UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JÚLIO DE MESQUITA FILHO INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS RIO CLARO

Transcrição

1 unesp UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JÚLIO DE MESQUITA FILHO INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS RIO CLARO CURSO DE ESPECIALIZAÇÃO EM ENTOMOLOGIA URBANA: TEORIA E PRÁTICA INIBIDORES DA RESPIRAÇÃO CELULAR NO CONTROLE DE FORMIGAS CORTADEIRAS (HYMENOPTERA: FORMICIDAE) MARCELA CECCATO Monografia apresentada ao Instituto de Biociências do Campus de Rio Claro, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Especialista em Entomologia Urbana. 12/2010

2 CURSO DE ESPECIALIZAÇÃO EM ENTOMOLOGIA URBANA: TEORIA E PRÁTICA INIBIDORES DA RESPIRAÇÃO CELULAR NO CONTROLE DE FORMIGAS CORTADEIRAS (HYMENOPTERA: FORMICIDAE) MARCELA CECCATO ORIENTADOR: ODAIR CORREA BUENO CO-ORIENTADOR: FABIANA CORREA BUENO Monografia apresentada ao Instituto de Biociências do Campus de Rio Claro, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Especialista em Entomologia Urbana. 12/2010

3 Dedico aos meus pais, Edna Masson Ceccato e José Nivaldo Ceccato, pois não sei precisar as noites que a luz do meu quarto não os deixou dormir ou a preocupação que a minha ausência lhes causou. Não sei quantas vezes minhas provas foram suas provas de amor. Não sei quantos sonhos renunciaram para que os meus fossem realizados. Mas sei que só vocês representam os verdadeiros heróis dessa história! Obrigado por tudo!

4 Ofereço as minhas irmãs, pois sem elas nada disso seria possível! Muito obrigado por acreditarem e por me apoiarem! Amo vocês!

5 AGRADECIMENTOS Primeiramente agradeço a Deus e aos meus pais José Nivaldo e Edna, almas iluminadas por Ele, que me fizeram trilhar por caminhos seguros. Sem vocês a minha vida não teria sentido e nem existência. Ao Profº Dr. Odair Correa Bueno pela orientação, pelos conhecimentos e experiências passadas, pela paciência, preocupação, pela amizade, risadas, conversas e caronas nas idas e vindas de São Paulo. Muito obrigado pelas oportunidades e por tudo, você é um exemplo a seguir! À Fabiana Correa Bueno, pela co-orientação, pelas dicas, paciência, preocupação, conversas e por se desdobrar para me ajudar a escrever com qualidade esta monografia. Agradeço imensamente! Ao Profº Dr. Osmar Malaspina, pela confiança, amizade e compreensão. Ao CNPq, pela concessão da bolsa de estudo que permitiu a realização deste trabalho. Ao Centro de Estudos de Insetos Sociais (CEIS) UNESP, Campus de Rio Claro, pelo acesso aos laboratórios, às nossas queridas saúvas e equipamentos de informática. À querida Ita, pelos conselhos, companheirismo, dedicação e auxílio nas diluições e montagem dos experimentos. Sem a sua alegria, o CEIS não seria o mesmo! À Nathália e a Natieli, dedicadas a cuidar dos bioensaios nos períodos de aula em São Paulo. À Necis Miranda de Lima e a Lucilene Amaro da Silva, pelo companheirismo, auxílio com as declarações e compreensão nos momentos mais urgentes. A todos os meus queridos amigos do CEIS, que fazem e fizeram parte de mim, pelo apoio, incentivo e carinho. Em especial a Eliane, Amanda Barbosa, Amanda Picelli, Pâmela, Kauana, Keyla, Taís, Manuela, Juliana, Cíntia, Maria Fernanda, Daniel, Carlos, João, Fox, Rodrigo e Andrigo pelas muitas risadas, conversas, experiências trocadas, festas e principalmente pela amizade! Cresci muito no convívio de vocês! Sempre estarão guardados no meu coração! Não posso deixar de agradecer a Ali, Nathália, Caroline, Deonise e Catarina que são muito importantes na minha vida. Obrigado por todo apoio, por acreditarem em mim e no meu potencial. Eu amo vocês infinitamente!

6 Aos meus amigos, Eduardo Diniz, Caroline, Sandra e Amanda Carlos (que me auxiliaram na busca pelos artigos) e o Andrigo (nas informações sobre os ingredientes ativos), me dando suporte e orientação e também pelos momentos de risadas e companheirismo! Aos amigos queridos Karla e Titi da UFSCar de São Carlos que tornaram o Ciclo de Krebs mais simples em minha vida! Admiro toda dedicação e atenção que tiveram comigo! As minhas amadas irmãs, Luciana, Fernanda, Cristiane e também a Aline Nondillo (a irmã de coração que mora longe), pela convivência, pelas infinitas conversas, conselhos sobre a vida, sobre o futuro, pelas muitas risadas, muitas lágrimas, festas, companheirismo, e principalmente pelo carinho e pelo amor que é recíproco! Amo vocês de paixão! Vocês sempre serão muitos importantes na minha vida! A presença de vocês durante essa fase foi essencial para eu me tornar uma pessoa melhor e ser quem sou hoje! Muito obrigado por tudo! Aos professores do curso de especialização em Entomologia Urbana: Teoria e Prática, por todo carinho, atenção e dedicação nas agradáveis aulas e por todo ensinamento e vivência passada. Aos meus queridos amigos do curso de especialização pelos ensinamentos e experiências trocadas, pela grande amizade que ilumina a mente, enriquece o coração e dá brilho à vida. Em especial a Erika, Daniela, Valmerice, Julio, André (companheiros de alojamento) e Daniel pelo laço especial que compartilhamos, pela agradável companhia no café da manhã, nas divertidas jantas, passeios e noites no alojamento, por toda troca de experiência, conselhos, piadas, conversas e carinho! Amo vocês imensamente, pois trouxeram mais brilho à minha vida e a 5º turma do curso de especialização não seria a mesma sem vocês! Ao Instituto Biológico e a Cleonice pela disponibilidade do alojamento nos períodos de aula. Agradeço também a todos que me ajudaram a construir indiretamente toda essa caminhada e mais uma fase cumprida. Obrigada!

