Prevalência de Corynebacterium sp. no leite de vacas, sua relação com o manejo de ordenha e California Mastitis Test

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1 Acta Scientiae Veterinariae, : RESEARCH ARTICLE Pub ISSN Prevalência de Corynebacterium sp. no leite de vacas, sua relação com o manejo de ordenha e California Mastitis Test Prevalence of Corynebacterium sp. in the Milk of Cows, their Relationship with Milking Practices and the California Mastitis Test Dayane Dambrós 1, Juliana Bassani 1, Vagner Miranda Portes 2, André Thaler Neto 3, Adil Knackfuss Vaz 4 & Eliana Knackfuss Vaz 1 ABSTRACT Background: Corynebacterium bovis is the species among the Corynebacterium spp. more often isolated from mammary glands and despite being classified as a secondary pathogen, its role in intramammary infection is not yet defined. Some studies have shown that this agent causes no change in production and milk composition, while others noted the ability of Corynebacterium sp. in causing mastitis, considering it as a limiting factor for production of quality milk. This study aims were to determine the prevalence of Corynebacterium sp. in herds of five Brazilian States and assess the risk factors associated with the presence of this agent in milk samples. It was also analyzed the influence of Corynebacterium sp. on the California Mastitis Test of each cow in the dairy herds in Santa Catarina State (SC), Brazil. Materials, Methods & Results: It was conducted a longitudinal study in dairy herds in the States of Pernambuco (PE), Minas Gerais (MG), Paraná (PR), Santa Catarina (SC) and Rio Grande do Sul (RS). Herds were sampled four times in the period from January 2010 to July 2011, at six months intervals. Milk samples were collected from each animal, composed of the mixture of the four mammary quarters, packed in ice and sent to laboratories responsible for each State for microbiological analysis. Bacteria examination was performed by inoculation 10 µl of each milk sample, using a calibrated disposable loop on blood Agar plates with 5% sheep blood and incubated at 37 o C for h. The microorganisms were identified following the recomendations of National Mastitis Council (NMC). From the total of 4949 milk samples, 666 (13,46%) were positive for Corynebacterium sp. The results of bacterial isolation and identification, and questionnaire data from herds in the States of Minas Gerais (MG), Pernambuco (PE), Paraná (PR) and Rio Grande do Sul (RS) were sent to the CAV/UDESC - Lages, SC. A questionnaire was applied to the farmers for information on management practices for milking and mastitis control including questions about foremilk stripping, washing and drying udders before milking, teat disinfection before and after milking, and treatment of clinical cases and of dry cows. Only in herds from Santa Catarina State California Mastitis Test (CMT) was performed in the milk of animals sampled as an indirect measure of somatic cell count (SCC). The prevalence of Corynebacterium sp. in herds from Minas Gerais State showed a significant higher difference in relation to the herds in other States, with a percentage of isolation of 21,07%. Discussion: Although Corynebacterium sp. is considered a secondary pathogen, the isolation of this agent was comparable to the observed for Staphylococcus aureus and Streptococcus agalactiae, which are considered major pathogens. Corynebacterium sp. was isolated in all dairy herds of Minas Gerais and Pernambuco States. The risk factors evaluated through the questionnaire showed no significant influence on the isolation of Corynebacterium sp. of milk samples from herds in all five States. The isolation of Corynebacterium sp. was related to changes in California Mastitis Test of milk samples from herds in Santa Catarina State, not only in the number of positive mammary quarters, but also in the California Mastitis Test score. Keywords: Corynebacterium sp., mastitis, california mastitis test. Received: 30 May 2012 Accepted: 28 September 2012 Published: 3 January Centro de Diagnóstico Microbiológico Animal, Centro de Ciências Agroveterinárias (UDESC), Lages, SC, Brazil. 2 Empresa de Pesquisa Agropecuária e Extensão Rural de Santa Catarina S. A. (EPAGRI), Chapecó, SC, Brazil. 3 Departamento de Produção Animal, UDESC, Lages, SC. 4 State University New York (SUNY), Buffalo, NY, USA. CORRESPONDENCE: D. Dambrós [dayane.veterinaria@gmail.com - Tel.: +55 (49) ]. Rua Leonel Machado, n o 181, Apto Térreo, Bairro Centro. CEP São Joaquim, SC, Brazil. 1

