TÍTULO: AVALIAÇÃO DA SENSIBILIDADE DO ANFÍPODE HYALE NIGRA EM FASE SÓLIDA EMPREGANDO O MÉTODO DE SEDIMENTO-MARCADO "SPIKED"

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1 Anais do Conic-Semesp. Volume 1, Faculdade Anhanguera de Campinas - Unidade 3. ISSN TÍTULO: AVALIAÇÃO DA SENSIBILIDADE DO ANFÍPODE HYALE NIGRA EM FASE SÓLIDA EMPREGANDO O MÉTODO DE SEDIMENTO-MARCADO "SPIKED" CATEGORIA: CONCLUÍDO ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE SUBÁREA: ECOLOGIA INSTITUIÇÃO: UNIVERSIDADE SANTA CECÍLIA AUTOR(ES): PEDRO HENRIQUE CAVAZIN DAVID ORIENTADOR(ES): AUGUSTO CÉSAR, MARINA CUNHA PASSARELLI

2 RESUMO Nos últimos anos, tem se discutido muito sobre o aumento dos impactos ao meio ambiente oriundo da poluição. Neste contexto, os sedimentos acabam sofrendo com o acumulo de poluentes, e por esse motivo, são amplamente empregados em programas de monitoramento ambiental. A Ecotoxicologia dispõe de diversas ferramentas segundo critérios específicos de qualidade e os ensaios de toxicidade constituem uma das principais linhas de evidência. A escolha de organismos-teste para uso em ensaios de toxicidade baseia-se: na importância ecológica, sensibilidade aos diferentes contaminantes, facilidade de cultivo em laboratório, ampla distribuição no ambiente, entre outros. Assim os anfípodes são considerados excelentes organismos-testes para avaliar a qualidade ambiental. A fim de avaliar a possibilidade de aplicação do anfípode epibentônico marinho Hyale nigra em ensaios de toxicidade, foi avaliado a sensibilidade da espécie em fase sólida, empregando a técnica de sedimento-marcado spiked com Cloreto de Cádmio (CdCl 2 ) substancia referencia. O ensaio foi realizado, aplicando o método de resuspensão resultando uma CL50 de 6,49 mg Cd/Kg, sendo este valor similar ao encontrado para o anfípode de água doce Hyalella curvispina. A partir deste estudo foi possível avaliar que o anfípode apresenta potencial para ser empregado como organismo-teste em ensaios de toxicidade.

3 1. INTRODUÇAO Atualmente, o crescimento urbano esta interferindo e causando uma série de alterações no meio ambiente, essas por sua vez, geram problemas como a poluição orgânica, poluição química, explorações dos recursos naturais promovendo efeitos adversos ao homem. Neste contexto, os ecossistemas aquáticos acabam tornandose verdadeiros receptáculos de grande quantidade de poluentes (CETESB, 1990). Dentre as principais fontes de poluição dos ecossistemas aquáticos, encontram-se os lançamentos de efluentes líquidos domésticos e industriais sem o devido tratamento, assim alcançando direta ou indiretamente, o meio ambientes. A Ecotoxicologia exerce um papel importante nas avaliações da qualidade ambiental, possibilitando o entendimento do comportamento dos compostos químicos no ambiente. Esta ciência utiliza diversas ferramentas que propiciam uma estimativa sobre os efeitos biológicos. Os ensaios de toxicidade são definidos como procedimentos nos quais as respostas de organismos vivos avaliam a capacidade de substâncias químicas e/ou amostras ambientais, causarem efeitos deletérios nos organismos (RAND et al., 1995). Porém, alguns critérios devem ser observados para aplicação de um organismo em ensaios de toxicidade, tais como: ampla distribuição geográfica, relevância ecológica, disponibilidade de informações sobre a sua biologia e fisiologia, hábitos alimentares, apresentar uma sensibilidade constante a contaminantes e se possível ser de fácil cultivo em laboratório (USEPA, 1994). Entre os organismos empregados para testes com sedimento, os anfípodes são mundialmente utilizados para avaliação da contaminação, devido a sua sensibilidade as alterações do ambiente bentônico (MELO & NIPPER, 2007). Contudo, no Brasil os ensaios de toxicidade padronizados com sedimento são realizados normalmente com duas espécies de anfípodes, Tiburonella viscana de ocorrência nacional e a espécie exótica Leptocheirus plumulosus. Portanto, destacase a necessidade de padronização de novas espécies representativas dos