7 SUMÁRIO RESUMO INTRODUÇÃO REVISÃO BIBLIOGRÁFICA As formigas cortadeiras Importância econômica Métodos de controle Formicidas pós Formicidas líquidos Fumigantes Termonebulização Nebulização Iscas tóxicas Controle de formigas cortadeiras com iscas tóxicas Controle de formigas cortadeiras em ambientes urbanos Ingredientes ativos MATERIAL E MÉTODOS Testes in vitro de toxicidade da rotenona e do diafentiurom em operárias de Atta sexdens rubropilosa Coleta e manutenção das formigas utilizadas nos bioensaios Bioensaios para determinação da toxicidade Bioensaio I: incorporação em dieta artificial Bioensaio II: incorporação em polpa cítrica Análise dos dados de toxicidade RESULTADOS E DISCUSSÃO Rotenona Toxicidade para operárias de Atta sexdens rubropilosa Incorporação em dieta artificial Incorporação em polpa cítrica Diafentiurom Toxicidade para operárias de Atta sexdens rubropilosa Incorporação em dieta artificial Incorporação em polpa cítrica CONCLUSÕES REFERÊNCIAS... 42

8 1. RESUMO As formigas cortadeiras são consideradas pragas por causarem muitos prejuízos em áreas agrícolas e em monoculturas. Em consequência às alterações ambientais provocadas pela atividade humana, essas formigas invadiram e se adaptaram a zona urbana, causando problemas em jardins residenciais, parques e na arborização de ruas e avenidas. Visando à substituição dos agrotóxicos tradicionais, o controle de formigas cortadeiras tem evoluído na procura de novos ingredientes ativos mais seletivos, que não causem efeitos indesejáveis ao ambiente e que possuam rápida degradação no solo. Atualmente, os ingredientes ativos que têm se mostrado promissores no controle de formigas cortadeiras são os inibidores da respiração celular. Portanto, o presente trabalho teve por objetivo avaliar a eficiência dos ingredientes ativos rotenona e diafentiurom, utilizando como modelo a espécie Atta sexdens rubropilosa. Para tal, foram realizados testes de toxicidade para operárias médias isoladas da colônia, através de: 1) tratamentos por incorporação dos ingredientes ativos em dieta artificial diluídos em acetona e na mistura acetona + óleo, ambos nas concentrações 10µg/mL; 50µg/mL; 100µg/mL e 500µg/mL e 2) tratamentos por incorporação dos ingredientes ativos em mistura de polpa cítrica e óleo de soja, nas concentrações 5.000µg/mL; µg/mL; µg/mL e µg/mL. No bioensaio de incorporação em dieta artificial, a rotenona dissolvida em acetona apresentou toxicidade às operárias, com redução mais acentuada para a concentração 500µg/mL. E quando diluída na mistura acetona e óleo todas as concentrações apresentaram resultados significativos. Já no bioensaio de incorporação de rotenona em polpa cítrica nas concentrações de µg/mL e µg/mL, a mortalidade das operárias foi muito acentuada, inviabilizando a incorporação da rotenona em iscas nessas concentrações. A presença do óleo de soja aumentou a toxicidade da rotenona e do diafentiurom. O bioensaio com diafentiurom dissolvido em acetona e incorporado na dieta artificial apresentou toxicidade às operárias de Atta sexdens rubropilosa em todas as concentrações testadas, assim como ocorreu quando este estava dissolvido em mistura de acetona e óleo de soja. Apesar dos resultados satisfatórios de toxicidade do diafentiurom nos bioensaios de incorporação em dieta artificial para as operárias de Atta sexdens rubropilosa apresentados no presente trabalho, o ingrediente ativo

9 diafentiurom apresentou baixa toxicidade às operárias quando incorporado em polpa cítrica. Diante disso, novos bioensaios de incorporação em dieta artificial com o ingrediente ativo diafentiurom devem ser realizados para observar se não há um efeito de repelência deste ativo nas formigas através da filmagem do experimento durante as primeiras 48 horas do oferecimento da dieta. Palavras - chave: inibidor da respiração, rotenona, diafentiurom, Atta sexdens rubropilosa, controle.

10 8 1. INTRODUÇÃO As formigas são insetos que apresentam um importante papel no ecossistema terrestre, mantendo a homeostase do ambiente, as condições físicas e químicas do solo, a polinização das plantas e a dispersão das sementes (BROWN Jr., 2000; HÖLLDOBLER; WILSON, 1990). Entretanto, em ambientes muito alterados pela atividade humana, esses insetos podem se tornar pragas indesejáveis e, muitas vezes, incontroláveis. As formigas cortadeiras, conhecidas como saúvas e quenquéns, destacam-se como principais pragas que ocorrem nas regiões tropicais e subtropicais das Américas. Estas formigas cortam e transportam fragmentos vegetais para seus ninhos, cultivando o fungo Leucoagaricus gongylophoros Singer (Möller), do qual se alimentam. Entre elas, as saúvas são responsáveis por grandes danos econômicos em áreas agrícolas, devido ao tamanho do sauveiro, o qual necessita de enorme volume de folhas para o cultivo do fungo simbionte (ABREU; DELABIE, 1986; CHERRETT, 1982; HOWARD, 1988). Muitos trabalhos demonstram os danos causados pelas formigas cortadeiras em áreas agrícolas e de pastagens, porém, não há muitos relatos em relação aos danos em áreas urbanas. Contudo, sabe-se que elas ocorrem em jardins residenciais, parques, pequenas hortas domésticas e na arborização de ruas e avenidas (BUENO, 2003; JUSTI Jr. et al., 1996). Não há um levantamento das espécies de formigas cortadeiras que ocorrem em ambientes urbanos, porém todas as classificadas como praga agrícola apresentam potencial para ocorrer, desde que haja o alimento preferencial disponível para o cultivo do fungo, pois estas formigas apresentam grande capacidade de adaptação à diferentes tipos de ambientes, nidificando com sucesso tanto em áreas naturais, pastagens, agrossistemas e áreas severamente alteradas pela degradação humana (BUENO, 2003). Os prejuízos ocasionados por essas formigas têm sido mencionados desde o século XVI, mas as medidas de controle ainda são insuficientes (MARICONI, 1970). Por outro lado, todas as formas de controle, apesar do custo elevado, apresentam efeitos temporários e algumas vezes, danos indevidos para o ambiente (WILLIAMS, 1990).

