MONOLISA HBs Ag ULTRA 1 plate - 96 tests plates tests 72348

Transcrição

1 MONOLISA HBs Ag ULTRA 1 plate - 96 tests plates tests English p 3 Français p 13 Espãgnol p 25 Deutsch p 37 Italiano p 49 Portugese p 59 Svensk p 69 Dansk p 79 The other languages required in conformity to the European Directive can be obtained from your local Bio-Rad agent

2 2

3 MONOLISA HBs Ag ULTRA 1 plate - 96 tests plates tests KIT FOR THE DETECTION OF THE SURFACE ANTIGEN OF THE HEPATITIS B IN HUMAN SERUM OR PLASMA BY THE ENZYME IMMUNOASSAY TECHNIQUE IVD For In Vitro Diagnostic Use Manufacturer Quality Control All manufactured and commercialised reagents are under complete quality system starting from reception of raw material to the final commercialisation of the product. Each lot is submitted to a quality control and only is released on the market when conforming to the acceptance criteria. The records relating to production and control of each single lot are kept within our company. 3

4 CONTENTS 1 - INTENDED USE 2 - CLINICAL VALUE 3 - PRINCIPLE OF THE MONOLISA HBs Ag ULTRA 4 - CONTENTS OF THE MONOLISA HBs Ag ULTRA 5 - PRECAUTIONS 6 - HEALTH AND SAFETY INSTRUCTION 7 - MATERIAL REQUIRED BUT NOT PROVIDED 8 - PREPARATION OF REAGENTS 9 - STORAGE CONDITIONS - SHELF LIFE 10 - COLLECTION AND HANDLING OF SPECIMENS 11 - ASSAY PROCEDURE 12 - SYSTEM ADAPTATIONS 13 - CALCULATION AND INTERPRETATION OF THE RESULTS 14 - SPECTROPHOTOMETRIC VERIFICATION OF SAMPLE AND CONJUGATE PIPETING 15 - PERFORMANCES 16 - LIMITS OF THE TEST 17 - REFERENCES 4

5 1 - INTENDED USE MONOLISA HBs Ag ULTRA assay is a one step enzyme immunoassay technique of the "sandwich" type for the detection of the surface antigen of the Hepatitis B virus (HBs Ag) in the human serum or plasma. 2 - CLINICAL VALUE The detection of HBs Ag in the serum indicates an infection caused by the hepatitis B virus. It is the first marker to appear and may be observed 2 or 3 weeks before the clinical and biological symptoms of the disease. Its period of presence may be very short (a few days) or very long (several years). HBs Ag persisting beyond 6 months in the serum denotes "chronic hepatitis". Because of the existence of numerous asymptomatic chronic carriers, hepatitis B represents an important transfusion hazard and the prevention of the transmission is based upon the detection of the HBs Ag at the time of each blood donation. 3 - PRINCIPLE OF THE MONOLISA HBs Ag ULTRA MONOLISA HBs Ag ULTRA assay is a one step enzyme immunoassay based on the principle of the "sandwich" type using monoclonal antibodies and polyclonal anibodies selected for their ability to bind themselves to the various subtypes of HBs Ag now recognized by the WHO and the most part of variant HBV strains. The MONOLISA HBs Ag ULTRA solid phase is coated with monoclonal antibodies. The MONOLISA HBs Ag ULTRA conjugates are based upon the use of monoclonal antibodies from mouse and polyclonal antibody from goat against the HBs Ag.These antibodies are bound to the peroxidase. The assay procedure includes the following reaction steps : 1. Distribution of control sera and samples into the wells of the microplate. This distribution can be visually controlled : there is a clear difference of colouration between empty well and well with sample.this distribution can also be controlled automaticaly by reading at 490/ nm (optional). 2. Distribution of the red coloured conjugate into the wells. This distribution can also be visually controlled : After the conjugate solution addition, the colour of the well becomes red. It is possible to control automaticaly this distribution by spectrophotometric reading at 490/ nm (optional). The sample deposition can also be controlled at this step of the manipulation by automatic reading at 490/ nm. 3. After incubation at 37 C during one hour and half the unbound conjugate is removed by washing. 4. Distribution of coloured Substrate solution. This distribution can be visually controlled : there is a clear difference of colouration between empty well and well with the pink substrate solution.this distribution can also be controlled automaticaly by reading at 490 nm (optional). 5. After 30 minutes incubation in presence of the substrate in dark and at room temperature (18-30 C), the presence of the complexed conjugate is shown by a change of colour. 6. Distribution of stopping solution. This distribution can be visually controlled : The substrate solution wich initialy pink becomes uncoloured for the non reactive sample wells and turn blue to yellow for the positive sample wells. 7. Reading of the optical densities at 450/ nm and interpretation of the results. 5

6 4 - CONTENTS OF THE MONOLISA HBs Ag ULTRA All reagents are exclusively for in vitro diagnostic use. LABEL NATURE OF THE REAGENTS PRESENTATION R1 MICROPLATE : 12 strips of 8 wells each, coated 1 plate 5 plates with monoclonal anti-hbs antibodies (mouse) R2 CONCENTRATED WASHING SOLUTION (20 X ) 1 vial 1 vial Tris NaCl buffer ph ml 235 ml Preservative : ProClin TM 300 (0.04%) R3 NEGATIVE CONTROL 2 vials 2 vials Tris HCl buffer containing BSA 2 x 2.5 ml 2 x 2.5 ml Preservative : ProClin TM 300 (0.1 %) R4 POSITIVE CONTROL (HUMAN) 1 vial 1 vial Tris HCl buffer containing BSA with addition of 2.5 ml 2.5 ml mixture of purified HBs Ag from ad and ay subtypes Preservative : ProClin TM 300 (0.1 %) R6 CONJUGATE DILUENT 1 vial 2 vials Tris HCl buffer ph 7.4 containing BSA, Tween 20, 8 ml 2 x 18 ml bovine immunoglobulins and mouse immunoglobulins with sample addition control reagent Preservatives : ProClin TM 300 (0,1%), Ciprofloxacine (10 µg /ml) R7 CONJUGATE 1 vial 2 vials Mouse Monoclonal anti-hbs antibodies and Goat sqf 8 ml sqf 2 x 18 ml polyclonal anti-hbs antibodies bound to the peroxidase. Lyophilized. R8 SUBSTRATE BUFFER 1 vial 2 vials Citric acid and Sodium acetate solution ph ml 2 x 60 ml containing H 2 O 2 (0.015%) and DMSO (4%) R9 CHROMOGEN PINK COLOURED 1 vial 2 vials Solution containing tetramethyl benzidine (TMB) 5 ml 2 x 5 ml R10 STOPPING SOLUTION 1 vial 3 vials 1N sulphuric acid solution 28 ml 3 x 28 ml ADHESIVE FILM FOR MICROPLATES x 4 x PRECAUTIONS The reliability of the results depends on correct implementation of the following Good Laboratory Practices : The name of the test, as well as a specific identification number for the test, are written on the frame of each microtiterplate. This specific identification number is stated on each strip too. Monolisa HBs Ag Ultra : Specific ID number = 51 Verify the specific identification number before any use. If the identification number is missing, or different from the stated number corresponding to the assay to be tested, the strip should not be used. Do not use expired reagents. Do not mix reagents from different lots within a given test run. REMARK : For washing solution (R2, label identification : 20x coloured green), peroxidase substrate buffer (R8, label identification : TMB buf, coloured blue), chromogen (R9, label identification : TMB 11x, coloured purple) and stopping solution (R10, label identification : 1N coloured red), it is possible to use other lots than those contained in the kit, provided the same lot is used within a given test run. These reagents can be used with some other products of our company. In addition, the wash solution (R2, label identification : 20X coloured green) can be mixed with the 2 other wash solutions included in various Bio-Rad Reagent kits (R2, label identifications : 10X coloured blue or 10X coloured orange) when properly reconstituted, provided only one mixture is used within a given test run. 6

7 Contact our technical service for detailed information. Before use, it is necessary to wait 30 minutes for the reagents to stabilise to room temperature and one hour for diluted wash buffer R2. Carefully reconstitute the reagents avoiding any contamination. Do not carry out the test in the presence of reactive vapours (acid, alkaline, aldehyde vapours) or dust that could alter the enzyme activity of the conjugates. Use glassware thoroughly washed and rinsed with deionized water or preferably, disposable material. Do not allow the microplate to dry between the end of the washing operation and the reagent distribution. The enzyme reaction is very sensitive to metal ions. Consequently, do not allow any metal element to come into contact with the various conjugate or substrate solutions. The development solution (substrate buffer + chromogen) must be coloured pink. The modification of this pink colour within a few minutes after reconstitution indicates that the reagent cannot be used and must be replaced. Preparation of the development solution can be made in a clean disposable single use plastic tray or glass container that has first been pre-washed with 1N HCl and rinsed thoroughly with distilled water and dried. This reagent must be stored in the dark. Use a new distribution tip for each sample. Well washing is a critical step in this procedure: respect the recommended number of washing cycles and make sure that all wells are completely filled and then completely emptied. Incorrect washing may lead to inaccurate results. Never use the same container to distribute conjugate and development solution. Check the pipettes and other equipment for accuracy and correct operation. Do not change the assay procedure. 6 - HEALTH AND SAFETY INSTRUCTIONS All the reagents included in the kit are intended for "in vitro diagnostic use". Wear disposable gloves when handling reagents and samples and thoroughly wash your hands after handling them. Do not pipette by mouth. The positive control R4 contains purified HBs Ag from subtypes ad and ay prepared with negative human plasma for anti-hcv, anti-hiv1 and anti-hiv2 antibodies and inactivated by warming. Because no known test method can offer complete assurance that infectious agents are absent, handle reagents and patient samples as if capable of transmitting infectious disease. Any equipment directly in contact with specimens and reagents as well as the washing solutions should be considered as contaminated products and treated as such. Avoid spilling samples or solutions containing samples. Spills must be rinsed with bleach diluted at 10%. If the contaminating fluid is an acid, spills must be initially neutralised with sodium bicarbonate and dried with absorbent paper. The material used for cleaning must be discarded in a contaminated residue container. Samples and reagent of human origin, as well as, contaminated material and products must be discarded after decontamination : - either by immersion in bleach at a final concentration of 5% of sodium hypochlorite (1 volume of bleach for 10 volumes of contaminated fluid or water) for 30 minutes. - or by autoclaving at 121 C for 2 hours minimum. Autoclaving is the best method to inactivate the HIV and the HBV viruses. - DO NOT PLACE SOLUTIONS CONTAINING SODIUM HYPOCHLORITE IN THE AUTOCLAVE Do not forget to neutralise and/or autoclave the solutions or washing wastes or any fluid containing biological samples before discarding them into the sink. The Safety Data Sheet is available upon request. Chemicals should be handled and disposed of in accordance with Good Laboratory Practices. Avoid any contact of the substrate buffer, the chromogen and the stopping solution with the skin and mucosa (toxicity, irritation or burn hazard). Some reagents contain ProClin 300 (0.04%, 0.1% and/or 0.5%) Xi Irritant R43 : may cause sensitisation by skin contact. S28-37 : After contact with skin, wash immediately with plenty of soap and water. Wear suitable gloves. 7

8 The Safety Data Sheet is available upon request. 7 - MATERIAL REQUIRED BUT NOT PROVIDED Distilled water. Sodium hypochlorite (household bleach) and sodium bicarbonate. Automatic or semiautomatic, adjustable or preset pipettes or multipipettes to measure and dispense 50 µl, 100 µl, 1000 µl and 10 ml. Graduated cylinders of 100 ml, ml capacity. Container for biohazardous waste. Water-bath or equivalent microplate incubator, thermostatically set at 37 C ± 1 C (*). Manual, semiautomatic or automatic microplate washer (*). Microplate reader equipped with 450, 490nm and nm filters (*). Absorbent paper. (*) Consult us for detailed information about the equipment recommended by our technical department. 8 - PREPARATION OF THE REAGENTS NOTE : Before use, allow reagents to reach room temperature (18-30 C). 1) Ready for use reagents Reagent 1 (R1) : Microplate Each frame support containing 12 strips is packaged in a ZIP bag. Cut the bag using scissors or a scalpel 0.5 to 1 cm above the ZIP. Open the bag and take out the frame. Put the unused strips back into the bag. Close the bag carefully and put it back into storage at +2-8 C. Reagent 3 (R3) : Negative control Reagent 4 (R4) : Positive control Reagent 10 (R10) : Stopping solution 2) Reagents to reconstitute Concentrated washing solution (20x) : Reagent 2 (R2) Dilute 1:20 in distilled water to obtain the ready-for-use washing solution. Prepare 800 ml for one plate of 12 strips. Conjugate working solution (R6 + R7) Gently tap the vial of the lyophilized conjugate (R7) on the work-bench to remove any substance from the rubber cap. Carefully remove the cap and pour the content of a conjugate diluent vial (R6) into the lyophilized conjugate vial (R7). Put the cap on and let stand for 10 minutes while gently shaking and inverting from time to time to ease dissolution. Enzyme development solution : Reagent 8 (R8) + Reagent 9 (R9) Dilute 1:11 the chromogen (R9) in the Substrate Buffer (R8) (ex : 1 ml reagent R9+10 ml reagent R8). Stability is for 6 hours in the dark once prepared. 9 - STORAGE CONDITIONS - SHELF LIFE The kit should be stored at +2-8 C. When stored at this temperature, each reagent contained in the kit can be used until the expiry date mentioned on the package (except for specific instructions). R1 : After the vacuum-sealed bag has been opened, the microwell strips stored at +2-8 C in the carefully resealed bag can be used for 1 month. R2 : The diluted washing solution can be stored at C during 2 weeks. The concentrated washing solution (R2) can be stored at C. R6 + R7 : After the reconstitution, the reagents can be used for 1 month if stored at +2-8 C and 8 hours if stored at room temperature (18-30 C). R8 + R9 : After the reconstitution, the reagent stored in the dark can be used for 6 hours at room temperature (18-30 C) COLLECTION AND HANDLING OF SPECIMENS Collect a blood sample according to the current practices. The test should be performed on undiluted serum or plasma (collected with EDTA, heparin, citrate, ACD-based anticoagulants). Separate the serum or plasma from the clot or red cells as soon as possible to avoid any haemolysis. Extensive haemolysis may affect test performance. Specimens with observable particulate matter should be clarified by centrifugation prior testing. Suspended fibrin particles or aggregates may yield falsely positive results. The specimens can be stored at +2-8 C if screening is performed within 7 days or they may be deep-frozen at -20 C for several months. Avoid repeated freeze/thaw cycles. Samples that have been frozen and defrozen more than 3 times cannot be used. If the specimens are to be shipped, they must be packaged in accordance with the regulations in force regarding the transport of aetiological agents. 8

9 DO NOT USE CONTAMINATED, HYPERLIPAEMIC OR HYPEHAEMOLYSED SERA OR PLASMA. REMARK : Samples containing up to 90 g/l albumin, 100 mg/l bilirubin, lipemic samples containing up to the equivalent of 36 g/l triglyceride, and hemolyzed samples containing up to 1 g/l hemoglobin do not affect the results ASSAY PROCEDURE Strictly follow the proposed procedure. Use the negative (R3) and (R4) positive controls for each series of determinations to validate the test results. Follow the following Good Laboratory Practice : 1. Carefully establish the sample distribution and identification plan. 2. Prepare the diluted washing solution (refer to chapter 8). 3. Prepare the conjugate R6+R7 working solution (refer to chapter 8). 4. Take out from the protective packing the support frame and the necessary number of strips (R1). Put the unused strips back in their packing and reclose it. 5. Distribute in the wells in the following order (advisable plate distribution) : Wells A1, B1, C1 and D1: 100 µl of negative control (R3) Well E1 : 100 µl of positive control (R4) Well F1 : 100 µl of the first unknown sample if this well is not used as control well for the validation of the sample and conjugate deposition (optional) Wells G1, H1,...etc : 100 µl of unknown sample. Depending on the used system, it is possible to modify the position of controls or the order of distribution. NB : The sample distribution can be visually controlled at this step of the manipulation : there is a difference of colouration between empty well and well with sample (Refer to section 14 for automatic verification). 6. Quickly dispense 50 µl of conjugate solution (R6 + R7) into all wells, the conjugate solution must be shaken before use. Homogenize the reaction mixture. NB : The sample distribution can also be visually controlled at this step of the manipulation, as well as the conjugate distribution : The conjugate solution (R6+R7), which is coloured red, can be visually controlled at this step of the manipulation. (refer to section 14 for automatic verification). 7. When possible, cover the plate with new adhesive film and incubate for 1hour and 30 ± 5 minutes at 37±1 C. 8. Remove the adhesive film, empty all wells by aspiration and wash a minimum of 5 times. The residual volume must be lower than 10 µl (if necessary, dry the strips by turning them upside down on absorbent paper.) 9. Quickly dispense into each well 100µl of prepared development solution (R8+R9), freshly prepared before use. Allow the reaction to develop in the dark for 30 ± 5 minutes at room temperature (18-30 C). Do not use adhesive film during this incubation. N.B.: The distribution of the development solution, which is coloured pink, can be visually controlled at this step of the manipulation : There is a clear difference of colouration between empty well and well containing the pink substrate solution. (refer to section 14 for automatic verification : SPECTROPHOTOMETRIC VERIFICATION OF SAMPLE AND REAGENT PIPETING) 10. Add 100µl stopping solution (R10) by using the same sequence and rate of distribution as for the substrate solution. Homogenize the reaction mixture. N.B.: The distribution of the stopping solution, which is not coloured, can be visually controlled at this step of the manipulation. After the addition of the stopping solution the pink colouration of the substrate disappears (for the negative samples) or turns from blue to yellow (for the positive samples). 11. Carefully wipe the plate bottom. Wait at least 4 minutes after stopping solution addition before reading and within 30 minutes of stopping the reaction, read the optical density at 450/ nm using a plate reader. 12. Check for agreement between the spectrophotometric and visual readings and against the plate and sample distribution and identification plans SYSTEM ADAPTATION WASHING : Carefully follow the washing procedures described to obtain maximum test performance. With some instrument, It could be necessary to optimize the washing procedure (increase of number of cycle of washing step and /or volume of wash buffer for each cycle) to obtain an acceptable level of OD background for the negative sample. Contact our company for the adaptations and special procedures. 9

10 13 - CALCULATION AND INTERPRETATION OF THE RESULTS 1) Calculation of the negative control mean optical density : OD R3 Example Negative control R3 OD Total R3 OD = Total R3 OD / 4 = = mean OD R3 2) Calculation of the cut-off value For each method, the cut-off value is equal to : OD R Example : OD R3 = Cut-off value = = ) Test validity conditions All the values of the negative control should be lower or equal to unit of optical density. The positive control value (OD R4) should be over or equal to If one negative control value does not respect this norm or is superior to 40% compared to the mean value of the negative controls (OD R3), disregard and recalculate the mean using the three remaining values. Only one value may be eliminated in this way. In case of very low background for the negative control R3 (average value of negative control below OD) do not use these rejection criterias for R3 negative control. The test must be redone if all control values are out of these norms. 4) Calculation of ratio sample For each sample, calculate the ratio : OD sample Ratio = Cut-off value 5) Interpretation of the results Samples with ratio values lower than 1 are considered to be negative by the MONOLISA HBs Ag ULTRA. Results just below the cut-off value (sample ratio between 0.9 and 1) should however, be interpreted with caution. It is advisable to retest in duplicate the corresponding samples when the systems and laboratory procedures permit. Samples with ratio values equal to or greater than 1 are considered to be initially positive by the MONOLISA HBs Ag ULTRA. They should be retested in duplicate before final interpretation. If after retesting of a sample, the ratio values of the 2 duplicates are less than 1, the initial result is non repeatable and the sample is declared to be negative with the MONOLISA HBs Ag ULTRA. For initial reactive or doubtful (0.9 < ratio < 1) samples, if after retesting the ratio values of at least one of the 2 duplicates is equal to or greater than 1, the initial result is repeatable and the sample is declared to be positive with the MONOLISA HBs Ag ULTRA test, subject to the limitations of the procedure, described below. The samples which have been retested twice and found negative with MONOLISA HBs Ag ULTRA test, but with one value near the cut-off value (ratio between 0.9 and 1) should be considered with care. It is advised to retest the patient with another method or on another sample. In case of very low optical density for tested samples (negative OD) and when the presence of samples as well as of reagent is controlled, the results can be interpretated as negative. To verify the specificity of the reaction, every positive result in accordance with the interpretation criterias of MONOLISA HBs Ag ULTRA should be confirmed by a neutralisation method of the HBs Ag. Non repeatable reactions are often caused by : inadequate microplate washing, contamination of negative samples by serum or plasma with a high HBs Ag concentration, contamination of the substrate solution by oxidising agents (bleach, metal ions, etc...), contamination of the stopping solution. 10

11 14 - SPECTROPHOTOMETRIC VERIFICATION OF SAMPLE AND CONJUGATE PIPETING Sample and Conjugate pipetting verification 1) Sample pipetting verification. It is possible to verify the presence of sample into the well before the conjugate dispensing by automatic reading at 490/ nm : a well with sample must have an optical density included between and There is a clear difference of colouration between empty well and well containing sample weak yellow. 2) Conjugate pipetting verification. When the presence of samples has been verified by automatic reading as described before, the conjugate addition can be controled by automatic reading at 490/ nm : a well containing conjugate and sample has an optical density greater than The colour of wells containing samples is weak yellow and becomes red after the conjugate addition. 3) Simultaneous verification of the presence of sample and conjugate into wells. (Spectrophotometric verification only). When the presence of samples has not been verified by automatic reading as described before, the simultaneous presence of sample and conjugate into wells can be performed by automatic reading at 490/ nm if you have a well containing conjugate alone. The delta of their optical density has to be greater than 0.35 at 490/ nm. [DO (sample + conjugate) DO conjugate alone] 0.35 Development solution pipetting verification It is possible to verify the presence of pink development solution into the well by automatic reading at 490 nm : a well with development solution must have an optical density greater than (a lower OD indicates a poor dispensing of the development solution) PERFORMANCES The performances of MONOLISA HBs Ag ULTRA has been determined by testing samples from random blood donors, clinical patients with acute and chronic hepatitis B infection or with diseases unrelated to hepatitis B infection, and from commercial samples and seroconversion panels. More over the sensitivity limit has been tested using French SFTS panels, and the WHO standards. Specificity Specificity on a total of 9894 random blood donors from 3 different sites was found at 99.94% (9887/9893). One repeated reactive sample was confirmed positive for Hepatitis B surface antigen. Specificity study has been performed in a clinical laboratory (Hepatology Center) On 200 clinical samples tested, 2 samples were found repeat reactive (one found doubtful in first intention (ratio = 0.97), positive at 1.87 when repeated, the other with ratio of 2.29 and patients showing different pathologies or status not linked to the hepatitis B (pregnant women, rheumatoid factor, anti-nuclear antibodies, anti-mouse Ig or other viral or bacterial infections) were tested with MONOLISA HBs Ag ULTRA. 11 samples found repeat reactive were controled with an avalaible commercial EIA test and with a neutralisation assay. 10 out of 11 repeat positive samples with the MONOLISA HBs Ag ULTRA assay were obtained positive with the commercial HBs Ag assay. One sample found non interpretable with the neuralisation assay was withdrawn from the final calculation; 2 samples were not neutralised; one came from an HSV IgG sample and one from a myeloma sample; sample found positive either with the commercial EIA assay, conducted to a final specificity of 99.28% (276/278). The 9 other positive from HSV IgG samples and myeloma samples were found negative with MONOLISA HBs Ag ULTRA. Analytical Sensitivity The sensitivity limit of the test has been estimated inferior to ng /ml during the evaluation with the French SFTS 2001 panel of HBs antigen, and inferior to IU /ml for the WHO standard. The following sub-types from SFTS 2001 panel : adw2, adw4, adr, ayw1, ayw2, ayw3, ayw4, ayw5, and ayr, were all found positive with a ratio superior to 5 with MONOLISA HBs Ag ULTRA. Sensitivity Sensitivity studies have been performed on 428 positive samples from follow-up of chronic or acute HBV infected patient showing a sensitivity of 100%. A panel of 15 recombinant proteins mimicking major mutations on amino acid sequences of HBs antigen have been tested and all have been detected with MONOLISA HBs Ag ULTRA. A total of 60 well documented commercial HBV seroconversion panels (293 samples) were also studied and compared to commercially available EIA assay. Bio-Rad HBs Ag Ultra shows equivalent results to Monolisa HBs Ag Plus for 29 panels. 11

12 Bio-Rad HBs Ag Ultra is more sensitive with one sample earlier for 28 panels, with 2 samples earlier for 2 panels and with 5 samples earlier for 1panel. Assay Reproducibility The reproducibility of MONOLISA HBs Ag ULTRA test has been determined, by the analysis of 4 samples : 1 negative sample, 2 HBs Ag positive samples (samples 2 and 3) and 1 high HBs Ag positive sample. The intra assay reproducibility has been evaluated by testing these 4 samples 30 times in the same run, the inter assay reproducibility has been evaluated by testing these 4 samples in duplicate during 20 days on 2 independant runs each days. Results are shown in the following tables : Table 1 : Intra assay reproducibility n = 30 sample 1 sample 2 sample 3 sample 4 mean of ratios standard deviation (SD) CV (%) ratios % 3.83 % 3.77 % 6.19 % Table 2 : Inter assay reproducibility n = 40 sample 1 sample 2 sample 3 sample 4 mean of ratios standard deviation (SD) CV (%) ratios 18.1 % 8.2 % 9.36 % % 16 - LIMITS OF THE TEST A negative result indicates that the tested sample does not contain detectable HBs Ag with MONOLISA HBs Ag ULTRA test. However because very low titer of HBs Ag could not be detected, such a result does not prelude the possibility of exposure to an infection by the hepatitis B virus. In addition, several authors have reported in the literature cases of viral hepatitis B (acute or chronic) where in viral DNA is detectable in the absence of the surface antigen (HBs Ag negative patients). These abnormal profiles, though rare, are the consequence of possible genetic mutations, either at the S and pre-s gene level (preventing recognition of the Ag by some immunological reagents) or, usually, at the X and pol gene level, inducing weak viral replication. Testing additional markers (HBs Ag-specific antibody or, if possible, amplified viral DNA) is recommended for the final diagnosis of the infection, in those very particular cases. To verify the specificity of the reaction, every positive result (in accordance with the interpretation criterias of MONOLISA HBs Ag ULTRA) should be confirmed by a neutralisation method of the HBs Ag (test MONOLISA HBs Ag confirmation for exemple, code number 72208) The colorimetric method for the samples, conjugate and development solution deposition verification does not allow to verify the accuracy of the dispensed volumes. This method only shows the presence of sample, conjugate and development solution into wells. The rate of wrong answers with this method is closely linked to the accuracy of the utilized system (cumulated coefficient of variation of dispensing and reading over 10% significantly decrease the quality of the verification). In case of very poor washing efficiency after the conjugate incubation, the automatic verification of the development solution pipetting (by reading OD of wells at 490 nm) may provide wrong results with OD above in the absence of development solution. Never observed during evaluation on 939 tested samples REFERENCES See French version. 12

13 MONOLISA HBs Ag ULTRA 1 plaque - 96 tests plaques tests TROUSSE POUR LA DÉTECTION DE L'ANTIGÈNE DE SURFACE DU VIRUS DE L'HÉPATITE B PAR TECHNIQUE IMMUNO-ENZYMATIQUE DANS LE SÉRUM OU LE PLASMA HUMAIN IVD Contrôle de qualité du fabriquant Tous les produits fabriqués et commercialisés par la société Bio-Rad sont placés sous un système d'assurance qualité de la réception des matières premières jusqu'à la commercialisation des produits finis. Chaque lot du produit fini fait l'objet d'un contrôle de qualité et n'est commercialisé que s'il est conforme aux critères d'acceptation. La documentation relative à la production et au contrôle de chaque lot est conservée par notre société. 13

14 TABLE DES MATIÈRES 1 - BUT DU DOSAGE 2 - INTÉRÊT CLINIQUE 3 - PRINCIPE DU TEST MONOLISA HBs Ag ULTRA 4 - COMPOSITION DE LA TROUSSE MONOLISA HBs Ag ULTRA 5 - PRÉCAUTIONS 6 - CONSIGNES D'HYGIÈNE ET DE SÉCURITÉ 7 - MATÉRIEL NÉCESSAIRE MAIS NON FOURNI 8 - PRÉPARATION DES RÉACTIFS 9 - CONSERVATION - VALIDITÉ 10 - ÉCHANTILLONS 11 - MODE OPÉRATOIRE 12 - ADAPTATION 13 - CALCUL ET INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS 14 - VÉRIFICATION SPECTROPHOTOMÉTRIQUE DU DÉPÔT DES ÉCHANTILLONS ET DU CONJUGUÉ 15 - PERFORMANCES 16 - LIMITES DU TEST 17 - RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES 14

15 1 - BUT DU DOSAGE MONOLISA HBs Ag ULTRA est une technique immuno-enzymatique de type "sandwich" en 1 temps pour la détection de l'antigène de surface du virus de l'hépatite B (Ag HBs) dans le sérum ou le plasma humain. 2 - INTÉRÊT CLINIQUE La présence de l'ag HBs dans le sérum témoigne d'une infection par le virus de l'hépatite B. Il est le premier marqueur à apparaître et peut précéder de 2 à 3 semaines les signes cliniques et biologiques de la maladie. Sa présence peut être très brève (quelques jours) ou très longue (plusieurs années). Au delà de 6 mois de persistence de l'ag HBs, l'hépatite est qualifiée de "chronique". L'existence de nombreux porteurs chroniques asymptomatiques fait que l'hépatite B représente un risque transfusionnel important. La prévention de la transmission repose sur la détection de l'ag HBs à chaque don de sang. 3 - PRINCIPE DU TEST MONOLISA HBs Ag ULTRA MONOLISA HBs Ag ULTRA est une technique immuno-enzymatique de type "sandwich" en 1 temps utilisant des anticorps monoclonaux et des anticorps polyclonaux sélectionnés pour leur capacité à se lier aux différents sous-types de l'ag HBs actuellement reconnus par l'oms et la plupart des souches variantes de l hépatite B. La phase solide de MONOLISA HBs Ag ULTRA est sensibilisée avec des anticorps monoclonaux. Les conjugués de MONOLISA HBs Ag ULTRA sont basés sur l utilisation des anticorps monoclonaux de souris et des anticorps polyclonaux de chèvre contre l Ag HBs. Ces anticorps sont couplés à la peroxydase. Le dosage comprend les étapes suivantes : 1) Distribution des échantillons et des sérums de contrôle dans les cupules de la microplaque. Cette distribution peut être contrôlée visuellement : en effet, il y a une nette différence de coloration entre une cupule vide et une cupule contenant un échantillon. Elle peut être aussi contrôlée par lecture spectrophotométrique à 490/ nm (optionnel). 2) Distribution du conjugué Cette distribution peut être également contrôlée visuellement : en effet, après rajout du conjugué initialement rouge, la cupule se colore en rouge. Elle peut être contrôlée par lecture spectrophotométrique à 490/ nm (optionnel), la distribution des échantillons peut aussi être contrôlée à ce stade de la manipulation par lecture spectrophotométrique à 490/ nm. 3) Après incubation pendant une heure et demi à 37 C, le conjugué non lié est éliminé par lavage. 4) Distribution de la solution de révélation de l activité enzymatique. Cette distribution peut être également contrôlée visuellement : il y a une nette différence de coloration entre une cupule vide et une cupule contenant le substrat de couleur rose. Elle peut être contrôlée par lecture spectrophotométrique à 490 (optionnel). 5) Après 30 minutes d incubation en présence du substrat à l obscurité et à témpérature ambiante (18-30 C), la présence du conjugué est révélée par un changement de couleur. 6) Distribution de la solution d arrêt. Cette distribution peut être également contrôlée visuellement : La coloration du substrat, rosée (pour les échantillons négatifs) ou bleu (pour les échantillons positifs), disparaît des cupules qui deviennent incolores (pour les échantillons négatifs) ou jaunes (pour les échantillons positifs) après addition de la solution d'arrêt. 7) Lecture des densités optiques à 450/ nm et interprétation des résultats. 15