4 ecossistemas brasileiros com potencial de serem aplicadas em ensaios de toxicidade. A realização de ensaios de toxicidade empregando a técnica de sedimento-marcado tem se mostrado cada vez mais eficaz nos últimos anos, pois através desses ensaios é possível estimar as concentrações de compostos químicos, sejam eles orgânicos ou inorgânicos, que possam causar algum efeito adverso à biota. Além disso, os resultados obtidos a partir de estudos que aplicam essa técnica podem servir como parâmetro para avaliar se os valores estipulados nos guias orientadores da qualidade dos sedimentos conferem com as concentrações de efeito aos organismos aquáticos. Neste sentido, o presente estudo avaliou a viabilidade de aplicação do anfípode epibentônico marinho Hyale nigra, empregando ensaios de sensibilidade na fase sólida. Os resultados obtidos demonstraram que o anfípode H. nigra apresenta potencial para ser empregado em ensaios de toxicidade, uma vez que se observou uma sensibilidade ao CdCl 2 similar a encontrada na literatura para outras espécies de anfípodes já padronizadas. 2. OBJETIVO Avaliar a sensibilidade do anfípode Hyale nigra em fase sólida empregando a técnica de contaminação do sedimento spiked, utilizando como substância tóxica de referência o cloreto de cádmio (CdCl 2 ). 3. METODOLOGIA Organismos teste - A espécie Hyale nigra (Fig.1) é crustáceo, anfípode, pertencente à família Hyalidae (BULYCHEVA, 1957). Essa espécie é frequentemente encontrada abrigada em costões rochosos de regiões entre-marés, associadas a algas Ulva sp, e encontram-se fértil durante todo o ano.

5 Figura 1. Espécie empregada no estudo: Hyale nigra. Coletas, triagem e seleção dos organismos - Os organismos foram coletados nas praias dos municípios de Santos e Guarujá SP, e transportados para o laboratório em uma caixa térmica com água do mar e aeração. No laboratório foi realizada a triagem (Fig. 2) e seleção do material coletado, e a identificação dos organismos foi realizada com o auxilio de guias especializados. Fig. 2. Processo de triagem Aclimatação dos organismos-teste - Após a triagem do material coletado os organismos foram aclimatados às condições empregadas nos ensaios (20 C, 35 Sal, ph 7,0 8,0), em cubas de vidro contendo 1L de água do mar filtrada em membrana 0,45 µm e livre de contaminações (Fig. 3). Durante o período de aclimatação os organismos foram alimentados com uma ração de peixe (Tetra-Min ) concentrada e talos de algas Ulva sp. Sensibilidade do organismo-teste - Para avaliar a sensibilidade anfípode H. nigra em fase sólida foi realizado um ensaio com sedimento-marcado contaminando-o com a substância tóxica de referência CdCl 2 seguindo os protocolos técnicos nacionais e internacionais (ABNT NBR 15638/ 2008; USEPA, 1994).

6 Substância tóxica de referência - O CdCl 2 é uma substância tóxica padrão de referência. Este metal pode ser encontrado de forma natural nos ambientes aquáticos, podendo proporcionar danos como bioacumulação crônica, além da transferência trófica (SCHLEKAT et al., 1999). Caracterização do sedimento-controle - Segundo ABNT NBR (15638/2008), o sedimento empregado nos ensaios deve ser caracterizado quanto ao carbono orgânico total, distribuição de tamanho da partícula e umidade. Neste sentido, cabe ressaltar que tais parâmetros foram avaliados antes dos experimentos, seguindo os protocolos padronizados. Para a determinação da granulometria os resultados foram calculadas seguindo as classificações granulométricas de Shepard (1954) e obtidos os teores de areia, segundo classificação de Folk; Ward (1957). Já o método utilizado para medir teor de matéria orgânica foi o descrito por Luczak et al., (1997). Sedimento-marcado spiked - A técnica utilizada foi a de resuspensão, misturando 600 ml da solução contendo as concentrações de cádmio (CdCl 2 ) e o sedimento controle (150g) com um agitador magnético (Fig.3) (QUIMIS) por 4 horas em uma velocidade de 130 rpm (rotação por minuto). Após 24h foi retirada toda a solução dos frascos testes. Figura 3. Agitador magnético empregado para a marcação do sedimento spiked. Após o procedimento de mistura deve-se assegurar um tempo suficiente para equilíbrio da substância de referência. Dessa forma, o sedimento permaneceu estabilizando sob a temperatura empregada nos ensaios (20 C) (SIMPSON et al., 2005) por 14 dias (Giutso et al., 2012).