11 9 Alguns métodos mecânicos, culturais e biológicos são empregados no controle das formigas cortadeiras, porém, nem todos apresentam critérios de utilização bem definidos e adequadamente mensuráveis. O controle químico, apesar de algumas limitações, é o único a apresentar tecnologia disponível para ser utilizado em escala comercial. Suas estratégias diferem quanto a formulação e modo de aplicação dos inseticidas, destacando-se a termonebulização e as iscas tóxicas como as mais eficientes (FORTI; BOARETTO, 1997). Dado os efeitos maléficos causados pelos agrotóxicos sobre o meio ambiente, o homem e outros animais, o controle químico de pragas de plantas cultivadas, dentro das quais estão as formigas cortadeiras, constitui-se numa das principais preocupações ecológicas. Em conseqüência disso, nos últimos anos, ocorreu um aumento nas pesquisas na procura de alternativas para o controle desses insetos. Uma delas foi a utilização de produtos que pudessem substituir os agrotóxicos tradicionais por outros de degradação rápida, de maior especificidade e menos danosos ao ambiente (MORINI et al., 2005). Outro aspecto importante e pouco analisado é a otimização do uso dos ingredientes ativos atuais, conhecendo melhor o modo de ação de cada um deles, a concentração mais adequada e a melhor forma de atingir o alvo (BUENO, 2005) Por muitos anos, as iscas foram formuladas com inseticidas organoclorados, entre eles o dodecacloro, proibido a partir de 1993 devido à alta persistência no solo e ao acúmulo na cadeia alimentar. Desde então vários ingredientes ativos foram utilizados, entre eles os organofosforados, a sulfluramida e o fipronil. Atualmente, 95% do controle de formigas cortadeiras são realizados com o uso de iscas a base de sulfluramida, o que tem causado preocupação constante, pois esta molécula foi incluída no anexo B da Convenção de Estolcomo sobre Poluentes Orgânicos Persistentes no ano de 2009, com restrições de produção e uso somente para o controle de formigas cortadeiras no Brasil até que um ingrediente ativo substituto seja encontrado (UNITED NATIONS ENVIRONMENT PROGRAMME, 2009). Portanto, novamente há uma procura de novos compostos para o controle desses insetos e uma crescente preocupação entre os pesquisadores no sentido de encontrar inseticidas mais seletivos e menos agressivos ao ambiente, além de outros métodos alternativos. Análises toxicológicas recentes foram realizadas utilizando vários ingredientes ativos empregados no controle de pragas em geral, buscando assim novos

12 10 ingredientes ativos para o controle de formigas cortadeiras e os que se mostraram mais promissores para uso em iscas foram os que atuam na inibição da respiração celular dos insetos (BUENO, 2005; NAGAMOTO, 1998, 2003; NAGAMOTO et al., 2004; TAKAHASHI-DEL-BIANCO, 2002). Diante disso, o presente trabalho tem por objetivo avaliar a eficiência dos inibidores da respiração celular, rotenona e diafentiurom, para o uso em iscas no controle de formigas cortadeiras, utilizando como modelo a saúva-limão Atta sexdens rubropilosa. 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1. As formigas cortadeiras As formigas cortadeiras dos gêneros Atta (saúvas) e Acromyrmex (quenquéns), pertencentes a Tribo Attini, subfamília Myrmicinae e família Formicidae são insetos sociais que se caracterizam pela estreita relação simbiótica que mantêm com um fungo específico que é a base da alimentação da colônia, o qual é cultivado sobre fragmentos frescos de origem vegetal (HÖLDOBLER; WILSON, 1990; WEBER, 1972). No Brasil, ocorrem 21 espécies do gênero Acromyrmex (FOWLER et al., 1986; FOWLER, 1988; GONÇALVES, 1961, 1967, 1982) e 9 espécies do gênero Atta (DELABIE, 1998). A associação mutualística surgiu há aproximadamente 50 milhões de anos (MUELLER et al., 2001; SCHULTZ, 1999) e teria origem com uma ancestral Attini forrageadora generalista que cultivava o fungo de forma facultativa e que posteriormente, passou a ter uma relação simbiótica obrigatória (MUELLER, 2002). Essa relação simbiótica entre o fungo e as formigas cortadeiras proporciona benefícios a ambos (SCHUTZ et al., 2005), pois por um lado, as formigas se beneficiam do fungo através da quebra de enzimas possibilitando a detoxicação de compostos secundários (aleloquímicos) oriundos dos vegetais, os quais poderiam agir como inseticida às formigas (LITTLEDYKE; CHERRETT, 1978; NORTH et al., 1997; 1999) e por outro lado, o fungo se beneficia pela manutenção do ambiente livre de competidores (antagonista ou entomopatogênicos) através da aplicação de

13 11 compostos antibióticos produzidos pelas formigas, além do fungo não poder viver independente delas (CURRIE et al., 1999). Sendo assim, as formigas protegem o fungo da presença de microorganismos patogênicos, através da produção de substâncias (enzimas proteolíticas) livrando-o de competidores que poderiam reduzilo e consequentemente matá-lo. Existindo assim, uma dependência entre eles, onde a ausência de um acarretará no desaparecimento do outro (CURRIE et al., 1999; CURRIE; STUART, 2001) Importância econômica O fato das formigas cortadeiras atacarem muitas espécies vegetais resulta em altos prejuízos, não só pela competição por esses produtos com o homem e seus animais domésticos (AMANTE, 1972), como também pela preferência desses insetos para a utilização de plantas cultivadas (CHERRETT, 1968). Além disso, o efeito pode ser indireto, em decorrência da contaminação ambiental pelos agrotóxicos utilizados no seu controle (DELLA LUCIA; FOWLER, 1993). Segundo Amante (1967), dez sauveiros adultos/ha cortam cerca de 21kg de folhas/dia, reduzindo em mais de 50% a capacidade de pastagem, além de proporcionar maior desenvolvimento de plantas daninhas. Os prejuízos causados pela atividade de A. sexdens rubropilosa, numa densidade de 4 colônias/ha foram calculados em 14% para plantações de eucalipto e 14,5% para a produção de pinos (AMANTE, 1972), porém, os danos causados em áreas urbanas são pouco relatados e consequentemente não há uma estimativa dos prejuízos causados por estas formigas (BUENO, 2003). Mariconi (1970) refere-se as saúvas causando danos às construções, tais como prédios, represas, pontes e pontilhões, mausoléus e túmulos, bem como nas estradas de rodagem e de ferro pelo fato de as galerias e as panelas poderem ceder o peso das paredes de uma casa ou outra construção.

