2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1. MASTITE EM PEQUENOS RUMINANTES

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1 12 1. INTRODUÇÃO A caprino-ovinocultura brasileira dispõe de um expressivo rebanho, principalmente na região Nordeste do país, onde se encontra 93 % e 55% dos caprinos e ovinos, respectivamente (IBGE, 2004). O estado de Pernambuco apresenta o 3º maior efetivo destes pequenos ruminantes na região Nordeste do país. A elevada adaptabilidade destes animais às condições edafoclimáticas da região, além da baixa necessidade de capital inicial, torna a criação destes pequenos ruminantes uma alternativa viável para a geração de renda e garantia de segurança alimentar para a população nordestina, principalmente aquela localizada em áreas semi-áridas (HOLANDA JUNIOR; ARAÚJO, 2004). Os sistemas de produção variam desde criações de subsistência, sendo a produção destinada exclusivamente para o próprio consumo do grupo familiar, geralmente em pequenos criatórios, tanto nas áreas rurais quanto nas periferias das grandes cidades, até criatórios comerciais bem organizados, com grandes estruturas de produção e, na maioria das vezes, dedicando-se também ao beneficiamento e comercialização dos produtos (RIBEIRO, 1998). Na Região NE, a falta de organização dos criadores, de assistência técnica especializada, além da precariedade do manejo higiênico-sanitário, são alguns dos entraves que impedem o crescimento da atividade. Os problemas sanitários, nutricionais e de manejo em geral, limitam o potencial produtivo dos animais (VIEIRA et al., 1998). Nesse contexto surge a mastite, uma importante enfermidade em rebanhos leiteiros, sendo as formas de controle desta doença um importante campo de pesquisa. Até o presente momento não foram encontrados dados na literatura sobre a utilização de vacinas e ou antibióticos nos rebanhos de cabras leiteiras na região do submé*dio do Sertão do São Francisco. Portanto, objetivou-se com este trabalho testar a utilização isolada ou combinada de antibióticos e vacinas direcionados a partir de resultados da lactocultura, considerada prova padrão para diagnóstico da mastite em pequenos ruminantes.

2 13 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1. MASTITE EM PEQUENOS RUMINANTES A mastite é uma inflamação da glândula mamária provocada principalmente por bactérias. A produção de ovinos e caprinos é bastante familiar, logo possuindo um forte compromisso com o desenvolvimento regional. A mastite nesses animais é um grave problema, tanto pela redução na produtividade, como pelos riscos a saúde pública (SILVA et al., 2001). Dentre as formas de mastite, a mastite clínica é facilmente diagnosticada por alterações no leite e no úbere (COSTA et al., 1995; PUGH, 2004). No entanto, a forma associada a maior impacto econômico é a mastite subclínica, que não pode ser diagnosticada pela observação visual da fêmea ou do leite e sim pela presença de elevadas contagens de células somáticas (CCS) no leite (WATTS et al., 1988). Segundo Contreras et al. (2007) a prevalência de mastite subclínica em pequenos ruminantes situa-se entre 5 e 30%, no entanto a incidência de mastite clínica é inferior a 5%. Na maioria dos países, as observações da incidência de mastite, independente da causa, mostram números comparáveis a 40 % de morbidade em vacas leiteiras e uma taxa de infecção, em um dos quartos de úbere, de 25 %. A incidência é similar em cabras e búfalas leiteiras (BLOOD et al., 1994). As perdas na produção de leite atribuídas às mastites subclínicas alcançam de 10 a 26% do total da produção, de acordo com grau de intensidade do processo inflamatório, da prevalência da doença, da patogenicidade do agente infeccioso e do estádio de lactação. Além da diminuição na produção, observa-se perda da qualidade do leite e da função do parênquima glandular, tornando o úbere uma reserva de patógenos. O animal não apresenta alterações visíveis na glândula, porém o leite apresenta alta contagem de células somáticas (DE GREAVES; FETROW, 1993).

3 PRINCIPAIS AGENTES ETIOLÓGICOS Os principais agentes etiológicos de mastite ovina são: Staphylococcus aureus, Pasteurella haemolytica, Streptococcus spp., Escherichia coli, Pseudomonas sp., Arcanobacterium pyogenes, Staphylococcus coagulase negativos, Corynebacterium spp., Clostridium spp. O Staphylococcus aureus e a Pasteurella haemolytica são responsáveis por 80% dos casos de mastite aguda, enquanto que os Staphylococcus coagulase negativos e o Corynebacterium spp. são responsáveis pela maioria dos casos de mastite subclínica (MORONI et al., 2005). Os patógenos bacterianos responsáveis pela mastite infecciosa são divididos em dois grupos: contagiosos e ambientais. Os contagiosos são transmitidos fundamentalmente no momento da ordenha ou no ato de mamar do filhote e são representados por Staphylococcus coagulase positiva, como o S. aureus, Staphylococcus coagulase negativa, como o S. epidermidis e S. caprae, S. agalactiae e Corynebacterium bovis. Os agentes ambientais são transmitidos antes e após as ordenhas e incluem principalmente as enterobactérias (Escherichia coli, Klesbsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes), Nocardia spp. Pseudomonas aeruginosa, fungos e algas (SMITH; HOGAN, 1998; RADOSTITS et al., 2002). Os Staphylococcus spp. têm sido apontados como os principais patógenos responsáveis pela mastite intramamária em pequenos ruminantes. Infecções intramamárias causadas por S. aureus têm merecido atenção especial, pois esta bactéria é responsável por dois tipos graves de mastite (mastite gangrenosa) e mastite subclínica. S. aureus produz algumas toxinas contribuindo para a patogênese da mastite e também têm um papel em doenças alimentares, mesmo com leite pasteurizado devido as enterotoxinas termoestáveis (CONTRERAS et al., 2007). Staphylococcus coagulase negativa (SCN) são os mais prevalentes patógenos causadores de mastite subclínica em ruminantes leiteiros. Embora menos patogênico que Staphylococcus aureus, CNS podem também produzir mastite subclínica persistente, significativo aumento de CCS, causar mastite clínica (DEINHOFER; PERNTHANER, 1995), bem como produzir enterotoxinas termoestáveis (UDO et al., 1999). No entanto, apesar da aceitação do papel dessa bactéria como maior causadora de infecções intramamárias em pequenos ruminantes, a patogenicidade de diferentes espécies de SCN é muito variável. A maioria das espécies de SCN, comumente isoladas de mastite subclínica em cabras e ovelhas são Staphylococcus epidermidis, S. caprae, S. simulans, S. chromogenes e S. xylosus

4 15 (BERGONIER et al., 2003). S. epidermidis e S. caprae estão entre os mais prevalentes microorganismos em cabras e S. epidermidis e S. simulans em ovelhas. A presença de diferentes espécies de CNS pode ser atribuída até certo ponto as práticas de controle da mastite, tal como o protocolo e tipo de desinfetante usado para imersão do teto ou terapia no período seco (CONTRERAS et al., 2003) PATOGENIA Exceto no caso de tuberculose, onde o meio de disseminação pode ser hematógeno, a infecção da glândula mamária sempre ocorre via canal do teto, e na primeira impressão, o desenvolvimento da inflamação, após a infecção, aparenta uma seqüência natural. Entretanto, o desenvolvimento de mastite é mais complexo e pode ser mais satisfatoriamente explanado em termos de três fases: Invasão, infecção e inflamação. A invasão é a fase na qual um microorganismo passa do exterior do teto para o leite, por meio do canal do teto. A infecção é a fase na qual o microrganismo se multiplica rapidamente e invade o tecido mamário, essa por sua vez causa inflamação fase em que aparece a mastite clínica e ocorre elevação no número de leucócitos no leite (BLOOD et al., 1994). Dependendo da resistência do tecido mamário e da virulência da bactéria invasora, podem ocorrer vários sintomas, desde o início gradual de fibrose, por meio de inflamação aguda sem sintomas sistêmicos, à toxemia grave com sintomas sistêmicos (BLOOD et al., 1994) MEDIDAS DE CONTROLE O controle desta enfermidade depende muito mais do sucesso de práticas preventivas que de tratamentos (CONCHA, 2004), sendo importante aumentar a capacidade de resposta do sistema imune do animal, através de vacinas contra agentes específicos (SANTOS; FONSECA, 2005). O uso destas vacinas torna-se uma opção econômica para os veterinários e criadores, uma vez que reduz custos e tem efeitos positivos sobre a qualidade do leite e a saúde pública, já que reduz a necessidade do uso de antibióticos (PORTES et al.,

