EFEITOS DAS PROTEÍNAS DO PLASMA SEMINAL EQÜINO COM MASSA SUPERIOR A 10 kda SOBRE A CONGELABILIDADE DO SÊMEN, REAÇÃO INFLAMATÓRIA UTERINA E FERTILIDADE

Transcrição

1 EFEITOS DAS PROTEÍNAS DO PLASMA SEMINAL EQÜINO COM MASSA SUPERIOR A 10 kda SOBRE A CONGELABILIDADE DO SÊMEN, REAÇÃO INFLAMATÓRIA UTERINA E FERTILIDADE MARCUS ANTONIO PESSANHA BARRETO UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE CAMPOS DOS GOYTACAZES RJ FEVEREIRO 2007

2 EFEITOS DAS PROTEÍNAS DO PLASMA SEMINAL EQÜINO COM MASSA SUPERIOR A 10 kda SOBRE A CONGELABILIDADE DO SÊMEN, REAÇÃO INFLAMATÓRIA UTERINA E FERTILIDADE MARCUS ANTONIO PESSANHA BARRETO Tese apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense, como parte das exigências para obtenção do título de Doutor em Produção Animal. Orientador: Prof. José Frederico Straggiotti Silva CAMPOS DOS GOYTACAZES RJ FEVEREIRO 2007

3 EFEITOS DAS PROTEÍNAS DO PLASMA SEMINAL EQÜINO COM MASSA SUPERIOR A 10 kda SOBRE A CONGELABILIDADE DO SÊMEN, REAÇÃO INFLAMATÓRIA UTERINA E FERTILIDADE MARCUS ANTONIO PESSANHA BARRETO Tese apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense, como parte das exigências para obtenção do título de Doutor em Produção Animal. Em 05 de Março de Comissão Examinadora: Prof. Aldo Shimoya (D.Sc., Genética e Melhoramento) - UNIVERSO Prof. Cláudio Andres Retamal Martines (D.Sc., Biologia da Reprodução) - UENF Prof a. Reginaldo Silva Fontes (D.Sc., Reprodução Animal) - UENF Prof. José Frederico Straggiotti Silva (D.Sc., Reprodução Animal) UENF (Orientador)

4 A minha esposa Mara pelo companheirismo e dedicação As minhas lindas filhas Mariana e Gabriela por encherem minha vida de alegria Aos meus pais Manoel Antonio e Arli DEDICO ii

5 AGRADECIMENTOS A Deus, pelo dom da vida. À Universidade Estadual do Norte Fluminense (UENF) e ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias (CCTA), pelo oferecimento deste curso. Ao professor José Frederico Straggiotti Silva, homem cujo coração não cabe no peito, que além de orientador tenho o prazer de tê-lo como amigo. Ao grande amigo Dr. José Renato Costa Caiado, irmão de coração. Ao meu amigo Bruno Fagundes, pela sua amizade mostrando-se presente em todos os momentos, sem medir esforços para ajudar. Ao amigo Dr. Guilherme Valente que sempre se colocou a disposição para colaborar com a realização deste trabalho. Ao Vinícius Motta e Felipe estagiários dedicados. Aos companheiros de trabalho no LRMGA Médicos Veterinários João Gomes, Carla Sobrinho e Fausto Carvalho, pelo excelente convívio em nosso local de trabalho, amizade e acima de tudo pelo apoio nas horas certas. Ao Sr. Washington Teixeira de Oliveira que com tanta presteza abriu as portas do Haras Lugavi propiciando a realização deste trabalho. Àqueles que contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste trabalho. iii

6 BIOGRAFIA Marcus Antonio Pessanha Barreto, filho de Manoel Antonio Manhães Barreto e de Arli Pessanha Barreto, nasceu em 6 de abril de 1973, na cidade de Campos dos Goytacazes RJ. Em março de 1988 iniciou o curso Técnico em Agropecuária, no Colégio Estadual Agrícola Antonio Sarlo em Campos dos Goytacazes, onde se formou em dezembro de Em março de 1994 iniciou o curso de Medicina Veterinária na Universidade Estadual do Norte Fluminense, onde se formou em dezembro de Foi admitido em março de 1999 no Curso de Pós-Graduação em Produção Animal, ao nível de Mestrado, na área de Reprodução Animal, da Universidade Estadual do Norte Fluminense (UENF), em Campos dos Goytacazes RJ, submetendo-se a defesa de tese para conclusão do curso em fevereiro de Em março de 2002, deu início ao Curso de Pós-Graduação em Produção Animal, ao nível de Doutorado, na área de Reprodução Animal, da Universidade Estadual do Norte Fluminense (UENF), em Campos dos Goytacazes RJ, submetendo-se à defesa de tese, para conclusão do curso, em março de iv

7 RESUMO BARRETO, MARCUS ANTONIO PESSANHA, D.Sc. Universidade Estadual do Norte Fluminense; fevereiro de 2007; Influência das proteínas do plasma seminal eqüino com massa superior a 10 kda sobre a criopreservação dos espermatozóides, reação inflamatória uterina e fertilidade; Professor Orientador: José Frederico Straggiotti Silva. O presente trabalho objetivou avaliar os efeitos da adição de um pool de proteínas do plasma seminal concentradas no diluente de congelamento sobre a congelabilidade do sêmen eqüino, resposta inflamatória uterina e fertilidade. Foram avaliados cinco tratamentos: no tratamento1 (controle) o sêmen foi congelado no diluente Botu-Crio ; no tratamento 2 foi realizada a adição de 10% de solução de BSA (130 mg de albumina sérica bovina para cada mililitro de diluente de congelamento) ao diluente de congelamento (Botucrio ); no tratamento 3 foi adicionado 20% de solução de BSA (130 mg de albumina sérica bovina para cada mililitro de diluente de congelamento) ao diluente de congelamento (Botucrio ); no tratamento 4 (PPS 10%) foi adicionado 10% (v/v) de proteínas do plasma seminal ao mesmo diluente; no tratamento 5 (PPS 20%) foi adicionado 20% (v/v) de proteínas do plasma seminal ao diluente Botu-Crio. A adição das proteínas do plasma seminal afetou de uma maneira dose dependente a motilidade espermática. O tratamento BSA 10% apresentou as maiores médias de motilidade total mostrandose estatisticamente superior aos tratamentos BSA 20% e PPS 20%. Com relação à motilidade progressiva o tratamento BSA 10% apresentou a maior média, entretanto esta diferença não foi significativa em relação ao tratamento controle. Na avaliação v