14 Métodos de controle Devido aos danos econômicos, as formigas cortadeiras são alvos de diferentes métodos de controle. Atualmente, os métodos utilizados são: culturais, mecânicos, biológicos, físicos e químicos (DELLA LUCIA; VILELA, 1993; FORTI; BOARETTO, 1997; LOECK et al., 2001). O controle cultural pode ser realizado através de métodos de aração e gradagem do solo para formigueiros com até 4 meses de idade, pois nesta fase, a única câmara da colônia ainda se localiza a aproximadamente 20 centrímetros de profundidade do solo e há grande probabilidade das lâminas do equipamento atingirem a rainha e matá-la (DELLA LUCIA; VILELA, 1993). Porém para formigueiros adultos, o efeito pode ser prejudicial, uma vez que a mecanização do solo pode desestruturar parcialmente a colônia, cessando temporariamente sua atividade, dando a falsa impressão de que foi controlada e dificultando sua localização (FORTI; BOARETTO, 1997). O controle mecânico consiste na escavação do ninho até que a rainha seja localizada e morta. É uma alternativa viável para exterminar ninhos iniciais ou jovens, porém tratando-se de ninhos mais antigos que podem atingir grandes dimensões, não existe previsão da localização da rainha e o método se torna inadequado (JUSTI Jr. et al, 1996). Já o controle biológico natural, através de predadores, parasitóides e microrganismos patogênicos é importante na regulação das populações de formigas cortadeiras, principalmente durante o período da revoada e da fundação de novas colônias. Os inimigos naturais juntamente com as condições ambientais são responsáveis pelo controle de 99,95% das rainhas, antes mesmo que elas tenham fundado suas colônias (FORTI; BOARETTO, 1997). No entanto, a introdução de inimigos naturais no ambiente, sejam eles microrganismos, outros invertebrados e vertebrados ainda não pode ser visualizada como estratégia de controle para as formigas cortadeiras devido aos poucos estudos nesta área. Ainda assim, o controle biológico deve ser sempre lembrado como técnica de manejo integrado de pragas e algumas medidas como restrição à caça de animais e ao uso de fitossanitários e plantação de vegetação nativa entre a cultura

15 13 principal são importantes para a preservação dos inimigos naturais das formigas (DELLA LUCIA; VILLELA, 1993). O uso de barreiras para proteger a copa das plantas é um método de controle físico muito antigo e um dos mais utilizados em pomares para se evitar o ataque das formigas, sendo que cones plásticos invertidos e tiras plásticas cobertas com graxa ou vaselina colocados nos troncos das árvores são as barreiras mais utilizadas. Este é um método eficiente, porém, vistorias e reparos constantes devem ser feitos para que a proteção das árvores seja prolongada (JUSTI Jr. et al., 1996). A busca de alternativas de controle para as formigas cortadeiras é feita através de métodos que visam um resultado rápido devido ao nível de dano e a velocidade com que esse dano é causado. A eficiência do controle depende do método de aplicação adequado à situação, sendo que o ideal é achar uma condição de campo e uma tecnologia de aplicação que levem a um resultado econômico e eficiente. Por isso, os métodos químicos se destacam, apesar de suas várias restrições é o único que apresenta tecnologia disponível para ser utilizado em larga escala comercial no controle de formigas cortadeiras. As estratégias de controle químico diferem, principalmente, pelo tipo de formulação e modo de aplicação dos inseticidas, podendo ser (FORTI; BOARETTO, 1997): Formicidas pós: São formulados em veículos sólidos (talcos) e aplicados com equipamentos manuais (polvilhadeiras). O produto é aplicado nos olheiros visando atingir o interior do formigueiro e a morte das formigas se dá com o contato direto do produto. Como há impossibilidade de penetração do produto nas câmeras de ninhos adultos, apresenta fortes limitações, dada a sua complexidade estrutural, aderência do produto ao solo devido á umidade, inviabilizando a aplicação e a necessidade de remoção da terra solta 24 a 48 horas antes da aplicação, tornando a técnica trabalhosa e apresenta riscos elevados para o ambiente e para o aplicador Formicidas líquidos:

16 14 Antigamente foram muito difundidos e utilizados para o controle de formigas cortadeiras. No entanto, devido a baixa eficiência dos produtos já testados, decorrente da necessidade destes entrarem em contato com as formigas, além do dispendioso trabalho de perfuração do ninho e perdas do produto pela absorção do solo, foram rapidamente substituídos por outras formas de controle Fumigantes: O emprego de gases tóxicos para matar formigas cortadeiras é um dos métodos pioneiros no controle desses insetos. Consiste no uso de gases que são comercializados comprimidos em embalagens apropriadas e são liberados diretamente no interior dos ninhos, através dos olheiros por meio de mangueiras adaptadas ou uma válvula de saída. Tal método dispensa o uso de equipamentos na aplicação, no entanto o custo da formulação dos ingredientes ativos utilizados é elevado, exige mão de obra especializada para a aplicação e apresenta alta periculosidade Termonebulização: A aplicação dos líquidos termonubulizáveis consiste na introdução de um inseticida líquido veiculado em óleo mineral ou diesel sob ação do calor, aplicado nos olheiros por aparelhos próprios, os termonebulizadores, que produzem fumaça tóxica. Geralmente o método de aplicação mais utilizado é por saturação, ou seja, a fumaça é injetada num dos orifícios e quando a fumaça torna-se densa, os orifícios são fechados. Destaca-se como um método eficiente para o controle de grandes ninhos em áreas extensas, onde outras metodologias podem tornar-se inviáveis. No entanto, o método apresenta desvantagens operacionais e econômicas, sendo a manutenção dos equipamentos um dos maiores entraves à sua viabilidade. Apresenta alto risco de intoxicação para o trabalhador.

17 Nebulização: A nebulização a frio do ingrediente bifentrina, veiculados pelos gases butano e propano é feita pelo equipamento Aero-system. A maior densidade dessa mistura em relação ao ar permite o deslocamento descendente destes gases no interior do formigueiro sendo que a aplicação pode ser feita por dosagem previamente estabelecida (medida do fluxo gasoso/ tempo) ou por saturação (constatada pelo refluxo do gás no olheiro de aplicação). No entanto, as principais limitações do método se devem à baixa eficiência no controle de formigueiros adultos e problemas operacionais, tal como o congelamento na lança de aplicação e a consequente obstrução do fluxo, bem como a possibilidade de vazamento nas válvulas Iscas tóxicas: Consistem da mistura de um ingrediente ativo dissolvido em óleo de soja e incorporado a um substrato atrativo, geralmente polpa cítrica desidratada, prensados na forma de grânulos. Os grânulos são distribuídos próximos as trilhas de forrageamento, sendo posteriormente transportados pelas próprias formigas para o interior da colônia. Embora apresente limitações de uso em dias chuvosos e em áreas muito extensas, bem como a possibilidade de intoxicação de animais silvestres, trata-se de um método eficiente, prático e econômico. A polpa cítrica é o substrato mais atrativo para várias espécies de formigas cortadeiras. O uso de iscas tóxicas destaca - se entre as estratégias de controle químico por oferecer maior segurança ao aplicador, uso de mão-de-obra barata, por dispensar equipamentos especializados e permitir o tratamento de formigueiros em locais de difícil acesso Controle de formigas cortadeiras com iscas tóxicas