16 4 - COMPOSITION DE LA TROUSSE MONOLISA HBs Ag ULTRA Tous les réactifs sont destinés exclusivement pour le diagnostic in vitro. ETIQUETAGE NATURE DES RÉACTIFS PRÉSENTATION R1 MICROPLAQUE : 12 barrettes de 8 cupules sensibilisées 1 microplaque 5 microplaques avec des anticorps monoclonaux anti-hbs (souris) R2 SOLUTION DE LAVAGE concentrée (20 fois) 1 flacon 1 flacon Tampon tris, NaCI, ph = 7,4 70 ml 235 ml Conservateur : ProClin TM 300 (0,04 %) R3 CONTRÔLE NÉGATIF 2 flacons 2 flacons Tampon Tris HCl, contenant de la SAB. 2 x 2,5 ml 2 x 2,5 ml Conservateur : ProClin TM 300 (0,1 %) R4 CONTRÔLE POSITIF (Humain) 1 flacon 1 flacon Tampon Tris HCl, contenant de la SAB, additionné d'un 2,5 ml 2,5 ml mélange d Ag HBs purifiés des sous-types ad et ay, (humains) Conservateur : ProClin TM 300 (0,1 %) R6 DILUANT CONJUGUÉ : Tampon Tris HCl ph 7.4 additionné 1 flacon 2 flacons de BSA, de Tween 20, d'immunoglobulines de boeuf et 8 ml 2 x 18 ml de souris et d'un indicateur coloré témoin de dépôt Conservateurs : Ciprofloxacine (10 µg/ml), ProClin TM 300 (0,1 %) R7 CONJUGUÉ 1 flacon 2 flacons Anticorps monoclonaux anti-hbs de souris et anticorps qsp 8 ml qsp 2 x 18 ml polyclonaux anti-hbs de chèvre couplés à la peroxydase. Lyophilisé. R8 TAMPON SUBSTRAT DE LA PEROXYDASE 1 flacon 2 flacons Solution d'acide citrique et d'acétate 60 ml 2 x 60 ml de sodium ph 4,0 contenant 0,015% d'h 2 O 2 et 4% de diméthylsulfoxyde (DMSO) R9 CHROMOGÈNE coloré en rose : 1 flacon 2 flacons solution contenant du tétraméthyl benzidine (TMB) 5 ml 2 x 5 ml R10 SOLUTION D'ARRÊT 1 flacon 3 flacons Solution d'acide sulfurique 1 N 28 ml 3 x 28 ml FEUILLES ADHÉSIVES x 4 x PRÉCAUTIONS La qualité des résultats dépend du respect des bonnes pratiques de laboratoire suivantes : Le nom du test ainsi qu un numéro d identification spécifique du test sont mentionnés sur le cadre de chaque microplaque. Ce numéro d identification spécifique figure également sur chaque barrette. Monolisa HBs Ag ULTRA : Numéro spécifique d identification = 51 Cette identification doit être vérifiée avant chaque utilisation. Toute barrette dont le numéro de test est absent, ou différent de celui correspondant au test réalisé, ne doit pas être utilisée. Ne pas utiliser des réactifs dont la validité est expirée. Ne pas mélanger des réactifs de lots différents au cours d'un même essai. REMARQUE : Il est possible d'utiliser d'autres lots de solution de lavage (R2, identifié 20x en vert sur l étiquette), de tampon substrat (R8, identifié TMB buf. en bleu), de chromogène (R9, identifié TMB 11x en violet) et de solution d'arrêt (R10, identifié 1N en rouge), que ceux fournis dans la trousse sous réserve d'utiliser un seul et même lot de ceux-ci au cours d'un même essai. Ces réactifs peuvent être utilisés avec d'autres produits de BIO-RAD. De plus, la solution de lavage (R2, identifié 20X en vert sur l étiquette), peut être mélangée avec l une des deux autres solutions de lavage inclues dans les différents kits réactifs Bio-Rad (R2, identifié 10X en bleu ou 10X en orange sur l étiquette) correctement reconstituées, à condition qu un seul mélange soit utilisé pour une même manipulation donnée. Contacter nos services techniques pour obtenir des informations détaillées. 16

17 Avant utilisation, attendre 30 minutes que les réactifs s'équilibrent à la température ambiante (18-30 C) et une heure pour la solution de lavage diluée (R2). Reconstituer soigneusement les réactifs en évitant toute contamination. Ne pas réaliser le test en présence de vapeurs réactives (acides, alcalines, aldéhydes) ou de poussières qui pourraient altérer l'activité enzymatique du conjugué. Utiliser une verrerie parfaitement lavée et rincée à l'eau distillée ou de préférence du matériel à usage unique. Ne pas laisser la microplaque sécher entre la fin du lavage et la distribution des réactifs. La réaction enzymatique est très sensible à tous métaux ou ions métalliques. En conséquence, aucun élément métallique ne doit entrer en contact avec les différentes solutions contenant le conjugué ou la solution substrat. La solution de révélation (tampon substrat + chromogène) doit être colorée en rose. L'apparition d'une autre coloration dans les minutes suivant la reconstitution indique que le réactif est inutilisable et doit être remplacé. Pour cette préparation, utiliser de préférence des récipients et du matériel de distribution en plastique à usage unique ou de la verrerie préalablement lavée à l'acide chlorhydrique 1N, rincée à l'eau distillée et séchée. Conserver cette solution à l'abri de la lumière. Utiliser un cône de distribution neuf pour chaque sérum. Le lavage des cupules est une étape essentielle de la manipulation : respecter le nombre de cycles de lavages prescrits, et s'assurer que toutes les cupules sont complètement remplies, puis complètement vidées. Un mauvais lavage peut entraîner des résultats incorrects. Ne jamais utiliser le même récipient pour distribuer le conjugué et la solution de révélation. Vérifier l exactitude et la bonne précision des pipettes et le bon fonctionnement des appareils utilisés. Ne pas changer le protocole opératoire. 6 - CONSIGNES D'HYGIÈNE ET DE SÉCURITÉ Tous les réactifs de la trousse sont destinés à l'usage du diagnostic "in vitro". Porter des gants à usage unique lors de la manipulation des réactifs et des échantillons et se laver les mains soigneusement après leur manipulation. Ne pas "pipeter à la bouche" Le contrôle positif (R4) contient de l'ag HBs de sous-type ad et ay purifié à partir de plasmas humains négatifs en anticorps anti-vih1 et 2 et anticorps anti-vhc, et inactivés par la chaleur. Du fait qu'aucune méthode ne peut garantir de façon absolue l'absence des virus VIH, VHB, VHC ou d'autres agents infectieux, considérer les réactifs d'origine humaine, ainsi que les échantillons de patients, comme potentiellement infectieux et les manipuler avec les précautions d'usage. Considérer le matériel directement en contact avec les échantillons et les réactifs d'origine humaine, ainsi que les solutions de lavage, comme des produits contaminés. Eviter les éclaboussures d'échantillons ou de solutions les contenant. Les surfaces souillées seront nettoyées par de l'eau de javel diluée à 10%. Si le liquide contaminant est un acide, les surfaces souillées seront neutralisées au préalable avec du bicarbonate de soude, puis nettoyées à l'aide de l'eau de javel et séchées avec du papier absorbant. Le matériel utilisé pour le nettoyage devra être jeté dans un conteneur spécial pour déchets contaminés. Les échantillons, les réactifs d'origine humaine ainsi que le matériel et les produits contaminés seront éliminés après décontamination : - soit par trempage dans de l'eau de javel à la concentration finale de 5% d'hypochlorite de sodium (1 volume d'eau de javel pour 10 volumes de liquide contaminé ou d'eau) pendant 30 minutes, - soit par autoclavage à 121 C pendant 2 heures minimum. L autoclave est la meilleure méthode pour inactiver les virus VIH et VHB. ATTENTION : NE PAS INTRODUIRE DANS L'AUTOCLAVE DES SOLUTIONS CONTENANT DE L'HYPOCHLORITE DE SODIUM. Ne pas omettre de neutraliser et/ou d'autoclaver les solutions ou effluents de lavage ou tout liquide contenant des échantillons biologiques avant de les jeter dans l'évier. La fiche de données de sécurité est disponible sur demande. La manipulation et l élimination des produits chimiques doivent être effectuées selon les bonnes pratiques de laboratoire. Eviter tout contact du tampon substrat, du chromogène et de la solution d'arrêt avec la peau et les muqueuses (toxicité, irritation ou brûlure). 17

18 Certains réactifs contiennent du ProClin 300 (0.04%, 0.1 % et/ou 0,5%) Xi Irritant R43 : peut entraîner une sensibilisation par contact avec la peau S28-37 : Après contact avec la peau, se laver immédiatement et abondamment avec de l'eau et du savon. Porter des gants appropriés. La fiche de données de sécurité est disponible sur demande. 7 - MATÉRIEL NÉCESSAIRE MAIS NON FOURNI Eau distillée. Hypochloride de sodium (Eau de javel) et bicarbonate de soude. Pipettes automatiques ou semi-automatiques réglables ou fixes pouvant distribuer 50 µl, 100 µl, 1000 µl et 10 ml. Eprouvettes graduées de 100 ml et 1000 ml. Conteneur de déchets contaminés. Bain-marie, ou incubateur sec*, pouvant être thermostaté à 37 C ± 1 C(*). Système de lavage, automatique*, semi-automatique* ou manuel pour microplaque. Appareil de lecture* pour microplaques équipés de filtres 450, 490 et nm. Papier absorbant. (*) Nous consulter pour une information précise concernant les appareils validés par nos services techniques. 8 - PRÉPARATION DES RÉACTIFS Avant utilisation des réactifs de la trousse MONOLISA HBs Ag ULTRA, les laisser s équilibrer à température ambiante (18-30 C). 1) Réactifs prêts à l'emploi Réactif 1 (R1) : Microplaque Chaque support cadre contenant 12 barrettes est conditionné en sachet ZIP. Couper le sachet à l aide de ciseaux ou scalpel 0,5 à 1 cm au-dessus du ZIP. Ouvrir le sachet et sortir le cadre. Replacer dans le sachet les barrettes inutilisées. Refermer le sachet soigneusement et le replacer à +2-8 C. Réactif 3 (R3) : Contrôle Négatif Réactif 4 (R4) : Contrôle Positif Réactif 10 (R10) : Solution d arrêt 2) Réactifs à reconstituer Solution de lavage (concentrée 20x) : Réactif 2 (R2) Diluer au 1/20 è la solution de lavage R2 dans de l eau distillée. Préparer 800 ml pour une microplaque de 12 barrettes. Conjugué (R6 + R7) Taper doucement le flacon de conjugué lyophilisé (R7) sur la paillasse pour détacher toute substance pouvant adhérer au bouchon de caoutchouc. Ouvrir le flacon de conjugué lyophilisé (R7) et y transvaser le contenu d'un flacon de diluant pour conjugué (R6). Reboucher et laisser reposer 10 minutes en homogénéisant de temps en temps pour faciliter la dissolution. Solution de révélation enzymatique (R8 + R9) Diluer le réactif R9 dans le réactif R8 au 1/11ème (exemple : 1 ml de réactif R9 dans 10 ml de réactif R8) sachant que 10 ml sont nécessaires et suffisants pour traiter 12 barrettes. Cette solution reste stable 6 heures à l obscurité. Homogénéiser. 9 - CONSERVATION - VALIDITÉ Conserver la trousse à C avant utilisation. Chaque élément de la trousse MONOLISA HBs Ag ULTRA conservé à +2-8 C peut être utilisé après une première ouverture jusqu à la date de péremption indiquée sur le coffret, sauf indication spécifique : R1 : Après ouverture du sachet, les barrettes conservées à +2-8 C dans leur sachet d origine, refermé avec soin, sont utilisables pendant 1 mois. R2 : La solution de lavage diluée peut être conservée à C pendant 2 semaines. La solution de lavage concentrée (R2) peut être conservée à C. R6 + R7 : La solution de conjugué, stockée à +2-8 C, est utilisable pendant 1 mois et est utilisable à température ambiante (18-30 C) pendant 8 heures. R8 + R9 : Après reconstitution, la solution de révélation est utilisable 6 heures à l obscurité à température ambiante (18-30 C). 18