8 da funcionalidade da membrana plasmática o tratamento BSA 20% proporcionou a maior proteção, mostrando-se superior aos tratamentos controle, PPS 10% e PPS 20. A avaliação da resposta inflamatória uterina mostrou que não houve influência das proteínas do plasma seminal na intensidade nem na duração da resposta uterina avaliada através da citologia. Também não encontramos efeito do tratamento PPS 10% sobre a fertilidade do sêmen. Concluímos que a adição do concentrado de um pool de proteínas do plasma seminal não melhorou os parâmetros espermáticos avaliados neste trabalho, não afetou a resposta inflamatória, nem a fertilidade. Palavras-chave: Plasma seminal, proteínas, albumina, sêmen, eqüino, criopreservação. vi

9 ABSTRACT The aim of this work was evaluate the effect of seminal plasma proteins pool concentrated addition on equine frozen semen extender, uterine inflammatory response and fertility. It was evaluated five treatments: On treatment 1 (control) semen was frozen on Botu-Crio extender; on treatment 2, it was added 10% of BSA (130 mg/ml of Botu-Crio extender) on treatment 3, it was added 20% of BSA (130 mg/ml of Botu-Crio extender) on treatment 4 (PPS 10%), it was added 10% of seminal plasma proteins to Botu-Crio extender; on treatment 5 (PPS 20%), it was added 20% of seminal plasma proteins to Botu-Crio extender. The addition of seminal plasma proteins affect sperm motility according to the dosage. The BSA 10% treatment showed the highest averages of total motility with statistically significance difference in regard to treatments 3 and 5. The treatment 2 showed the highest average of progressive motility but it was not statistically different of control treatment. In the plasmatic membrane functionality evaluation, the treatment BSA 20% showed better protection than others treatments. Uterine inflammatory evaluation showed that there was no influence of seminal plasma proteins on polymorphonuclear neutrophil uterine response intensity or duration. There was no effect of treatment PPS 10% on semen fertility. We conclude that addition of a protein seminal plasma pool concentrated didn t improve the sperm parameters evaluated in this work, neither the polymorphonuclear neutrophil uterine response or fertility. Key-word: Seminal plasma, protein, albumin, equine, semen, cryopreservation vii

10 SUMÁRIO RESUMO v ABSTRACT vii 1 INTRODUÇÃO 01 2 REVISÃO DE LITERATURA Plasma seminal Albumina sérica bovina Membranas espermáticas Crioprotetores Resfriamento e choque térmico Congelamento Descongelamento Reação inflamatória uterina Mecanismos de limpeza Transporte de espermatozóides até o sítio de fecundação Momento da inseminação 22 3 MATERIAL E MÉTODOS Experimento Animais Delineamento experimental Sêmen Plasma seminal Concentração do plasma seminal Determinação da concentração de proteínas do plasma seminal Albumina sérica bovina Congelamento Descongelamento Motilidade espermática Funcionalidade da membrana plasmática Integridade de acrossoma Experimento Animais e procedimentos gerais Congelamento do sêmen Delineamento experimental 31 viii

11 3.2.4 Inseminação artificial Avaliação da reação inflamatória endometrial Diagnóstico de gestação Análise estatística 33 4 RESULTADOS e DISCUSSÃO 34 5 CONCLUSÃO 50 6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 51 ix

12 1 1. INTRODUÇÃO Existe um crescente interesse no uso da inseminação artificial com sêmen congelado na espécie eqüina. Também é crescente o número de associações que permitem o uso desta tecnologia. A criopreservação aumenta a disponibilidade de espermatozóides, facilitando os trabalhos de reprodução assistida, pois a qualquer momento, pode-se lançar mão de doses de sêmen, devidamente acondicionadas em um botijão de nitrogênio e realizar o trabalho desejado. Tal facilidade é um dos fatores responsáveis pelo aumento do interesse pelo uso de sêmen congelado. Dentre as inúmeras vantagens da criopreservação, destacam-se: a otimização do uso de garanhões com comprovada superioridade genética, com a possibilidade do armazenamento de sêmen mesmo fora da estação de monta e a quebra das barreiras geográficas, tornando-se possível à remessa de sêmen para qualquer parte do planeta. Por outro lado, o potencial de fertilização do sêmen criopreservado torna-se comprometido para a maioria dos garanhões. Segundo SAMPER (1995), uma das mais importantes razões que impedem que o sêmen eqüino congelado seja usado em larga escala é a grande variabilidade na habilidade do sêmen de diferentes garanhões em tolerar o processo de congelamento e descongelamento. Apenas 25% dos garanhões apresentam uma taxa de concepção comparável a que se obtém quando se usa monta natural ou inseminação com sêmen fresco (AMANN e PICKETT, 1987). O número médio de ciclos estrais por gestação tende a aumentar

13 2 e a taxa de gestação por ciclo tende a diminuir, quando éguas são inseminadas com sêmen congelado-descongelado, em comparação ao uso da cobertura natural ou inseminação com sêmen fresco (SQUIRES et al., 1999). Seja através da monta natural ou da inseminação artificial, o sêmen é depositado diretamente no útero de éguas, o que aumenta as chances de uma contaminação seja por bactérias ou por componentes seminais, resultando em inflamação uterina, que é caracterizada pelo influxo de neutrófilos polimorfonucleares no lúmen uterino. A maioria das éguas é capaz de eliminar os produtos da inflamação causada pelo sêmen ou bactérias que tenham alcançado o útero durante a cobertura ou inseminação artificial. É vital que a limpeza uterina ocorra precocemente para que, ao chegar ao útero por volta do quinto dia pós-ovulação, o embrião encontre um ambiente apropriado para seu desenvolvimento. Tem sido mostrado que o plasma seminal possui um efeito modulatório na resposta inflamatória pós-cobertura e que a proteção conferida aos espermatozóides através do plasma seminal pode ser benéfica, principalmente, por ocasião de uma segunda cobertura ou inseminação durante o mesmo cio, quando os espermatozóides encontram um ambiente uterino hostil, decorrente da resposta inflamatória, desencadeada pela cobertura ou inseminação subseqüente. Grande parte do plasma seminal é retirada durante a preparação do sêmen para o processo de criopreservação. Talvez isto explique a resposta inflamatória mais acentuada, quando se utiliza sêmen criopreservado. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da adição de um pool de proteínas do plasma seminal com massa superior a 10 kda concentradas dez vezes sobre o congelamento de espermatozóides eqüinos, resposta inflamatória uterina e fertilidade.