18 16 Para apresentar resultados eficientes, as iscas tóxicas devem apresentar as seguintes características: 1) ser atrativa às formigas, se possível a certa distância do ninho; 2) ser carregada sempre que encontrada; 3) ter ação lenta o suficiente para ser conduzida para longas distâncias; 4) ser distribuída amplamente pela colônia antes que apareçam os primeiros sintomas de intoxicação; 5) apresentar especificidade às espécies alvos; 6) apresentar baixa toxicidade aos vertebrados; 7) permanecer efetiva em condições adversas e; 8) conter um ingrediente ativo biodegradável (BUENO; CAMPOS-FARINHA, 1999; ETHERIDGE; PHILLIPS, 1976; FORTI et al., 1993). Apesar de ser um método relativamente prático, o emprego de iscas tóxicas deve ser feito com muito critério e requer uma série de conhecimentos para a obtenção de resultados satisfatórios. Para tal, é muito importante realizar a vistoria da área a ser tratada, localizando os formigueiros e identificando as espécies de formigas presentes (ANJOS et al., 1993; FORTI; BOARETTO, 1997). Uma vez localizado o formigueiro e constatado que a colônia está ativa, a área de terra solta deve ser medida para o estabelecimento da dose de isca, multiplicando-se a maior largura pelo maior comprimento do monte de terra solta. Embora o estabelecimento da dose de isca por unidade de área seja um método empírico, não há outra alternativa até o presente momento e, as doses recomendadas pelos fabricantes são de 6 a 10 g/m 2 de terra solta para saúvas, em função do modo de ação e da concentração do ingrediente ativo, e de 10 g/ninho para quenquéns (FORTI; BOARETTO, 1997). As iscas podem ser aplicadas a granel ou em pequenos recipientes, denominados porta-iscas (PIs) ou micro-porta-iscas (MIPIs), em função da quantidade de isca presente na embalagem. As iscas a granel devem ser aplicadas diretamente das embalagens, sem o contato manual, ao lado do maior número de trilhas que possuem olheiros ativos, próximos aos montes de terra solta. No entanto, os PIs devem ser distribuídos sistematicamente sobre a área, sem levar em consideração o local em que cada formigueiro está situado, evitando a necessidade de localização e medição dos ninhos (ANJOS et al., 1993). As iscas contendo um ingrediente ativo de ação lenta, uma vez transportadas para o interior do ninho, são distribuídas uniformemente por toda a colônia (MOREIRA et al., 2003; PRETTO; FORTI, 2000) sendo fragmentadas e lambidas pelas operárias por repetidas vezes. Num período entre 6 e 8 horas estas

19 17 iscas já estão totalmente fragmentadas, sendo incorporadas no jardim de fungo, onde sofrem hidratação, incham e se fragmentam ainda mais em pedaços muito pequenos, impossibilitando sua remoção da colônia (FORTI; BOARETTO, 1997). Neste mesmo período, algumas operárias já estão contaminadas e, 50% a 70% das operárias se contaminam a partir de 24 horas. Essa contaminação se dá por ingestão direta do ingrediente ativo durante o processamento da isca e através da limpeza individual e coletiva das operárias na tentativa de remover pequenos fragmentos de iscas de seus corpos e não através da trofalaxia, como era amplamente divulgado, pois recentemente, verificou-se que este comportamento ocorre com uma freqüência muito baixa entre as operárias adultas (ANDRADE et al., 2002; SCHNEIDER, 2003; BUENO et al., 2008). As operárias generalistas e jardineiras são as que se contaminam mais intensa e rapidamente, devido à atividade que desempenham na limpeza em geral e no cuidado com o fungo. Com a crescente mortalidade das operárias ocorre uma desorganização geral da colônia e a cultura de fungo deixa de ser cuidada, facilitando a contaminação por outros fungos e, conseqüentemente, o formigueiro é extinto em poucos dias (FORTI; BOARETTO, 1997) Controle de formigas cortadeiras em ambientes urbanos Os ninhos de formigas cortadeiras na área urbana não atingem grandes dimensões por encontrarem-se em áreas reduzidas, onde são facilmente visualizados, como é o caso de jardins residenciais e dos parques onde geralmente possuem uma equipe técnica de manutenção para a realização de vistorias visando a aplicação posterior de mecanismos de controle. Assim, os ninhos não chegam a atingir mais que dois anos de idade nesses locais. Por possuírem números reduzidos de panelas, estes formigueiros jovens podem ser destruídos por meio de escavações e eliminação da rainha, por saturação com água por meio de mangueiras ou por introdução de emulsão de sabão em pó a 0,5%, inundando-se cerca de um terço do volume inferior do ninho. Caso a opção seja por um controle químico, a formulação na forma de isca revela-se a mais indicada, em termos de facilidade de aplicação e segurança para o aplicador e o meio ambiente. Deve-se tomar medidas importantes de segurança tais como: dimensionamento preciso do

20 18 formigueiro para que se determine uma dosagem adequada, para que não ocasione falta ou excesso de isca e com o auxílio de luvas e pás, remover o excesso desse material, assim evitando que crianças, leigos e animais manuseiem e ou ingiram os grânulos, o isolamento da área durante o período do tratamento, impedindo assim o tráfego de pessoas e animais e a vigilância constante do local durante o período de controle (JUSTI Jr. et al., 1996). No caso de grandes condomínios em que ainda existam lotes vagos, canteiros centrais de grandes avenidas e parques onde não sejam viáveis vistorias minuciosas e constantes, os formigueiros podem atingir grandes dimensões. Para estas condições a formulação em isca será a mais adequada, entretanto, há a necessidade de medidas de segurança, como isolamento e vigilância da área. Para o uso destas formulações é de fundamental importância que o produto seja registrado no Ministério da Saúde como domissanitário para não ocorrer nenhum tipo de acidente indesejado. (JUSTI Jr. et al., 1996) Ingredientes ativos Conhecer a qualidade e a forma de ação dos ingredientes ativos é fundamental na preparação de iscas tóxicas eficientes e economicamente viáveis para o controle de formigas cortadeiras. O ingrediente ativo deve atender os requisitos básicos como: não apresentar efeito repelente, agir mesmo quando em baixas concentrações, ter ação cumulativa por ingestão e apresentar baixa toxicidade aos mamíferos, além de ser de ação lenta e rapidamente degradável quando exposto ao ambiente (BUENO; CAMPOS-FARINHA, 1999; FORTI; BOARETTO, 1997). Os inibidores da respiração celular pertencem a um grupo de ingredientes ativos de ação lenta, dentro do qual se encontra a hidrametilnona, registrada com o nome comercial Amdro e utilizada no controle de Solenopsis spp. (LOFGREN, 1986). No entanto, poucos estudos foram realizados para avaliar o potencial deste ingrediente ativo no controle de formigas cortadeiras (CAMERON, 1990; MENDONÇA et al., 1987; NAGAMOTO; FORTI, 1999; PAPA et al., 1997; VILELA, 1986; WILCKEN et al., 1998). O trabalho mais atual realizado com hidrameltinona no controle de formigas cortadeiras, usando a espécie Atta sexdens rubropilosa, foi

