TÉCNICAS LABORATORIAIS EM QUÍMICA E BIOQUÍMICA Espetrofotometria de absorção molecular no visível

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1 TÉCNICAS LABORATORIAIS EM QUÍMICA E BIOQUÍMICA Espetrofotometria de absorção molecular no visível Determinação de nitritos (NO 2- ) pelo método da sulfanilamida Miguel Mourato (Coordenador) Inês Leitão Mestrado em Engenharia Zootécnica ISA, 2018/2019 1

2 Espectrofotometria Comprimento de onda ( ) Amplitude (A) Raios X (absorção, emissão, fluorescência e difração) 0,1 100 A Ultravioleta/ visível (absorção, emissão e fluorescência) nm Infravermelho (absorção e Raman) 0, m Microondas (absorção) 0,75 3,75 mm 1 A = m 1 nm = 10-9 m 1 m = 10-6 m 2

3 Espectrofotometria A zona do visível do espectro electromagnético: É a zona do espectro electromagnético visível para o olho humano (cerca de 400 a 700 nm) 3

4 Espectrofotometria A Espectroscopia baseia-se no estudo da interação entre a radiação e a matéria. Todas as partículas elementares (átomos, iões, moléculas) têm um certo conjunto único de níveis energéticos discretos, o mais baixo dos quais é o estado fundamental (à temperatura ambiente a maior parte das partículas elementares está no estado fundamental). Energia Estado excitado Radiação com energia correspondente à diferença entre os níveis energéticos da espécie Estado fundamental M + h M* (passados cerca de 10-6 a 10-9 s) M* M + calor ou M* decomposição fotoquímica ou M* reemissão de radiação (por fluorescência ou fosforescência) 4

5 Espectrofotometria Tipos de espectroscopia: -Atómica - Molecular - Absorção - Emissão - Ultravioleta - Visível - Infravermelho

6 Espectrofotometria de absorção molecular Absorção molecular: As moléculas sofrem três tipos de transições quantizadas: Transições eletrónicas provocadas pela absorção de radiação ultravioleta e visível (desde que a energia dos fotões incidentes seja exatamente igual à diferença de energia entre as duas orbitais) Transições vibracionais devido aos diferentes tipos de vibração que uma molécula pode sofrer. As diferenças de energia entre os diferentes níveis vibracionais são muito mais baixas que entre os níveis de energia para as transições eletrónicas (basta radiação na zona do infravermelho). Transições rotacionais devido ao movimento de rotação das moléculas. As diferenças de energia entre os diferentes níveis rotacionais são muito mais baixas que entre os níveis de energia para as transições vibracionais. 6

7 energia Espectrofotometria de absorção molecular Absorção molecular: Devido ao elevado numero de níveis energéticos, as diversas linhas de absorção juntam-se para formar bandas continuas. Isto também se deve às moléculas estarem em solução e a sua colisão com as moléculas do solvente leva à dispersão das energias dos níveis. E E 0 IV Visível (UV) Estados vibracionais Estados rotacionais 7

8 Aplicações da espetrofotometria Análise Qualitativa Análise Quantitativa: Lei de Beer Absorvância A =.b.c Absortividade molar (L.mol -1.cm -1 ) Concentração da espécie absorvente (mol.l -1 ) Espessura da substância atravessada pela radiação (cm) Moléculas Radiação Incidente (de um certo λ) 0 A 12 Radiação que atravessa ( < 0 ) Transmitância (%): Absorvância: T A log T log 0 cuvette 8

9 Abs a 275 nm Utilização prática da Lei de Beer ou reta padrão 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Curva de Calibração y = 9,4115x + 0,0116 R² = 0, ,02 0,04 0,06 0,08 Concentração (M) melhor reta que passa pelos pontos experimentais determinada pelo método dos mínimos quadrados a calibração deve ser repetida periodicamente Soluções de concentração conhecida (devem ter uma composição próxima da solução a analisar; devem-se fazer replicados) 9

10 Determinação experimental da Absorvância b erdas por dispersão na solução 0 erdas por reflexão nas interfaces Solução absorvente de concentração c Solvente (branco) branco A log log branco 0 solução 0 solução T solução branco 0 Solução a analisar 10

11 Determinação experimental da Absorvância - Espectrofotómetro de feixe duplo O monocromador está antes da célula de modo a evitar fotodecomposição se toda a energia radiante incidisse na amostra Célula de referência Detector 1 Fonte de radiação Filtro ou Monocromador Detector 2 Leitor Espelho Célula da amostra (terá de ser transparente na gama de radiações utilizadas: plástico, vidro, quartzo ) 11

12 Determinação de nitritos (NO 2- ) Quando os nitritos são adicionados aos alimentos, sofrem transformações complexas, originando muitas espécies químicas diferentes, sendo difícil ter um método que as determine com rigor. Existem vários métodos, cada um com as suas vantagens e desvantagens: Reação de Griess (espectrofotometria) Métodos cromatográficos Métodos eletroquímicos Espectroscopia ER (Electron paramagnetic resonance) Ressonância Magnética Nuclear (RMN) The use of nitrite as a food preservative represents a problem of balancing risks. It is difficult to assess these risks until the mechanisms of action are better understood. Despite over 50 years of research, the actions of this compound are not clear. Cammack et al., Nitrite and nitrosyl compounds in food preservation, Biochimica et Biophysica Acta 1411 (1999)

13 Determinação de nitritos (NO 2- ) pelo método da sulfanilamida (reação de Griess) A maior parte dos compostos não absorve radiação suficiente para se poder medir a absorvância diretamente. Neste caso pode-se fazer reagir o analito com outra substância para produzir uma substância que absorva radiação que possa ser medida. Os nitritos vão reagir com aminas aromáticas para formar sais de diazonio. No método que vai ser efetuado, os nitritos vão reagir com a sulfanilamida para dar p-diazobenzenosulfonamida H 2 NO NH + NO - 2 S 2 H N 2 2 NO 2 S + + 2H + N + 2H 2 O De seguida faz-se reagir este composto com N-(1-naftil)-etilenodiamina (NED) para formar um composto de cor avermelhada, que absorve radiação a 543 nm H 2 NO 2 S + N N + NHCH 2 CH 2 NH 2 H 2 NO 2 S N N NHCH CH NH + H

14 Determinação de nitritos (NO 2- ) pelo método da sulfanilamida (reação de Griess) 543 nm Absorbance (cm -1 ) Conc (mg/l) Absorbance (cm -1 ) Wavelength (nm) Nitrite Conc. (mg/l as N Espectro de absorção do composto corado derivado dos nitritos e respectiva curva de calibração. 14

15 Determinação de nitritos (NO 2- ) pelo método da sulfanilamida (reação de Griess) Qual o interesse da determinação de nitritos em produtos alimentares? 15

16 Determinação de nitritos (NO 2- ) pelo método da sulfanilamida (reação de Griess) Aditivos Os mais adicionados: o nitritos de potássio (E 249) o nitritos de sódio (E 250) o nitratos de sódio (E 251) o nitratos de potássio (E 252) Funções: o Conservantes (inibição da peroxidação lipídica, evitando a rancificação). o Intensificadores/fixadores de cor (avermelhado característico da carne). o Inibidores do desenvolvimento microbiano (Clostridium botulinum). Adaptado de uma apresentação realizada por Maria João Bule e Inês Mendes, no âmbito da UC Nutrição e Toxicologia Alimentar, a 95% do total de nitritos ingerido pelo Homem provêm de produtos cárneos. 16

17 Determinação de nitritos (NO 2- ) pelo método da sulfanilamida (reação de Griess) Nitritos e nitratos utilizados como conservantes alimentares Nº E Designação Fórmula Química roduto Alimentar Qtdd Adicionada (mg/kg) Qtdd residual (mg/kg) E249 Nitrito de potássio KNO2 rodutos salgados e de salsicharia (sangue), enchidos sem trat. térmico, curados e secos E250 Nitritos de sódio NaNO2 Salgados/salsicharia (sangue) e outros enchidos; produtos á base de carne em conserva. Foie gras. Toucinho fumado. (bacon) E251 Nitrato de sódio NaNO3 E252 Nitrato de potássio KNO3 Fumados/salsicharia.. rod. base de carne em conserva. Queijo, sucedâneos de queijo (à base de prod. lácteos). Conservas Adaptado de uma apresentação realizada por Maria João Bule e Inês Mendes, no âmbito da UC Nutrição e Toxicologia Alimentar,

18 reparação da curva de calibração Balão Volume de solução diluída de nitrito (ml) ,2 3 0,5 4 1,0 5 3,0 6 5,0 7 7,0 Encher os balões com água destilada até ao traço. 18

19 reparação de todas as amostras reparação da leitura para todos balões tanto de amostra como padrões. Curva adrão Amostra Adicionar 1 ml da solução de sulfanilamida a cada balão, agitar e aguardar 5 minutos. 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml Adicionar a cada balão 1 ml da solução de N-(1-naftil)- etilenodiamina dihidroclorica, agitar e aguardar 10 minutos. Leitura da absorvância a 540 nm 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml 19

20 Absorvância Curva de calibração 0,400 0,350 0,300 0,250 0,200 0,150 y = 2,604x - 0,0007 R² = 0,9995 0,100 0,050 0,000 0,000 0,020 0,040 0,060 0,080 0,100 0,120 0,140 0,160 Concentração (mg/l) 20

21 Apresentação dos resultados mg/l Balão de 500 ml Massa da amostra colocada no Erlenmeyer mg/kg 21