiro grau completos do tipo bivariado (X+X 2 +X 3 +Y+Y 2 +Y 3 +X 2 Y+XY 2 +XY). Os 27 monômeros, representando tendências lineares, quadráticas, cúbicas ou mais complexas, foram submetidos a procedimentos de seleção para determinar aqueles que melhor representassem as tendências nos metabólitos. Como critérios de seleção foram utilizados o fator de inflação da variância da variável (VIF), o coeficiente R 2 adj e a significância das partições pela prda. A análise de tendência espacial por meio de termos dos polinômios é de difícil interpretação (Jombart et al., 2009) e incapaz de modelar corretamente os padrões em escalas geográficas finas (Bocard & Legendre, 2002). Assim utilizaram-se os Mapas de autovetores de Moran (MEM) para obter uma melhor representação nas diferentes escalas. Os MEM utilizam as coordenadas espaciais das amostras para calcular uma série de ondas senoidais semelhantes a uma decomposição de Fourier. Os autovetores são chamados de "mapas" porque seus valores podem ser mapeados usando as posições geográficas das observações. Neste trabalho foram obtidas três classes de MEM (Tabela 12), de acordo com estratégia definida por Legendre & Legendre (2012): Tabela 12. Classes de geração de mapas de autovalores de Moran (MEM). Classe de Matrizes Geradoras Comentários sobre os MEM MEM Conectividade (B) Pesos (A) Binários baseados na topologia e com 1 igual a 1 Vizinhança baseada na influência apenas de B triangulação de Delaunay* 2 f2=1-(d/dmax) Ponderados pelo inverso do poder da distância Euclidiana não-linear Baseados no variograma multivariado 3a igual a 1 Vizinhança baseada no empírico com influência apenas de B variograma multivariado 3b f2=1-(d/dmax) α Ponderados pelo inverso do poder da distância Euclidiana não-linear *triangulação com o maior ângulo mínimo, isto é, os melhores triângulos únicos entre as amostras. As duas primeiras classes baseiam-se na construção de uma matriz de conectividade (B) cujos locais de amostragem definem vértices de triângulos cujas arestas geram um círculo circunscrito aos vértices sem a inclusão de novos locais, conhecidos como triângulos de Delaunay (Toussaint, 1980). A ausência de ponderação ou a ponderação pelo inverso da distância Euclidiana definem as classes 1 e 2, respectivamente. O uso do complemento da distância, na classe 2, baseia-se no argumento de que processos ecológicos são mais fortemente associados a curtas distâncias. A terceira classe utiliza o conceito de distância ao redor de um ponto, o qual identifica pares entre pontos de amostragem a partir de um variograma multivariado da matriz resposta. Também nesse caso pode-se não ponderar (classe 3a) ou gerar uma variante (classe 3b) baseada na ponderação pelo inverso do poder da distância Euclidiana dos pontos. 41

55 Os MEM significativos de cada classe foram selecionados por um procedimento de seleção automática de variáveis, retendo-se aqueles de mais baixo valor do critério de informação de Akaike corrigido, AIC c (Hurvich & Tsai, 1989), e incorporados à matriz explicativa contendo os nutrientes das partes dos frutos e dos solos de origem. A RDA do melhor modelo baseou-se nos valores de VIF e R 2 adj como critérios nas regressões multivariadas. Os resultados da RDA e/ou das frações da variação provenientes da prda foram utilizados na construção de variogramas para estimar a magnitude da dependência espacial entre os locais de amostragem. A variância foi estimada usando a equação que define a semivariância, (h), onde n(h) é o número de pares nas classes de distância h; Z x e Z x+h são valores dos parâmetros químicos nas posições x e x+h, respectivamente (Bachmaier & Backes, 2011): Sendo o número de classes (h = 8) determinado pela regra de Sturges (Legendre & Legendre, 2012), que evita a inflação arbitrária da variação espacial explicada como uma função do tamanho da classe. O gráfico de (h) contra h fornece o variograma (Figura 11), que apresenta um comportamento aleatório ou sistemático, com este último descrito por um modelo teórico linear, esférico, exponencial ou gaussiano. Figura 10. Variograma com indicadores da variância estruturada no espaço ao longo da distância. A maioria dos modelos começa com um valor de variância acima de zero no eixo de (h), chamado pepita (C o; nugget). Se houver autocorrelação espacial, a semivariância aumenta com os intervalos de distância (classe) até atingir seu máximo, conhecido como patamar (C o+c; sill). A variância entre a pepita e o patamar é chamada de patamar parcial (C) e corresponde à parte da variância explicada pela estrutura espacial. A razão entre o patamar parcial e o patamar [C/(C o+c)] determina a força da autocorrelação espacial (variância estrutural, Q), ou seja, essa estatística fornece uma medida da proporção da variância amostral (C o+c) que é explicado pela variância espacialmente estruturada (C). Valores altos indicam um padrão espacial nos dados. Para estimar 42

