JOSUÉ DO AMARAL RAMALHO

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Transcrição:

2 UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA - UFPB CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM DESENVOLVIMENTO E INOVAÇÃO TECNOLÓGICA EM MEDICAMENTOS LABORATÓRIO DE ENSAIOS TOXICOLOGICOS JOSUÉ DO AMARAL RAMALHO AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA E CRÔNICA DO EXTRATO ETANÓLICO BRUTO DA CASCA DA RAIZ DE DIOCLEA GRANDIFLORA MART. EX BENTH JOÃO PESSOA - PB 216

JOSUÉ DO AMARAL RAMALHO AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA E CRÔNICA DO EXTRATO ETANÓLICO BRUTO DA CASCA DA RAIZ DE DIOCLEA GRANDIFLORA MART. EX BENTH Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Desenvolvimento e Inovação Tecnológica em Medicamentos do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal da Paraíba, para obtenção do título de Doutor Desenvolvimento e Inovação Tecnológica em Medicamentos (Farmacologia-Toxicologia). Orientador: Prof. Dr. Isac Almeida de Medeiros Co-orientadora: Profª. Dra. Margareth de Fátima F. Melo Diniz JOÃO PESSOA - PB 216

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JOSUÉ DO AMARAL RAMALHO AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA E CRÔNICA DO EXTRATO ETANÓLICO BRUTO DA CASCA DA RAIZ DE DIOCLEA GRANDIFLORA MART. EX BENTH Tese aprovada em: de de 215. BANCA EXAMINADORA Prof. Dr. Isac Almeida de Medeiros Orientador Profª. Dra. Margareth de Fátima Formiga Melo Diniz Co-orientadora Prof. Dr. Reinaldo Nóbrega de Almeida Examinador Interno Profª. Dra. Liana Clébia de Morais Pondeus Examinadora Interna Profa. Dra. Carolina Uchôa Guerra Barbosa de Lima Examinadora Externa Profa. Dra. Lindomar de Farias Belém Examinadora Externa

3 A minha esposa Luciana, por todo amor, cumplicidade e dedicação e as minhas filhas Maria Eduarda, Letícia e Raquel. Dedico.

4 AGRADECIMENTOS À Deus pela força e amor demonstrado em minha vida. Aos meus pais, José Ramalho Sobrinho (in memorian) e Isa do Amaral Ramalho por terem acreditado em mim. Aos meus irmãos: Felipe Ramalho de Oliveira Neto (in memorian), pelas palavras: Estuda que o resto é consequência. Moises do Amaral Ramalho, por ser um homem trabalhador. As minhas cunhadas Sandra Ramalho Alves do Amaral e Silvia da Cruz Ramalho. Aos cunhados Rangel da Silva Nunes e Renato da Silva Nunes. As minhas sobrinhas Débora, Rebeca e Luana, ao meu único sobrinho Felipe Ramalho de Oliveira Bisneto (in memorian ). Aos meus sogros, Francisco da Silva Nunes e Terezinha da Silva Nunes, foram eles os principais incentivadores. Ao meu orientador Prof. Dr. Isac Almeida de Medeiros, pela confiança neste trabalho. À minha co-orientadora que é orientadora, Profª Dra. Margareth de Fátima Formiga Melo Diniz, pela admiração e confiança. À querida e batalhadora, Profª Dra. Caliandra Maria Bezerra Luna Lima por sempre me apoiar e cobrar. À minha amiga e bioquímica Kardilândia Oliveira, pelo apoio na construção dos exames laboratoriais. À minha amiga Edla Julinda, pela companhia nas horas de angústia e alegria. À Alexandre Rolim Paz, pelo grande auxílio nos exames histopatológicos.

5 Aos funcionários do Biotério/UFPB, José Crispim Duarte e Raimundo Nonato da Silva Filho, pelo importante papel na execução deste trabalho. Aos amigos Liane, Guilherme, Mateus, George, Igor, Ivana, Andressa e Fernanda pelas demonstrações de amizade e importante colaboração durante todo o estudo. Aos meus queridos e amados professores da graduação e momentos de aprendizado. pós-graduação, pelos bons Aos companheiros de pós-graduação, pelos bons momentos compartilhados. A todos que contribuíram de alguma forma para a construção desta importante etapa da minha vida.

6 Mas se desejarmos fortemente o melhor e, principalmente, lutarmos pelo melhor... O melhor vai se instalar em nossa vida. Porque sou do tamanho daquilo que vejo, e não do tamanho da minha altura. Carlos Drummond de Andrade

7 LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 - Rato Wistar... 38 Figura 2 - Analisador bioquímico automático Cobas Mira Plus - Roche... 39 Figura 3 - Aparelho de Rota-rod... 39 Figura 4 - Aparelho de campo aberto... 39

8 LISTA DE QUADROS Quadro 1 - Quadro 2 - Quadro 3 - Lista oficial das espécies cujos efeitos terapêuticos foram comprovados cientificamente, conforme a RDC nº17, de 24 de fevereiro de 2... 32 Período de observação Duração mínima dos estudos de toxicidade de Doses Repetidas... 35 Sistema de organização, Sendo caixas impares as fêmeas e caixas pares os machos... 42

9 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Consumo de água e ração de ratos, machos e fêmeas, tratados com a dose de 2 mg/kg do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex. Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade aguda,via oral. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=6). Teste t de Student.p,5... 45 Tabela 2 - Parâmetros bioquímicos obtidos do soro de ratos tratados com a dose de 2mg/kg do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex. Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade aguda. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=6). Teste t de Student.p,5... 47 Tabela 3 - Parâmetros hematológicos obtidos do soro de ratos tratados com a dose de 2 mg/kg do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora. Ex. Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade aguda. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=6). Teste t de Student.p,5... 5 Tabela 4 - Temperatura corporal (ºC) de ratos tratados com diferentes doses do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5... 52 Tabela 5 - Efeito da administração crônica de diferentes doses do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) sobre a glicemia dos animais. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p,5... 53 Tabela 6 - Consumo semanal de água por ratos Wistar durante os 9 dias de tratamento crônico com diferentes doses do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg). Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p,5... 56 Tabela 7 - Consumo semanal de ração durante os 9 dias do ensaio de toxicidade crônica com diferentes doses do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg). Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p,5... 64

1 Tabela 8 - Variação da evolução ponderal de ratos tratados com diferentes doses do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5... 73 Tabela 9 - Número de Ambulações no experimento de campo aberto, em ratos tratados com diferentes doses Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg). Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p,5... 79 Tabela 1 - Número de execuções de comportamento Rearing (levantar) no experimento de campo aberto, em ratos tratados com diferentes doses do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg). Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p,5... 8 Tabela 11 - Número de execuções de comportamento Grooming (limpeza) no experimento de campo aberto, em ratos tratados com diferentes do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg). Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p,5... 81 Tabela 12 - Número de bolos fecais no experimento de campo aberto, em ratos tratados com diferentes doses do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg). Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p,5... 82 Tabela 13 - Tempo de permanência (em segundos) na barra giratória do aparelho Rota rod, de ratos durante o tratamento crônico com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg). Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p,5... 83 Tabela 14 - Parâmetros bioquímicos obtidos do sangue de ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5... 86 Tabela 15 - Parâmetros hematológicos obtidos do sangue de ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg ) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5... 92

11 LISTA DE GRÁFICOS Gráfico 1 - Dosagem de Albumina no soro de ratos tratados com a dose de 2 mg/kg do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex. Benth (Fabaceae) (EEBCRDg), nos ensaios de toxicidade aguda. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=6). Teste t de Student.p,5... 48 Gráfico 2 - Gráfico 3 - Gráfico 4 - Gráfico 5 - Gráfico 6 - Gráfico 7 - Dosagem de Fosfatase Alcalina no soro de ratas tratadas com a dose de 2 mg/kg do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex. Benth (Fabaceae) (EEBCRDg), nos ensaios de toxicidade aguda. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=6). Teste t de Student.p,5... 48 Dosagem de Proteínas Totais no soro de ratas tratadas com a dose de 2 mg/kg do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex. Benth., nos ensaios de toxicidade aguda. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=6). Teste t de Student.p,5... 48 Dosagem de Globulina no soro de ratas tratadas com a dose de 2 mg/kg do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Ex. Benth., nos ensaios de toxicidade aguda. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=6). Teste t de Student.p,5... 49 Dosagem de Hemácias obtida do soro de ratas tratadas com a dose de 2mg/kg do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex. Benth (Fabaceae) (EEBCRDg )., nos ensaios de toxicidade aguda. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=6). Teste t de Student.p,5... 51 Temperatura de ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) na segunda temperatura durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5... 52 Temperatura de ratas Wistar tratadas com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) na segunda temperatura durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5... 53

12 Gráfico 8 - Gráfico 9 - Gráfico 1 - Gráfico 11 - Gráfico 12 - Gráfico 13 - Gráfico 14 - Gráfico 15 - Segunda Glicemia de ratos Wistar tratados com Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5... 54 Terceira Glicemia de ratos Wistar tratados com Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5... 54 Terceira Glicemia de ratas Wistar tratadas com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5... 54 Consumo de Água por ratos Wistar machos tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg). durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). Oneway ANOVA/ Tukey.p<,5... 58 Segunda semana do consumo de água por ratos Wistar tratados com Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5... 58 Terceira semana do consumo de água por ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5... 58 Quarta semana do consumo de água por ratos Wistar tratados com Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5... 59 Quinta semana do consumo de água por ratos Wistar tratados com Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5... 59

13 Gráfico 16 - Gráfico 17 - Gráfico 18 - Gráfico 19 - Gráfico 2 - Gráfico 21 - Gráfico 22 - Gráfico 23 - Sétima semana do consumo de água por ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5... 59 Oitava semana do consumo de água por ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5... 6 Décima primeira semana do consumo de água por ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5... 6 Consumo de Água por ratas Wistar fêmeas tratadas com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). Oneway ANOVA/ Tukey.p<,5... 6 Segunda semana do consumo de água por ratas Wistar tratadas com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5... 61 Sétima semana do consumo de água por ratas Wistar tratadas com Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5... 61 Oitava semana do consumo de água por ratas Wistar tratadas com Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5... 61 Nona semana do consumo de água por ratas Wistar tratadas com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5... 62

14 Gráfico 24 - Gráfico 25 - Gráfico 26 - Gráfico 27 - Gráfico 28 - Gráfico 29 - Gráfico 3 - Gráfico 31 - Décima semana do consumo de água por ratas Wistar tratadas com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5... 62 Décima primeira semana do consumo de água por ratas Wistar tratadas com Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5... 62 Décima segunda semana do consumo de água por ratas Wistar tratadas com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5... 63 Consumo de Ração por ratos Wistar machos tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). Oneway ANOVA/ Tukey.p<,5... 66 Terceira semana do consumo de ração por ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg). durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5... 66 Quarta semana do consumo de ração por ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5... 66 Quinta semana do consumo de ração por ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5... 67 Sexta semana do consumo de ração por ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5... 67

15 Gráfico 32 - Gráfico 33 - Gráfico 34 - Gráfico 35 - Gráfico 36 - Gráfico 37 - Gráfico 38 - Gráfico 39 - Setíma semana do consumo de ração por ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5... 67 Nona semana do consumo de ração por ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5... 66 Décima semana do consumo de ração por ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5... 68 Décima primeira semana do consumo de ração por ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5... 68 Décima segunda semana do consumo de ração por ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5... 69 Consumo de Ração de ratas Wistar fêmeas tratadas com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). Oneway ANOVA/ Tukey.p<,5... 69 Segunda semana do consumo de ração por ratas Wistar tratadas com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5... 69 Quinta semana do consumo de ração por ratas Wistar tratadas com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5... 7

16 Gráfico 4 - Gráfico 41 - Gráfico 42 - Gráfico 43 - Gráfico 44 - Gráfico 45 - Gráfico 46 - Gráfico 47 - Sétima semana do consumo de ração por ratas Wistar tratadas com Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5... 7 Oitava semana do consumo de ração por ratas Wistar tratadas com Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5... 7 Nona semana do consumo de ração por ratas Wistar tratadas com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5... 71 Décima primeira semana do consumo de ração por ratas Wistar tratadas com Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5... 71 Evolução ponderal de ratos Wistar tratados com Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5... 75 Quinta semana da evolução ponderal de ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5... 75 Sexta semana da evolução ponderal de ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5... 75 Setíma semana da evolução ponderal de ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5... 76

17 Gráfico 48 - Gráfico 49 - Gráfico 5 - Gráfico 51 - Gráfico 52 - Gráfico 53 - Décima primeira semana da evolução ponderal de ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5... 76 Décima segunda semana da evolução ponderal de ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5... 76 Evolução ponderal de ratas Wistar tratadas com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5... 77 Primeira semana da evolução ponderal de ratas Wistar tratadas com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5... 77 Primeira semana da evolução ponderal de ratas Wistar tratadas com Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5... 77 Primeira semana da evolução ponderal de ratas Wistar tratadas com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5... 78 Gráfico 54 - Número de execuções de comportamento Ambulação no experimento de campo aberto de ratos Wistar fêmeas tratados com Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg). Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p,5... 79 Gráfico 55 - Número de execuções de comportamento Rearing (levantar) no experimento de campo aberto de ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg). Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p,5... 8

18 Gráfico 56 - Gráfico 57 - Gráfico 58 - Gráfico 59 - Gráfico 6 - Gráfico 61 - Gráfico 62 - Número de execuções de comportamento Rearing (levantar) no experimento de campo aberto de ratas Wistar fêmeas tratadas com Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg). Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p,5... 81 Número de execuções de comportamento Grooming (limpeza) no experimento de campo aberto de ratas Wistar fêmeas tratadas com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg). Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p,5... 82 Número de execuções de comportamento Defecação no experimento de campo aberto de ratas Wistar fêmeas tratadas com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg). Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p,5... 83 Tempo de Permanência (em segundos) na barra giratória do Rota Rod de ratos Wistar tratados com Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5... 84 Tempo de Permanência (em segundos) na barra giratória do Rota Rod de ratas Wistar tratadas com Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5... 84 Dosagem de glicose em ratos Wistar tratados com diferentes doses Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg ) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Turkey, p<,5... 88 Dosagem de creatinina em ratos Wistar tratados com diferentes doses do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Turkey, p<,5... 88

19 Gráfico 63 - Gráfico 64 - Gráfico 65 - Gráfico 66 - Gráfico 67 - Gráfico 68 - Gráfico 69 - Dosagem de Aspartato Transaminase (AST) em ratos Wistar tratados com diferentes doses Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Turkey, p<,5... 88 Dosagem de Alanina Aminotransferase (ALT) em ratos Wistar tratados com diferentes doses Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Turkey, p<,5... 89 Dosagem de LDH em ratos Wistar tratados com diferentes doses do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Turkey, p<,5... 89 Dosagem de proteínas totais em ratos Wistar tratados com diferentes doses do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Turkey, p<,5... 89 Dosagem de albumina em ratos Wistar tratados com diferentes doses do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Turkey, p<,5... 9 Dosagem de globulina em ratos Wistar tratados com diferentes doses do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Turkey, p<,5... 9 Dosagem de proteínas totais em ratas Wistar tratadas com diferentes doses do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Turkey, p<,5... 9

2 Gráfico 7 - Gráfico 71 - Gráfico 72 - Gráfico 73 - Dosagem de globulinas em ratas Wistar tratadas com diferentes doses do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Turkey, p<,5... 91 Dosagem de hemácias obtidas do sangue de ratos tratados com diferentes doses Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=2). One-way ANOVA/ Turkey, p<,5... 94 Dosagem de hematócritos obtidos do sangue de ratos tratados com diferentes doses do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=4). One-way ANOVA/ Turkey, p<,5... 92 Dosagem de Volume Corpuscular Médio (VCM ) obtidos do sangue de ratos tratados com diferentes doses do extrato Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=4). One-way ANOVA/ Turkey, p<,5... 94 Gráfico 74 - Dosagem de CHCM obtidos do sangue de ratos tratados com diferentes doses do Extrato Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=4). One-way ANOVA/ Turkey, p<,5... 95 Gráfico 75 - Gráfico 76 - Dosagem de Leucócitos obtidos do sangue de ratos tratados com diferentes doses do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=4). One-way ANOVA/ Turkey, p<,5... 95 Dosagem de hemácias obtidas do sangue de ratas tratadas com diferentes doses do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=2). One-way ANOVA/ Turkey, p<,5... 95

21 Gráfico 77 - Gráfico 78 - Dosagem de Volume Corpuscular Médio (VCM) obtidos do sangue de ratas tratadas com diferentes doses do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg ) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=4). One-way ANOVA/ Turkey, p<,5... 96 Dosagem de HCM obtidos do sangue de ratas tratadas com diferentes doses do extrato Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=4). One-way ANOVA/ Turkey, p<,5... 96

22 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária AST - Aspartato Amino Transferase ALT - Alanina Amino Transferase CEME - Central de Medicamentos CK - Creatina Quinase CNS - Conselho Nacional de Saúde CPK - Creatina Fosfoquinase CHCM - Concentração da Hemoglobina Corpuscular Média EEBCRDg - Extrato Etanólico Bruto da casca da raiz de Dioclea grandiflora EDTA - Ácido Etilenodiamino Tetracético FAL - Fosfatase Alcalina HULW - Hospital Universitário Lauro Wanderley HCM - Hemoglobina Corpuscular Média IPeFarM - Instituto de Pesquisa em Fármacos e Medicamentos LDH - Lactato Desidrogenase LABETOX - Laboratório de Ensaios Toxicológicos MS - Ministério de Saúde NOEL - Dose sem observação de efeitos tóxicos NOAEL - Maior dose administrada num estudo de toxicidade na qual não se observa nenhum efeito adverso OMS - Organização Mundial de Saúde RDC - Resolução da Diretoria Colegiada SUS - Sistema Único de Saúde VCM - Volume Corpuscular Médio HCM - Hemoglobina corpuscular média CHCM - Concentração de Hemoglobina Corpuscular Média

23 RESUMO RAMALHO, Josué do Amaral. Avaliação da toxicidade aguda e crônica do extrato etanólico bruto da casca da raiz de Dioclea grandiflora Mart. ex Benth. 216. 11f. (Tese). Programa de Pós-graduação em Desenvolvimento e Inovação Tecnológica em Medicamentos -PPgDITM. Introdução: A Dioclea grandiflora, conhecida como Mucunã de caroço, atua sobre o Sistema Nervoso Central, doenças da próstata e pedras nos rins. Objetivo: Avaliação toxicológica não clínica aguda e crônica do extrato etanólico bruto da casca da raiz de Dioclea grandiflora, com base na Instrução Normativa nº4, de 18 de junho de 214 da Agencia Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Metodologia: Para ambas as metodologias foram utilizados ratos Wistar, ambos os sexos, com a administração do extrato etanólico bruto da casca da raiz de Dioclea grandiflora (EEBCRDg), via oral. Na toxicidade aguda, utilizou-se um grupo tratado com a dose 2 mg/kg e um grupo controle (veiculo). Após a administração, observou-se os parâmetros de comportamento por 3, 6, 9, 12, 18 e 24 minutos, consumo de ração e água diariamente, evolução ponderal semanal e parâmetros hematológicos e bioquímicos, após os 14 dias da administração da dose única. O número de sobreviventes contabilizados para determinar a DL5. Para a toxicidade crônica os animais foram tratados por via oral (v.o) com as doses de 1, 5 e 25 mg/kg do EEBCRDg e um grupo controle, durante 9 dias. Foram analisados o consumo de água e ração, temperatura, glicemia, evolução ponderal, testes comportamentais tais como, rota rod e campo aberto, parâmetros bioquímicos e hematológicos e anatomopatológicos. Resultados: Na toxicidade aguda houve aumento estatisticamente significativo no consumo de água e ração para ambos os sexos. Aumento da albumina dos machos, nas fêmeas reduziu a fosfatase alcalina, proteína total e globulinas. Diminuiu o número de hemácias nas fêmeas. Na toxicidade crônica houve aumento na temperatura dos machos e diminuição das fêmeas, diminuição da glicemia em ambos os sexos, diminuiu o consumo de água e ração nos machos, aumento e diminuição da água e ração nas fêmeas, aumento e diminuição da evolução ponderal para ambos os sexos, para o teste corportamental campo aberto, aumentou a ambulação nas fêmeas, aumentou o levantar em ambos os sexos, aumento da limpeza nas fêmeas, diminuiu a quantidade de bolos fecais nas fêmeas. Para os parâmetros bioquímicos houve diminuição da glicose e albumina, aumento da creatinina, AST, ALT, LDH, Proteínas totais, albumina e globulina para os machos, aumento nas proteínas totais e globulina nas fêmeas. Para os parâmetros hematológicos houve aumento das hemácias, hematócrito, leucócitos e diminuiu o VCM e CHCM nos machos, nas fêmeas aumentou hemácias, diminuiu VCM e HCM. Apresentando infiltrado inflamatório nos pulmões dos machos. Conclusão: De acordo com os resultados obtidos o EEBCRDg apresentou uma toxicidade considerável, sendo necessárias maiores investigações para atestar a segurança de seu uso. Palavras-chave: Dioclea grandiflora. Toxicidade. Anatomopatológico.

24 ABSTRACT RAMALHO, Josué do Amaral. Evaluation of acute and chronic toxicity of crude hydroalcoholic extract from the bark of Dioclea grandiflora mart root. ex benth. 216. 11f. (Tese). Programa de Pós-graduação em Desenvolvimento e Inovação Tecnológica em Medicamentos -PPgDITM. Introduction: Dioclea grandiflora, known as stone Mucunã, acts on the Central Nervous System, diseases of the prostate and kidney stones. Objective: Toxicology Assessment Acute and chronic nonclinical crude hydroalcoholic extract from the bark of Dioclea grandiflora, based on normative Statement 4, 18 June 214 national health surveillance agency (ANVISA). Methodology: For both methodologies were used Wistar rats, both sexes, with the administration of ethanolic extract of the root bark of Dioclea grandiflora (EEBCRDg), orally. On acute toxicity, a group treated with 2 mg/kg dose and a control group (forward). After administration, the parameters of behaviour for 3, 6, 9, 12, 18 and 24 minutes feed intake and water daily, weekly and haematological parameters by evolution and biochemists, after 14 days of administration of a single dose. The number of survivors recorded to determine the LD5. For chronic toxicity the animals were treated orally (v) with the doses of 1, 5 and 25 mg/kg of EEBCRDg and a control group, during 9 days. We analyzed the water and feed consumption, temperature, blood glucose, weight evolution, behavioural tests such as, rod and the open route, biochemical and Hematological and pathological. Results: In acute toxicity there was statistically significant increase in the consumption of water and feed for both sexes. Increased albumin of males, females reduced alkaline phosphatase, total protein and globulins. Decreased the number of red blood cells in females. In chronic toxicity an increase in temperature of males and females decreased, decreased blood glucose levels in both sexes, decreased water consumption and feed in males, increase and decrease of water and rations in females, increased and decreased by evolution for both sexes, for the corportamental open field test, increased the body postures when walking in females, increased the lift in both sexes, increased cleaning in females, decreased the amount of faecal cakes in females. For the biochemical parameters there was decrease of glucose and albumin, increased creatinine, AST, ALT, LDH, total protein, albumin and globulin for males, an increase in total protein and immunoglobulin in females. Haematological parameters increased red blood cells, hematocrit, leukocytes and decreased the VCM and MCHC in males, females increased, decreased red blood cells MCV and MCH. Showing inflammatory infiltrate in the lungs of males. Conclusion: According to the results of the EEBCRDg presented a considerable toxicity, and required further investigation to attest to the safety of its use. Keywords: Dioclea grandiflora. Toxicity. Pathology.

25 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO... 27 1.1 Considerações Gerais... 29 1.1.1 Resoluções... 29 1.1.2 Toxicidade... 33 2 OBJETIVOS... 36 2.1 Objetivo Geral... 36 2.2 Objetivos Específicos... 36 3 MATERIAIS E MÉTODOS... 37 3.1 Local da Pesquisa... 37 3.2 Materiais... 37 3.2.1 Material botânico... 37 3.2.2 Animais... 37 3.2.2.1 Ratos Wistar... 37 3.2.3 Aparelhagem... 38 3.3 Metodologia... 4 3.3.1 Ensaio toxicológico não clínico agudo... 4 3.3.1.1 Análise laboratorial do sangue... 4 3.3.1.1.1 Parâmetros hematológicos... 4 3.3.1.1.2 Parâmetros bioquímicos... 41 3.3.2 Ensaio toxicológico não clínico crônico... 41 3.3.2.1 Temperatura... 42 3.3.2.2 Glicemia... 42 3.3.3.3 Consumo de água e alimento e avaliação ponderal... 43 3.3.3.4 Avaliação comportamental (Teste do Campo Aberto) e Motora (Teste no Rota-rod)... 43 3.3.3.5 Avaliação laboratorial do sangue... 44 3.3.3.6 Exame anatomopatológico... 44 4 RESULTADOS... 45 4.1 Ensaio Toxicológico Não-Clínico Agudo... 45

26 4.1.1 Avaliação comportamental... 45 4.1.2 Evolução ponderal... 45 4.1.3 Consumo de água e alimentos... 45 4.1.4 Análise laboratorial do sangue... 46 4.1.4.1 Análise bioquímica... 46 4.1.4.2 Análise hematológica... 49 4.4 Ensaio Toxicológico Não-Clínico Crônico... 51 4.4.1 Temperatura... 51 4.4.2 Glicemia... 53 4.4.3 Consumo de água e ração... 55 4.4.4 Variação da evolução ponderal... 71 4.4.5 Avaliação comportamental... 78 4.4.5.1 Teste no campo aberto... 78 4.4.5.2 Teste no Rota Rod... 83 4.4.6 Análise laboratorial do sangue... 85 4.4.6.1 Parâmetros bioquímicos... 85 4.4.6.2 Parâmetros hematológicos... 91 4.4.7 Estudo anatomopatológico... 96 5 DISCUSSÃO... 98 6 CONCLUSÕES... 16 REFERÊNCIAS... 17

27 1 INTRODUÇÃO No Brasil, a mata atlântica é o terceiro maior bioma, depois da Amazônia e do Cerrado. Cobria originalmente uma área de 1.227.6 km2, correspondendo a cerca de 16% do território brasileiro, distribuída por 17 estados: Rio Grande do Sul, Santa Catarina, Paraná, São Paulo, Goiás, Mato Grosso do Sul, Rio de Janeiro, Minas Gerais, Espírito Santo, Bahia, Alagoas, Sergipe, Paraíba, Pernambuco, Rio Grande do Norte, Ceará e Piauí (Conservation International do Brasil 2) (FERREIRA, 214). Cerca de 82% da população brasileira utiliza produtos à base de plantas medicinais nos seus cuidados com a saúde, seja pelo conhecimento da medicina tradicional indígena, quilombola, entre outros povos e comunidades tradicionais, seja pelo uso popular, de indicação verbal entre gerações, ou nos sistemas oficiais de saúde (OMS 28). A Organização Mundial de Saúde (OMS), visando diminuir o número de excluídos dos sistemas governamentais de saúde, recomenda aos órgãos responsáveis pela saúde pública de cada país que: procedam a levantamentos regionais das plantas usadas na medicina popular tradicional e identifiquem-nas botanicamente; estimulem e recomendem o uso daquelas que tiverem comprovadas sua eficácia e segurança terapêutica; desaconselhem o emprego das práticas da medicina popular consideradas prejudiciais; desenvolvam programas que permitam cultivar e utilizar as plantas selecionadas na forma de preparações dotadas de eficácia, segurança e qualidade (OMS 28). As plantas medicinais correspondem às mais antigas armas empregadas pelo homem no tratamento de enfermidades de todos os tipos, ou seja, a utilização de plantas na prevenção e/ou na cura de doenças é um hábito que sempre existiu na história da humanidade (MORAES; SANTANA, 21). Sendo que o homem dependia fundamentalmente da natureza para sua sobrevivência. No decorrer da história da humanidade, vários povos desenvolveram conhecimentos acerca da cura, utilizando-se principalmente das plantas e recursos minerais. Todas as culturas sempre buscaram estratégias que lhes permitissem desenvolver seus próprios sistemas e técnicas de uso do mundo vegetal (ALBUQUERQUE 22; MOREIRA et al., 22). Entretanto, a total aceitação de drogas derivadas de plantas e a fitoterapia na medicina científica só poderão ocorrer se estes produtos cumprirem os mesmos critérios de eficácia, segurança e controle de qualidade que os produtos sintéticos (Rates, 21), ou seja, os produtos derivados de plantas devem ter eficácia avaliada e confirmada, assim como deve ser

28 garantida que sua administração a organismos vivos ocorra sem riscos para sua saúde (CAMURÇA-VASCONCELOS et al., 25). No Brasil as fases de um estudo toxicológico não-clínico estão bem definidas atualmente. Uma das normas que regulamentam este estudo é a Resolução RDC nº 26, de 13 de maio de 214, que dispõe sobre o registro de medicamentos fitoterápicos. Esta resolução determina que os ensaios de toxicologia não-clínica deverão seguir a Instrução Normativa n 4 de 18 de junho de 214 que preconiza seguir como parâmetros mínimos o Guia para a condução de estudos não clínicos de toxicologia e segurança farmacológica necessária ao desenvolvimento de medicamentos (BRASIL, 213e). O objeto do estudo foi avaliar a toxicidade não-clínica agudo e crônico do Extrato Etanólico da casca da raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg), por via oral, seguindo o Guia para a condução de estudos não clínicos de toxicologia e segurança farmacológica necessária ao desenvolvimento de medicamentos (BRASIL, 213e), conforme a IN 4/214 (ANVISA). A Dioclea grandiflora Mart. Ex. Benth (Fabaceae), popularmente conhecido como "mucuna", "mucuna -de- caroço" e "olho-de -boi", é uma planta trepadeira que cresce na caatinga e cerrado, regiões do Nordeste do Brasil. De acordo com a tradição popular, a casca das sementes desta planta e das raízes têm sido amplamente utilizada para tratar doenças da próstata e as pedras nos rins (LIMA, 1989). Estudos fitoquímicos mostraram a presença de várias substâncias na Dioclea grandiflora, tais como o flavanonas paraibanol, agrandol e diosalol (JENKINS et al., 1999), dioclein, dioflorin, diidroflavonol, dioclenol (BHATTACHARYYA et al., 1995, 1997, 1998), isolado a partir do clorofórmio (CHCI3) porção solúvel do extrato de casca da raiz desta planta. Investigações anteriores evidenciaram uma atividade significativa do SNC do extrato de etanolico obtido a partir da casca da raiz seca (BATISTA et al., 1995), e do extrato hidroalcoólico a partir das sementes de Dioclea grandiflora (ALMEIDA et al., 23). O seu principal constituinte, diocleina, tem um efeito analgésico significativo em roedores (BATISTA et al., 1995) e um efeito vaso relaxante no endotélio da aorta de rato (LEMOS et al., 1999). A triagem farmacológica também revelou a atividade antinoceptiva de dioclenol e dioflorin em camundongos (ALMEIDA et al., 2). Um estudo foi realizado com uma outra parte da planta, as vagens, e relatou uma atividade antinoceptiva eficaz em camundongos (SÁ et al., 21). Uma espécime registrada sob o número 444, e depositado no Herbário Lauro Pires Xavier da Universidade Federal da Paraíba (UFPB ).

29 Os testes toxicológicos não-clínicos foram desenvolvidos levando-se em consideração aquilo que preconiza a legislação brasileira de fitoterápicos. Os ensaios de toxicidade aguda foram realizados durante um período de 14 dias, via oral, utilizando-se ratos Wistar, submetidos a uma única dose de 2 mg/kg do extrato e foram avaliados parâmetros comportamentais, evolução ponderais, parâmetros hematológicos e bioquímicos. Os ensaios de toxicidade crônica foram realizados com ratos Wistar, em um período de 9 dias de exposição à substância avaliada. Foram utilizadas três diferentes doses: 1, 5 e 25 mg/kg e os animais foram avaliados sob diferentes aspectos como: consumo de água e ração, evolução ponderal, temperatura corporal, avaliação glicêmica, testes comportamentais, tais como: rota Rod e campo aberto, parâmetros bioquímicos, parâmetros hematológicos e anatomopatológicos. 1.1 Considerações Gerais 1.1.1 Resoluções A publicação da primeira edição da Farmacopéia Brasileira, em 1929, foi o primeiro ato normativo e o mais expressivo e importante com referência a plantas medicinais no Brasil. Foi elaborada por Rodolfo Albino durante doze anos e contemplava mais de 28 espécies botânicas brasileiras e estrangeiras contendo as monografias a serem utilizadas como referência nos aspectos de controle de qualidade na preparação de medicamentos (MARQUES, 23). No Brasil, as normas que regiam os ensaios toxicológicos de novos produtos, constantes da Resolução Normativa nº 1/78 da Câmara Técnica de Medicamentos do Conselho Nacional de Saúde, contém informações de caráter geral sobre os testes a serem realizados (CONSELHO NACIONAL DE SAÚDE, 1978), não especificando, porém, como realizá-los e interpretá-los convenientemente. Em 1983, O Programa de Pesquisa de Plantas Medicinais (PPPM) foi estabelecido pela Central de Medicamentos-CEME, órgão do MS criado pelo Decreto nº 68.86, de 25 de junho de 1971, responsável pela distribuição de medicamentos. O PPPM foi estruturado com o objetivo de promover a pesquisa científica das propriedades terapêuticas potenciais das espécies vegetais utilizadas pela população, mirando o futuro desenvolvimento de medicamentos ou preparações que sirvam de suporte para o estabelecimento de uma

3 terapêutica alternativa, considerando, inclusive, sua integração ao Relatório Nacional de Medicamentos Essenciais-RENAME Naquela ocasião foram selecionadas 74 espécies para o desenvolvimento de estudos, entre elas, 17 nativas. O PPPM possibilitou o desenvolvimento de pesquisas que levaram à comprovação da eficácia terapêutica de Espinheira santa Maytenus ilicifolia (SANT ANA; ASSAD, 24). Em 1983 a CEME constituiu a Comissão de Ensaios Pré-clínicos e Clínicos, através da portaria nº 14 de 29/12/82 (CEME, 1983b), destinada a elaborar protocolo detalhado de pesquisa integrada, baseada no conjunto de plantas definido pela Comissão de Seleção de Plantas. Este protocolo conteve especificação a nível de bateria de testes a ser executada por classe terapêutica do elenco de plantas, selecionado para estudo sistemático e completo. Em 1988 a Resolução nº 1/88 do Conselho Nacional de Saúde (CONSELHO NACIONAL DE SAÚDE, 1988), aprovou Normas de Pesquisas em Saúde. Nesta resolução, define-se por pesquisa farmacológica as atividades científicas de estudos de medicamentos e produtos biológicos para uso em seres humanos, a respeito dos quais não se tenha experiência prévia no país, que não tenham sido registrados pelo Ministério da Saúde e, portanto, não sejam distribuídos em forma comercial, bem como os medicamentos registrados e aprovados para venda, quando se pesquisa seu uso com modalidades, indicações, doses ou vias de administração diferentes daquelas estabelecidas, incluindo seu emprego em combinações. A Resolução nº 1/88 ainda define as exigências da pesquisa pré-clínica e as fases para pesquisa clínica (fases I, II, III, IV) que somente deveria ser iniciada mediante expressa autorização do Comitê de Ética da instituição de atenção à saúde, devidamente credenciado pelo Conselho Nacional de Saúde. A extinção da CEME em 1997, sem dúvida, representou uma perda para os estudos e pesquisas sobre plantas medicinais no país (SANT ANA; ASSAD, 24). No início de 1995, foi publicada a Portaria nº 6 da ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária, de 31 de janeiro de 1995, onde foram apresentadas as principais exigências para a concessão do Registro do produto fitoterápico tais como: A) Apresentar estudos científicos que comprovem a segurança e a eficácia terapêutica do produto fitoterápico, de acordo com as exigências estipuladas na Resolução 1/88 do Conselho Nacional de Saúde- CNS: - Toxicologia pré-clínica. - Toxicologia clínica.

31 B) Apresentar estudos científicos que comprovem a eficácia do produto fitoterápico de acordo com as exigências estipuladas na Resolução 1/88 do CNS: - Farmacologia pré-clínica. - Farmacologia clínica, estabelecendo a relação dose/ atividade. - Definir o conjunto de indicações terapêuticas, adequadamente nominadas. - Apresentar as contra-indicações, registro de uso, efeitos colaterais e reações adversas, para cada forma farmacêutica. Esta Portaria exigiu a revalidação do registro dos produtos fitoterápicos já comercializados, dando prazos para apresentação dos estudos de toxicidade (5 anos) e de comprovação da eficácia (1 anos). Ainda relacionada a Portaria nº6 da ANVISA, de 31 de janeiro de 1995, é divulgada a Portaria nº 116, de 8 de agosto de 1996 emitida pela Secretaria de Vigilância Sanitária Ministério da Saúde (SVS/MS), que publicou as Propostas de Normas para estudo da Toxicidade e da Eficácia de Produtos Fitoterápicos. Neste mesmo ano, o Conselho Nacional de Saúde aprovou a Resolução nº 196/96 que fundamentava-se nos principais documentos internacionais que emanaram declarações e diretrizes sobre pesquisas que envolvem seres humanos. Esta resolução incorpora, sob a ótica do indivíduo e das coletividades, os quatro referenciais básicos da bioética: autonomia, não maleficência, beneficência e justiça, visando assegurar os direitos e deveres que dizem respeito à comunidade científica, aos sujeitos da pesquisa e ao Estado (CONSELHO NACIONAL DE SAÚDE, 1996). A Resolução nº 251 do Conselho Nacional de Saúde, de 7 de agosto de 1997 aprova as normas de pesquisa envolvendo seres humanos para a área temática de pesquisa com novos fármacos, medicamentos, vacinas e testes diagnósticos e incorpora todas as disposições contidas na Resolução 196/96. A Portaria nº 6/MS/SNVS, de 31 de janeiro de 1995 foi revogada pela Resolução da Diretoria Colegiada- RDC nº 17, de 24 de fevereiro de 2, que dispõe sobre o registro de medicamento fitoterápico. Esta Resolução incorpora as definições de medicamento fitoterápico novo, tradicional e similar. A RDC nº17, de 24 de fevereiro de 2 apresenta a Relação Oficial de 13 espécies cujos efeitos terapêuticos foram comprovados cientificamente, apresentada no quadro 1.

32 Quadro 1 - Lista oficial das espécies cujos efeitos terapêuticos foram comprovados cientificamente, conforme a RDC nº17, de 24 de fevereiro de 2 NOME CIENTÍFICO NOME POPULAR Cynara scolymus L. Allium sativum L. Aloe vera L. Pneumus boldus Molina Calendula officinalis L Matricaria recutita,l. Symphytum officinale L Pimpinella anisum L Zingiber officinale Roscoe Mentha piperita L Melissa officinalis L. Passiflora incarnata L. Senna Alexandria Mill Alcachofra Alho Babosa Boldo-do Chile Calêndula Camomila Confrei Erva-doce Gengibre Hortelã-pimenta Melissa Maracujá Sene Na RDC nº17 foi determinado que os medicamentos registrados até 31/1/95, apresentassem até 31/1/21 os estudos sobre toxicologia do medicamento fitoterápico de acordo com esta resolução. A Resolução RDC nº 48, de 16 de março de 24, que dispõe sobre o registro de medicamentos fitoterápico, revogou a RDC nº 17 de 25 de fevereiro de 2. Esta resolução define fitoterápico como Medicamento obtido empregando-se exclusivamente matériasprimas ativas vegetais. É caracterizado pelo conhecimento da eficácia e dos riscos de seu uso, assim como pela reprodutibilidade e constância de sua qualidade. Sua eficácia e segurança é validada através de levantamento etnofarmacológicos de utilização, documentações tecnocientíficas em publicações ou ensaios clínicos fase 3. Não se considera medicamento fitoterápico aquele que, na sua composição, inclua substância ativas isoladas, de qualquer origem, nem as associações destas com extratos vegetais. Ainda determinou que um dos critérios para a avaliação da segurança de uso e indicações terapêuticas é a apresentação da comprovação de segurança de uso (Toxicologia pré-clínica, Toxicologia clínica) e de eficácia terapêutica (Farmacologia pré-clínica, Farmacologia clínica) do medicamento. Os ensaios clínicos deverão atender ás exigências estipuladas pelo Conselho Nacional de Saúde-CNS através das Resoluções 196/96 e 251/97. Os ensaios de toxicologia pré-clinica deverão utilizar como parâmetros mínimos o GUIA PARA A REALIZAÇÃO DE ESTUDOS DE

33 TOXICIDADE PRÉ-CLÍNICA DE FITOTERÁPICOS, que é normatizado pela Resolução RE nº9, de 16 de março de 24. A portaria nº 971 de 3 de maio de 26 do Ministério da Saúde, aprova a Política Nacional de Práticas Integrativas e Complementares (PNPIC) no Sistema Único de Saúde. Esta portaria define a fitoterapia como terapêutica caracterizada pelo uso de plantas medicinais em suas diferentes formas farmacêuticas, sem a utilização de substâncias ativas isoladas, ainda que de origem vegetal. Tem como objetivos incorporar e implementar as Práticas Integrativas e Complementares no SUS, na perspectiva da prevenção de agravos e da promoção e recuperação da saúde, com ênfase na atenção básica, voltada para o cuidado continuado, humanizado e integral em saúde; Contribuir para a ampliação do acesso às Práticas Integrativas e Complementares, garantindo qualidade, eficácia e segurança no uso; Promover a racionalização das ações de saúde. Apresenta como uma das suas diretrizes a elaboração da Relação Nacional de Plantas Medicinais e da Relação Nacional de Fitoterápicos; Promoção do uso racional de plantas medicinais e dos fitoterápicos no SUS; Cumprimento dos critérios de qualidade, eficácia, eficiência e segurança de uso. O decreto nº 5.813 de 22 de junho de 26 aprova a Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos, e tem como objetivo garantir à população brasileira o acesso seguro e o uso racional de plantas medicinais e fitoterápicos, promovendo o uso sustentável da biodiversidade, o desenvolvimento da cadeia produtiva e da indústria nacional. As normas atuais, embora aprimoradas em muitos aspectos, não vêm sendo aplicadas em sua totalidade visto que ainda são comercializados medicamentos sem registro ou apenas com protocolo, com informações incompletas e sem embasamento científico (VIRGILIO, 24). Para tanto a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), estabelece como diretriz para estudos de eficácia e segurança o Guia para a condução de estudos não clínicos de toxicidade e segurança farmacológica necessária ao desenvolvimento de medicamentos que é regulamentada pela RDC nº 26/214 e IN 4/214. 1.1.2 Toxicidade A Toxicologia, observada sobre o âmbito da ciência moderna, é uma ciência multidisciplinar que, além de estudar os efeitos adversos ocasionados por agentes químicos no

34 homem e no meio ambiente, estuda também as propriedades físico-químicas de cada substância avaliando a segurança de seu uso (ADEBAL, 21). Partindo do princípio e considerando que toda e qualquer substância pode ser um agente tóxico, dependendo da forma e condições de exposição, como a dose administrada ou absorvida, tempo e freqüência de exposição e via pela qual é administrada. Dessa forma, fazse necessário conhecer as condições de uso seguro dos medicamentos para a saúde humana. Vários modelos para estudos experimentais têm sido desenvolvidos objetivando melhor conhecer as ações tóxicas e uma previsão mais exata de seus efeitos terapêuticos, sejam eles benéficos ou prejudiciais ao usuário. Os efeitos prejudiciais ao organismo, conhecidos como efeitos tóxicos, são objetos de estudo da Toxicologia. Atualmente, essa ciência trabalha, cada vez mais, dentro de um princípio que consiste em conhecer os riscos da exposição humana a diversos produtos e substâncias químicas para estabelecer condições seguras de exposição a estes agentes (BARROS; DAVINO, 23). Os estudos de toxicidade aguda são aqueles utilizados para avaliar a toxicidade produzida por uma substância teste, quando, esta é administrada em uma ou mais doses durante um período não superior a 24 horas (Brasil, 213e). Após a administração da droga são avaliados o estado geral e possíveis alterações sobre os sistemas: nervoso central, autônomo e locomotor. O consumo de água e ração são avaliados diariamente a evolução ponderal semanalmente por um período de 14 dias. Ao final deste período, os animais são sacrificados para análises bioquímicas e hematológicas (BRITO, 1994; CARVALHO, 26). Os estudos de toxicidade de doses repetidas têm como objetivo, caracterizar o perfil toxicológico da substância pela administração repetida. A partir deles é possível a obtenção de informações sobre os efeitos tóxicos, identificação de órgãos alvos, efeitos na fisiologia do animal, hematológicas, bioquímicas, anátomo e histopatológicas, além de informações sobre a indicação do NOEL, dose sem observação de efeitos toxicos e NOAEL, maior dose administrada num estudo de toxicidade na qual não se observa nenhum efeito adverso (BRASIL, 213e). Sendo realizados utilizando pelo menos duas espécies animais, sendo uma roedora e outra não-roedora, por exemplo o coelho. O período de administração do produto nos animais segue relação com o período proposto para utilização terapêutica de acordo com o quadro 2.

35 Quadro 2 - Período de observação Duração mínima dos estudos de toxicidade de Doses Repetidas São utilizadas no mínimo três doses (a dose que produza efeito terapêutico, a menor dose que produza um efeito adverso detectável e uma dose intermediária). Nesse estudo os animais devem ser tratados diariamente sem qualquer interrupção e, durante esse período, são observados parâmetros como: alterações comportamentais, evolução ponderal, consumo de água e ração, glicemia, temperatura. Ao final do tratamento, o sangue é retirado para análises hematológicas e bioquímicas. Os animais são eutanasiados e seus órgãos retirados e enviados para análise histopatológica (BRITO, 1994; CARVALHO, 26). Os animais tratados foram mortos por tração cervical, e o sangue coletado através de sangria do plexo braquial, de todos os animais, machos e fêmeas. Respeitando as medidas para diminuir dor, estresse ou outro sofrimento dos animais assim como os tempos limites de exposição do animal aos estímulos dos testes, a fim de evitar lesão tecidual como recomendado pela comunidade científica.

36 2 OBJETIVOS 2.1 Objetivo Geral Realizar um estudo toxicológico não clínico, agudo e crônico, com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora, de acordo com a Instrução normativa número 4 de 214 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária. 2.2 Objetivos Específicos Avaliar a toxicidade aguda com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz Dioclea grandiflora utilizando ratos Wistar através da observação de parâmetros comportamentais, ponderais, hematológicos e bioquímicos; Avaliar a toxicidade crônica com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz Dioclea grandiflora utilizando ratos Wistar através da observação de parâmetros comportamentais, ponderais, temperatura, glicemia, hematológicos, bioquímicos e anatomopatológicos.

37 3 MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 Local da pesquisa As atividades de pesquisa não clínica foram realizadas no Laboratório de Ensaios Toxicológicos (LABETOX) e no Biotério Prof. Dr. Thomas George do Instituto de Pesquisa em Fármacos e Medicamentos-IPeFarM-UFPB. Outras atividades foram realizadas nos laboratórios de análises clínicas e patologia clínica do Hospital Universitário Lauro Wanderley da UFPB. 3.2 Materiais 3.2.1 Material botânico O Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz Dioclea grandiflora foi preparado no Laboratório de Química de Produtos Naturais do Instituto de Pesquisa em Fármacos e Medicamentos (IPeFarM-UFPB). Após a coleta do material, as cascas foram submetidas a um processo de extração utilizando o aparelho de Soxhlet, por um período de 24 horas, sendo o solvente extrator uma solução de etanol a 95% e concentrados em evaporador rotatório em uma temperatura de 6 ºC. 3.2.2 Animais 3.2.2.1 Ratos Wistar Durante os ensaios, foram utilizados ratos Wistar (Ratus novergicus), albinos, adultos, machos e fêmeas (nulíparas e não grávidas), pesando entre 18 e 22 gramas, fornecidos pelo biotério Prof. Thomas George do Instituto de Pesquisa em Fármacos e Medicamentos (IPeFarM-UFPB). Os animais foram agrupados em gaiolas de polietileno, mantidos sob condições controladas de temperatura de 25 2 o C, sem uso de qualquer medicamento, tendo livre acesso à comida (tipo pellets de ração da marca Purina ) e água potável disponível em garrafas graduadas de polietileno, colocadas nas grades metálicas das

38 gaiolas na sua parte superior. Os animais foram mantidos em ciclo claro-escuro de doze horas. Projeto aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal sob número 44/21. Figura 1 - Rato Wistar 3.2.3 Aparelhagem Analisador bioquímico automático Cobas Mira Plus - Roche Diagnostic System - para determinações bioquímicas no soro; Analisador de íons seletivos, Iselab, para determinações dos íons sódio, potássio e cálcio; Analisador hematológico celular automático Cobas Argos 5 - Roche Diagnostic System - para obtenção de hemograma e dosagem de plaquetas. Os esfregaços sanguíneos foram corados automaticamente no HEMATEL 2 e analisados em microscópio Olympus, para confirmação e controle da contagem de células; Balança analítica marca AID HR 12g Japão; Balança eletrônica BG 8 GEHAKA ; Centrífuga BIO ENG BE 4, para separação do soro em dez minutos, a 35 rpm; Glicosímetro ACCU-CHEK performa : monitor de glicemia com fitas reativas; Microscópio RML5 Askmania-Germany, utilizado nas análises histopatológicas; Termômetro digital, modelo MC 3BC, OMRON/China; Aparelho do Rota-rod para a avaliação da capacidade motora dos animais; Aparelho do campo aberto (Open Field).

39 Figura 2 - Analisador bioquímico automático Cobas Mira Plus - Roche Figura 3 - Aparelho de Rota-rod Figura 4 - Aparelho de campo aberto

4 3.3 Metodologia 3.3.1 Ensaio toxicológico não clínico agudo Os ratos Wistar selecionados foram divididos em dois grupos: grupo controle e grupo tratado. Cada grupo era formado por 12 animais, sendo 6 machos e 6 fêmeas. O grupo controle foi distribuído em duas caixas separando os animais por sexo, e a estes animais foi administrado o veículo de diluição do extrato (a água). Os grupos que foram tratados estavam distribuídos igualmente e foram submetidos a uma única dose de 2 mg/kg do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) por via oral (gavagem). Após a administração do EEBCRDg, foi realizada a observação de parâmetros comportamentais através da triagem farmacológica para se detectar sinais de atividade no Sistema Nervoso Central nos intervalos: 3, 6, 9, 12, 18 e 24 minutos. Segundo protocolo experimental elaborado pelo Setor de Psicofarmacologia do Instituto Pesquisa em Fármacos e Medicamentos (IPeFarM-UFPB) e descrito por Almeida et al (1999). Diariamente, foi avaliado o consumo de água e ração consumida, enquanto que a evolução ponderal foi verificada semanalmente dos animais, em ambos os sexos, desde a 24ª hora e até 14 dias após a administração da dose única. Após o 14º dia, os animais foram eutanasiados por tração cervical, sendo retirado o sangue para análise laboratorial de parâmetros hematológicos e bioquímicos. 3.3.1.1 Análise laboratorial do sangue A coleta das amostras foi realizada através de sangria do plexo braquial, e o sangue foi coletado em tubos com o anticoagulante ácido etilenodiamino tetracético (EDTA), para a determinação dos parâmetros hematológicos, e em tubos com gel separador - Microtainer Becton Dickson - para a obtenção do soro e posterior determinação dos parâmetros bioquímicos. 3.3.1.1.1 Parâmetros hematológicos As análises hematológicas constaram de estudos das séries vermelha (eritrograma),

41 branca (leucograma) e contagem de plaquetas. No eritrograma foi realizada a contagem de hemácias, determinação do hematócrito, da hemoglobina, do volume corpuscular médio (VCM), da hemoglobina corpuscular média (HCM), e da concentração da hemoglobina corpuscular média (CHCM). No leucograma realizou-se a contagem global dos leucócitos e da diferenciação celular. Estas determinações foram realizadas no analisador celular COBAS ARGOS 5-ROCHE. Os esfregaços sanguíneos foram corados automaticamente no HEMATEL 2 e analisados em MICROSCÓPIO Olympus, para confirmação e controle da contagem de células. 3.3.1.1.2 Parâmetros bioquímicos As análises bioquímicas foram realizadas em amostras de soro utilizando analisador bioquímico automatizado COBAS MIRA PLUS- ROCHE. Foram determinadas as dosagens da glicose, uréia, colesterol total, triglicerídios, ácido úrico, creatinina, transaminases: Aspartato Amino Transferase (AST) e Alanina Amino Transferase (ALT), fosfatase alcalina, proteínas totais e frações, lactato-desidrogenase (LDH), amilase e creatina quinase. 3.3.2 Ensaio toxicológico não clínico crônico No ensaio crônico, a substância é administrada diariamente, em diferentes doses a vários grupos de animais por um período de 9 dias (BRITO, 1994). Os parâmetros a serem avaliados foram orientados conforme Guia de orientação para registro de medicamento fitoterápico e registro e notificação de produto tradicional fitoterápico da ANVISA. Animais pré-selecionados foram distribuídos em 4 grupos contendo 2 animais por grupo (1 machos e 1 fêmeas). Os animais foram distribuídos em gaiolas separados por sexo, permanecendo 5 animais por gaiola totalizando 16 gaiolas durante o ensaio crônico. Os grupos foram distribuídos da seguinte maneira conforme quadro 3: Grupo controle, caixas de 1 a 4, que foi tratado diariamente com água, veículo utilizado na dissolução do EEBCRDg. Três grupos foram tratados diariamente durante 9 dias, no turno da manhã, por via oral (gavagem) da seguinte forma: caixas de 5 a 8 com a dose de 1 mg/kg;

42 caixas de 9 a 12 com a dose de 5 mg/kg, e caixas de 13 a 16 com a dose de 25 mg/kg do EEBCRDg. Quadro 3 - Sistema de organização, Sendo caixas impares as fêmeas e caixas pares os machos Caixa 1 Caixa 2 Caixa 3 Caixa 4 Caixa 5 Caixa 6 Caixa 7 Caixa 8 Caixa 9 Caixa 1 Caixa 11 Caixa 12 Caixa 13 Caixa 14 Caixa 15 Caixa 16 Os efeitos da administração prolongada do EEBCRDg foram avaliados sobre parâmetros como: temperatura, glicemia, consumo de água e alimentos, evolução ponderal, atividade exploratória e motora dos animais, parâmetros hematológicos, bioquímicos, e ainda foram realizados exames histopatológicos de órgão dos animais. Os resultados foram comparados com os dados obtidos no grupo controle e com dados da literatura. 3.3.2.1 Temperatura A temperatura corporal foi medida utilizando-se um termômetro digital modelo MC 3BC ORON/China, cujo termosensor foi lubrificado com vaselina líquida e introduzido 5 cm pelo reto (atingindo o cólon). Este parâmetro foi avaliado uma vez por mês em todos os animais, durante os 9 dias de tratamento. 3.3.2.2 Glicemia Os níveis glicêmicos dos animais foram avaliados uma vez por mês durante os 9 dias do ensaio crônico da seguinte forma: os ratos eram imobilizados em contensores plásticos e uma gota de sangue era coletada da veia caudal e analisada em fita reativa para dosagem de glicemia. A leitura foi efetivada em monitor de glicemia ACCU-CHEK performa Marca Roche, sendo observado jejum prévio de 12 horas.

43 3.3.3.3 Consumo de água e alimento e avaliação ponderal Neste experimento avaliou-se o consumo de água e de ração pelos animais, em ambos os sexos, nos 9 dias de tratamento. Diariamente, eram colocados 25g de ração e mamadeiras graduadas contendo 5 ml de água nas gaiolas e, no dia seguinte, sempre pela manhã, o volume de água ingerido pelos animais era registrado e contabilizado o peso consumido de ração. A pesagem dos animais foi realizada semanalmente para ajuste da dose testada. 3.3.3.4 Avaliação comportamental (Teste do Campo Aberto) e Motora (Teste no Rota-rod) Na avaliação comportamental foi utilizado o aparelho de campo aberto, seguindo o descrito por Carlini et al.,(1986) para analisar a atividade exploratória dos animais através: Da movimentação espontânea (ambulação), registrada pelo número de cruzamentos, com as quatro patas, entre as divisões do campo; Da quantificação dos comportamentos de auto limpeza, de levantar e a defecação (número de bolos fecais). Este teste foi realizado quinzenalmente, uma hora após a administração do extrato, com animais tratados e animais controle que foram expostos (durante 3 minutos para cada animal) ao aparelho para a observação dos parâmetros acima descritos (MANSUR et al., 1971). Também, quinzenalmente, uma hora após administração do EEBCRDg, os animais do grupo controle e tratado foram colocados na barra giratória do aparelho Rota-rod, com velocidade constante de 9, rpm, e registrado o tempo de permanência dos mesmos, com até três reconduções no aparelho. Deve-se levar em consideração que cada teste foi realizado com metade do grupo, ou seja, 1 animais por dose (5 machos e 5 fêmeas) e que antes de iniciar o experimento crônico com a administração do EEBCRDg, os animais foram selecionados de acordo com o peso corporal aproximadamente 2g, e foram submetidos ao aparelho de rota-rod com a finalidade de observar aqueles que estivessem aptos a participarem dos testes.

44 3.3.3.5 Avaliação laboratorial do sangue Após o término do experimento para avaliação da toxicidade crônica, foram coletadas amostras de sangue, através de sangria do plexo braquial, dos animais, machos e fêmeas, dos grupos tratados com EEBCRDg (doses 1; 5 e 25 mg/kg/dia) e do grupo controle. O sangue foi coletado em tubos contendo anticoagulante EDTA para avaliação dos parâmetros hematológicos (hemograma e contagem das plaquetas) e em tubos contendo gel separador, que foram centrifugados por 1 minutos a 35 rpm, para obtenção do soro, destinado a análises bioquímicas de glicose, uréia, creatinina, transaminases AST e ALT, colesterol, triglicerídios, ácido úrico, fosfatase alcalina, proteínas totais e frações, cálcio e magnésio, sendo observado um jejum de 12 horas antes da coleta de sangue. 3.3.3.6 Exame anatomopatológico Animais do ensaio crônico foram sacrificados por tração cervical e tiveram suas vísceras coletadas e examinadas macroscopicamente. O cérebro, coração, fígado e rins foram seccionados por incisão sagital e os pulmões, submetidos à perfusão via traquéia, com solução de formol a 1%. Após 12 horas de fixação, foram obtidas as amostras necessárias para processamento histopatológico, empregando-se técnica de inclusão em parafina e coloração em hematoxilina-eosina, para análíse morfológica.

45 4 RESULTADOS 4.1 Ensaio Toxicológico Não-Clínico Agudo 4.1.1 Avaliação comportamental Na avaliação da triagem comportamental após a administração do EEBCRDg, por v.o., na dose de 2 mg/kg, não foi evidenciada nenhuma alteração no comportamento dos animais nos intervalos: 3, 6, 9, 12, 18 e 24 minutos. 4.1.2 Evolução ponderal A administração aguda do EEBCRDg de Dioclea grandiflora na dose 2 mg/kg, não foi observado variação estaticamente significativa no peso dos animais. 4.1.3 Consumo de água e alimentos Os resultados, mostrados na Tabela 1, demonstram aumento estatisticamente significativo no consumo de água e ração de machos e fêmeas tratados com a dose de 2 mg/kg do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex. Benth (EEBCRDg), durante 14 dias. Tabela 1 - Consumo de água e ração de ratos, machos e fêmeas, tratados com a dose de 2 mg/kg do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex. Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade aguda,via oral. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=6). Teste t de Student.p,5 GRUPO CONSUMO DE ÁGUA (ml) Machos CONSUMO DE RAÇÃO (g) Controle 236,7 6,43 152,4 2,51 2 mg/kg 267,5 8,72 177,6 4,15 CONSUMO DE ÁGUA Fêmeas CONSUMO DE RAÇÃO Controle 16,4 5,85 95,98 3,2 2 mg/kg 21,3 8,55 113,1 2,42

46 4.1.4 Análise laboratorial do sangue 4.1.4.1 Análise bioquímica Após quatorze dias da administração da dose de 2 mg/kg v.o. do EEBCRDg, alguns parâmetros bioquímicos analisados demonstraram alterações estatisticamente significativas em ambos os sexos. Nos machos foi verificado um aumento na dosagem de albumina (Gráfico 1). Assim como uma diminuição nas dosagem de fosfatase alcalina (Gráfico 2), proteínas totais (Gráfico 3) e globulina (Gráfico 4) das fêmeas. Os resultados estão mostrados na tabela 2, a seguir.