21 19 realizado por Bueno (2005) e este por sua vez apresentou resultados satisfatórios no controle dessas formigas. A sulfuramida também é um inibidor da respiração celular dos insetos, atua na síntese do ATP (BOOMQUIST, 2009) e foi lançada no mercado como um substituto do dodecacloro (ZANUNCIO et al., 1993). Os inseticidas/acaricidas inibidores da respiração celular têm sido bastante utilizados no controle de pragas em geral e usados no manejo de ácaros em diversas culturas, devido à sua eficiência no controle e ao seu mecanismo de ação diferenciado. Esses acaricidas atuam em diversas etapas da respiração celular comprometendo, principalmente, a geração de energia (adenosina trifosfato - ATP) e são divididos de acordo com o seu provável modo de ação: inibidores da fosforilação oxidativa via disrupção da síntese de ATP (exemplo: organoestânicos, diafentiurom, propargite e tetradifom), desacopladores da fosforilação oxidativa via disrupção do gradiente de próton H + (clorfenapir e dinocape), inibidores do transporte de elétrons no complexo I (piridabem, fenpiroximate, fenazaquim e tebufenpirade) e no complexo III. Embora não esteja muito esclarecido, o grupo dos inibidores da fosforilação oxidativa via disrupção da síntese de ATP são subdivididos em: organoestânicos, propargite, tetradifom e diafentiurom (CORBETT et al. 1984, DEKEYSER 2005). Os ingredientes ativos rotenona e diafentiurom, analisados no presente trabalho, estão caracterizados a seguir. As informações básicas sobre rotenona foram obtidas da Pesticide Action Network Europe - PAN-UK (EUROPE, 2010). Já os dados do diafentiurom foram extraídos da monografia depositada no Ministério da Saúde Brasil (Brasil, 2010). Nome comum: Rotenona/ Rotenone Nome químico: 2R,6aS,12aS)-1,2,6,6a,12,12a-hexahydro-2-isopropenyl-8,9 dimethoxychromeno[3,4-b] furo(2,3-h)chromen-6-one Formula molecular: C 23 H 22 O 6

22 20 Formula Estrutural: Classe química: rotenóide Classificação toxicológica: classe II Modo de ação: inibidor de uma das enzimas do Complexo I da cadeia de transporte de elétrons na mitocôndria. Na presença deste inseticida, os elétrons provenientes do NADH não podem entrar na cadeia de transporte de elétrons, o que resulta na incapacidade de produzir ATP a partir da oxidação do NADH. A enzima inibida pela rotenona é a NADH desidrogenase. A rotenona afeta a respiração celular e pode também afetar a coordenação muscular (WASILEWSKI, J. 2002). Características do ingrediente ativo: produto de origem botânica, obtido das raízes de várias espécies de plantas subtropicais e tropicais pertencentes ao gênero Lonchocarpus e Derris. A rotenona é rapidamente degradada no solo e na água: sua meia-vida em ambos é entre um e três dias Quase toda a sua toxicidade é perdida em 5-6 dias de sol de primavera, ou dois ou três dias de sol de verão. Não é facilmente lixiviada no solo e provavelmente não é um poluente das águas subterrâneas. É solúvel em éter e acetona e pouco solúvel em etanol. Nome comum: Diafentiurom/ Diafenthiuron Nome químico: 1-tert-butyl-3-(2,6-di-isopropyl-4-phenoxyphenyl) thiourea

23 21 Fórmula molecular: C 23 H 32 N 2 OS Fórmula Estrutural: Grupo Químico: Feniltiouréia Classificação toxicológica: Classe III Modo de ação: Interfere na respiração celular dos insetos por meio da inibição da ATPase. Características do ingrediente ativo: solúvel em água (0,06mg/L 25ºC), em etanol, acetona (43g/L), tolueno, n-hexano 9.6, octanol-n-26 ( g/L- 25ºC). Estável em ar, água e à luz. Diafentiurom e seus principais metabólitos mostram uma forte sorvidade (infiltração X tempo) às partículas do solo. Degradação de recursos em solos rapidamente: DT 50 <1 h para 1,4 dias (CHINA, 2009). 3. MATERIAL E MÉTODOS 3.1. Testes in vitro de toxicidade da rotenona e do diafentiurom em operárias de Atta sexdens rubropilosa Coleta e manutenção das formigas utilizadas nos bioensaios

24 22 As operárias de Atta sexdens rubropilosa, com massa corpórea variando de 15 a 25 mg, foram coletadas de formigueiros mantidos em laboratório no Centro de Estudos de Insetos Sociais - UNESP - Campus Rio Claro. Para a manutenção desses formigueiros, diariamente foram oferecidos folhas de Eucaliptus sp. e flocos de aveia e, ocasionalmente, outras plantas palatáveis às saúvas como Hibiscus sp., Ligustrum sp. ou folhas e pétalas de roseiras (Figura 1). Para a manutenção das formigas isoladas do formigueiro, consequentemente na ausência do fungo simbionte e de folhas considerados seus alimentos, foi utilizada uma dieta artificial sólida, preparada com 5 g de glicose, 1 g de peptona bacteriológica, 0.1 g de extrato de levedura e 1.5 g de ágar bacteriológico, dissolvidos em 100 ml de água destilada. Após a mistura das substâncias, a dieta foi levada ao forno de microondas para melhor solubilização dos ingredientes e, posteriormente autoclavada a 120ºC e 1 atm por 15 minutos. Em seguida foi vertida ainda quente em placas de Petri de 10 cm de diâmetro, previamente esterilizadas em estufa a 180º C e, após o resfriamento e a solidificação, foi embrulhada em filme de PVC e mantida em geladeira, sendo utilizada nos dias subsequentes, durante o período do experimento (BUENO et al., 1997). Figura 1. Vista geral do formigueiro de Atta sexdens rubropilosa mantido no laboratório do Centro de Estudos de Insetos Sociais (CEIS).