56 a escala na qual a dependência espacial ocorre, estima-se a distância além da qual as amostras são independentes da distância ou intervalo entre classes. Esta distância é aquela na qual o modelo atinge o patamar, sendo conhecida como alcance ou faixa efetiva (range). Os parâmetros pepita, patamar, alcance, Q, coeficiente de determinação (R 2 ) e o seu valor ajustado (R 2 adj) foram obtidos do modelo teórico com melhor ajuste aos dados de variância. O critério de melhor ajuste baseou-se em seleção automática com parâmetros de validação cruzada como estratégia de validação. Todos os dados das amostras foram investigados para anisotropia, usando variogramas direcionais, antes do cálculo dos variogramas omnidirecionais. Na presença de dependência espacial, a distribuição espacial do parâmetro químico (Z x) pode ser expressa por meio de um mapa de interpolação linear (kriging) que fornece a melhor estimativa que minimize as variações de erro de previsão para as variáveis de resposta. Embora os mapas resultantes forneçam uma poderosa visualização do padrão espacial, optou-se também por mapas de probabilidade que excedam o valor médio das variáveis de resposta, evitando-se um excessivo nivelamento nos mapas de krigagem, além de incluir uma medida de incerteza nos mapas (Chilès & Delfiner, 1999). As probabilidades foram calculadas através de 1000 simulações condicionais sobre a distribuição prevista das variáveis de resposta. As informações do variograma sobre a distribuição espacial da variabilidade química, entretanto, nada sinaliza a respeito da escala na influência espacial. Assim, para modelar estruturas espaciais em várias escalas, utilizaram-se autofunções baseada na distância (MEM), isto é, a variabilidade química pode estar estruturada em um nível multiescalar (Wagner, 2004). Nesses casos, as comparações múltiplas da semivariância ao longo do aumento da distância foram realizadas com o nível de significância ajustado pela correção de Bonferroni (k = 0,05/n, onde n é o número classes e k a significância ajustada), evitando-se o aumento do erro tipo I. Ao final, avaliou-se a influência da escala na variabilidade química espacial por meio da técnica de ordenação em multiescala por meio de variogramas multivariados (Wagner, 2004). Envelopes descrevendo os limites de confiança em torno da semivariância empírica média foram utilizados para avaliar a independência da escala ao longo da distância. Antes das análises espaciais a matriz resposta foi transformada para log(x+1), centrada na média e destendenciada em relação às coordenadas geográficas, enquanto a matriz explicativa foi autoescalonada. Para os cálculos foram utilizados os pacotes GS+ (Geostatistics for the Environmental Sciences, versão 10.0, Gamma Design, Michigan, 2014), Canoco (Canonical Community Ordination, versão 5.0, Biometrics, The Netherlands, 2012) e o R (R Foundation for Statistical Computing, versão 3.1.2, Vienna, 2014) Resultados e Discussão A presença de uma estrutura espacial nos dados foi evidenciada pela correlação entre as distâncias Euclidianas (DE) da matriz dos metabólitos com a distância geográfica entre as 43

