EFEITO DO INÓCULO DE MICRORGANISMOS DO RESERVATÓRIO DE BARRA BONITA SOBRE CULTURAS DE Anabaena spiroides (CYANOBACTERIA).

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1 308 EFEITO DO INÓCULO DE MICRORGANISMOS DO RESERVATÓRIO DE BARRA BONITA SOBRE CULTURAS DE Anabaena spiroides (CYANOBACTERIA). Bagatini 1 I.L., Meccheri 2 F.S., Tessarolli 3 L.P., Regali-Seleghim 4 M.H., Vieira 5 A.A.H. 1, 2, 3, 4, 5 Universidade Federal de São Carlos, Rod. Washington Luiz, km 235, São Carlos, CEP São Paulo,Brasil; inessalacativa@gmail.com, 2 meccheri@hotmail.com, 3 letessarolli@yahoo.com.br, 4 pmhrs@iris.ufscar.br, 5 ahvieira@power.ufscar.br. RESUMO A cianobactéria Anabaena spiroides é uma espécie cosmopolita em ambientes eutrofizados que apresenta grande biomassa flutuante, devido à presença de aerótopos. O trabalho realizado teve como objetivo detectar possíveis efeitos do inóculo de microrganismos de Barra Bonita sobre o crescimento da cianobactéria quando adicionado em diferentes fases de desenvolvimento das culturas de A. spiroides. As culturas experimentais, 6 no total, foram separadas em 2 grupos: que C1 recebeu o inóculo de A. spiroides e 18 dias depois recebeu o inóculo proveniente de Barra Bonita; e C2 que recebeu inóculo de A. spiroides e água de Barra Bonita ao mesmo tempo. Em cada grupo, uma cultura permaneceu como controle, sem adição do inóculo de Barra Bonita. As culturas foram monitoradas por meio da concentração de clorofila-a. As curvas de clorofila mostraram diferenças entre os tratamentos e o controle no fim do experimento, indicando que microrganismos aceleram a morte da cultura de A. spiroides, e o efeito do inoculo é mais rápido quando adicionados em culturas na fase estacionária de crescimento, mostrando maior susceptibilidade de células mais velhas. ABSTRACT The cyanobacterium Anabaena spiroides is a cosmopolitan species in eutrophic environments with floating biomass that is mostly related to the presence of aerótopos. This work aimed to detect possible effects of the inoculation of microorganisms from Barra Bonita reservoir on the growth of Cyanobacteria when added at different stages of development of the cultures of A. spiroides. The experimental cultures, 6 in total, were divided into 2 groups: C1 which received the inoculation of A. spiroides and 18 days later received the inoculums from Barra Bonita, and C2 which received inoculation of A. spiroides together with the water from Barra Bonita. In each group, a culture remained as control, without the addition of the inoculum from Barra Bonita. The cultures were monitored through the concentration of chlorophyll-a. The curves of chlorophyll showed differences between the treatment and control at the end of the experiment, indicating that microorganisms accelerate the death of the culture of A. spiroides. Also, the effect of the inoculum is faster when added to cultures in stationary phase of growth, showing greater susceptibility of older cells.