14 3 2- REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Plasma seminal O plasma seminal eqüino se constitui de secreções provenientes do epidídimo, ampola, próstata, vesícula seminal e glândula bulbouretral, na qual os espermatozóides estão suspensos no momento da ejaculação (SAMPER, 2000). Proteínas do plasma seminal são adsorvidas na superfície de espermatozóides que sofreram choque térmico, revertendo as alterações de membrana oriundas do stress térmico (OLLERO et al., 1997). PEREZ-PE et al., (2001) estudaram os efeitos da adição de proteínas do plasma seminal com peso superior a 3Kda a espermatozóides livres de plasma seminal pela técnica dextran/suwin-up submetidos ao choque térmico. Concluíram que as proteínas do plasma seminal foram eficientes na proteção dos espermatozóides contra o choque térmico, medido pela integridade de membranas. Além disso, tal efeito benéfico foi dependente da concentração de proteínas, pois os melhores resultados foram obtidos com maiores concentrações de proteínas (2,1 mg de proteínas com massa superior a 3 kda em 0,5 ml de amostra). O plasma seminal é uma rica fonte de anti-oxidantes com o potencial de proteger os espermatozóides do ataque oxidativo durante a estocagem. O plasma seminal reduz os danos causados pelas espécies reativas de oxigênio, diminuindo a ocorrência de fraturas nas moléculas de DNA e a peroxidação dos lipídeos (POTTS et al., 2000).

15 4 BAUMBER et al. (2002) mostraram que espermatozóides eqüinos podem gerar espécies de oxigênio reativo e que a produção destes aumenta com o processo e criopreservação, concorrendo para uma fragmentação do DNA espermático. Segundo BALL et al. (2001), o plasma seminal possui sistemas de remoção de espécies reativas de oxigênio (ROS), sendo a catalase um destes sistemas. KOSKINEN et al. (2002) relataram melhor sobrevivência dos espermatozóides com maiores níveis de catalase. RAIJMAKERS et al. (2003) quantificaram a glutationa e observaram maiores níveis no plasma seminal de machos férteis, além disso, a motilidade bem como a morfologia dos espermatozóides foi melhor mantida com maiores concentrações de glutationa que é um tripeptídeo que serve como co-fator para glutationa peroxidase e glutationa S- transferase e tem função na proteção contra danos oxidativos e toxinas. Embora os efeitos do plasma seminal nas funções dos espermatozóides tenham sido largamente estudados, os resultados são contraditórios (PEREZ-PE et al 2001). A influência do plasma seminal na criopreservação de sêmen não está, ainda, bem definida, pois enquanto alguns trabalhos relatam benefícios do plasma seminal, outros postulam que o mesmo provoca efeitos maléficos aos espermatozóides e por isso deve ser excluído ou mantido em pequenas frações. NISHIKAWA (1975) sugere a remoção do plasma seminal antes do congelamento objetivando manter a motilidade pós-descongelamento. Este autor relaciona o efeito negativo do plasma seminal com a alta concentração de cloreto de sódio encontrada no mesmo. VIDAMENT et al. (2001) recomenda a remoção do plasma seminal antes do resfriamento e armazenamento a 5ºC. A centrifugação do sêmen antes do seu congelamento é um procedimento padrão, usado para concentrar o sêmen e remover o plasma seminal e seus possíveis efeitos nocivos. Entretanto, devem ser consideradas diferenças entre garanhões, com relação à composição e qualidade do seu plasma seminal, pois para alguns, o efeito pode ser benéfico, enquanto para outros o plasma seminal pode ser prejudicial ao congelamento (AURICH et al., 1998). A adição de plasma seminal de garanhões com boa congelabilidade ao sêmen de garanhões com baixa motilidade espermática após congelamentodescongelamento aumentou significantemente a motilidade progressiva do segundo grupo (AURICH et al., 1996). A integridade de membrana foi melhor mantida e, além

16 5 disso, a adição de plasma seminal de garanhões de baixa congelabilidade diminuiu a motilidade progressiva dos garanhões com boa motilidade pós congelamentodescongelamento. Os componentes do plasma seminal responsáveis pela boa congelabilidade do sêmen permanecem desconhecidos e as diferenças individuais no conteúdo destas substâncias estabilizadoras no plasma seminal podem explicar as diferentes capacidades de congelamento entre garanhões (AURICH et al., 1996). KATILA et al. (2002) realizaram coletas fracionadas de sêmen de três garanhões e congelaram na presença de 20% de plasma seminal autólogo e na ausência do mesmo. O sêmen de dois garanhões apresentou maior motilidade total e progressiva na presença do plasma seminal, enquanto que para o terceiro garanhão o plasma seminal não teve efeito sobre o congelamento. FAGUNDES (2003) observou que a adição de proteínas do plasma seminal, com massa molecular superior a 10 kda concentradas 10 vezes, ao diluente de congelamento melhora as características espermáticas pós-descongelamento enquanto que o congelamento com proteínas de massa molecular inferior a 10 kda teve efeito prejudicial à motilidade e integridade acrossomal. AZERÊDO et al. (2001) obtiveram melhor motilidade e integridade de membranas tanto no sêmen fresco quanto congelado na presença de plasma seminal. Segundo MAXWELL et al. (1997), o plasma seminal aumentou a viabilidade e integridade de membrana durante o processamento de espermatozóides no citômetro de fluxo. TROEDSSON et al. (2002) demonstraram que o plasma seminal reduz significantemente a ligação entre espermatozóides e polimorfonucleares, quando espermatozóides são incubados (in vitro) na presença de secreções de útero inflamado. ALGHANDI et al. (2000) relataram que secreções coletadas do útero de éguas 6, 12 e 24h após inseminação com um bilhão de espermatozóides suprimiram a motilidade espermática quando comparado com secreções coletadas antes da inseminação. Além disso, secreções uterinas ricas em PMNs (que não sofreram centrifugação) tiveram maior efeito supressor na motilidade que secreções livres de PMNs (centrifugadas). Atribuíram tal fato à ligação entre PMNs e espermatozóides. TROEDSSON et al. (2002) após terem provocado uma resposta inflamatória no útero de éguas por meio de inseminação artificial com sêmen morto, inseminaram estas mesmas éguas doze horas após, com sêmen de um garanhão de fertilidade conhecida, sendo que após 10 minutos de centrifugação a 400 X g, os espermatozóides (500 x 10 6 por dose) foram ressuspendidos em 30 ml de diluente