57 amostras de sementes (Figura 11). Os valores de distância nos pares dos sítios de amostragem variaram de 0,4 (6,1 m) entre S1(replicata1) e S1(replicata3) a 17,3 (1457,6 m) entre S3(3) e S5(1). Figura 11. Correlação entre matrizes de distância dos metabólitos (sementes) e geográfica D quím. = 0,008 D geog. + 0,0003 (r = 0,950, p < 0,0001, N = 105) Distância química Distância geográfica (m) Globalmente, as mais baixas DE dos metabólitos foram para amostras de sementes com pequenas distâncias geográficas, enquanto as mais elevadas foram observadas entre as amostras geograficamente distantes. Este resultado foi confirmado pelo teste de Mantel (Legendre & Legendre, 2012) por meio da forte correlação (R = 0,950; p = 0,001; 999 permutações), enquanto que metabólitos das cascas (R = 0,112; p = 0,818) ou do conjunto cascas/sementes (R = 0,005; p = 0,344), não apresentou qualquer correlação significativa, evidenciando ausência de autocorrelação espacial. No entanto esses testes baseiam-se em estratégias lineares, não eliminando modelos não-lineares de influência espacial nos metabólitos das cascas. A distribuição dos metabólitos, dos nutrientes minerais da semente e do solo de cultivo dos frutos, em função dos locais de coleta (Figura 12), permite visualizar a modelamento polinomial para identificar estruturações espaciais. De fato, qualquer superfície pode adequadamente ser modelada por um modelo polinomial ajustando os expoentes. Procedimentos computacionais de seleção descritos anteriormente conduziram ao monômio de característica cúbica (X 3 ), não ortogonal, como representação mais adequada dos dados espaciais das sementes de jabuticaba. Os monômios cúbicos estão associados à ocorrência de fenômenos que possuem pontos de máximo, mínimo e que retornam para um valor médio. Essa formação frequentemente é encontrada quando a área de estudo é suficientemente grande para cobrir um ciclo completo do fenômeno avaliado, indicando adequação da janela amostral (Legendre & Legendre, 2012). 44

58 Figura 12. Variações nos metabólitos, nos parâmetros de cor e nos nutrientes minerais da semente de jabuticaba em função dos solos, além dos preditores espaciais na área de estudo. Similar a esse estudo, uma tendência cúbica também foi encontrada em uma comunidade de ácaros oribatídeos (Acari: Oribatida) em Montreal (Borcard et al., 1992). Por outro lado, as cascas de jabuticaba foram modeladas com o termo do polinômio ortogonal de segundo grau (Y 2 o). Esse monômio indica que o fenômeno estruturado no ambiente é maior que a área de estudo e essa restrição de janela amostral impossibilita a avaliação adequada dos fenômenos de correlação e autocorrelação espacial para as cascas. 45

59 A utilização de polinômios não ortogonais e ortogonais em representações espaciais é problemática por várias razões, entre elas a multicolinearidade entre os monômios, a dificuldade de interpretação dos fenômenos e a incapacidade de representação das escalas espaciais em curtas distâncias. Nesse contexto a utilização dos MEM é capaz de explicar os metabólitos nas sementes de forma mais detalhada, podendo inclusive capturar toda a informação da matriz resposta. Essas autofunções ortogonais podem modelar tendências, variáveis não amostradas, correlação espacial, auto correlação e qualquer fenômeno que possua variação entre os locais coletados. Frente ao potencial representado pelo emprego dos MEM, os teores dos metabólitos nas sementes foram previamente destendenciados para remoção de qualquer gradiente linear. Esse procedimento é importante, pois potencializa a utilização das autofunções na modelagem de estruturas mais interessantes que a tendência que ao longo de um eixo de coordenada (Legendre & Legendre, 2012). A construção de autofunções para as três classes de MEM conduziu a autovalores selecionados pelo mais baixo valor do critério de informação de Akaike corrigido, AIC c. Os MEM de cada classe compuseram, com os nutrientes das sementes (Mn 2+, Cu 2+ ) e do solo de cultivo dos frutos (Mn 2+ ), a matriz explicativa para novas RDA. O conjunto de MEM mais representativo foi aquele que resultou da RDA com o menor valor do fator de inflação da variância das variáveis (VIF) e de maior coeficiente de determinação ajustado pelos graus de liberdade (R 2 adj) para a descrição dos dados químicos das sementes (Tabela 13). Tabela 13. MEM selecionados com base no critério de AIC de acordo com a classe geradora Matrizes Geradoras RDA Classe MEM* Conectividade (B) Pesos (A) VIF R 2 adj 1 triangulação de 1 2; 4; 8 9,1 0,900 2 Delaunay f2=1-(d/dmax) 1; 4 6,2 0,880 3a variograma 1 1; 8 11,9 0,959 3b multivariado f2=1-(d/dmax) α 2; 14 15,4 0,933 *Selecionados segundo o critério de informação de Akaike (AICc). Maior valor obtido entre as variáveis na RDA. A análise dos critérios anteriores conduziu ao modelo representado pelos MEM1 e MEM8 (classe 3a) obtidos a partir da distância não ponderada do variograma multivariado da matriz resposta das sementes (Figura 12). Os outros dois modelos, com duas variáveis MEM, foram descartados devido a um alto valor de VIF (classe 3b) ou por apresentar um baixo valor para o R 2 adj (classe 2), relativamente ao da classe 3a. Como os autovetores dos MEM representam uma decomposição espectral das relações espaciais entre as observações, em todas as possíveis escalas de variação ao longo de uma série espacial das amostras, eles representam diferentes escalas espaciais, sendo que os da classe 3a modelaram adequadamente o espaço entre os pontos de amostragem a longas (MEM1) e curtas (MEM8) distâncias (Figura 13). 46