2 INTRODUÇÃO A mastite bovina é a enfermidade que mais causa prejuízos na pecuária leiteira tendo como principal causa as bactérias, divididas em agentes ambientais e contagiosos. As bactérias causadoras de mastite contagiosa incluem Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae e Mycoplasma bovis, considerados como patógenos principais e Corynebacterium bovis, como patógeno secundário. Corynebacterium bovis é a espécie, dentre os Corynebacterium sp., mais frequentemente isolada de glândulas mamárias e apesar de ser classificada como um patógeno secundário, seu papel na infecção intramamária ainda não está definido. Autores relataram uma diminuição na produção de leite em mastites causadas por C. bovis [8]. Este agente foi frequentemente isolado de amostras de leite quando o pós-dipping não era praticado corretamente [2]. Estudos verificaram um aumento significativo na contagem de células somáticas (CCS) em amostras de leite com de C. bovis [7,11]. No entanto, autores descreveram que, apesar de C. bovis ser um dos agentes mais comumente isolados de amostras de leite, a CCS de quartos mamários individuais destas amostras é baixa, na maioria das vezes. [5,10] Os objetivos do estudo foram determinar a prevalência de Corynebacterium sp. nos rebanhos de cinco Estados e relacionar a presença deste agente com as práticas de ordenha nas propriedades. Além disso, avaliar a influência de Corynebacterium sp. no California Mastitis Test (CMT) de cada vaca dos rebanhos leiteiros no Estado de SC. MATERIAIS E MÉTODOS O estudo foi parte do Projeto CDA-RAM - Centro Colaborador em Defesa Agropecuária para monitoramento e avaliação do risco da resistência antimicrobiana em bactérias patogênicas para o gado de leite, tendo como responsável a Embrapa Gado de Leite - Juiz de Fora, MG. O projeto foi conduzido em cinco estados: PE, MG, PR, SC e RS. O presente estudo foi realizado em duas etapas: Prevalência de Corynebacterium sp. nos rebanhos dos cinco Estados e análise do questionário, avaliando os fatores de risco associados a presença de Corynebacterium sp. nas amostras de leite; Influência de Corynebacterium sp. no CMT individual das vacas de rebanhos leiteiros no Estado de SC. Delineamento amostral Os rebanhos foram selecionados a partir da base de dados da Assistência Técnica dos rebanhos de seu Estado, e foram amostrados durante quatro vezes no período de janeiro de 2010 a julho de 2011, em intervalos semestrais. A amostragem foi realizada de acordo com o número de animais em lactação por rebanho. Em rebanhos com até 30 animais em lactação, foram coletadas amostras de todas as vacas em lactação, e em rebanhos com mais de 30 animais em lactação, o número de animais amostrados foi no mínimo 30, selecionados de forma aleatória. Coleta de amostras e aplicação de questionário Os procedimentos de coleta e transporte das amostras de leite e o e identificação dos agentes da mastite seguiram as recomendações de National Mastitis Council [8]. Foram coletadas amostras de leite de cada vaca, dos rebanhos no Estado de SC, compostas pela mistura dos quatro quartos mamários. As amostras foram obtidas após a lavagem dos tetos com água, retirada dos primeiros jatos e após cuidadosa antissepsia da extremidade dos tetos com álcool 70%. A coleta foi realizada diretamente em frascos estéreis e o material amostrado foi imediatamente acondicionado em caixas isotérmicas, posteriormente congelado e encaminhado ao laboratório de bacteriologia, do Centro de Diagnóstico Microbiológico Animal (CAV/UDESC), em Lages, SC, para bacteriano. Foi aplicado um questionário aos proprietários dos rebanhos de SC para obter informações sobre o manejo e cuidados higiênicos durante a ordenha, para controle e prevenção de mastites (exame dos primeiros jatos, lavagem e secagem dos tetos antes da ordenha, desinfecção pré e pós-ordenha, tratamento dos casos clínicos e tratamento de vaca seca). Os resultados do e identificação bacteriana, e os dados do questionário dos rebanhos nos Estados de MG, PE, RS e PR foram enviados ao CAV/UDESC, em Lages, SC. Realização do California Mastitis Test - CMT Somente nos rebanhos do Estado de SC foi realizado o California Mastitis Test (CMT) dos animais amostrados. O resultado foi avaliado em função do grau de viscosidade da mistura de partes iguais de leite e reagente. Os resultados do CMT foram expressos em cinco escores classificados em: negativo, traços, +, ++ e +++ [9]. 2