7 Após os 14 dias de estabilização, as amostras foram submetidas a análises químicas, a fim de avaliar a concentração real de cádmio que constava no sedimento. Com os resultados obtidos determinou as concentrações que seriam utilizadas nos ensaios definitivos (1mgCd, 2 mg, 4 mgcd e 8 mgcd/kg de sedimento) Foi realizado um ensaio com o anfípode H. nigra, sendo um período de exposição de 10 dias, com 4 réplicas contendo 10 organismos. O ensaio foi realizado em frascos de polietileno de 1L, contendo 150 g do sedimento e 600 ml de água do mar filtrada a 0,45 µm. Os parâmetros físico-químico foram analisados no inicio e no final de cada experimento. Análise dos resultados - Os resultados obtidos no ensaio foi analisado por um método estatístico Trimmed Spearman-Karber, foi estimada a CL50 (concentração letal mediana a 50% dos organismos) e seu intervalo de confiança para 10 dias de exposição. 4. RESULTADO Os resultados obtidos no ensaio de toxicidade em fase solida (sedimento-marcado) o anfípode H. nigra apresentou uma CL50 de 6,49 mg.cd/kg (5,19 8,09). Quanto às análises físico-químicas, referente aos fatores limitantes (TºC, ph, OD e salinidade), medidos no início e ao fim dos experimentos, mantiveram-se constantes e de acordo com os protocolos estandardizados supracitados. Na Tabela 2 estão descritos os valores encontrados na caracterização da amostra de sedimento. Tabela 2. Caracterização das amostras de sedimento (Ilha das Palmas Santos,SP). AMF Areia Muito Fina; AF Areia Fina; AM Areia Média; AG Areia Grossa; AMG Areia Muito Grossa. Amostras CaCO 3 (%) M. O (%) Granulometria (%) Lama AMF AF AM AG AG

8 Controle 7,29 1,6 2,48 0,38 5,9 62,84 17,30 4,01 5. DISCUSSÃO Para a validação de espécies para serem empregadas em ensaios de toxicidade para avaliar a qualidade dos sedimentos é interessante conhecer a sensibilidade desses organismos a contaminantes presentes nesta matriz ambiental, uma vez que estes estarão sendo aplicados com esta finalidade nos ensaios. O resultado da CL50 obtida com a espécie Hyale nigra 6,49 mg.cd/kg (5,19 8,09) demonstrou similaridade com o valor obtido para o anfípode de água doce Hyalella curvispina (5,6 mg Cd/kg) (GIUSTO et al., 2012). A nova Resolução Conama n 454/2012 (BRASIL, 2012) recomenda avaliar a toxicidade para anfípodes empregando a CL50 (concentração letal a 50% dos organismos expostos) e estabelece valores guias para diversos contaminantes presentes na matriz sedimentar em regiões sujeitas a dragagens e de disposição de sedimento. No entanto, em Abessa et al., 2006 há um questionamento quanto a esses valores guias, já que tais foram baseados seguindo protocolos norteamericanos e canadenses (ENVERONMENTAL CANADA, 1999; McDONALD et al., 1996), sem a realização de um estudo demonstrando se esses valores são aplicáveis para os sedimentos brasileiros. Seguindo este raciocínio, os resultados obtidos no presente estudo para o anfípode H. nigra nos ensaios com sedimento contaminado indicaram uma maior sensibilidade da espécie (CL50 96h de 5,6 mg Cd/kg) quando comparado com o limite estabelecido para o cádmio (7,2 mgcd/kg) em Brasil (2012). Portanto, é necessário a realização de ensaios com sedimentomarcado com cádmio com outras espécies aquáticas, a fim de avaliar a sensibilidade das mesmas a este contaminante e rever o valor exigido pela legislação, buscando um valor que condiz com a realidade de organismos nativos de regiões tropicais e os proteja de forma eficaz. 6. CONCLUSÃO

9 Foi possível observar que o resultado obtido para o anfípode Hyale nigra corroboram com o valor encontrado para Hyalella curvispina, o que evidencia sua sensibilidade e consequentemente seu potencial para ser empregado como organismo-teste em ensaios de toxicidade. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ABNT (Associação Brasileira de Normas Técnicas), (2007). Ecotoxicologia Aquática Toxicidade em sedimento Método de ensaio com Hyalella spp (Amphipoda). ABNT NBR 15470:2007, 20p. ABNT (Associação Brasileira de Normas Técnicas), (2008). Qualidade da água Determinação da toxicidade aguda de sedimentos marinhos ou estuarino com anfípodes. ABNT NBR 15638:2008, 19p. AHSANULLAH M. (1976) Acute toxicity of zinc and cadmium to seven invertebrate species from Western port, Victoria.Ausf. J. mar. Freshwar. Res. 27, APHA; AWWA; WPCP (1998). Standard Methods for the examination of water and wastewater 19th edition. Washington, DC. American Public Health Association/American Water Works Association/Water Pollution Control Federation. BARNARD, J.L. & KARAMAN, G.S. (1991). The families and genera of marine amphipoda (except marine gammaroids). Record of the Australian Museum, Supplement 13, part 1-2: CESAR, A. (2003). Análisis ecotoxicologico integrado de la contanaminación marina en los sedimentos de la Costa de Murcia: El caso de Portmán, Sudeste- España. Tese de doutorado. Universidad de Murcia España. CETESB. (1990). Procedimento para utilização de toxidade no controle de efluente líquido. Goldstein, E. G.; Bertoletti, E.; Zagatto, P. A.; Araujo, R. P. A.; Ramos, M. L. L. C. Secretaria do Meio Ambiente, série manuais ISSN São Paulo 2-5P.

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