2 309 INTRODUÇÃO Os efeitos antrópicos como a eutrofização e o represamento de rios associados ao grande potencial de crescimento das Cyanobacteria faz com que estes organismos produzam quantidades enormes de biomassa em curtos períodos de tempo. Nos ambientes eutrofizados, onde os principais nutrientes nunca estão em concentrações limitantes, as variações na composição fitoplanctônica, especialmente das cianobactérias, podem ser influenciadas por interações bióticas como ataques por outros microrganismos, como bactérias, vírus e fungos (eg. Sigee et al 1999). A cianobactéria Anabaena spiroides é uma espécie cosmopolita em ambientes eutrofizados, nos quais produz, freqüentemente, grandes biomassas flutuantes devido à presença de aerótopos em suas células, sendo muito freqüente em reservatórios construídos para gerar energia elétrica. No reservatório de Barra Bonita a produção de biomassa de origem fitoplanctônica é dominada por A. spiroides e Microcystis aeruginosa (Dellamano-Oliveira et al. 2007). O presente trabalho foi realizado a fim de se detectar possíveis efeitos do inóculo de microrganismos de Barra Bonita (água do reservatório filtrada em 1,2 µm) sobre o crescimento da cianobactéria quando adicionado em diferentes fases de desenvolvimento das culturas de A. spiroides. Estes dados são importantes para o melhor entendimento da ecologia da cianobactéria e para melhor compreensão da dinâmica dos ecossistemas aquáticos nos quais florações desta alga são comuns. MATERIAL E MÉTODOS Foram feitas 6 culturas com volume final de 1,6 litros, em frascos de 2 litros de capacidade, em meio ASM-1, ph 7,0 (Gorham et al 1964) que foram incubadas sob condições controladas de iluminação (100±15 μmol fótons m -2 s -1 ), fotoperíodo (12:12 h) e temperatura (23 ± 1 ºC). Essas culturas foram divididas em 2 grupos de 3 culturas, sendo que em cada grupo uma cultura permaneceu como controle, ou seja, sem a adição da água de Barra Bonita e as outras duas culturas receberam 80mL de inóculo do reservatório. Este foi coletado com uma garrafa que não permite a contaminação com organismos aéreos e de modo a obter-se uma amostra integrada da coluna d água de água. A amostra foi filtrada em filtro de fibra de vidro GF/C (poros de 1,2 μm) para a remoção de algas, protozoários e detritos, mas não bactérias, vírus e fungos. O primeiro grupo de culturas (C1) foi inoculado com A. spiroides 18 dias antes de ser acrescentado o inóculo de Barra Bonita, para que este fosse adicionado quando a cultura estivesse no final da fase de crescimento exponencial ou início da fase de senescência; o outro grupo (C2) foi inoculado ao mesmo tempo com A. spiroides e a água de Barra Bonita. As amostragens foram feitas nos dias 1 (18 horas), 4, 7, 10 e 16 após a adição do inóculo de bactérias para todas as culturas e ainda no 21º dia para as culturas C2. Uma vez que as culturas C1 já estavam crescendo quando o inóculo bacteriano foi adicionado, a primeira amostragem foi no 18º dia de cultivo, não havendo dados da curva de crescimento da cianobactéria até esse dia. As culturas foram monitoradas por meio da concentração de clorofila a, que foi extraída segundo Nusch (1980) e quantificada seguindo as equações de Lorenzen (1967).

3 310 RESULTADOS E DISCUSSÃO As curvas de concentração de clorofila mostram maiores diferenças entre os tratamentos e o controle no final do experimento, para os dois grupos de culturas: C1 (Figura 1) e C2 (Figura 2). As culturas C2 apresentaram diferenças significativas (p = 0,0307 teste t de Student), com maior concentração de clorofila a no controle do que nas culturas inoculadas, apenas no último dia de amostragem (21º dia de cultivo). Já nas culturas C1, que receberam o inóculo com idade de 18 dias, e foram amostradas no 19º dia de cultivo (18 horas após receberem o inóculo), as diferenças na concentração de clorofila a entre as culturas inoculadas e o controle foram estatisticamente significativas nos dois últimos dias de cultivo (Figura 2). 250 Clorofila a (µg.l-¹) C2 controle C2 inoculada dias Figura 1. Concentrações de clorofila a (µg.l -1 ) nas culturas C2 em função do tempo de cultivo. As barras representam o desvio padrão: n=2 nas culturas C2 controle (réplicas de amostragem) e n=4 nas culturas C2 inoculadas (2 amostragens em cada réplica de cultura). Nas culturas C1 o efeito do inóculo bacteriano de Barra Bonita foi significativo 9 dias após a adição deste, enquanto que nas culturas C2 o efeito no crescimento da cianobactéria foi evidente apenas 21 dias após a adição do inóculo. Esses resultados mostram maior susceptibilidade das culturas mais velhas de A. spiroides aos microrganismos provenientes de Barra Bonita.