3 Análises microbiológicas O bacteriano foi realizado através da semeadura de uma alíquota de 10 µl de leite de cada amostra, com alça descartável calibrada, em placas de Ágar sangue de carneiro a 5%. Após a inoculação das amostras de leite, as placas foram incubadas em estufa a 37 o C por 24 a 48 h. As amostras que apresentaram bacteriano foram transferidas para um subcultivo em Ágar Triptona de Soja (TSA) ou Ágar Brain Heart Infusion (BHI) sendo incubadas durante um período mínimo de 18 h, para obtenção de culturas puras. Foram realizados os esfregaços corados pelo método de Gram, para verificação da morfologia e coloração da bactéria. Em seguida, os microrganismos foram identificados seguindo as recomendações do National Mastitis Council. Foi classificado como Corynebacterium sp., o microrganismo que apresentou morfologia de colônias pequenas, brancas, secas, não hemolíticas, agrupadas na porção onde a gordura do leite estava concentrada devido seu caráter lipofílico, ou seja, sua exigência por ácidos graxos insaturados como o ácido oléico. Seu crescimento foi ausente ou escasso em 24 h de incubação, mas suas colônias se tornaram evidentes após 48 h de incubação. Nos esfregaços corados, o microrganismo apresentou formato de bastonetes Gram-positivos e no teste da catalase, observou-se a formação de bolhas indicando reação positiva. Apesar dos isolados de Corynebacterium sp. não apresentarem uma confirmação de C. bovis, pois não foram realizados os testes bioquímicos, os isolados foram sugestivos de C. bovis, devido seu caráter lipofílico e sua maior freqüência de na infecção intramamária. Análise estatística Na primeira etapa, a análise dos dados foi realizada considerando os dados de campo, pela aplicação do questionário e os resultados das análises microbiológicas, que determinaram a prevalência de Corynebacterium sp. nos rebanhos leiteiros de cada Estado. Os dados foram submetidos à análise de variância, utilizando o procedimento GML (General Linear Models) do SAS, para investigar quais os fatores de risco potenciais para a ocorrência de infecção intramamária causada por Corynebacterium sp. Na segunda etapa, verificou-se a influência de Corynebacterium sp. no CMT individual dos animais de rebanhos de SC, através do teste de qui-quadrado (χ 2 ) do pacote estatístico SAS. RESULTADOS Prevalência de Corynebacterium sp. nos Estados e fatores de risco associados à presença de Corynebacterium sp. Do total de 4949 amostras de leite individual dos animais, procedentes de rebanhos leiteiros de cinco Estados brasileiros, submetidas à cultura microbiológica, 666 (13,46%) amostras apresentaram de Corynebacterium sp. Os resultados das prevalências de Corynebacterium sp. nos Estados encontram-se na Tabela 1. A prevalência de Corynebacterium sp. nos rebanhos do Estado de MG foi significativamente diferente em relação às prevalências nos rebanhos dos Estados do Sul do Brasil, com um percentual de de 21,07%. Considerando o total de rebanhos amostrados em cada Estado, Corynebacterium sp. foi isolado em todos os rebanhos nos Estados de MG e PE e nos demais, o número de rebanhos com deste agente também foi elevado. Verificou-se uma frequência expressiva de de Corynebacterium sp. nos rebanhos leiteiros, quando comparado aos demais agentes contagiosos isolados (Staphylococcus sp. coagulase positiva, Staphylococcus aureus e Streptococcus agalactiae), os quais são considerados como os principais patógenos causadores de mastite. Em relação ao manejo e cuidados higiênicos para controle e prevenção de mastite, os dados mostraram que mais de 80,0% dos rebanhos nos Estados de SC e RS, realizavam o teste da caneca telada, porém 78,26% dos rebanhos no PR não realizavam este procedimento. A lavagem dos tetos era realizada com uma freqüência elevada nos rebanhos dos Estados da região Sul, mas nos rebanhos dos Estados de MG e PE, um percentual próximo a 30,0% não realizavam essa prática e foram nestes Estados que se encontraram as maiores prevalências de Corynebacterium sp. O pós-dipping não era praticado em 45,46% dos rebanhos no Estado de MG, contudo 65,22% dos rebanhos no PR, não realizavam esta prática. Os fatores de risco estudados, obtidos através da aplicação do questionário, não apresentaram influência significativa no de Corynebacterium sp. nas amostras de leite dos rebanhos (Tabela 2). Apesar de 65,22% dos rebanhos do PR não realizarem o pós-dipping, a prevalência de Corynebacterium sp. foi baixa (9,63%), comparada aos rebanhos de MG e PE. 3

