CAMILA VIEIRA DA SILVA

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1 CAMILA VIEIRA DA SILVA Avaliação do efeito de Metarhizium anisopliae (Metsch) Sorokin (Deuteromycotina: Hyphomycetes) e do extrato de óleo de Neem, Azadirachta indica, em ovos de Diatraea saccharalis (Fabricius 1794) (Lepidoptera: Crambidae) em condições laboratoriais. Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas (Área de concentração - Biologia Celular e Molecular) da Universidade Estadual de Maringá, para obtenção do grau de Mestre em Ciências Biológicas. Maringá Julho 2008

2 Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP) (Biblioteca Central - UEM, Maringá PR., Brasil) S586a Silva, Camila Vieira da Avaliação do efeito de Metarhizium anisopliae (Metsch) Sorokin (Deuteromycotina : hyphomycetes ) e do extrato de óleo de Neem, Azadirachta indica, em ovos de Diatraea saccharalis (Fabricius 1794 ) (Lepidoptera : crambidae) em condições de laboratório / Camila Vieira da Silva. -- Maringá : [s.n.], f. : il. color. Orientador : Prof. Dr. Hélio Conte. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Maringá. Programa de Pós-graduação em Ciências Biologicas, Controle biológico - Cana-de-açúcar. 2. Extrato de óleo de neem. 3. Metarhizium anisopliae - ovos de Diatraea saccharalis. I. Universidade Estadual de Maringá. Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas. Cdd 21.ed.633

3 CAMILA VIEIRA DA SILVA Avaliação do efeito de Metarhizium anisopliae (Metsch) Sorokin (Deuteromycotina: Hyphomycetes) e do extrato de óleo de Neem, Azadirachta indica, em ovos de Diatraea saccharalis (Fabricius 1794) (Lepidóptera: Crambidae) em condições laboratoriais. Prof. Dr. HÉLIO CONTE Orientador

4 BIOGRAFIA Camila Vieira da Silva, nascida em São Paulo/SP em 26/10/1982. Possui graduação em Ciências Biológicas pela Universidade Estadual de Maringá (2005). Teve como monografia de conclusão de curso o trabalho intitulado: Estudo da Parameiose em Isolados Selvagens de Aspergillus nidulans. Foi monitora das disciplinas de Biologia Celular e Genética ( ). Tem experiência na área de Genética de Microorganismos e Controle biológico. Atualmente está em fase de conclusão do mestrado em Ciências Biológicas, área de concentração em Biologia Celular e Molecular, pela mesma instituição, trabalhando com controle biológico da broca da cana-de-açúcar.

5 Expresso à minha mãe, de forma especial, meu agradecimento por toda dedicação, amor e apoio incondicional. A Larissa pelo apoio e carinho em todos os momentos.

6 AGRADECIMENTOS À Deus por ser o Mentor de todos os meus atos e por ter possibilitado mais uma conquista. À minha mãe Albany e meu pai Rafael por contibuirem, cada um de sua maneira, para a concretização de mais uma etapa. À minha tia madrinha Alba por todo carinho e apoio, principalmente nas horas mais difíceis. À minha família como um todo pelo apoio e amor. À Larissa Schneider pelo auxílio direto na realização de todo o trabalho. Ao Professor Hermes por toda presteza, amizade e disposição em ajudar. À Valéria Pereira Mendes pelos ensinamentos primordiais no campo da Biologia. Aos colegas das disciplinas cursadas durante o Mestrado, pela amizade. Aos colegas de laboratório, Bruno, Juliana e Elton por toda paciência e auxílio. Aos professores e coordenadores do Curso de Pós-graduação em Ciências Biológicas pela colaboração e ensinamentos ministrados. Ao Prof. Dr. Hélio Conte pela acolhida, incentivo e solicitude com que sempre orientou. Ao Prof. Dr. João Pamphile, pelo fornecimento das linhagens de fungos, disponibilidade do uso do laboratório e auxílio na realização do trabalho. À Coordenação de Aperfeiçoamento do Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo suporte financeiro. Às técnicas Maria Euride, Maria dos Anjos e Ana Paula do DCM, pela disponibilidade de materiais para a realização das técnicas histológicas e o uso do Micrótomo.

7 Ao Prof. Dr. Kitajima, pelo ensinamento e pela disponibilidade do Microscópio Eletrônico de Varredura, ESALQ/USP. Aos colegas, Fábio e Daniela, pelo amparo e auxílio na realização das técnicas de Microscopia Eletrônica de Varredura. À Universidade Estadual de Maringá e o Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas. A todos que tenham contribuído de forma direta ou indireta para a realização deste trabalho.