60 Figura 13. Autovetores dos MEM de acordo com a classe geradora. Classe: [MEM] Autovetores dos Sítios de Amostragem (Índice) 1: [2; 4; 8] 2: [1; 4] 3a: [1; 8] 3b: [2; 14] A RDA1 foi responsável por ca. 52% da variação explicada (F = 2,0; p = 0,001) e separou as sementes provenientes dos frutos do solo S5 dos demais locais (Figura 14), principalmente pelos baixos teores de Mn 2+, umidade, fibras insolúveis e teor de cinzas e acúmulo de açúcares monoméricos (glicose e frutose) e ácido cítrico. Figura 14. Triplot da RDA dos metabólitos das sementes nos locais S1-S5 com as variáveis explicativas e preditores espaciais, MEM e polinomial (X 3 ). 47

61 Essas características estão fortemente associadas ao MEM1 (X 3 ), tal que a RDA1 descreve a variabilidade de metabólitos primários o qual se opera principalmente em uma escala longa de distância geográfica entre as amostras. Por outro lado, a RDA2 (ca. 29%; F = 3,5; p = 0,001) está principalmente associada à variabilidade de metabólitos especiais (secundários) entre os locais de amostragem a curtas distâncias (S1-S4), correlacionados ao MEM8: as sementes dos solos pobres em Mn 2+ (S1 e S4) acumulando majoritariamente polifenóis (fenóis, flavonoides e taninos totais) e sacarose, enquanto que aquelas ricas em Cu 2+ e oriundas de frutos de solos ricos em Mn 2+ (S2 e S3), apresentando os maiores teores de ácido elágico, vescalagina e castalagina, especialmente no pomar S3. Embora os dois primeiros eixos da RDA consigam representar significativamente mais de 80% dos dados avaliados, o terceiro eixo também foi significativo. Na figura 15 pode-se verificar que a RDA3 atua separando os solos S1 e S4. Essa separação está associada principalmente a maiores teores de metabólitos especiais, Mn 2+ e Cu 2+ no solo S4 quando comparado a S1. A RDA3 representou 15% da informação explicada e não pode ser desconsiderada na avaliação da variabilidade química dessas sementes. Figura 15. Triplot do primeiro e terceiro eixos da RDA dos metabólitos das sementes nos locais S1-S5 com as variáveis explicativas e preditores espaciais, MEM. 48

62 Quando se particionou a variância total dos metabólitos da semente (Figura 16), o efeito de X 3, sem sobreposição aos outros preditores, explicou e com alta significância (p < 0,005), 16,3% (fração [c]) da variância total do conjunto dos descritores (95,7%) Sua fração sobreposta com os nutrientes minerais da semente apresentou o maior percentual na partição ([e] = 35,6%). No entanto, as representações polinomiais carecem de eficiência para representar as escalas mais finas como, por exemplo, as frequências do fenômeno espacial entre as triplicatas que ocorrem em poucos metros, além de se mostrarem incapazes de capturar as estruturas que podem ocorrer entre os sítios separados por distâncias menores que 400 metros, como por exemplo, entre os solos S2 e S3. Figura 16. Frações do particionamento da variação dos metabólitos da semente de jabuticaba pelos preditores dos nutrientes e polinomial. Por outro lado, o particionamento da variação utilizando o modelo espacial com as autofunções MEM, como preditores, foi responsável por explicar 97,9% da variabilidade total nos metabólitos das sementes (Figura 17) com valores de VIF < 12. Apesar de uma maior inflação na variância total, relativamente ao modelo polinomial (VIF < 9), o uso dos MEM permitiu a decomposição das escalas, resultando em partições realizadas com quatro conjunto de preditores. 49

63 Figura 17. Frações do particionamento da variação dos metabólitos da semente de jabuticaba pelos preditores dos nutrientes e MEM. Assim a informação espacial pode ser visualizada com detalhes para as grandes (MEM1) e finas (MEM8) escalas, além daqueles preditores relacionados aos nutrientes do solo (Mn 2+ ) e das sementes (Cu 2+ e Mn 2+ ). A Figura 17 apresenta apenas as frações de partição da variância superiores a zero e mostra que o MEM1 capturou informações análogas ao monômio X 3, com os mesmos percentuais explicados para o conjunto do preditor (51,9% e p = 0,005). A análise comparativa também mostrou os mesmos valores de variância explicados pelos nutrientes minerais dos solos (27,5% e p = 0,007) e das sementes (66,4% e p = 0,007). As principais diferenças foram encontradas entre as frações individuais, sobrepostas e provenientes da MEM8. O autovalor do MEM8 foi negativo e possui uma contribuição pura pequena, porém significativa ([d] = 1,2% e p = 0,010) e a variância total explicada por este descritor não foi estatisticamente significativa (11,5%; p = 0,181). A utilização de MEM negativos e significantes não são proibitivas, embora pouco frequentes (Legendre & legendre, 2012) e a sua interpretação física geralmente está associada à autocorrelação espacial de origem biótica (Borcard et al., 2018), como competição, interação intra e interespecífica e, sendo um plantio cultivado, a origem genética ou mesmo variações fenotípicas entre as amostras. Algumas frações sobrepostas com o 50

64 MEM8 ([h]=0,5%, [k]=7,7%, [m] = 6,3%) tiveram seus valores diferentes de zero e representativos frente a variabilidade total. Isso indica um efeito conjunto dessas frações sobre os metabólitos das sementes, pois essa informação não foi possível com os modelos polinomiais. Existe também alguma variação explicada pelas variáveis espaciais independentemente do ambiente (nutrientes minerais). Esta variação é representada pelas frações [c], [d] e [j], que juntas explicam 21,9% da variação, e que podem estar associadas a variáveis ambientais não mensuradas, como a intensidade luminosa efetiva nos pomares, com alguns deles formando copas muito fechadas e, sendo espacialmente estruturada (Miehe-Steier et al., 2015), influenciariam na plasticidade química observada nas sementes. As variáveis espaciais apresentaram uma intersecção não nula, apesar do fato de serem ortogonais: a fração [j] (-2,3%) e os totais [j+m+n+o] (-4,4%). Isto ocorre devido as variáveis nutricionais da semente e do solo, que não são ortogonais ao MEM, estarem envolvidas no particionamento, além dessas frações serem obtidas por diferença nos valores de R 2 adj. Para descrever mais adequadamente a estrutura espacial da variabilidade química, especialmente quanto a influência da escala, foram obtidos os variogramas dos coeficientes canônicos dois primeiros eixos da RDA, que fornecem uma ponderação das variáveis explicativas na variabilidade dos metabólitos das sementes de jabuticaba. A utilização de variogramas é muito importante na área de Química de Produtos Naturais, embora escassamente estudados e de aplicação restrita a polifenóis e a óleos essenciais (Baluja et al., 2012, Cortell et al., 2005; Covelo & Gallardo, 2004; 2009; Vilela et al., 2013). O efeito pepita (C o) permite informações sobre fontes de erro nas medições ou na presença de quimiovariações não detectadas nas vizinhanças dos pontos de amostragem. Em adição, o variograma avalia a dependência espacial das variáveis de resposta, pela razão pepita/patamar, e a faixa efetiva da autocorrelação espacial, ambas utilizadas em programas de manejo e conservação de populações naturais (Vilela et al., 2012; 2013). Neste estudo, modelos gaussiano e esférico foram obtidos para os variogramas das RDA1 e RDA2 do modelo dos MEM, respectivamente (Tabela 14, Figura 18), confirmando a estrutura química espacial e descartando a distribuição randômica dos metabólitos das sementes nos locais amostrados. Tabela 14. Parâmetros modelados para os variogramas dos metabólitos das sementes de M. cauliflora. Variável Modelo Pepita Patamar Alcance (m) Q (%)* r 2 SQR MCD (m) RDA1 Gaussiano 0,005 0, ,2 96,8 0,914 4, ,6 RDA2 Esférico 0,001 0, ,0 99,8 0,207 0,966 50,5 *Variância estrutural (C / [Co + C]); soma do quadrado dos resíduos; distância de correlação média (3/ 8 alcance Q). 51

65 Figura 18. Variogramas da RDA1 e RDA2 das sementes de jabuticaba modeladas pelos MEM. Os resultados mostraram que ao menos 97% da variância total dos metabólitos da semente são espacialmente estruturados. Por outro lado, a proporção do efeito pepita foi maior na RDA1 (3,2%), relativamente ao da RDA2 (0,2%), o que reflete na maior dependência espacial dessa última variável de resposta (99,8%). O alcance dos variogramas diminuiu da RDA1 (1401,2 m) para a RDA2 (135,0 m), de maneira similar à distância de correlação espacial média (MCD), cerca de 10 vezes entre as duas variáveis de resposta. A MCD informa sobre a distância da dependência espacial dentro das amostras e indicou uma diminuição na dimensão da área geográfica que apresenta conteúdo similar entre metabólitos especiais, ou seja, a variabilidade no conteúdo de metabólitos como lipídeos, proteínas, açúcares, a exceção da sacarose, ácido cítrico e fibras ocorreu a distâncias mais longas que aquelas envolvendo polifenóis (fenóis, flavonoides, taninos, ácido elágico, vescalagina e castalagina) sempre que dois locais de amostragem adjacentes foram escolhidos. Esses resultados confirmam as trocas no padrão químico espacial, não somente entre as duas grandes rotas metabólicas (metabolismo primário e especial), como entre diferentes classes de uma mesma rota de biossíntese (polifenóis). As alterações quali e quantitativas nos metabólitos especiais, como os polifenóis, podem fornecer uma defesa constitutiva (deter potenciais herbívoros) ou uma resposta induzida a danos provocados por herbívoros, atraindo predadores ou parasitas (Dicke & Hilker, 2003; Jurgens et al., 2006). A faixa efetiva observada para o conjunto de dados também ocorreu em uma distância geográfica similar àquela determinada pelo autocorrelograma multivariado de Mantel (1075 m). Esse resultado contrasta com simulações numéricas (Legendre & Fortin, 2010) das quais o teste de Mantel e formas derivadas não estimaram corretamente a proporção da variação dos dados originais explicada pelas estruturas espaciais. A predição em locais não amostrados foi realizada com a técnica de krigagem para uma ótima estimativa dos pesos para o processo de interpolação. Esses pesos produzem o mínimo de erro possível na estimação. A metodologia utiliza-se do variograma para considerar parâmetros como a proximidade das amostras, a redundância entre dados amostrados, a anisotropia e a 52

66 magnitude da continuidade espacial e produzindo estimadores que combinados linearmente produzem a minimização do erro. O variograma gaussiano, encontrado para a RDA1, é caracterizado por representar fenômenos contínuos. Na região inicial desse gráfico se observa um formato quadrático (Figura 18). Diferente de outros modelos, esses variogramas produzem curvas de nível que são imagens espelhadas na área de estudo, quando utilizado para os cálculos de krigagem e interpolação (Armstrong, 1998), como pode ser observado na Figura 19. Figura 19. (A) Mapas de distribuição espacial dos metabólitos de jabuticaba de acordo com os modelos ajustados provenientes das RDA1 e RDA2. (B) Mapas dos MEM nos sítios de coleta. RDA1 RDA2 No caso da RDA2 o formato variográfico foi esférico, caracterizando mapas com regiões menores, mais espaçadas e carregando a descontinuidade presente na derivada desse variograma (Armstrong, 1998). 53

67 No presente trabalho, os mapas apresentaram maior variação entre as amostras com certas semelhanças nos padrões espaciais de duas áreas bem diferenciadas: uma área com alta variação, principalmente de metabólitos primários (RDA1), em amostras localizadas ao longo da direção Sul-Norte (S5) e outra (oeste-leste) com maior complexidade nos teores dos metabólitos especiais (RDA2). A primeira região (S5) é caracterizada por solos ricos em argila, K +, P e Fe 3+, com sementes acumulando glicose, frutose, ácido cítrico e zinco em sua composição. Essa constituição caracteriza bem o crescimento vegetativo. Por outro lado, a segunda população, posicionada na parte inferior da Figura 9, agrupa os solos ricos em areia, argila, Ca 2+, Mg 2+, Al 3+ e Mn 2+. As sementes nessa segunda são ricas, principalmente, em vários metabólitos especiais além de Cu 2+, Fe 3+, Mn 2+ e Zn 2+, discutidos no capitulo 1, de grande valor biológico agregado e que podem estar relacionados a mecanismos de defesa da planta. A krigagem, porém, pode subestimar algumas regiões e superestimar outras e, de forma análoga as médias móveis das séries temporais, suaviza os valores estimados não levando em consideração o acaso em fenômenos naturais. Assim, essa ferramenta foi bastante útil para se entender a tendência que caracteriza a diferenciação entre os metabolismos primário e especial diretamente nos locais de coleta (Figura 19). No entanto, para situações finas, como diferenciação entre vias biossintética de compostos fenólicos (RDA2), a krigagem apresentou perdas de informação que foram devidamente tratadas pelo método de simulação gaussiana sequencial. Esta técnica utiliza os procedimentos comuns de simulação de Monte Carlo e corrige o alisamento realizado pela krigagem (Pyrcz & Deutsch, 2014), favorecendo a acurácia global das estimativas em detrimento da acurácia local. Nessa simulação, a variância perdida pelo processo de krigagem é estimada pelas considerações matemáticas sobre a distribuição do erro. Existem vários motivos para se considerar a distribuição gaussiana nesse processo (Pyrcz & Deutsch, 2014), entre eles o fato de o teorema do limite central indicar que a adição sequencial de resíduos randômicos conduz a um conjunto de valores com a referida distribuição. Assim a Interpolação por simulação exige que os dados sejam inicialmente normalizados, processados e finalmente restaurados. Esse processamento conduziu ao gráfico da Figura 19, para RDA2, com valores mais precisos em regiões mais distantes dos locais amostrados e mais apropriados para entender as separações entre as vias metabólicas dos constituintes fenólicos ao longo da direção Leste- Oeste. Os modelos apresentaram uma ótima correspondência com os estimados pela validação cruzada (Figura 20): intercepto próximo de zero (0,01 para ambos, RDA 1 e RDA2), elevados valores de r 2 (0,980 e 0,932) e baixos valores de erro padrão (0,15 e 0,27, respectivamente). 54

68 Figura 20. Validação dos modelos por meio da técnica de validação cruzada. É particularmente interessante à visualização dos MEM utilizando os mapas dessas autofunções no local de coleta das amostras (Figura 20) e a representação que guarda a mesma informação (Figura 13). Os quadrados pretos representam à parte positiva da onda e os quadrados brancos a parte negativa. Comparando com a distribuição dos metabólitos e a imagem no terreno (Figura 21), observa-se que o rio Dourados separa as amostras do solo S5 dos demais. Figura 21. Imagem aérea do local de amostragem na Fazenda e Vinícola Jabuticabal. O MEM1 (e o polinômio X 3 ) representou bem essa situação e a interpolação nessa região hidrográfica apresentou valor nulo para a RDA, o que também está de acordo com o fenômeno esperado para essa realidade. A barreira física, imposta pelo rio, provoca a divisão dessas populações tornando-as independentes e adaptadas localmente (Vilela et al., 2013). O MEM8, por sua vez, representa o fenômeno modelado no mapa construído com a RDA2. Embora a RDA2 possua importante contribuição dos nutrientes da semente, a moderada multicolinearidade entre o MEM8 e o Mn 2+ e Cu 2+ foi responsável pelo formato espacial análogo 55