17 6 de sêmen (KENNEY, 1975) ou 30 ml de plasma seminal. Apenas uma égua, de um total de 22, tornou-se prenhe após ter sido inseminada na ausência de plasma seminal, enquanto que dezessete de 22 éguas (77%) tornaram-se prenhes quando o plasma seminal foi adicionado à dose inseminante. Segundo DAHMS e TROEDSSON (2002), o efeito supressivo do plasma seminal na fagocitose de espermatozóides por polimorfonucleares é mediado por dois mecanismos distintos. Estudos realizados por estes pesquisadores mostraram que a opsonização foi marcadamente suprimida pelo plasma seminal e que um mecanismo de ligação entre polimorfonucleares e espermatozóides eqüinos, independente de opsonização, parece ser responsável por uma quase completa inibição da fagocitose de espermatozóides opsonizados, pois a adição de plasma seminal a uma solução de espermatozóides e polimorfonucleares bloqueou quase completamente a fagocitose (1,0 + 0,71%), quando comparado com o controle (71,8 + 3,5%) sem plasma seminal. FIALA et al. (2002) estudaram os efeitos da infusão de plasma seminal e diluente à base de leite no útero de éguas, concluindo que ambos promovem uma resposta inflamatória uterina aguda. Entretanto quando o plasma seminal foi utilizado a resposta inflamatória aumentou progressivamente até quatro horas e regrediu após vinte e quatro horas. Por sua vez, a resposta inflamatória induzida pelo diluente à base de leite continuou a aumentar até vinte e quatro horas após a infusão. Estes resultados sugerem que o plasma seminal não inibe a resposta inflamatória, que afinal tem importante função a desempenhar na limpeza uterina, entretanto, o plasma seminal pode afetar a duração do processo inflamatório, diminuindo sua duração, o que poderia beneficiar as éguas susceptíveis à persistência da reação inflamatória induzida por sêmen. A adição de plasma seminal ao meio usado para colher espermatozóides da porção caudal do epidídimo de garanhões aumentou a motilidade total dos mesmos, embora tal efeito não tenha sido sustentado por mais que seis horas (TIPLADY et al., 2002). O tratamento térmico do plasma seminal (45 minutos em banho-maria a 95 C) suprime o efeito modulatório do plasma seminal na fagocitose de espermatozóides eqüinos por neutrófilos polimorfonucleares (DAHMS e TROEDSSON, 2002).

18 7 2.2 Albumina sérica bovina A albumina sérica bovina (BSA), uma proteína plasmática sangüínea usada na constituição de diluentes do sêmen de diferentes espécies de animais domésticos, é conhecida por suas propriedades estimulantes e preservativas sobre a motilidade espermática (MÜLLER, 1992). Seu efeito está associado à hiperflagelação celular (FRAZER, 1985) e à alteração da composição lipídica da membrana plasmática do espermatozóide (LANGLAIS e ROBERTS, 1985). Admite-se que as macromoléculas como a BSA exerçam proteção das membranas celulares contra choque térmico, variações de ph e da pressão osmótica. A albumina sérica bovina parece exercer efeito protetor através da remoção de catabólitos que são capazes de lesar a membrana plasmática (WEBER, 1989). A albumina sérica bovina é largamente utilizada como suplemento de meio de capacitação e fertilização, em parte, devido à contaminação deste com outros componentes presentes no soro (MAURER, 1992; BAVISTER, 1995). É possível que em espermatozóides de eqüinos a albumina sérica bovina extinga parcialmente a ação do cálcio ionóforo, reduzindo sua eficiência em causar mudanças semelhantes à capacitação. Em contraste a isto, alta concentração de BSA aumenta a capacitação de espermatozóides de bovinos (PARRISH et al., 1989). MATSUOKA et al. (2006) verificaram uma melhor motilidade e viabilidade pósdescongelamento de espermatozóides ovinos quando adicionaram ao diluente de congelamento 10 a 15 % de BSA, ao comparar com o diluente de congelamento convencional a base de gema de ovo. KREIDER et al., (1985) utilizaram sete garanhões sexualmente maduros para testar a motilidade das células espermáticas do sêmen mantido resfriado ao adicionar 3 % de BSA no plasma seminal ou diluente a base de leite. Os dados mostraram que a BSA protegeu os espermatozóides dos efeitos nocivos da peroxidação lipídica, chegando, estes autores, a conclusão que a inclusão de BSA nos diluentes seminais pode prolongar a manutenção da motilidade espermática. A concentração apropriada de BSA para o congelamento de sêmen eqüino ainda não foi determinada.

19 8 2.3 Membranas Espermáticas A integridade da membrana plasmática é de crucial importância para o funcionamento da célula espermática. Esta membrana forma uma barreira semipermeável e serve para manter e modular a composição intracelular. A membrana protege a célula contra influências extracelulares, tanto no trato genital do macho como no da fêmea, além de influências não fisiológicas como as do diluente, durante a criopreservação da célula espermática. Uma adequada função da membrana plasmática é essencial para a sobrevivência da célula espermática durante o seu trajeto até o ovócito no local de fertilização (EINARSSON, 1992). PARKS e GRAHAM (1992) relataram que as membranas dos espermatozóides têm de resistir a uma variedade de estresses durante o congelamento e descongelamento. Isto inclui a adição de crioprotetores, mudanças volumétricas associadas com estiramento e encolhimento da membrana em resposta a soluções crioprotetoras hiperosmóticas, desidratação induzida pelo congelamento, elevada concentração de solutos e formação intracelular de cristais de gelo. ZAHN et al. (2002) obtiveram maior integridade de membrana através da incorporação de colesterol (methyl-β-cyclodextrin complex) ao diluente antes do congelamento, por outro lado, tal procedimento teve um efeito negativo na fertilidade, reduzindo a taxa de prenhes de 75% (grupo controle) para 25%. A reação de acrossoma foi suprimida pelo colesterol, tanto imediatamente quanto noventa minutos após o descongelamento, o que pode explicar a diminuída fertilidade. Segundo FLESCH e GADELLA (2000), as alterações sofridas pelas membranas espermáticas durante o processo de criopreservação afetam negativamente as funções espermáticas no trato genital feminino (ligação a células epiteliais do oviduto, capacitação, reação do acrossoma, ligação penetração na zona pelúcida do ovócito). Espermatozóides que passaram pelo processo de congelamentodescongelamento parecem ter maior fluidez em suas membranas, que por sua vez, podem se tornar mais fusogênicas (WATSON, 1995). Alterações de membrana induzem mudanças no acrossoma, concorrendo para uma diminuição da sobrevida do espermatozóide, diminuindo a longevidade e a capacidade de fecundação quando inseminados (MARSHBURN et al.,1992).