8 APRESENTAÇÃO Esta dissertação é composta de dois artigos científicos: 1. Mecanismo de infecção de Metarhizium anisopliae (Metsch) Sorokin (Deuteromycotina; Hyphomycetes) e mortalidade em ovos, de diferentes idades, de Diatraea saccharalis (Fabricius 1794) (Lepidoptera: Crambidae) que descreve a ação de duas linhagens de M. anisopliae, testada em laboratório, em ovos de D. saccharalis em diferentes fases de seu desenvolvimento embrionário. 2. Efeito inseticida do óleo de Neem, Azadirachta indica A. Juss., em ovos de Diatraea saccharalis (Fabricius, 1794) (Lepidoptera: Crambidae), que analisou os efeitos de soluções aquosas do produto a base de óleo de neem, NATUNEEM, sobre ovos de D. saccharalis em diferentes fases de seu desenvolvimento embrionário. Em consonância com as regras do Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas, os trabalhos foram redigidos em forma de artigo de acordo com as normas das revistas a que serão submetidas. 1. Camila Vieira da Silva, Larissa Carla Lauer Schneider, João de Alencar Pamphile e Hélio Conte. Mecanismo de infecção de Metarhizium anisopliae (Metsch) Sorokin (Deuteromycotina; Hyphomycetes) e mortalidade em ovos, de diferentes idades, de Diatraea saccharalis (Fabricius 1794) (Lepidoptera: Crambidae). Será encaminhado ao Canadian Journal of Microbiology. ISNN ; Fator Impacto = 1, Camila Vieira da Silva, Larissa Carla Lauer Schneider e Hélio Conte. Efeito inseticida do óleo de Neem, Azadirachta indica A. Juss., em ovos de de Diatraea saccharalis (Fabricius 1794) (Lepidoptera: Crambidae). Será encaminhado a revista Agricultural and Forest Entomology. ISNN ; Fator Impacto = 1,222. 8

9 RESUMO GERAL Dentre os países produtores de cana-de-açúcar, Saccharum officinarum, o Brasil desponta com cerca de 30% do total da produção. A cana é uma das gramíneas de maior importância devido a sua múltipla utilidade. Atualmente, a maioria das usinas a utiliza apenas para retirar o caldo e fazer açúcar e álcool. A fim de sustentar seu crescimento econômico, o país tem o desafio de aumentar o fornecimento de energia em 5% ao ano. Para tanto, o objetivo é tornar a utilização de biomassa intensiva, principalmente a advinda da cana-de-açúcar. Estima-se que até 2021 o potencial de energia obtida com o bagaço da cana será equivalente ao da hidrelétrica de Itaipu, que corresponde a 20% do abastecimento do país. Com isso, a qualidade de produção tem sido muito considerada, para que a cana possa ser aproveitada por completo. A produtividade da cana-de-açúcar é regulada por uma série de fatores, dentre os quais se destacam: variedade, solo, clima e o controle de pragas. Uma das pragas mais significativas nesta cultura é a broca da cana-deaçúcar, Diatraea saccharalis (Lepidoptera: Crambidae). Uma vez no interior do colmo, o controle deste inseto se torna difícil e métodos alternativos devem ser viabilizados. Com a crescente preocupação em conservar e proteger os recursos naturais, práticas lesivas ao ambiente têm sido evitadas. As políticas públicas, mediante acordos internacionais, têm incluído em seus planos e ações o fomento às atividades agrícolas sustentáveis que levam em conta a diminuição do uso de agrotóxicos, pela redução das taxas para a produção de biocontroladores, bem como incentivo ao Manejo Integrado de Pragas (MIP). No intuito de reduzir o uso indiscriminado de agrotóxicos, porém conservando a qualidade da produção, várias formas de controle biológico com entomopatogênicos e plantas inseticidas estão sendo estudadas. O fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok. é mundialmente conhecido e utilizado como agente de controle biológico para diversas pragas agrícolas de expressão econômica. Os extratos das folhas e sementes de neem, Azadirachta indica, também apresentam princípios ativos com comprovada eficácia na atividade inseticida. Considerando a ação satisfatória de M. anisopliae e do extrato de neem no controle de pragas, realizamos, no presente trabalho, um estudo para analisar os efeitos resultantes do tratamento com estes compostos em ovos de diferentes idades de D. saccharalis. Para isso, ovos de D. saccharalis com 0, 24, 48, 72, 96 e 120 horas da oviposição, foram fornecidos pelo laboratório de Morfologia e Citogenética de Insetos DBC/UEM, sendo separados em grupos de cinqüenta para posterior tratamento. As linhagens MT e E9, de M. anisopliae foram obtidas de estoques 9