5 ). Pesquisas têm demonstrado uma potencialização da antibioticoterapia associada à vacinação, elevando os índices de cura de 20 a 30% para 70 a 80% (SEARS; BELSCHNER, 1998; VAZ et al., 2001). A eficácia da vacina em prevenir a mastite por S. aureus e S. simulnans foi avaliada em condições de campo (MARCO, 1994). Os resultados indicaram uma redução da prevalência da mastite clínica, sendo que o mesmo efeito não foi observado com relação a infecções subclínicas. O mecanismo de ação desta vacina foi apenas parcialmente elucidado, mas acredita-se que a presença de opsoninas do tipo IgG2 facilita a opsonização das bactérias e a sua fagocitose, pois neutrófilos de ruminantes têm receptores de membrana para o fragmento Fc deste isotipo de imunoglobulina (GARCIA et al., 1996). Além disso, a IgA atuaria, como em outros epitélios, dificultando a adesão bacteriana. Este isotipo também é o primeiro a interagir com as proteínas dependentes de ferro expressas in vivo por diversas espécies bacterianas (LASCELLES et al. 1980). Tem-se excelente melhora da saúde do úbere e da contagem de células somáticas CCS em leite de tanque, quando adequados programas de controle da mastite são corretamente implementados (CONTRERAS et al., 2003; GONZALO et al., 2005). Em fazendas modernas a manutenção apropriada das máquinas e os parâmetros de ordenha e a correta rotina de ordenha são essências para minimizar os fatores de risco para IMI e quando eles são bem executados, a saúde do úbere melhora comparando com a ordenha manual. Com relação ao uso dos antibióticos observou-se que quando estes usados no período seco reduzem significativamente a incidência de infecções intramamárias em ovelhas e cabras leiteira (MCDOUGAL; ANNISS, 2005). Embora alguns autores desaprovassem, afirmando que o uso generalizado de antibióticos deve ser empregado em condições de alta prevalência (POUTREL et al., 1997).

6 17 3. OBJETIVOS 3.1 GERAL Avaliar a eficácia de três formas de controle da mastite estafilocócica em um rebanho leiteiro no município de Santa Maria da Boa Vista PE. 3.2 ESPECÍFICOS Isolar os agentes bacterianos envolvidos na etiologia da mastite em caprinos e em seguida realizar caracterização bioquímica dos agentes isolados; Determinar seu perfil de sensibilidade aos fármacos comumente utilizados para o tratamento das mastites; Avaliar a eficácia da associação de vacina usada isoladamente ou associada a antibiótico no controle da mastite.

7 18 4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1. LOCAL O estudo foi realizado em uma propriedade localizada no município de Santa Maria da Boa Vista PE. As análises foram realizadas no laboratório de Microbiologia e Imunologia Animal, do Campus da Fazenda Experimental da Universidade Federal do Vale do São Francisco (UNIVASF) ANIMAIS EXPERIMENTAIS Os animais foram distribuídos em quatro grupos (Figura 1). No grupo 01 (um) foi utilizada a antibioticoterapia, a partir do antibiótico que apresentou melhor atividade nos testes de sensibilidade. O grupo 02 (dois) recebeu vacina 1 + antibiótico. Em um terceiro grupo apenas a vacina foi empregada, e por último, foi constituído um grupo controle. Delineamento experimental Grupo 01 Grupo 02 Grupo 03 Grupo 04 Antibioticoterapia n = 13 Antibioticoterapia + Vacina n = 14 Vacina n = 11 Controle n = 15 Figura - 1. Fluxograma demonstrativo da distribuição dos animais de acordo com o tratamento empregado. 1 MASTAPH IRFA Química e Biotecnologia Industrial Ltda. Porto Alegre, RS Brasil.

8 19 O protocolo de vacinação foi realizado de acordo com as recomendações do fabricante, sendo empregadas duas doses da vacina com um intervalo de 21 dias. A aplicação da dose de 0,5 ml foi realizada na região atrás da paleta, utilizando-se a via subcutânea COLETA DAS AMOSTRAS DE LEITE Os jatos de leite foram coletados diretamente em frascos estéreis, previamente identificados e colocados em caixas isotérmicas com gelo e encaminhados imediatamente ao laboratório para processamento. O isolamento bacteriano foi realizado a partir de leite coletado antes da ordenha, após cuidadosa anti-sepsia dos tetos com álcool a 70% CULTURA BACTERIANA Volumes de 10 µl de cada amostra foram semeados com alça calibrada em cada quadrante de uma placa de Ágar-sangue contendo 5% de sangue desfibrinado de carneiro. Assim, somente foi consideradas significativas a presença de quatro colônias não hemolítica ou mais com as mesmas características morfológicas, enquanto que a partir de uma colônia hemolítica já se considera o cultivo significativo. As bactérias foram identificadas de acordo com características morfológicas, bioquímicas e tintoriais, conforme descrito por Quinn et al. (1994) TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS O perfil de sensibilidade dos microrganismos foi determinado através do método de difusão em disco Kirby-Bauer modificado (BAUER et al., 1966). Os isolados foram semeados em Müller Hinton caldo e incubados a 37ºC até obtenção de turvação conforme a escala 0,5 de Mac Farland. Com auxílio de um swab, os isolados foram semeados em placas de Petri contendo Müller Hinton ágar. Logo após, foram aplicados os discos impregnados

9 20 com as drogas antimicrobianas que incluíram: tetraciclina (30 µg), ciprofloxacina (05 µg), gentamicina (10 µg), ampicilina (10 µg), norfloxacina (10 µg), oxacilina (01mcg), ceftriaxona (30mcg), lincomicina (02 µg), nitrofurantoína (300 µg), sulfametoxazol (25 µg), neomicina (30 µg) e penicilina G (10 U.I). As placas foram incubadas em estufa durante 24h a 37ºC. Após a leitura dos halos foi determinado o perfil de sensibilidade dos isolados ANÁLISE ESTATÍSTICA teste Qui-quadrado. A análise da distribuição das freqüências observadas em cada grupo foi feita pelo

10 21 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO No teste de sensibilidade aos antimicrobianos, observou-se maior sensibilidade a: ciprofloxacina e norfloxacina (100%), seguidas de nitrofurantoína (97,8%), ceftriaxona (93,3%), cloxacilina (88,8%), gentamicina (82,2%), sulfametoxazol (71,1%), neomicina (66,6%) e lincomicina (55,5%) (Figura 02). De posse desses resultados e pela disponibilidade no mercado, optou-se pela avaliação de um derivado da oxacilina - cloxacilina. Estudo realizado por (MORONI, et al., 2005) demonstrou a resistência dos isolados de S. epidermidis a amoxacilina, contudo a sensibilidade aos demais beta-lactâmicos (ampicilina e penicilina G) foi variada. Os mesmos autores demonstraram a baixa sensibilidade a tetraciclina, tal fato foi semelhante ao observado no presente estudo. Isolados de Staphylococcus spp. provenientes de casos de mastite em caprinos e ovinos tendem a serem menos resistentes aos antimicrobianos (CONTRERAS et al., 2007). Tabela 01. Porcentagem de tetos infectados por Staphylococcus spp. coagulase negativa antes e após quatro formas de controle da mastite em cabras leiteiras, no município de Santa Maria da Boa Vista-PE Tratamento Porcentagem de tetos infectados por Staphylococcus spp. coagulase negativa Total (n) % Antes (n) % Depois (n) χ 2 P Antibiótico 26 34,6 (11) a 7,7 (2) b 4,55 P<0,05 Antibiótico + Vacina 28 42,8 (12) a 7,1 (2) b 7,21 P<0,05 Vacina 22 22,7 (2) 40,9 (9) 1,21 P>0,05 Controle 30 26,6 (9) 20,0 (6) 0,36 P>0,05 a, b Letras subscritas diferentes na mesma linha diferem pelo Qui-quadrado (χ 2 ). P = Probabilidade