4 311 Clorofila a (µg.l-¹) dias C1 controle C1 inoculada Figura 2. Concentrações de clorofila a (µg.l -1 ) nas culturas C1. As barras representam o desvio padrão n=2 nas culturas C1 controle (réplicas de amostragem) e n=4 nas culturas C1 inoculadas (2 amostragens em cada réplica de cultura). Uma vez que o inóculo proveniente de Barra Bonita foi adicionado em uma proporção pequena em relação ao volume final da cultura (5% do volume), possíveis interferências de compostos tóxicos foram descartadas. Além disso, a influência do inóculo foi detectada apenas nas fases finais do crescimento da cianobactéria, possivelmente devido ao desenvolvimento dos microrganismos presentes na amostra. Dentre os microrganismos que podem apresentar efeitos cianobactericidas estão os vírus, ou cianófagos (Padan & Shilo 1973, Manage et al 1999), as bactérias (Manage et al 2000, Kim & Lee 2006) e fungos ( Canter & Lund 1951). No entanto, a influência desses últimos é possivelmente menor do que a de bactérias e cianófagos, pois a filtração utilizada (membranas de poros de 1,2 µm) elimina grande parte dos filamentos, esporos e leveduras, e além disso, não foram observados organismos semelhantes a estes nas amostras de contagem bacteriana por microscopia (dados não apresentados). Esses dados fornecem subsídios para trabalhos futuros que visem o isolamento de microrganismos a serem utilizados no controle de florações de A. spiroides. CONCLUSÃO A fração menor do que 1,2µm da água de Barra Bonita (ou seja, o inóculo com bactérias, cianófagos e possivelmente fungos), acelera a morte da cultura de A. spiroides. O efeito do inóculo é mais rápido quando este é adicionado em culturas na fase estacionária de crescimento do que no início do cultivo, mostrando maior susceptibilidade de células mais velhas.

5 312 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS CANTER HM, LUND JW (1951) Fungal parasites of the phytoplankton: II.(Studies on British chytrids, XII.). Annals of Botany 15: DELLAMANO-OLIVEIRA MJ, COLOMBO-CORBI V, VIEIRA AAH (2007) Carboidratos dissolvidos do reservatório de Barra Bonita (Estado de São Paulo, Brasil) e sua relação com as algas fitoplanctônicas abundantes. Biota Neotropica 7:59-66 GORHAM, P.R.; MCLACHLAN, J.; HAMMER, U.T. & KIM, W.K (1964) Isolation and culture of toxic strains of Anabaena flos-aquae (Lyngb.) de Breb. Verh Int Verein Theor Angew Limnol 15: KIM J.D, LEE C.G (2006) Characterization of two algal lytic bacteria associated with management of the cyanobacterium Anabaena flos-aquae. Biotechnol Bioproc E 11: LORENZEN, C.J (1967). Determination of chlorophyll and. phaeopigment: spectrophotometric equations. Limnol. Oceanogr. 12: MANAGE P.M, KAWABATA Z, NAKANO S (1999) Seasonal changes in densities of cyanophage infectious to Microcystis aeruginosa in a hypereutrophic pond. Hydrobiologia 411: MANAGE P.M, KAWABATA Z, NAKANO S (2000) Algicidal effect of the bacterium Alcaligenes denitrificans on Microcystis spp. Aquat Microb Ecol 22: NUSCH, E. A. (1980). Comparation of different methods for chlorophyll and phaeopigment determination. Arch. Hydrobiol. Beih. 14: PADAN E, SHILO M (1973) Cyanophages-viruses attacking blue-green algae. Bacteriological Rev 37:343 SHILO M (1970) Lysis of blue-green algae by myxobacter. J Bacteriol 104: SIGEE D.C, GLENN R, ANDREWS M.J, BELLINGER E.G, BUTLER R.D, EPTON H.A.S, HENDRY R.D (1999) Biological control of cyanobacteria: principles and possibilities. Hydrobiologia 395: