Documentos. ISSN Outubro, Melhoramento animal: o uso de marcadores moleculares e da reprodução assistida

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1 Documentos ISSN Outubro, Melhoramento animal: o uso de marcadores moleculares e da reprodução assistida

2 ISSN Agosto, 2006 Recursos Genéticos e Biotecnologia Documentos 188 Melhoramento animal: o uso de marcadores moleculares e da reprodução assistida Maurício Machaim Franco Eduardo de Oliveira Melo Brasília - DF 2006

3 Exemplares desta edição podem ser adquiridos na Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia Serviço de Atendimento ao Cidadão Parque Estação Biológica, Av. W/5 Norte (Final) Brasília, DF CEP Caixa Postal PABX: (61) Fax: (61) TUTUTUhttp:// e.mail:sac@cenargen.embrapa.br Comitê de Publicações Presidente: Sergio Mauro Folle Secretário-Executivo: Maria da Graça Simões Pires Negrão Membros: Arthur da Silva Mariante Maria de Fátima Batista Maurício Machain Franco Regina Maria Dechechi Carneiro Sueli Correa Marques de Mello Vera Tavares de Campos Carneiro Supervisor editorial: Maria da Graça S. P. Negrão Normalização Bibliográfica: Maria Iara Pereira Machado Editoração eletrônica: Maria da Graça S. P. Negrão 1ª edição 1ª impressão (2006): Todos os direitos reservados. A reprodução não-autorizada desta publicação, no todo ou em parte, constitui violação dos direitos autorais (Lei no 9.610). F 825 Franco, Maurício Machaim. Melhoramento animal: o uso de marcadores moleculares e da reprodução assistida. / Maurício Machaim Franco e Eduardo de Oliveira Melo. Brasília: Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, p. (Documentos / Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, ; 188) 1. Animal - melhoramento. 2. Marcadores moleculares. 3. Reprodução assistida. I. Melo, Eduardo de Oliveira. II. Título. III. Série CDD 21.

4 AUTORES Maurício Machaim Franco Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia Eduardo de Oliveira Melo Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia

5 SUMÁRIO Introdução... 6 Seleção Clássica... 7 Seleção assistida por marcadores moleculares e genes... 8 Impacto das técnicas de reprodução assistida no melhoramento animal Considerações finais Bibliografia... 13

6 Melhoramento animal: o uso de marcadores moleculares e da reprodução assistida Introdução O constante aumento populacional nos obriga a aumentar a produção de alimentos de maneira exponencial com, no entanto, uma preocupação cada vez maior com a preservação do meio ambiente. Por isso, a necessidade de aumentarmos a produtividade por área utilizada é fundamental, até porque as fronteiras agrícolas estarão cada vez mais restritas. Trabalhos de seleção por melhoramento clássico e hoje, associado às técnicas de genética molecular e de reprodução assistida, resultaram em um animal mais produtivo e lucrativo; inclusive já faz parte das nossa realidade atual a produção de animais por clonagem e transgenia. As biotécnicas de reprodução animal como inseminação artificial, produção in vitro e transferência de embriões, clonagem e transgenia são ferramentas indiscutivelmente úteis à pecuária moderna, pois auxiliam na identificação, seleção e multiplicação mais rápida de animais geneticamente superiores. Esse conjunto de técnicas vem contribuindo para a melhoria dos índices produtivos, gerando lucros não só ao produtor rural, mas também ao consumidor no final da cadeia produtiva. A seleção de animais data do início da domesticação destes pelo homem. Inicialmente era feita apenas por observação visual, onde aqueles indivíduos que apresentavam um fenótipo (conjunto de características) desejado eram utilizados na reprodução. Com o nascimento de uma nova ciência, a genética, novos conhecimentos e ferramentas sugiram, permitindo uma melhor compreensão dos padrões de herança das características observadas. Neste contexto se destacam os experimentos de Johann Gregor Mendel nos idos de No início do século XX, com o melhor entendimento das leis da herança de Mendel, a genética deu um salto grandioso e várias descobertas importantes aconteceram em um curto espaço de tempo. Podemos citar aqui, dentre as várias descobertas, os experimentos de Avery em 1944 mostrando que a informação genética está contida na molécula de DNA; a descoberta da estrutura tridimensional do DNA em 1953 por Watson, Crick, Franklin e Wilkins; e a capacidade de amplificar a molécula de DNA em laboratório por Saiki e Mullis em Os avanços do conhecimento nas áreas da genética de populações; genética quantitativa; informática; das metodologias estatísticas e da técnica de Inseminação Artificial (IA) culminaram com o surgimento de uma nova área de conhecimento, o 6

7 melhoramento genético animal. A possibilidade, através da IA, de um touro ser capaz de produzir centenas de filhos em diferentes rebanhos e regiões geográficas distintas permitiu que ferramentas de melhoramento pudessem identificar, com uma boa acurácia, touros melhoradores. A partir daí vários programas de melhoramento surgiram no Brasil, uns de iniciativa pública, outros, de iniciativa privada. Hoje já existe a tendência de unificação de alguns programas gerando sumários consolidados, que agrupam os dados gerados e aumentam as possibilidades de escolhas de reprodutores por parte dos criadores. Seleção Clássica Um programa de melhoramento começa e termina dentro das fazendas. Inicia com a geração das informações pela propriedade e o envio dessas para os centros de avaliação; e termina com as informações voltando para os criadores, na forma de sumários de touros, que irão orientá-los na escolha dos reprodutores que melhor se adequam aos seus rebanhos. Como passos intermediários desse processo podem-se citar ordenadamente a formação dos grupos contemporâneos (que são grupos de animais da mesma raça, sexo, nascidos no mesmo ano e época e manejados de forma semelhante até a mensuração das características), a formação dos arquivos de dados, os cálculos do grau de parentesco genético entre todos os indivíduos, a formação das equações para solução simultânea e, por fim, a geração dos resultados da avaliação genética. O resultado de todo esse processo é a confecção de um catálogo ou sumário de touros, onde há todas as informações necessárias e importantes para subsidiar o pecuarista na escolha do melhor animal a ser usado na sua propriedade de acordo com seu objetivo de seleção e/ou de produção, inclusive com informação de segurança ou acurácia com que esses dados foram gerados. Dentre várias outras informações contidas nos catálogos, como fotos e genealogia dos animais, se destacam a Diferença Esperada na Progênie (DEP) ou Habilidade Prevista de Transmissão (PTA) e a acurácia. A DEP pode ser definida como a diferença esperada na média das performances das progênies futuras de determinado touro em relação à média das diferenças esperadas das progênies futuras de todos os touros que participaram da mesma avaliação. É importante enfatizar que a DEP é uma estimativa e, portanto não é um valor estático, podendo mudar em função da variação do número de informações usadas. A acurácia é a certeza ou segurança com que a DEP é estimada. Para exemplificar podemos imaginar uma situação em que o criador tem duas opções de escolha, sendo o touro X com uma DEP365 de -4 Kg e um touro Y com uma DEP365 de + 11 Kg. Se o criador optar pelo uso do touro Y na sua população de vacas terá um ganho de 15 Kg de peso 7

8 por animal aos 365 dias de idade, em média. Além disso, o criador poderá ter uma idéia bastante segura da certeza com que esse ganho poderá ocorrer, utilizando as informações da acurácia. Na prática, a DEP é que deve ser o fator de decisão de usar ou não determinado touro, sendo a acurácia o fator de definição da intensidade do seu uso. Nos vários programas de melhoramento são geradas várias DEPs diferentes como DEP120 (peso na fase maternal), DEP240 (peso aos 240 dias fase de desmame), DEP365 (peso aos 365 dias), DEP420 (peso aos 420 dias), DEPIPP (idade ao primeiro parto), PTALeite (produção de leite), PTAProteína (produção de proteína no leite), PTAGordura (produção de gordura no leite), dentre outras. Isto permite ao pecuarista escolher os melhores animais para características que são seu objetivo de produção. Por exemplo, pecuaristas que vendem bezerros a desmama podem priorizar a escolha de touros com as melhores DEP240, pois obterão bezerros mais pesados nessa fase, consequentemente agregando valor aos animais e aumentando sua lucratividade. Seleção assistida por marcadores moleculares e genes No início da década de 70 com a descoberta das enzimas de restrição, que são enzimas que tem a capacidade de cortar a fita de DNA, começaram os trabalhos na área da engenharia genética. Em apenas três décadas descobriu-se uma forma de sequenciar o DNA por Sanger; Maxam e Gilbert em 1977 e amplificá-lo em laboratório (PCR polymerase chain reaction) por Saiki e Mullis em 1985 e, com isso, foi possível iniciar o sequenciamento do genoma de vários organismos como humanos, suínos, caninos, bovinos, dentre outros. A partir da descoberta da seqüência de DNA de vários genes e regiões do genoma, aliados ao conhecimento da função fisiológica dos genes, surgiram os primeiros trabalhos associando diferenças na seqüência de DNA de uma região ou gene com uma característica fenotípica. Surgia aí a possibilidade do uso de marcadores moleculares para rastrear as características de interesse e a possibilidade do uso desses marcadores em programas de melhoramento, a chamada seleção assistida por marcadores ou Marker Assisted Selection (MAS) e a seleção assistida por genes ou Genes Assisted Selection (GAS). Baseando-se nessas informações, seria então possível predizer o potencial de um animal para expressar determinada característica logo após o seu nascimento. Para isso bastaria extrair o DNA do animal a partir de amostras de sangue, pêlo ou qualquer outro tecido, logo após o nascimento e identificar o genótipo do indivíduo para aquele gene em questão, estudando seu DNA no laboratório. Isso traria um impacto enorme ao setor produtivo, pois seria 8

9 possível identificar e selecionar os melhores animais precocemente, até mesmo antes da expressão (aparecimento) da característica desejada. Entretanto, o uso de marcadores moleculares nos programas de seleção não é tão simples assim. Para se entender um pouco melhor temos que voltar aos conhecimentos básicos da genética clássica e discutir um pouco sobre o padrão de herança das características fenotípicas. Podemos de um modo mais simplificado, dividir as características como qualitativas e quantitativas. Podemos dizer que as características qualitativas são aquelas onde os indivíduos são separados por classes fenotípicas bem distintas. Como exemplos podemos citar a presença ou ausência de chifres ou a pelagem branca, ruão ou vermelha, em bovinos. Os indivíduos são mochos ou chifrudos, sendo que o padrão de herança para essa característica é monogênica, ou seja, é de responsabilidade de um só gene, com pequeno ou nenhum efeito ambiental. Sendo assim, quando se identifica o genótipo do animal através do estudo do seu DNA, com muita certeza podemos predizer o fenótipo do animal e selecionar o que melhor nos convier, mesmo logo após o nascimento ou até mesmo no embrião. Mas quando se trata das características quantitativas o assunto se torna um pouco mais complexo. Podemos dizer que as características quantitativas são aquelas onde não se tem classes fenotípicas bem distintas; os fenótipos são obtidos por mensurações e os indivíduos podem apresentar diferenças muito pequenas entre si. Normalmente tais características têm um padrão de herança poligênica, ou seja, é determinada por vários genes (até dezenas ou mais) cada um com pequeno efeito no fenótipo e com considerável efeito ambiental. Podemos citar como exemplos as características quantitativas relacionadas à produção de carne na carcaça, a capacidade de ganho de peso, o acúmulo de gordura na carcaça, a produção de leite, as características reprodutivas, etc. Contudo, apesar de muitos genes estarem envolvidos na determinação dessas características, na prática percebe-se que é possível encontrar alguns genes que tem um efeito maior e mensurável na determinação da característica, com efeito preponderante em relação aos outros genes, sendo chamados de genes de efeito maior ou major genes. Isto permite que estes genes possam ser encontrados, isolados e seu efeito determinado com uma precisão razoável. Assim, os major genes podem ser utilizados como marcadores moleculares em programas de melhoramento, de forma similar aos genes para características qualitativas tratados anteriormente. Entretanto, para a maioria dos demais genes, que possuem efeito individual muito pequeno sobre a expressão da característica, a sua identificação e caracterização fica bastante dificultada, tornandose mais complicada sua utilização como marcadores moleculares na seleção assistida. 9

10 Um outro ponto a ser explorado, com grande potencial para o uso da genética molecular nos programas de melhoramento, seria a utilização de marcadores moleculares para identificação e erradicação de doenças genéticas. Algumas já foram bem caracterizadas como a Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency (BLAD) (SHUSTER et al., 1992) e a Complex Vertebral Malformation (CVM) (NIELSEN et al., 2003) no gado holandês, por exemplo. A BLAD é uma doença genética recessiva que causa deficiência na adesão de leucócitos. Os animais doentes raramente sobrevivem, apresentando diminuição na expressão de β-2 integrina e como conseqüência os leucócitos alterados não conseguem penetrar no tecido para combater os agentes patológicos. A CVM é também uma doença genética recessiva caracterizada por má formação congênita levando a múltiplas consequências como nanismo e malformação das partes cervical e torácica da coluna vertebral. A CVM provoca elevada taxa de aborto e o fenótipo CVM dos fetos pode afetar severamente características reprodutivas das vacas. Para as duas doenças, testes de DNA podem ser utilizados com uma precisão de 100% e assim os animais de genótipos indesejáveis podem ser eliminados. Esses marcadores já estão sendo utilizados comercialmente, e inclusive já constam em catálogos de touros da raça holandesa. Assim, o criador tem a informação dos touros que são portadores dos alelos para essas doenças e pode tomar a decisão de usar ou não um touro com uma DEP alta para uma característica de seu interesse, mas portador da alelo para a doença. Por tudo isso se pode perceber que as possibilidades do uso de marcadores moleculares na seleção são concretas e podem ser de grande ajuda nos programas de melhoramento. Talvez as melhores perspectivas para o uso dos marcadores moleculares sejam para a genotipagem de genes relacionados a doenças, a características qualitativas de interesse econômico e para major genes relacionados a características de produção que apresentam baixa herdabilidade, limitadas pelo sexo (produção de leite, por exemplo) e de difícil predição (marmoreio, maciez de carne, etc). Uma questão ainda em aberto é a necessidade de desenvolvimento de metodologias estatísticas eficientes para a inclusão de um grande número de marcadores durante o processo de identificação dos animais com mérito genético superior, ou seja, dentro das metodologias do melhoramento clássico. Portanto, devemos ver os marcadores moleculares como uma importante ferramenta para auxiliar os métodos clássicos de melhoramento e não para substituí-los. Finalmente, podemos concluir que o melhoramento clássico seleciona o conjunto de todos os genes, pelo fenótipo e o melhoramento assistido por marcadores, também acessa os genes e seleciona pelo genótipo. 10

11 Impacto das técnicas de reprodução assistida no melhoramento animal Em relação às biotecnologias reprodutivas, além da IA, a partir do início dos anos 80 grandes avanços foram obtidos com a Transferência de Embriões (TE) e a Produção in vitro de Embriões (PIV) em bovinos. Hoje é possível obter animais transgênicos associando-se à técnica de transgenia, a clonagem por Transferência Nuclear (TN). Dentro do contexto do melhoramento animal, as biotecnologias da reprodução se destacam também como importantes e imprescindíveis ferramentas de auxílio. Como já discutido anteriormente os avanços nos programas de melhoramento só foram possíveis devidos a IA, onde um touro pôde ter centenas de filhos em diversos rebanhos e diferentes regiões geográficas, e com isso alimentando os bancos de dados para a geração de informações robustas e confiáveis sobre os animais avaliados. Dentre as principais vantagens no uso das biotécnicas de reprodução, como a TE e PIV, que possuem impacto sobre programas de melhoramento, podemos citar: 1) Produção de grande número de descendentes pelo uso da IA, viabilizando os testes de progênie (TP) e provando touros; permitindo aumentar a intensidade de seleção de touros; 2) Otimização do uso da fêmea pela TE e PIV, aumentando o número de progênie por doadora, além da possibilidade de diminuição do intervalo entre gerações por poder utilizar ovócitos de bezerras; 3) Permite, através da TE (lavagem dos embriões), o resgate de material genético importante (variabilidade genética) que seria eliminado por motivos sanitários; 4) Permite a rápida expansão de estoques genéticos raros em vias de extinção, que apesar de pouca variabilidade, podem ser importantes em determinados casos por portarem genes de interesse; 5) Facilidade de importação e exportação de material genético. É mais seguro, rápido e barato transportar sêmen e embriões; 6) Formação de bancos de gametas congelados para utilização no futuro; 7) Aumento da eficiência de utilização do sêmen congelado de alto valor genético; 11