4 Infl uência de Corynebacterium sp. no CMT individual das vacas nos rebanhos leiteiros do Estado de SC. As amostras de leite dos rebanhos leiteiros de SC, que apresentaram de Corynebacterium sp., sofreram variações no número de quartos mamários positivos ao CMT. Estes resultados estão dispostos na Tabela 3. Um maior percentual de amostras com de Corynebacterium sp. apresentou todos os quartos negativos ao CMT. No entanto, houve amostras que apresentaram reação positiva ao teste, mostrando que a presença de Corynebacterium sp. nas amostras de leite pode afetar o número de quartos mamários positivos, assim como nas amostras com dos demais patógenos contagiosos. As amostras com de Corynebacterium sp. também mostraram variações quanto ao escore no CMT, sendo que o maior percentual (36,08%) destas, apresentaram uma reação inflamatória mais intensa (escore 3). Os resultados estão apresentados na Tabela 4. As amostras com dos mais importantes patógenos da mastite (Staphylococcus aureus e Streptococcus agalactiae), mostraram um maior percentual de amostras com escore 3 ao CMT, quando comparado com amostras que apresentaram de Corynebacterium sp. Tabela 1. Prevalências de Corynebacterium sp. nos rebanhos leiteiros de cinco Estados brasileiros durante o período de Estado Total de rebanhos Total de amostras Total de rebanhos Positivos Número de coletas positivas/ total Corynebacterium sp./ total 1 Corynebacterium sp./ agentes contagiosos 2 SC / / 978 b 101/ 133 PR / 82 74/ 768 b 74/ 212 RS / 84 64/ 1036 b 64/ 179 MG / / 1172 a 247/ 554 PE /40 180/ 995 ab 180/299 Total / / / Na coluna, os valores sobrescritos por letras diferentes (a b) indicam diferenças estatísticas para o mesmo parâmetro (P < 0,05). 2 Incluem Staphylococcus sp. coagulase positiva e Streptococcus agalactiae. Tabela 2. Análise dos fatores de risco extraídos do questionário, associando-os com o de Corynebacterium sp. nas amostras de leite, oriundas de rebanhos leiteiros dos cinco Estados brasileiros durante o período de Variáveis de exposição Descrição (número de categorias) P -valor Teste da caneca telada Sim ou não (2) 0,2227 Pós-dipping Sim ou não (2) 0,9225 Tratamento imediato Sim ou não (2) 0,3722 Tratamento de vaca seca Todas as vacas, parte das vacas ou não realizava (3) 0,9902 Preparação da ordenha Lavar, lavar e secar, pré-dipping ou nada (4) 0,2731 4

5 Tabela 3. Número de quartos mamários positivos ao CMT em função da presença ou ausência de e tipo de agente isolado nas amostras de leite dos rebanhos leiteiros de SC durante o período de Número de quartos positivos Amostras sem Percentual (%) Corynebacterium sp. S. aureus S. agalactiae 0 46,70 18,14 26,80 5,41 12, ,69 23,01 23,71 20,27 31, ,67 19,47 18,56 24,32 25,00 3 5,13 14,60 11,34 13,51 18,75 4 8,80 24,78 19,59 36,49 12,50 Tabela 4. Escore no CMT em função da presença ou ausência de e tipo de agente isolado nas amostras de leite dos rebanhos leiteiros de SC durante o período de Escore CMT Amostras sem Percentual (%) Corynebacterium sp. S. aureus S. agalactiae 0 46,70 18,14 26,80 5,41 12, ,11 16,37 24,74 10,81 18, ,89 14,16 12,37 20,27 25, ,29 51,33 36,08 63,51 43,75 DISCUSSÃO Corynebacterium sp. apresentou uma importante frequência de nas amostras de leite de rebanhos dos cinco Estados, semelhante ao encontrado em estudos anteriores que relataram uma presença crescente de Corynebacterium sp. nas amostras de leite submetidas a análise microbiológica [6,10]. No entanto, o fato de Corynebacterium sp. ser considerado um patógeno secundário não está relacionado apenas a frequência de mas também, à sua capacidade de provocar mastite persistente e de significância limitada na produção e qualidade do leite. O estudo mostrou que mesmo em propriedades onde era realizado o pós-dipping, Corynebacterium sp. foi isolado nas amostras de leite, concordando com os estudos anteriores que dizem que a desinfecção dos tetos pode ser influenciada pelo tipo de anti-séptico, presença de matéria orgânica, falta de reposição do produto e tipo de aplicador utilizado [6]. Já foi demonstrada grandes variações na CCS e no percentual de quartos