10 do laboratório de Biotecnologia Microbiana DBC/UEM. As suspensões de conídios foram preparadas com água destilada e Tween 80, ambos estéreis, em placas contendo as linhagens e a concentração 10 7 conídios/ml aferida em câmara de Newbauer. O produto comercial NATUNEEM (com teor de azadiractina de ppm) foi diluído em água destilada, segundo a indicação do rótulo, nas seguintes concentrações: 0,1; 0,3; 0,5; 1,0 e 2,0%. Os grupos controle foram tratados com água destilada estéril. Ovos em diferentes tempos de desenvolvimento, separados em grupos, foram tratados com 100µl das suspensões fúngicas e concentrações do extrato de óleo de neem. A porcentagem de viabilidade dos ovos e a mortalidade de larvas emergidas foi determinada através de programa estatístico PRISMA 2.1. Os resultados foram submetidos à ANOVA, sendo a comparação das médias realizadas por teste de Tukey (P<0,05). Em ovos tratados com o extrato de óleo de neem as alterações foram observadas apenas ao estereomicroscópio e documentadas fotograficamente. Já para ovos tratados com M. anisopliae as observações das alterações morfológicas foram realizadas em estereomicroscópio, microscópio de luz (montagem total utilizando-se azul de toluidina e técnicas histoquímicas com PAS) e microscópio eletrônico de varredura (MEV) onde o material fixado com Bouin foi desidratado em ponto crítico e metalizado com pó de ouro. Nos resultados do primeiro experimento, com as linhagens de M. anisopliae, observamos que a MT foi mais eficiente resultando em viabilidade de 0 a 56%, enquanto que em E9 variou entre 6,3 e 81,5%, sendo diferentes significativamente (P< 0,001). A maioria das larvas, que eclodiram após tratamento com o fungo morreu com o corpo recoberto por hifas fúngicas. As análises de microscopia de luz revelaram o crescimento do fungo e a formação de sítios de penetração, bem como o seu desenvolvimento no interior dos ovos, ocasionando um possível atraso ou bloqueio no processo embriogênico do ovo e a extrusão do fungo junto com a conidiogênese no exterior dos ovos. As análises ao MEV revelaram com mais detalhes a formação da estrutura de penetração denominada apressório e a reprodução do patógeno. No segundo experimento, onde foi analisada a eficiência do extrato de óleo de neem- NATUNEEM - os resultados mostraram efeito tóxico em todas as concentrações, sendo o grau dependente da dose usada e do estágio dos ovos, causando redução de 38,1 a 98,9% na viabilidade dos ovos. Em ovos tratados nos primeiros dias de desenvolvimento (0, 24 e 48h após oviposição) a redução foi superior, provavelmente devido à ação do principal componente do extrato, a azadirachtina, o qual tem efeito seletivo para insetos comprovado, podendo afetar os processos de muda. Um aspecto fundamental é o tempo de ação ou permanência dos inseticidas, ou seja, seu efeito residual pós-aplicação. As 10

11 larvas que não foram afetadas pela ação ovicida apresentaram, após 24h e 48h da eclosão, alta taxa de mortalidade para as concentrações 0,3-2%, variando entre 89,14±4,9 e 97,52±2,56. Verificamos que estes resultados ocorreram principalmente em ovos tratados em fases de desenvolvimento adiantado. Estas larvas apresentaram coloração clara, abdômen amolecido e em alguns casos, ausência de cápsula cefálica, o que leva a conclusão de que houve alterações na via relacionada às mudas, uma vez que estas também ocorrem na fase embrionária. Através dos resultados obtidos nas condições experimentais podemos concluir que o uso de M. anisopliae, linhagem MT na concentração de 10 7 conídios/ml e do extrato de óleo de neem (0,3-2,0%) são efetivos para o controle de ovos de D. saccharalis em diferentes estágios embrionários, apresentando ambos, efeito residual estendido às larvas de primeiro instar. 11