12 8) Estruturação de núcleos MOET (multiple ovulation and embryo transfer): vacas doadoras de embriões constituem grandes famílias de irmãos e irmãs completos sendo os touros avaliados pelo desempenho de suas irmãs completas ou meio-irmãs. Com isso pode-se obter um ganho genético mais rápido, pois touros jovens podem ser avaliados em menos tempo, de sete anos no TP para quatro anos ou menos para MOET (VALENTE et al., 2001); 9) MOET + PIV otimiza ainda mais o uso da fêmea, permitindo aumentar a intensidade de seleção; na seleção de uma fêmea utilizam-se as informações dela própria; 10) MOET diminui intervalo de gerações aumenta razão de ganho genético ao redor de 15% mas aumenta risco de consangüinidade (MEUWISSEN, 1998); 11) MOET + PIV + Marcador de DNA incremento de 24%; (MEUWISSEN, 1998); Alguns critérios devem ser observados quanto à utilização das biotécnicas de reprodução, dentre eles podemos citar a necessidade do conhecimento prévio do valor genético do material a ser multiplicado, se os animais que participam de programas de reprodução assistida fazem parte de um programa de melhoramento, e a multiplicação de animais de alto valor genético comprovado. Como propostas para evitar ou amenizar o aumento das taxas de endogamia pode ser sugerido acasalamentos de vários touros com cada vaca e a possibilidade de lançar mão de algum programa de acasalamento. O uso das biotecnologias aplicadas à reprodução animal têm sido de grande relevância e efeito nos programas de melhoramento animal, mas procedimentos de avaliação do material genético a ser utilizado e técnicas para evitar o aumento das taxas de endogamia são essenciais para a decisão a respeito de qual material genético deve ser disseminado na população e em com que frequência esse material pode ser utilizado (FERRAZ e ELER, 2001). Apesar de todas essas informações e ferramentas disponíveis ao setor produtivo, ainda assim há resistências ao uso dessas biotecnologias. Muitas vezes por desconhecimento, outras por falta de iniciativa ou ainda por resistência a mudanças. A aquisição de touros selecionados apenas por observação visual ainda é freqüente e, pior ainda, utilizamos em várias situações os chamados bois de boiada como reprodutores. Quantos animais entram em programas de produção de embriões sem 12

13 serem avaliados com relação ao seu mérito genético? Ao mesmo tempo em que podemos estar intensificando a multiplicação de animais alto mérito genético, e assim contribuindo para o ganho genético dos rebanhos, podemos também estar multiplicando animais de mérito genético inferior e retrocedendo no contexto geral do melhoramento, com o qual se espera obter ganhos positivos a cada geração. Considerações finais Finalmente, com a crescente globalização de todos os setores da economia, a competição se torna cada vez mais forte, exigindo a cada dia maior eficiência de produção. No setor agropecuário isto não é diferente, o que exige aumento da produtividade por área, assim como o aumento na qualidade do produto com menor custo de produção possível. Sem dúvida alguma o produtor que não se adequar às novas exigências do mercado, mantendo-se atualizado e incorporando novas e eficientes tecnologias para otimizar sua produção, naturalmente vai ser submetido a um forte processo de seleção e acabará sendo excluído da sua atividade. Bibliografia AVERY, O. T., MACLEOD, C. M.; MCCARTY, M. Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types. Induction of transformation by a deoxyribonucleic acid fraction isolated from Pneumococcus Type III. Journal of Experimental Medicine, New York, v. 79, p , FERRAZ, J. B. S.; ELER, J. P. Transferência de embriões - a necessidade do conhecimento prévio do valor genético do material a ser transferido - Parte 2. Disponível em: < >. Acesso em: MAXAM, A. M.; GILBERT, W. A new method for sequencing DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Washington, v. 74, n. 2, p , MEUWISSEN, T. H. Optimizing pure line breeding strategies utilizing reproductive technologies. Journal of Dairy Science, Savoy, v. 81, Suppl. 2, p.47-54, NIELSEN, U. S.; AAMAND, G. P.; ANDERSEN, O.; BENDIXEN, C.; NIELSEN, V. H.; AGERHOLM, J. S. Effects of complex vertebral malformation on fertility traits in Holstein cattle. Livestock Production Science, Amsterdam, Netherlands, v. 79, n. 2/3, p ,

14 SAIKI, R. K.; SCHARF, S.; FALOONA, F.; MULLIS, K. B.; HORN, G. T.; ERLICH, H. A.; ARNHEIM, N. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science, Washington, v. 230, n. 4732, p , SHUSTER, D. E., KEHRLI JUNIOR, M. E.; ACKERMANN, M. R.; GILBERT, R. O. Identification and prevalence of a genetic defect that causes leukocyte adhesion deficiency in Holstein cattle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Washington, v.89, n.19, p , VALENTE, J.; DURÃES, M. C.; MARTINEZ, M. L.; TEIXEIRA, N. M. Melhoramento genético de bovinos de leite. Juiz de Fora: Embrapa Gado de Leite, p. WATSON, J. D.; CRICK, F. H. Molecular structure of nucleic acids; a structure for deoxyribose nucleic acid. Nature, Washington, v. 171, n. 4356, p ,