20 9 NEILD et al. (2003) estudando as mudanças sofridas pelas membranas espermáticas durante cada estágio do protocolo de criopreservação de sêmen eqüino, incluindo o descongelamento, relataram que o número de espermatozóides vivos/capacitados não foi alterado em nenhum dos estágios, entretanto, o número de espermatozóides vivos com acrossoma reagido aumentou quatro vezes. Sugerindo que a subpopulação de espermatozóides capaz de se ligar à zona pelúcida aumenta com o processo de criopreservação, apesar da diminuição da quantidade total de espermatozóides vivos. Durante o processo de capacitação e reação de acrossoma, ocorrem mudanças na organização e composição dos lipídios da membrana plasmática, sendo estas mudanças necessárias para que o espermatozóide possa se ligar e penetrar na zona pelúcida e iniciar a formação do zigoto (FLESH e GADELLA, 2000). A capacitação envolve a remoção de substâncias que cobrem o espermatozóide ejaculado (fatores decapacitantes), modificações na organização da membrana plasmática e no metabolismo celular (COLENBRANDER et al., 2002). O processo de capacitação espermática, in vitro, requer bicarbonato, embora seja difícil provar que o mesmo ocorra in vivo, o fluido da cauda do epidídimo é praticamente desprovido de bicarbonato (<1mM), enquanto que na ampola do oviduto de éguas sua concentração alcança 25 mm. Um dos efeitos do bicarbonato nos espermatozóides eqüinos é uma rápida desorganização dos fosfolipídios, quando ocorrem deslocamentos de lipídeos, de um para outro folheto da membrana (GADELLA e HARRISON, 2000). COLENBRANDER et al. (2002) mostraram que o colesterol é o lipídio predominante na membrana plasmática de espermatozóides eqüinos não capacitados, correspondendo a 37,4% do conteúdo total de lipídeos. A capacitação induzida pelo bicarbonato teve pouco efeito na concentração de colesterol na membrana. Entretanto, quando o bicarbonato foi utilizado juntamente com albumina sérica bovina, ocorreu uma queda de 45% na quantidade de colesterol, ao passo que os outros lipídeos de membrana não foram afetados em sua quantidade, mas sim na distribuição entre os dois folhetos da membrana.

21 Crioprotetores Em 1789, SPALLANZANI relatou que espermatozóides de sapo após seu congelamento e descongelamento podem fertilizar ovócitos. No entanto, apenas após a descoberta acidental de POLGE et al. (1949) de que o glicerol atuava como crioprotetor de células é que o uso da técnica se inicia, dando origem aos programas de inseminação artificial com sêmen congelado. BENCHIMOL (1996) descreve crioprotetores como sendo substâncias que se ligam à água no citoplasma alterando seu ponto de fusão ou se ligam com a água livre formando pontes de hidrogênio bastante extensas interferindo, assim, no seu ponto de cristalização. Dessa forma, existe menor probabilidade para a formação de cristais de gelo. Os crioprotetores agem reduzindo o ponto de congelamento de água e aumentando seu ponto de super resfriamento. Removem os núcleos de cristalização e diminuem a faixa crítica de temperatura na qual se formam os cristais de gelo, pelo fato de se ligarem ou substituírem a água, reduzindo a quantidade da mesma disponível para o congelamento. Os crioprotetores são classificados como penetrantes e não penetrantes. Sendo glicerol o crioprotetor penetrante mais utilizado no congelamento de sêmen, agindo na proteção celular, tanto intra como extracelularmente. O glicerol aumenta o volume de canais de solventes descongelados e dilui a alta concentração de sais. Os crioprotetores não penetrantes, como a lactose e as lipoproteínas encontradas na gema do ovo, agem apenas no compartimento extracelular. Estes crioprotetores desidratam os espermatozóides, reduzindo desta forma a probabilidade de formação de grandes cristais no interior das células. Entretanto, o mecanismo ou mecanismos pelos quais estes crioprotetores afetam as células ainda é muito pouco compreendido (GRAHAM, 1996). Segundo HOLT (2000), a descoberta do glicerol como crioprotetor marcou um grande avanço na criopreservação de sêmen, mas as pesquisas subseqüentes têm feito relativamente pequenas melhorias nas bases técnicas estabelecidas nos anos 50. A gema de ovo, que é o aditivo lipídico mais utilizado no meio de congelamento, tem sido utilizada numa proporção de dois a 20% dos diluentes (AMANN e PICKETT, 1987). A ação protetora é conferida pelas lipoproteínas de baixa densidade da gema do ovo, em particular os fosfolipídios (AMANN e GRAHAM, 1993). Acredita-se que os fosfolipídios estabilizam a membrana dos

22 11 espermatozóides, mas a interação entre os fosfolipídios exógenos e a membrana dos espermatozóides não é bem detectada (QUINN et al., 1980). Alguns crioprotetores podem funcionar como quelantes, a exemplo do ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA), que pode se ligar ao cálcio e ao magnésio. Estes aditivos provavelmente protegem os espermatozóides ao ligar-se com íons e reduzindo o fluxo destes para dentro dos espermatozóides durante o resfriamento (SQUIRES et al., 1999). VIDAMENT et al. (2002) estudaram o efeito da dimetil formamida (DMF), bem como sua associação com glicerol na motilidade e fertilidade do sêmen eqüino. Relataram que a velocidade espermática aumentou com 5% de DMF, entretanto, a combinação de 5% de DMF com 3% ou 5% de glicerol diminui a velocidade. Concluíram que 2% de DMF tem um adequado efeito como crioprotetor de espermatozóides eqüinos e que nenhuma das associações testadas entre os dois crioprotetores teve maior eficiência que o uso de um dos mesmos separadamente. MEDEIROS et al. (2002) estudando a capacidade crioprotetora de amidas (dimetil formamida, metil formamida e dimetil acetamida), concluíram que as amidas conferem melhor proteção que o glicerol no processo de criopreservação de espermatozóides eqüinos. Garanhões com menor viabilidade do sêmen fresco tenderam a apresentar um aumento na quantidade de espermatozóides mortos após o período de equilíbrio com o diluente de congelamento. NEILD et al (2003) sugerem que tal fato possa ser atribuído a uma maior susceptibilidade ao glicerol. GOMES et al. (2002) estudando crioprotetores alternativos no congelamento do sêmen de cavalos da raça Mangalarga Marchador (apenas animais com menos que 30% de motilidade total quando o glicerol foi utilizado como crioprotetor) concluíram que a dimetil formamida é uma excelente alternativa para garanhões com baixa congelabilidade do sêmen. Pois quando utilizaram a dimetil formamida, obtiveram 42,75% de motilidade total e 13,5% de motilidade progressiva, enquanto com glicerol a motilidade total foi de 15,56% e a progressiva 5,62%.