mamários positivos ao CMT em função dos agentes isolados, concordando com os resultados do presente estudo [1]. O número de amostras de leite com infecção mista foi baixa e por isso foram excluídas da análise. O percentual de amostras sem bacteriano e que apresentaram quartos positivos ao CMT pode ter ocorrido em conseqüência de fatores individuais do animal, como idade e ordem de parto, entre outros [3]. Além disso, a utilização de terapia antimicrobiana intramamária e a possibilidade da presença de outros agentes causadores de mastite como vírus ou micoplasmas, podem ter influenciado no número de quartos positivos nestas amostras. A maioria das amostras com de Corynebacterium sp. apresentou reação mais intensa no CMT (escore 3) não condizendo com estudos anteriores que mencionaram o fato que, quando Corynebacterium sp. é isolado de amostras de leite, a CCS dos quartos mamários individuais destas amostras é baixa [5,10]. A presença de Corynebacterium sp. causou uma resposta celular, mesmo que de caráter moderado, em relação as amostras sem bacteria- 5

6 no. Esta reação inflamatória pode afetar de maneira significativa a CCS individual dos animais e conseqüentemente elevar a CCS do rebanho, assim como ocorre quando os principais patógenos, Staphylococcus aureus e Streptococcus agalactiae, são isolados de amostras de leite. CONCLUSÃO A prevalência de Corynebacterium sp. nos rebanhos leiteiros de SC, PR, RS, MG e PE foi de 13,46%, sendo que os rebanhos de MG apresentaram uma prevalência significativamente maior em relação aos demais Estados do Sul. O de Corynebacterium sp. não apresentou relação com as práticas de manejo avaliadas. O de Corynebacterium sp. nas amostras de leite dos rebanhos leiteiros de SC acarretou variações no CMT individual das vacas, não apenas no número de quartos positivos, mas também no escore do CMT. Acknowledgments. Ao CNPq, a Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, ao Centro de Ciências Agroveterinárias (UDESC) e aos pesquisadores que forneceram os dados das amostras, obrigada pelo apoio. Ethical approval. O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal (CETEA), do Centro de Ciências Agroveterinárias (UDESC) em Lages-SC, reunido no dia 29/10/2009, protocolado sob o número Declaration of interest. The authors report no conflicts of interest. The authors alone are responsible for the content and writing of the paper. REFERÊNCIAS 1 Brito M.A.V.P., Brito J.R.F., Ribeiro M.T. & Veiga V.M.O Padrão de infecção intramamária em rebanhos leiteiros: exame de todos os quartos mamários das vacas em lactação. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia. 51(2): Haltia L., Honkanen-Buzalski T., Spiridonova L., Olkonen A. & Myllys V A study of bovine mastitis, milking procedures and management practices on 25 Estonian dairy herds. Acta Veterinaria Scandinavica. 48 (1): Harmon R.J., Eberhart R.J., Jasper D.E., Langlois B.E. & Wilson R.A Microbiological procedures for diagnosis of bovine udder infection. Arlington: National Mastitis Council, 34p. 4 Hogan J.S., Smith K.L., Todhunter D.A. & Schoenberger P.S Rate of environmental mastitis in quarter infected with Corynebacterium bovis and Staphylococcus Species. Journal of Dairy Science. 71(9): Makovec J.A. & Ruegg P.L Results of milk samples submitted for microbiological examination in Wisconsin from 1994 to Journal Dairy of Science. 86(11): Martins R.P. Silva J.A.G., Nakazato L., Dutra V. & Almeida Filho E.S Prevalência e etiologia infecciosa da mastite bovina na microrregião de Cuiabá, MT. Ciência Animal Brasileira. 11(1): Mettifogo E., Muller E.E., Freitas J.C., Megid J., Alfieri A.A. & Beloti V Mastite subclínica bovina por Corynebacterium bovis no norte do Paraná, Brasil. Semina: Ciências Agrárias. 12(1): National Matitis Council Microbiological procedures for the diagnosis of bovine udder infection and determination of milk quality. 4th edn. Verona: NMC, 47p. 9 Philpot W.N. & Nickerson S.C Mastitis: counter attack. Naperville: Babson Bros, 150p. 10 Pitkala A., Haveri M., Pyorala S., Myllys V. & Honkanen-Buzalski T Bovine mastitis in Finland 2001: prevalence, distribution of bacteria, and antimicrobial resistance. Journal of Dairy Science. 87(8): Victoria C., Da Silva A.V., Elias A.O. & Langoni H Corynebacterium bovis e os padrões de contagem de células somáticas no Brasil. Arquivos de Ciências Veterinárias e Zoologia. 8(2):