19 10 - ÉCHANTILLONS Prélever un échantillon de sang selon les pratiques en usage. Les tests sont effectués sur des échantillons non dilués de sérum ou de plasma (collectés avec des anticoagulants comme l EDTA, l héparine, le citrate, l ACD). Extraire le sérum ou le plasma du caillot ou des globules rouges dès que possible pour éviter toute hémolyse. Une hémolyse très prononcée peut affecter les performances du test. Les échantillons présentant des agrégats doivent être clarifiés par centrifugation avant le test. Les particules ou agrégats de fibrine en suspension peuvent donner des résultats faussement positifs. Les échantillons seront conservés à C si le dépistage est effectué dans les 7 jours ou peuvent être conservés congelés à -20 C pour plusieurs mois. Eviter les congélations/ décongélations répétées. Les échantillons ayant été congelés et décongelés plus de 3 fois ne doivent pas être utilisés. Si les échantillons doivent voyager, les emballer selon la réglementation en usage pour le transport des agents étiologiques et les transporter préférablement congelés. NE PAS UTILISER DE SÉRUMS CONTAMINÉS, HYPERLIPÉMIQUES OU HYPERHÉMOLYSES. REMARQUE : Aucune interférence n a été mise en évidence sur des échantillons contenant jusqu à 90 g/l d albumine, 100 mg/l de bilirubine, ainsi que sur des échantillons lipémiques contenant jusqu à 36 g/l de trioléine et sur des échantillons hémolysés contenant jusqu à 1 g/l d hémoglobine MODE OPÉRATOIRE Suivre strictement le protocole proposé. Utiliser les contrôles positif (R4) et négatif (R3) pour chaque série de déterminations pour valider les résultats du test. Suivre les bonnes pratiques de laboratoire. 1) Etablir soigneusement le plan de distribution et d'identification des échantillons. 2) Préparer la solution de lavage R2 (cf chapitre 8). 3) Préparer la solution de conjugué (R6 + R7) (cf. chapitre 8). 4) Sortir de l'emballage protecteur le cadre support et le nombre de barrettes nécessaires (R1). Remettre les barrettes non utilisées dans l'emballage et refermer ce dernier. 5) Distribuer dans les cupules dans l'ordre suivant (plan de plaque conseillé) : Cupules A1, B1, C1 et D1 : 100 µl de contrôle négatif (R3) Cupule E1: 100 µl de contrôle positif (R4) Cupule F1:100 µl du premier échantillon à tester si cette cupule n'est pas utilisée comme cupule témoin pour la validation du dépôt des échantillons et du conjugué (optionnel) Cupules G1, H1,... etc: 100 µl d'échantillons à tester. En fonction du système utilisé, il est possible de modifier la position ou l ordre de distribution des témoins. NB : La distribution des échantillons peut être contrôlée à ce stade de la manipulation, en effet il y a une nette différence de coloration entre une cupule vide et une cupule contenant de l'échantillon (cf. paragraphe 14 pour la vérification automatique - VALIDATION SPECTROPHOTOMÉTRIQUE DU DÉPÔT DES ÉCHANTILLONS ET DU CONJUGUÉ) 6) Secouer la solution du conjugué avant utilisation. Homogénéiser.Distribuer rapidement 50 µl de la solution reconstituée de conjugué (R6 + R7) dans toutes les cupules. Homogénéiser le mélange réactionnel. NB : La distribution des échantillons peut aussi être contrôlée visuellement à ce stade de la manipulation, tout comme la distribution du conjugué peut également être contrôlée visuellement : après rajout du conjugué, les cupules contenant des échantillons se colorent en rouge. (cf. paragraphe 14 pour la vérification automatique - VALIDATION SPECTROPHOTOMÉTRIQUE DU DÉPÔT DES ÉCHANTILLONS ET DU CONJUGUÉ). 7) Lorsque cela est possible recouvrir d'un film adhésif et incuber pendant 1 heure et 30 ± 5 minutes à 37 ± 1 C. 8) Retirer le film adhésif, aspirer le contenu de chaque cupule et laver au moins 5 fois. Veillez à ce que le volume résiduel n'excède pas 10 µl (éventuellement, sécher la plaque par retournement sur une feuille de papier absorbant). 9) Distribuer rapidement dans toutes les cupules 100 µl de la solution de révélation de l'activité enzymatique (R8 + R9) préalablement préparée. Laisser la réaction se développer à l'obscurité pendant 30 ± 5 minutes à température ambiante (18 à 30 C). Lors de cette incubation, ne pas utiliser de film adhésif. N.B.: La distribution de la solution de révélation, qui est colorée en rose, peut être contrôlée visuellement à ce stade de manipulation : Il y a une différence de coloration significative entre une cupule vide et une cupule contenant la solution de révélation rosée. (se reporter au paragraphe 14 pour la vérification automatique VÉRIFICATION SPECTROPHOTOMÉTRIQUE DU DÉPÔT DES ÉCHANTILLONS ET DES RÉACTIFS) 19