23 Resfriamento e Choque Térmico Os defeitos apresentados pelos espermatozóides após o descongelamento são o somatório dos danos ocorridos em cada uma das fases que envolvem o processo de criopreservação, muitas das vezes, concorrendo para a inviabilidade espermática. Segundo NEILD et al. (2003), que estudaram os efeitos de cada estágio do processo de criopreservação nas membranas de espermatozóides eqüinos, relataram que o mais pronunciado dano funcional, somado a queda na motilidade progressiva, ocorreram após o descongelamento das amostras de sêmen. A criopreservação afetou, significantemente, a integridade de membranas após a centrifugação, rediluição e equilíbrio a temperatura ambiente e após o resfriamento até 5ºC. Espermatozóides são susceptíveis a severos danos quando submetidos à rápida diminuição da temperatura, entre 37ºC até 5ºC. Tais danos são conhecidos como choque térmico e caracterizados por: depressão do metabolismo; alteração na permeabilidade de membrana; perda de lipídeos e íons; queda irreversível na motilidade e aumento da porcentagem de espermatozóides mortos (WHITE and WALES citado por MCKINNON, 1992). Baseado nas características de motilidade KAISER et al. (1992) concluíram que espermatozóides eqüinos podem ser resfriados rapidamente de 37ºC a 20ºC, entretanto, abaixo desta temperatura, uma taxa de 0,05ºC/minuto deve ser adotada para manter o máximo de sobrevivência espermática a 5ºC. MORAN et al. (1992) mostraram que a faixa de temperatura na qual os espermatozóides eqüinos são mais susceptíveis ao choque térmico, situa-se entre 19ºC e 8ºC, sendo que abaixo de 8ºC a velocidade de resfriamento pode ser novamente aumentada. Neste protocolo, são necessárias quatro horas para abaixar a temperatura de 37ºC para 4ºC. DARIN-BENET e WHITE (1977) concluíram que as espécies de mamíferos que apresentam maior concentração de colesterol na membrana plasmática de seus espermatozóides são mais resistentes ao choque térmico. Segundo WOELDERS (1997) a diminuição da temperatura, abaixo da temperatura corporal, causa transição de fase nos lipídeos de membrana. Como diferentes lipídeos têm diferentes temperaturas de transição, alguns deles irão se

24 13 agregar em domínios sob a forma de gel excluindo, portanto, outros que ainda permanecem no estado líquido cristalino. Proteínas de membrana são também excluídas destes domínios sob forma de gel e, conseqüentemente, encontram-se em um ambiente não fisiológico que as impede de manter a integridade estrutural. Uma possível explicação para a diminuída fertilidade do sêmen criopreservado é que os espermatozóides recuperados após o descongelamento, não façam parte de um subgrupo aleatório, mas sim de uma seleta população, que se mostra resistente a criopreservação por apresentar membranas que não respondem a estímulos fisiológicos. Desta forma, o processo de criopreservação estaria selecionando uma subpopulação viável, mas relativamente infértil (WATSON, 2000). 2.6 Congelamento O primeiro potro nascido de uma inseminação artificial com sêmen congelado foi produzido a partir de espermatozóides epididimais, congelados em diluente a base de leite (BARKER e GANDIER, 1957). Desde a primeira criopreservação de espermatozóides com sucesso, nosso conhecimento sobre o mecanismo da crioinjúria tem aumentado e os métodos de criopreservação têm melhorado. Utilizando-se sêmen bovino congelado, conseguese taxas de prenhês iguais àquelas quando se usa sêmen fresco, no entanto, uma dosagem muito maior de sêmen é requerida com sêmen congelado. Futuras melhorias nos protocolos de congelamento e descongelamento são necessárias para diminuir a crioinjúria nos espermatozóides, para que a dose inseminante possa ser diminuída (WOELDERS, 1997). Mesmo tendo começado há dois séculos, as pesquisas sobre preservação de sêmen só vieram a ganhar impulso nas últimas quatro décadas. O problema que permanece até os dias de hoje é que mesmo utilizando as melhores técnicas de preservação, os dados de sobrevivência pós-descongelamento se restringem a 50 % da população de espermatozóides. Mais relevante ainda, é que a maioria dos espermatozóides sobreviventes tem características distintas das células que não passaram pelo estresse do congelamento. Como conseqüência disto, a fertilidade

25 14 quando se utiliza sêmen congelado é menor que quando se utiliza sêmen fresco, na maioria das espécies (WATSON, 1995). A motilidade pós-descongelamento varia entre garanhões e também entre ejaculados do mesmo garanhão (COCHRAN et al., 1983 e CRISTANELLI et al., 1984). Com taxas de congelamento maiores que o ótimo, não existe tempo hábil para que a água saia das células, aumentando a probabilidade de nucleações de gelo no interior das mesmas, o que é reconhecidamente letal (WATSON, 1995). Segundo WOELDERS (1997) uma grande mudança no ambiente do espermatozóide toma lugar quando a água líquida é convertida em gelo. Espontâneas nucleações de gelo irão ocorrer, após o super resfriamento da solução, entre 5 C e 15ºC. Isto se deve ao fato que pequenos cristais de gelo têm uma grande tensão superficial, o que os torna termodinamicamente instáveis. Conseqüentemente, a nucleação espontânea de gelo é um processo ao acaso, ocorrendo somente, quando por acaso, quantidade suficiente de moléculas com energia cinética menor que a média, juntam-se ao mesmo tempo e formam um instável núcleo de gelo. Uma vez que isto tenha acontecido, os cristais de gelo irão crescer rapidamente em todas as direções. A liberação do calor latente de fusão então eleva abruptamente a temperatura da amostra, até que a temperatura de fusão (da fração não congelada) seja alcançada. O que permanece é a fração não congelada, na qual todas as células e todos os solutos são confinados. A concentração de açúcar, sal, crioprotetor e, conseqüentemente, a pressão osmótica da fração não congelada, aumentam rapidamente. Ao mesmo tempo em que o volume da fração não congelada diminui rapidamente. Conseqüentemente a concentração intracelular de solutos também aumenta até que a pressão osmótica que incide na célula seja tão alta quanto fora da célula. Como o congelamento continua, este processo continua até que a viscosidade da fração não congelada torne-se tão alta que nenhuma cristalização seja possível. Células criopreservadas são expostas à cristalização de gelo extracelular, que leva a uma concentração de solutos na fração não congelada, com o conseqüente aumento da osmolaridade (WATSON, 2000).

26 15 O processo de criopreservação aumenta a suscetibilidade dos espermatozóides frente às mudanças de condições osmóticas que ocorrem durante o processamento para a Inseminação Artificial e após a deposição do sêmen no trato genital feminino (FISER e FAIRFULL, 1984; ZAVOS, 1991). O congelamento expõe as células ao estresse resultante da interação água/soluto que surge através da cristalização de gelo. A exposição de células à solução hiperosmóticas causa saída da água intracelular, conseqüentemente, murchamento da célula e possível influxo de íons. O descongelamento envolve o reverso destes efeitos e o conseqüente fluxo de água para dentro da célula pode causar ruptura da membrana celular (MAZUR, 1984). A taxa de resfriamento, juntamente com a taxa de descongelamento, governa a extensão na qual as mudanças físicas acontecem. Por esta razão a percentagem de células que sobrevivem ao congelamento e descongelamento apresenta uma curva sob a forma de U invertido, relacionado com a taxa de resfriamento (WOELDERS, 1997). WOELDERS et al. (1997) utilizaram várias taxas de congelamento para sêmen bovino (-40 a 300 C/minuto) e chegaram a conclusão que a ótima taxa de congelamento situa-se entre 76 e 140 C/minuto, que é maior que as taxas ótimas encontradas por outros autores e utilizada na maioria das centrais de inseminação artificial. 2.7 Descongelamento HOLT (2000) postulou que pequenos cristais de gelo formados no interior dos espermatozóides durante o processo de congelamento podem crescer se o descongelamento for realizado de forma lenta, sugerindo que rápidas taxas de descongelamento são requeridas para uma melhor recuperação de espermatozóides. Estudos realizados por COCHRAN et al. (1984), mostraram que palhetas de 0,5 ml de sêmen eqüino, descongeladas a 75 C durante 7 segundos, seguidas de imediata imersão em água a 37 C por, pelo menos, 5 segundos apresentaram uma melhor taxa de motilidade progressiva que o sêmen descongelado a 37 C por 30 segundos. O que não foi suportado por BORG et al. (1997), que não encontraram diferença entre os dois métodos de descongelamento e sugeriram que o sêmen

27 16 eqüino armazenado em palhetas de 0,5 ml seja descongelado a 37 C, por ser um método mais prático ao nível de fazendas. O descongelamento é tão importante como resfriamento em termos de impacto na sobrevivência de espermatozóides criopreservados. Células que sobreviveram ao resfriamento até -196 C ainda necessitam sofrer o estresse do reaquecimento durante o procedimento de descongelamento, precisando atravessar por duas vezes a zona de temperatura crítica (-15 a -60 C). Ambas taxas de resfriamento e de reaquecimento exercem seu efeito sobre a membrana plasmática e, portanto, sobre a sobrevivência dos espermatozóides (MAZUR, 1984). ORTMAN e RODRIGUEZ-MARTINEZ (1994) relataram que o procedimento de descongelamento aumentou dramaticamente a freqüência de espermatozóides suínos com danos na membrana plasmática e, portanto, particular atenção deve ser dada ao desenvolvimento de melhores protocolos de descongelamento de sêmen. Rápidas taxas de descongelamento são benéficas para motilidade e retenção de acrossoma pós-descongelamento, aumentando a fertilidade do sêmen bovino armazenado em palhetas plásticas (SÖDERQUIST et al., 1997; WOELDERS e MALVA, 1998; HOLT, 2000). BARRETO (2002) obteve melhor viabilidade espermática com o descongelamento ultra-rápido (98±2ºC por quatro segundos), possivelmente pela rápida passagem pela faixa de temperatura onde ocorre a recristalização do gelo que é um fenômeno conhecidamente danoso para as estruturas celulares. Estudos mostram que a taxa de descongelamento tem uma relação com a taxa de resfriamento e com a concentração de glicerol (RODRIGUEZ et al., 1975; ROBBINS et al., 1976). Estes estudos indicam que a melhor sobrevivência espermática é obtida sempre com as maiores taxas de descongelamento, desde que não ofereçam risco de super aquecimento do sêmen.

28 Reação inflamatória uterina Baseado na capacidade individual de resolver uma infecção uterina experimental, HUGHES e LOY (1969) classificaram dois grupos de éguas: as susceptíveis e as resistentes a infecção uterina persistente. Acreditava-se que bactérias introduzidas no útero durante a monta disparavam a reação inflamatória aguda (PETERSON et al., 1969), entretanto, recentes estudos têm mostrado que a inflamação pós-cobertura ou inseminação artificial é induzida primariamente por espermatozóides (KOTILAINEN et al., 1994; TROEDSSON et al., 1995). A inseminação asséptica com sêmen puro é capaz de desencadear uma resposta inflamatória, tanto quanto uma cobertura natural (TROEDSSON et al., 1995). O influxo de polimorfonucleares nos tecidos é o marco inicial da resposta inflamatória aguda. Em éguas normais, os primeiros neutrófilos entram no útero cerca de uma hora após inseminação e o maior número de neutrófilos é encontrado entre seis e doze horas. Após este período ocorre uma diminuição gradual na quantidade de neutrófilos e 48 horas após a inseminação eles tendem a desaparecer do útero (KATILA, 1995). O útero responde rapidamente a um estímulo antigênico, liberando mediadores químicos da inflamação, que resulta numa rápida migração de polimorfonucleares para o lúmen uterino (PYCOCK e ALLEN, 1988). A quimiotaxia de polimorfonucleares pode ser realizada por componentes do sistema complemento, leucotrieno B4, prostaglandina E, e prostaglandina F2α (WATSON et al., 1997; PYCOCK e ALLEN, 1988). Estudos realizados na espécie suína mostraram que a presença de inflamação pós-cobertura, no momento da inseminação, é prejudicial para a fertilidade, mas o plasma seminal é capaz de manter a capacidade fertilizante do sêmen (ROZEBOOM et al., 2000). Segundo TROEDSSON (1999), o objetivo da inflamação uterina póscobertura é retirar do útero espermatozóides defeituosos, mortos e em excesso, além de agentes contaminantes. O influxo de polimorfonucleares no lúmen uterino resulta na fagocitose de espermatozóides e bactérias, e a liberação de prostaglandina F2α que, por sua vez,