25 Bioensaios para determinação da toxicidade Os ingredientes ativos foram obtidos através das firmas produtoras, na forma de produto técnico, apresentando grau de pureza de 80% para a rotenona e de 95% para o diafentiurom. Para o estabelecimento das concentrações testadas, não foram realizadas as correções das impurezas dos produtos técnicos. Os ingredientes ativos foram pesados em balança analítica, dissolvidos e testados de 2 modos diferentes: incorporados em dieta artificial (bioensaio I) e incorporados em polpa cítrica (bioensaio II). Em todos os bioensaios as formigas foram retiradas dos formigueiros e distribuídas em lotes de 50 operárias para cada concentração testada, divididas em grupos de 10 formigas e mantidas em 5 placas de Petri de 10 cm de diâmetro forradas com papel filtro (Figura 2). Essas placas foram colocadas em estufa para BOD com temperatura de 24ºC + 1ºC e umidade relativa acima de 70%. Os bioensaios foram examinados diariamente, para a retirada e anotação do número de formigas mortas, durante um período de 25 dias. A dieta para manutenção das formigas (controle) ou dieta acrescida dos ingredientes ativos (tratamentos) foi colocada em papel alumínio na quantidade aproximada de 0.4 a 0.5 g/placa. A cada 24 horas a dieta foi renovada e sempre que necessário, os papéis filtro (que geralmente são cortados pelas formigas) foram trocados, a fim de se evitar o desenvolvimento de fungos contaminantes bem como manter o ambiente limpo para as formigas. Foi estipulado um período máximo de 25 dias para a realização dos experimentos de toxicidade, levando-se em conta o período normal de sobrevivência das formigas mantidas com dieta artificial (BUENO et. al, 1997).

26 24 Figura 2. Operárias de Atta sexdens rubropilosa submetidas ao tratamento com o ingrediente ativo incorporado em dieta artificial Bioensaio I: incorporação em dieta artificial Os ingredientes ativos, dissolvidos em acetona ou em mistura de acetona e óleo de soja (9:1), foram incorporados em dieta artificial ainda quente (logo após a retirada da autoclave), nas concentrações estipuladas. As formigas foram distribuídas nas placas de Petri e juntamente a elas foi acrescida a dieta contendo o ingrediente ativo. No bioensaio por ingestão foram utilizados dois controles. No primeiro, a acetona ou a mistura de acetona e óleo de soja foi incorporada na dieta artificial e, no segundo apenas a dieta artificial. O objetivo do primeiro controle foi acompanhar e avaliar a sobrevivência das formigas com referência a toxicidade da acetona e do óleo, enquanto que a do segundo foi verificar a interferência do manuseio na sobrevivência das formigas. Os testes de incorporação do ingrediente ativo em dieta artificial foram: rotenona dissolvida em acetona nas concentrações: 10µg/mL; 50µg/mL; 100µg/mL e 500µg/mL, utilizando-se acetona como controle.

27 25 rotenona dissolvida em mistura de acetona e óleo de soja (9:1) nas concentrações 10µg/mL; 50µg/mL; 100µg/mL e 500µg/mL, utilizando-se a mistura acetona e óleo de soja como controle. diafentiurom dissolvido em acetona nas concentrações: 10µg/mL; 50µg/mL; 100µg/mL e 500µg/mL, utilizando-se acetona como controle. diafentiurom dissolvido em mistura de acetona e óleo de soja (9:1) nas concentrações 10µg/mL; 50µg/mL; 100µg/mL e 500µg/mL, utilizando-se a mistura acetona e óleo de soja como controle Bioensaio II: incorporação em polpa cítrica Os ingredientes ativos foram adicionados a uma mistura de polpa cítrica em pó e óleo de soja na proporção 9:1, nas concentrações 5.000µg/mL (0,5%); µg/mL (1%); µg/mL (2%) e µg/mL (5%). A polpa cítrica em pó foi preparada a partir dos pellets originários das indústrias de suco de laranja, que foram moídos em moinho de facas e selecionados em peneira de malha fina. No primeiro dia de experimento as formigas foram distribuídas em placas de Petri e juntamente a elas foi acrescentada 0,3g da mistura (ingrediente ativo + óleo + polpa cítrica), além de aproximadamente 0,5g da dieta artificial descrita no item (Figura 3). A partir do segundo dia de experimento todas as placas de Petri foram substituídas para retirada da sobra de polpa cítrica e, as formigas passaram a receber somente a dieta artificial até o término do experimento. Portanto, neste caso, o ingrediente ativo foi oferecido as formigas por apenas 24 horas. Para esse tipo de bioensaio foram utilizados dois controles. No primeiro foram oferecidos mistura de polpa cítrica e óleo juntamente com a dieta artificial e, no segundo ofereceu-se somente dieta artificial. O objetivo do primeiro controle foi avaliar a sobrevivência das formigas com referência a toxicidade do óleo de soja, enquanto que o do segundo foi verificar a interferência do manuseio na sobrevivência das formigas.

28 26 Figura 3. Operárias de Atta sexdens rubropilosa submetidas ao tratamento com o ingrediente ativo incorporado em polpa cítrica Análise dos dados de toxicidade A análise gráfica foi realizada através das determinações das porcentagens acumuladas de formigas vivas por dia para cada tratamento. Posteriormente, o tempo de sobrevivência mediana foi determinado e as curvas de sobrevivência foram comparadas por meio do teste não paramétrico log rank, com nível de significância de 5% (ELANDT - JOHNSON et al., 1980), utilizando-se o software Graph-Pad, aplicativo Prisma 3.0. As curvas de sobrevivência de operárias tratadas com o primeiro controle e com o segundo controle foram comparadas através do teste log-rank. A ausência de diferença significativa entre elas indicou a não interferência do solvente e do óleo de soja. Em seguida, procedeu-se a comparação das curvas de sobrevivência de formigas submetidas aos tratamentos com aquelas do controle solvente ou solvente + óleo.

29 27 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1. Rotenona Toxicidade para operárias de Atta sexdens rubropilosa Os resultados obtidos para cada bioensaio estão apresentados através das análises gráficas das curvas de sobrevivência e das tabelas que resumem as porcentagens acumuladas de mortalidade diária, o tempo de sobrevivência mediana (Md) e a interpretação do teste log rank Incorporação em dieta artificial A rotenona dissolvida em acetona e incorporada na dieta artificial provocou diminuição na sobrevivência das operárias de Atta sexdens rubropilosa, com redução mais acentuada para a concentração 500µg/mL (Figura 4). A análise estatística revelou que as concentrações 10µg/mL, 50µg/mL, 100µg/mL e 500µg/mL apresentaram valores significativos quando comparadas com o controle acetona. O tempo de sobrevivência mediana das formigas tratadas com rotenona foi de 22 dias para a concentração 10µg/mL, 17 dias para as concentrações 50µg/mL e 100µg/mL e 15 dias para a concentração 500µg/mL. O controle dieta pura apresentou mediana superior a 25 dias e o controle acetona atingiu a mediana no 25º dia de experimento. Não houve mortalidade total das formigas até o término do experimento, observando-se 68% de mortalidade para concentração 10µg/mL, 86% para as concentrações 100µg/mL e 500µg/mL e 90% para a concentração 50µg/mL. As formigas mantidas com dieta artificial contendo rotenona dissolvida em acetona apresentaram sintomas de intoxicação, principalmente dificuldade de locomoção e imobilidade (lentidão), a partir do 8º dia para as concentrações 100µg/mL e 500µg/mL e a partir do 11º dia para as concentrações 10µg/mL e 50µg/mL.