11 22 120% 100% 80% 60% 40% 20% 0% Ampicilina Ceftriaxona Ciprofloxacina Gentamicina Lincomicina Neomicina Nitrofurantoina Norfloxacina Oxacilina Penicilina G Sulfametoxazol Tetraciclina Figura 02. Perfil de sensibilidade aos antimicrobianos de isolados de S. epidermidis e S. caprae obtidos de caprinos leiteiros em Santa Maria da Boa Vista. Mesmo sem grande utilização na terapia humana, os grupos de antimicrobianos utilizados na terapia humana e veterinária são os mesmos e com isto a resistência cruzada pode ocorrer. Desta forma, estes patógenos podem representar um risco a saúde pública, especialmente pelo consumo de queijo cru (CONTRERAS et al., 2007). A porcentagem de tetos infectados por Staphylococcus spp. coagulase negativa antes e após os tratamentos foi de 34,60 e 7,70% para o grupo tratado com antibiótico; 42,80 e 7,1% para o grupo tratado com antibiótico mais vacina e 22,7 e 40,90 para o grupo de animais tratados apenas com vacinas. Os animais do (grupo dois) que receberam tratamento com a associação de antimicrobiano e vacina apresentaram redução significativa (P<0,05) no número de tetos infectados. A utilização a penas do antimicrobiano cloxacilina (grupo um) também foi eficiente em reduzir significativamente (P<0,05) a taxa de infecção. Pesquisas têm demonstrado uma potencialização da antibioticoterapia associada à vacinação, elevando os índices de cura de 20 a 30% para 70 a 80% (VAZ et al., 2001). O uso isolado da vacina não foi eficiente para o controle da mastite estafilocócica de pequenos ruminantes. Foi observado no (grupo 03), que o número de casos de mastite aumentou de 22,7% para 40,9% (Tabela 01). A vacina utilizada no presente estudo é indicada para prevenção da mastite produzida pelo Staphylococcus aureus. Isso pode explicar a baixa eficiência desta no rebanho, já que foi comprovado em estudos prévios que apenas

12 23 Staphylococcus coagulase negativa, são isolados dos animais enfermos nesta propriedade. De acordo com Contreras et al. (2007), mais estudos sobre imunização são necessários para melhorar esta estratégia. Da mesma forma sugere-se que novos estudos devem ser conduzidos em rebanhos onde Staphylococcus aureus não seja o principal agente etiológico da mastite nos caprinos. O tratamento com antibióticos requer acompanhamento veterinário para garantir a adequada e higiênica administração. Alguns surtos têm sido atribuídos a erros iatrogênicos devido a seringas contaminadas por P. aeruginosa or A. fumigatus (BERGONIER et al., 2003; CONTRERAS et al., 2003). Uso excessivo de antibióticos pode aumentar o risco da resistência aos antibióticos e tem se tornado um problema de saúde pública. A detecção de cepas de S. aureus resistentes aos aminoglicosídios deve ser considerada uma preocupação para saúde pública, dado ao mecanismo similar para cepas isoladas em humanos (GONI et al., 2004). A ausência de resíduos de antibióticos no leite de vacas e outras espécies é obrigatória na União Européia, embora parecesse que resultados positivos são maiores em leite de pequenos ruminantes que em vacas (YAMAKI et al., 2004). Apesar da disponibilidade de registros de métodos não específicos para detecção de resíduos para o leite de pequenos ruminantes, Contreras et al. (1997) demonstraram a alta seletividade dos Kits registrados para leite de vacas quando empregados com leite de cabra. Contudo, devido às técnicas de rotina usadas para identificação de resíduos de antibióticos são ineficazes para detectar todos os casos positivos, métodos para detectar antibióticos precisam ser padronizados para leite de (YAMAKI et al., 2004). Antes do risco a saúde humana o perigo que pode ser causado por algumas bactérias da mastite, leite é geralmente tratado através do calor para minimizar este efeito. Todavia, em regiões onde o queijo é fabricado de leite cru, o controle da mastite clínica e subclínica tornam-se uma prioridade. Mesmo usando pasteurização do leite, a habilidade de algumas bactérias, tal como o Staphylococcus aureus, para produzir toxinas termoestáveis, aumenta o potencial zoonótico deste patógeno. De acordo com a legislação européia, o controle de S. aureus é obrigatório, tal que o marketing de leite contaminado de ovelha, cabras, e vacas com S. aureus é proibido (CONTRERAS et al., 2007). É de fundamental importância o conhecimento dos agentes causadores da mastite em ovinos e caprinos, bem como a determinação de sua sensibilidade aos agentes antimicrobianos a fim de permitir o estabelecimento de uma terapia racional com maiores chances de sucesso.

13 24 6. CONCLUSÃO A elevada prevalência de Staphylococcus coagulase negativa sugere a presença de fatores de risco relacionados à higiene da ordenha. Observou-se elevada sensibilidade aos diversos antimicrobianos, principalmente as grupo das quinolonas: ciprofloxacina e norfloxacina. O antibiótico a base de cloxacilina pode ser usado isoladamente ou em associação a vacinas anti-mastíticas para controle da mastite estafilocócica em pequenos ruminantes. Contudo, faz-se necessária a continuidade dos estudos acerca do potencial das vacinas para o controle da mastite em pequenos ruminantes.

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