29 18 causa contrações miometriais que são necessárias para a limpeza via cervix e drenagem linfática (TROEDSSON et al., 1993; TROEDSSON, 1999). Após a fertilização do ovócito, o zigoto permanece no oviduto por cinco a seis dias e então desce para o lúmen uterino (FREEMAN et al., 1992). Este é o tempo que a égua tem para efetuar a limpeza uterina, pois a presença de bactérias ou produtos de inflamação é incompatível com a sobrevivência do embrião. A limpeza uterina deve ser realizada, antes que a concentração de progesterona pós-ovulação afete o tônus da cervix e o padrão de contração uterina, impedindo a eliminação dos produtos de inflamação. Todos os aspectos relacionados com a função dos neutrófilos como: migração em número suficiente para o local desejado, quimiotaxia, opsonização (complemento, igg e outros) e fagocitose, são essenciais para a defesa contra bactérias invasoras no útero, entretanto, não existem evidências de que nenhum destes fatores encontra-se deficiente em éguas susceptíveis, por outro lado, aumentam as evidências de que deficiências nos mecanismos de drenagem do útero são a melhor explicação para a susceptibilidade a infecções uterinas. Uma adequada dilatação cervical, contração miometrial e um intacto sistema de drenagem linfática são essenciais para a saúde uterina (KATILA, 1996). A remoção de fluidos uterinos contendo produtos de inflamação, por meio de lavagem com solução salina e indução de contração uterina com ocitocina, aumenta consideravelmente a taxa de concepção (LEBLANC, 1994). Segundo KATILA, (1996) além da dilatação da cervix e contração miometrial, a drenagem linfática tem um importante papel na limpeza uterina. Vasos linfáticos e linfonodos drenam o excesso de fluido da submucosa e do lúmen uterino. LEBLANC et al. (1995) concluíram que a eficácia da drenagem linfática encontra-se diminuída em éguas susceptíveis quando comparada com éguas resistentes. LEBLANC (1994) mostrou que a maioria das éguas susceptíveis apresenta lacunas de drenagem linfática em biópsias endometriais. Propôs que se o útero não estiver totalmente limpo, antes que a cervix se feche, a drenagem linfática desempenha, com sucesso, o seu papel em éguas normais, entretanto, em éguas susceptíveis, os produtos de inflamação permanecem no lúmen uterino, produzindo mais inflamação e irritando o endométrio. TROEDSSON et al. (1993), estudando a função da atividade miometrial na limpeza física uterina, mostraram que todas as éguas têm um visível aumento da

30 19 atividade miometrial após uma infusão de bactérias, entretanto, éguas resistentes demonstraram maior freqüência, duração e intensidade de atividade miometrial que éguas susceptíveis. Concluíram que éguas susceptíveis têm um enfraquecimento da atividade elétrica no miométrio e propuseram que o aumento da atividade miometrial seria ocasionado pelas prostaglandinas liberadas através da ativação de polimorfonucleares. O óxido nítrico é um mediador da inflamação sintetizado por macrófagos, neutrófilos, células epiteliais e endoteliais que, entre outros efeitos, causa relaxamento de musculatura lisa, inclusive no útero de mamíferos (YALLAMPALLI et al., 1994). ALGHANDI e TROEDSSON (2002) demonstraram que a quantidade de óxido nítrico foi maior nas secreções uterinas de éguas susceptíveis que em éguas resistentes, o que pode ser explicado por uma maior produção de óxido nítrico ou diminuída capacidade de drenagem dos produtos da inflamação neste grupo de éguas. Como a atividade miometrial é similar entre os grupos resistente e susceptível durante as seis primeiras horas pós cobertura, a diminuição da atividade miometrial em éguas susceptíveis que ocorre entre sete e dezenove horas pós cobertura (TROEDSSON 1999) pode ser devido à formação e acúmulo de óxido nítrico no útero. Pois enquanto éguas resistentes têm a capacidade de eliminar produtos da inflamação logo que estes são formados, o grupo susceptível falha em drena de imediato tais produtos, levando a um acúmulo de óxido nítrico, com o conseqüente relaxamento da musculatura uterina e retenção de líquido que age como estímulo contínuo para que a endometrite se torne persistente. 2.9 Mecanismos de limpeza uterina Com o intuito de diagnosticar éguas susceptíveis à infecção uterina, LEBLANC (1994) sugeriu a infusão intra-uterina de carvão durante o cio, quando uma lavagem uterina, 48 horas após a infusão, classifica a égua como resistente se nenhum carvão for recuperado do útero ou susceptível, se a égua tiver retido carvão. TROEDSSON (1991) sugere que se faça uma infusão intra-uterina de bactérias, e sendo a égua capaz de debelar a infecção, por si só, dentro de 96 horas, a mesma é considerada resistente.

31 20 TROEDSSON e LIU (1992) mostraram que éguas susceptíveis acumularam seis vezes mais líquido no útero após um desafio com bactérias que éguas normais. Mecanismos de limpeza física uterina são um importante fator na persistência de infecções. Existe um componente da idade envolvido, pois éguas jovens quando inoculadas com bactérias, carvão ou micro esferas pela via uterina, se limparam mais rapidamente que éguas velhas (EVANS et al., 1987). Os trabalhos mais recentes têm focado os mecanismos de drenagem através da cérvix (KATILA, 1996). CADARIO et al (1999) estudando os efeitos da ocitocina na limpeza uterina e na produção de PGF2α, concluíram que embora a administração de ocitocina (20 UI) induza a contratibilidade do endométrio, não há estimulação da produção de PGF2α em éguas normais. Por outro lado, a administração de ocitocina em éguas com problemas nos mecanismos de limpeza uterina estimulou uma grande liberação de PGF2α. Segundo os autores, a diferença no padrão de liberação de prostaglandinas nos dois grupos pode estar associada com a inflamação inerente ao útero de éguas com problemas de limpeza uterina, uma vez que macrófagos ativados, linfócitos e neutrófilos têm a capacidade de produzir PGF2α. Neste experimento, duas horas após a infusão uterina de radiocolóide o grupo de éguas normais retinha 40,4 ± 4,9% do mesmo, enquanto o grupo de éguas susceptíveis retinha 88 ± 5% do radiocolóide. Quinze minutos após a administração de ocitocina, todas as éguas normais e quatro das cinco éguas susceptíveis retinham menos que 6% do colóide. O tratamento de éguas com endometrite induzida por coito tem sido direcionado no sentido de ajudar o útero a se livrar fisicamente de contaminantes e produtos da inflamação, o que pode ser alcançado através da administração de drogas uterotônicas tais como ocitocina e PGF2α, em combinação com a lavagem uterina com solução salina entre seis e 24h após a cobertura. Tais procedimentos concorrem para o aumento das taxas de gestação (PYCOCK, 1994). Entretanto, segundo TROEDSSON et al (1995) devido a pequena meia vida da ocitocina, múltiplas aplicações diárias são necessárias para que haja efeito satisfatório, ao contrário da PGF2α que tem um efeito muito mais duradouro nas contrações uterinas. Por outro lado, trabalho realizado por TROEDSSON et al (2000) mostrou que o uso de PGF2α nos primeiros dois dias pós-ovulação interfere na formação do corpo lúteo, causando um retardo no seu desenvolvimento, concorrendo para uma diminuída produção de progesterona nos primeiros cinco dias de período pós-