30 28 A rotenona dissolvida em mistura de acetona e óleo de soja e incorporada na dieta alimentar também provocou diminuição na sobrevivência das operárias de Atta sexdens rubropilosa, com redução mais acentuada para as concentrações 100µg/mL e 500µg/mL (Figura 5). A análise estatística revelou que as concentrações 10µg/mL, 50µg/mL, 100µg/mL e 500µg/mL apresentaram valores significativos quando comparadas com o controle acetona + óleo. O tempo de sobrevivência mediana das formigas tratadas com rotenona foi de 11 dias para as concentrações 10µg/mL e 100µg/mL, 10 dias para a concentração 500µg/mL e 9 dias para a concentração 50µg/mL. O controle dieta pura e o controle acetona + óleo apresentaram medianas superiores a 25 dias. A mortalidade total das operárias ocorreu no 25º dia para a concentração 10µg/mL, no 21º dia para a concentração 50µg/mL e no 17º dia para as concentrações 100µg/mL e 500µg/mL. As formigas mantidas com dieta artificial contendo rotenona dissolvida em acetona e óleo de soja também apresentaram sintomas de intoxicação, principalmente dificuldade de locomoção e imobilidade (lentidão), a partir do 5º dia para as concentrações 50µg/mL, 100µg/mL e 500µg/mL e a partir do 7º dia para a concentração 10µg/mL. Assim como observado por Bueno (2005) para o ingrediente ativo hidrametilnona, a presença do óleo de soja também aumentou a toxicidade da rotenona, reduzindo o tempo da sobrevivência mediana das operárias de 22 dias para 11 dias na concentração 10µg/mL, de 17 dias para 9 dias na concentração 50µg/mL, de 17 dias para 11 dias na concentração 100µg/mL e de 15 dias para 10 dias na concentração 500µg/mL. O tempo de mortalidade total das formigas também foi reduzido. Nos tratamentos com rotenona dissolvida em acetona não ocorreu mortalidade total das operárias até o término do experimento enquanto que nos tratamentos com rotenona dissolvida em acetona + óleo ocorreu mortalidade total das operárias para todas as concentrações testadas antes do término do experimento.

31 29 Figura 4. Curvas de sobrevivência de operárias de Atta sexdens rubropilosa submetidas ao bioensaio de incorporação em dieta artificial com rotenona e solvente acetona. Tabela 1. Mortalidade acumulada e sobrevivência mediana (Md) de operárias de Atta sexdens rubropilosa submetidas ao bioensaio de incorporação em dieta artificial com rotenona e solvente acetona % acumulada de mortalidade por dia Tratamento Md * Dieta Pura >25a Acetona a Rotenona 10µg/mL b Rotenona 50µg/mL b Rotenona 100µg/mL b Rotenona 500µg/mL b * Letras distintas em relação ao controle indicam diferença significativa de acordo com o teste log rank (p< 0,05).

32 30 Figura 5. Curvas de sobrevivência de operárias de Atta sexdens rubropilosa submetidas ao bioensaio de incorporação em dieta artificial com rotenona e solvente acetona e óleo. Tabela 2. Mortalidade acumulada e sobrevivência mediana (Md) de operárias de Atta sexdens rubropilosa submetidas ao bioensaio de incorporação em dieta artificial com e solvente acetona e óleo % acumulada de mortalidade por dia Tratamento Md * Dieta Pura >25a Acetona + óleo >25a Rotenona 10µg/mL b Rotenona 50µg/mL ,0b Rotenona 100µg/mL b Rotenona 500µg/mL b * Letras distintas em relação ao controle indicam diferença significativa de acordo com o teste log rank (p< 0,05).

33 31 Além da toxicidade do ingrediente ativo, a sua velocidade de ação é outro fator considerado importante durante o processo de seleção de novos inseticidas para uso em iscas no controle de formigas cortadeiras. Os conceitos de toxicidade lenta e retardada foram primeiramente utilizados por Stringer et. al. (1964) para a realização de uma rápida seleção de ingredientes ativos para as formigas lava-pés e, posteriormente, adaptados por Nagamoto (1998) para as formigas cortadeiras. Estes conceitos referem-se à seleção de inseticidas de toxicidade lenta, que causem baixa mortalidade nas primeiras 24 horas e alta mortalidade no final do experimento. Esta característica é desejada para a eficiência de uma isca, pois desta forma as operárias poderão sobreviver tempo suficiente após o primeiro contato com o ingrediente ativo e distribuí-lo por toda a colônia (SANTOS, 2005). Não há relatos de ensaios de ingestão com rotenona realizados para insetos, mas em comparação com as curvas de sobrevivência observadas para a hidrametilnona (BUENO, 2005), a rotenona apresentou resultado semelhante, com toxicidade lenta. Neste tipo de bioensaio onde as formigas não possuem outro recurso alimentar, sendo mantidas exclusivamente com a dieta artificial contendo ingrediente ativo, sem oportunidade de escolha de alimento, permite o controle de variáveis para se analisar somente a toxicidade. Entretanto, muitas dúvidas surgem em relação ao efeito repelente que o ingrediente ativo possa estar causando nas operárias, impedindo que elas se alimentem. Sendo assim, as formigas morreriam por falta de nutrientes e não pela ação tóxica do ingrediente ativo (BUENO, 2005). Os resultados obtidos nos bioensaios de incorporação em dieta artificial permitiram selecionar as concentrações de rotenona para serem testadas nos bioensaios seguintes de incorporação em polpa cítrica. Como a polpa cítrica foi oferecida somente no primeiro dia de experimento, as concentrações consideradas tóxicas nos bioensaios de incorporação em dieta artificial (50µg/mL, 100µg/mL e 500µg/mL) foram aumentadas em 100 vezes. No entanto, a concentração de 10µg/mL não foi utilizada, pois não apresentou resultados promissores, sendo substituída por uma concentração de 200µg/mL, intermediária entre as concentrações 100µg/mL e 500µg/mL.