12 GENERAL ABSTRACT Among the countries producers of sugar cane, Saccharum officinarum, Brazil arising with about 30%. The cane is a grass of utmost importance because of its multiple uses. Currently, most of the power plants used only to utilized the broth and make sugar and alcohol. In order to sustain its economic growth, the country has the challenge of increasing the supply of energy at 5% a year. To that end, the objective is to make intensive use of biomass, mainly arising from sugar cane. It is estimated that by 2021 the potential of energy obtained with the cane pomace is equivalent to that of the Itaipu Hydroelectric, which corresponds to 20% of supply. With this, the quality of production has been considered, so that the cane can be used entirely. The productivity of sugar cane is governed by a number of factors, among which stand out: variety, soil, climate and pest control. One of the most significant pest granddaughter cultures is the drill of sugar cane, Diatraea saccharalis (Lepidoptera: Crambidae). Once inside the stem, the control of this insect becomes difficult and with that, alternative methods must be possible. With the growing concern to conserve and protect natural resources, practices detrimental to the environment have been avoided. Public policies through international agreements have included in their plans and actions, the promotion of sustainable agricultural activities that take into account the reduction in the use of pesticides, the reduction of rates for the production of biocontrol and encourage the Integrated Management Pests (IMP). To reduce the indiscriminate use of pesticides, but retaining the quality of production, various forms of biological control and of insecticides plants are being studied. The entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok. is widely known and used for biological control of agricultural pests for various economic expressions. The extracts of the leaves and seeds of neem, Azadirachta indica, also have active ingredients with proven effectiveness in insecticidal activity. Considering the satisfactory action of M. anisopliae and the extract of neem in control of pests, we conducted, in this work, a study to examine the effects of treatment with these compounds in eggs of different ages of D. saccharalis. For this, eggs of D. saccharalis with 0, 24, 48, 72, 96 and 120 hours of oviposition, were provided by the Laboratory of Morphology and Cytogenetics of Insect DCB / State University of Maringá and are separated into groups than fifty for further treatment. The isolates MT and E9, Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin was obtained from the laboratory stocks of Microbial Biotechnology CBD / SUM. The suspensions of conidia were 12

13 prepared with distilled water and Tween 80, both sterile, plates containing the lines and concentration measured at 10 7 conidia/ml in chamber of Newbauer. The commercial product NATUNEEM (with the content of azadiractina of 1,500 ppm) was diluted with distilled water, according to the label indication, in the following concentrations: 0.1, 0.3, 0.5, 1.0 and 2.0%. Control groups were treated with sterile distilled water. Eggs at different times of development, separated into groups, were treated with 100 µl of fungal suspensions and concentrations of extract neem oil. The percentage of viable eggs and mortality of larvae emerged were determined through statistical program PRISM 2.1. The results were submitted to ANOVA, and the comparison of means test conducted by Tukey (P <0.05). In eggs treated with the extract of neem oil changes were observed only in stereomicroscope and documented photographically. For eggs treated with M. anisopliae the analyses were realized in stereomicroscope, in a light microscope (assembly using a total of toluidine blue and technical routine with histological PAS) and scanning electron microscopy (SEM) where the material fixed was dehydrated in critical point and metallic powder with gold. In the results of the first experiment, the isolates MT and E9 of M. anisopliae were tested, we found that it was more efficient than this, resulting in viability of 0 to 56%. In contrast, in eggs treated with E9 it ranged between 6.3 and 81.5%, which was significantly different (P <0.001). We also saw that most of the larvae, which hatch from eggs successfully treated, died with the body covered by fungal hyphae. Analyses of light microscopy, showed the growth of fungus and the formation of sites of penetration as well as the development inside the egg, showing the organization, the development, which may result in a possible delay or block the process of egg also embryogenesis and the extrusion of the fungus along with conidiogenesis abroad eggs. The analyses also revealed SEM in the formation of the structure of penetration (apressoria) and reproduction. In the second experiment, where he examined the efficiency of neem oil extract-natuneem - the results showed toxic effect at all concentrations, and the degree dependent on the dose used and the stage of eggs. The treatment caused reduction from 38.1 to 98.9% in the viability of eggs. In eggs treated in the early days of development (0, 24 and 48 hours of oviposition) the reduction was higher, which may be linked to action of the main component of the extract, the azadirachtin, which takes effect for selective insects proven, by affecting the processes of ecdyse. A key aspect is the time for action or residence of insecticides, or its residual effect post-application. The larvae that were not affected by the action ovicide showed, after one or two days of the outbreak, high 13

14 mortality rate for concentrations 0.3-2%, ranging between 89.14± 4.9 and ± We note that these results occurred mainly in eggs treated in early stages. These larvae showed clear color, abdomen loose and in some cases, lack of cephalic capsule, which leads to the conclusion that ecdyse in the way related to the seedlings may have occurred, since they also occur in the embryonic stage. In conclusion, by the results obtained in experimental conditions of our study, we finished that the use of M. anisopliae, in strain MT concentration of 10 7 conidia/ml and the extract of neem oil ( %) are effective for the control of eggs, D. saccharalis in different stages, giving both residual effects extended the larvae of the first instar. 14