47 Tabela 2 - Parâmetros bioquímicos obtidos do soro de ratos tratados com a dose de 2mg/kg do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex. Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade aguda. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=6). Teste t de Student.p,5. Grupos Glicose (mg/dl) Uréia (mg/dl) Creatinina (mg/dl) Colesterol (mg/dl) Triglicerídeos (mg/dl) Machos ÁcidoÚrico (mg/dl) AST (U/l) ALT (U/l) Fosfatase Alcalina (U/l) Controle 19,8 5,23 43,4 3,36,56,3 55,8 3,51 138,6 13,94 1,4,7 31,8 2,14 93, 4,3 212,8 17,74 2 mg/kg 124,7 12,81 44, 1,,,57,3 69, 5,69 18, 19, 1,7,37 157, 15, 75,67 13,57 169,3 29,1 Controle 118,7 6,24 51,5 3,5,62,2 52,17 3,8 112, 4, 1,27,22 268,2 41,21 77,83 8,82 198,5 18,81 2 mg/kg 121,2 8,5 47,5 2,5,57,6 63,33 4,7 96,83 15,2 1,28,25 183, 48,18 74,5 7,2 99,97 16,2 Grupos Ca +2 (g/dl) Magnésio (g/dl) LDH (U/l) Amilase (U/dL) Proteínas totais (g/dl) Albumina(g/dL) Globulina (g/dl) Fêmeas Machos Controle 11,26,7 1,96,7 3617 344,8 653,2 14,92 7,22,13 3,2,8 4,2,9 2 mg/kg 12,3,8 1,99,9 2815 46,5 695,7 9,82 7,63,59 3,6,8 4,7,5 Fêmeas Controle 12,77,32 1,93,1 3139 555,5 396,2 9,78 7,85,9 3,57,7 4,28,14 2 mg/kg 13,67,42 2,4,15 2182 419,1 371,8 25,4 6,85,24 3,75,9 3,27,27

P r o te in a s T o ta is (g /d L ) Fosf. A lcalina (U /L ) A lbum ina (g /dl) 48 A lb u m in a M a c h o 4 3 2 1 2 D o s e (m g /K g ) Gráfico 1 - Dosagem de Albumina no soro de ratos tratados com a dose de 2 mg/kg do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex. Benth (Fabaceae) (EEBCRDg ), nos ensaios de toxicidade aguda. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=6). Teste t de Student.p,5. 3 F o s fa ta s e A lc a lin a F ê m e a 2 D o s e (m g /K g ) 2 Gráfico 2 - Dosagem de Fosfatase Alcalina no soro de ratas tratadas com a dose de 2 mg/kg do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex. Benth (Fabaceae) (EEBCRDg), nos ensaios de toxicidade aguda. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=6). Teste t de Student.p,5. P r o te ín a s T o ta is F ê m e a 8 6 4 2 D o s e (m g /K g ) 2 Gráfico 3 - Dosagem de Proteínas Totais no soro de ratas tratadas com a dose de 2 mg/kg do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex. Benth., nos ensaios de toxicidade aguda. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=6). Teste t de Student.p,5.

G lo b u lin a ( g /d L ) 49 G lo b u lin a F ê m e a 5 4 3 2 1 D o s e (m g /K g ) 2 Gráfico 4 - Dosagem de Globulina no soro de ratas tratadas com a dose de 2 mg/kg do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Ex. Benth., nos ensaios de toxicidade aguda. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=6). Teste t de Student.p,5. 4.1.4.2 Análise Hematológica Nos parâmetros hematológicos foram evidenciadas uma diminuição estatisticamente significativo nas hemácias (Gráfico 5) das fêmeas após quatorze dias da administração com a dose de 2 mg/kg, v.o, do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex. Benth (EEBCRDg). Resultados mostrados na tabela 3, a seguir.

5 Tabela 3 - Parâmetros hematológicos obtidos do soro de ratos tratados com a dose de 2 mg/kg do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora. Ex. Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade aguda. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=6). Teste t de Student.p,5 Grupos Hemácias (1 6 /mm 3 ) Hemoglobina (g/dl) Hematócrito (%) Machos VCM ( 3 ) HCM ( g) CHCM (%) Controle 1,21,23 16,5,29 47,9 1,19 47,,45 16,18,21 34,48,31 2mg/kg 1,12,43 16,6,27 48,3 2,49 48,,58 16,5,5 34,53 1,35 Fêmeas Controle 1,18,28 15,98,39 47,5 1,63 46,6,74 15,68,19 33,68,47 2mg/kg 9,62,18 15,46,28 44,3,86 46,,44 16,8,16 34,9,37 Grupos Leucócitos (1/mm) Neutrófilo (%) Eosinófilo (%) Machos Linfócito (%) Monócito (%) Plaquetas (1/mm) Controle 7,62,53 28,6 2,42,8,2 6,6 3,12 9,8 1,2 631 38,42 Tratado 8,43,67 22,3 1,2 1,3,33 67,33,88 8,3 1,68 631,3 88,5 Fêmeas Controle 6,26,7 25,4,68 1,8,49 66,2 1,34 6,6,68 65,6 66,56 Tratado 6,5,9 29,5 4,11 1,,4 62,3 4,2 7,3 1,65 633,3 39,16

H é m a c ia s ( 6 /m m ³) 51 H e m á c ia s F ê m e a s 1 5 5 D o s e (m g /K g ) 2 Gráfico 5 - Dosagem de Hemácias obtida do soro de ratas tratadas com a dose de 2mg/kg do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex. Benth (Fabaceae) (EEBCRDg )., nos ensaios de toxicidade aguda. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=6). Teste t de Student.p,5. 4.4 Ensaio Toxicológico Não-Clínico Crônico Observações Gerais: Os resultados demonstrados a seguir referem-se a administração do EEBCRDg, nas doses de 1, 5 e 25 mg/kg, que foram administradas diariamente durante 9 dias, por via oral, em ratos de ambos os sexos. Durante o período de tratamento não foram observadas alterações no comportamento dos animais, porém na sexta semana de tratamento houve a primeira morte de uma fêmea na dose de 5 mg/kg, seguida por mais três mortes na mesma dose e sexo. Na dose de 25 mg/kg morreram dois animais machos, na 9ª e 1ª semana de tratamento. 4.4.1 Temperatura Quanto à temperatura corporal, foram observadas na Tabela 4 alterações em ambos os sexos durante a administração das três doses nos 9 dias de administração do EEBCRDg no segundo mês conforme gráficos 6 e 7.

T e m p e r a tu ra ( C ) 52 Tabela 4 - Temperatura corporal (ºC) de ratos tratados com diferentes doses do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5. TEMPERATURA (º C) CORPORAL QUINZENAL BASAL 1 2 3 MACHOS Controle 36,6,2 36,2,3 35,7,2 36,1,2 1 mg/kg 37,,1 35,2,2 36,1,2 36,4,3 5 mg/kg 36,8,1 36,6,2 36,8,3 36,5,2 25 mg/kg 36,9,1 35,6,3 36,6,2 35,7,3 FÊMEAS Controle 36,1,3 37,6,1 38,5,1 36,5,4 1 mg/kg 36,7,3 37,5,1 38,4,1 36,4,3 5 mg/kg 36,7,3 37,3,4 37,6,2 36,3,3 25 mg/kg 36,2,3 37,5,2 37,6,1 35,3,3 2 T e m p e r a tu r a M a c h o 4 3 2 2 D o s e s (m g /K g ) Gráfico 6 - Temperatura de ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) na segunda temperatura durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5.

T e m p e r a tu ra ( C ) 53 2 T e m p e r a tu r a F ê m e a 4 3 2 2 D o s e (m g /K g ) Gráfico 7 - Temperatura de ratas Wistar tratadas com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) na segunda temperatura durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5. 4.4.2 Glicemia Quanto à Glicemia caudal observadas na Tabela 5 houve alterações estatisticamente significativa em ambos os sexos durante a administração das três doses nos 9 dias de administração do EEBCRDg, porém na segunda e terceira glicemia conforme gráficos 8, 9 e 1 apresentou um efeito hipoglicemiante. Tabela 5 - Efeito da administração crônica de diferentes doses do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg ) sobre a glicemia dos animais. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p,5 MESES GRUPOS BASAL 1 2 3 MACHOS Controle 92,8 3,36 91, 2,67 87,7 2,5 87, 1,88 1 mg/kg 94,6 2,69 87,9 3,19 81,1 1,59 89,2 2,98 5 mg/kg 9,1 1,83 83, 2,86 81,4 2,59 74,2 1,99 25 mg/kg 85, 2,14 93,5 2,96 78,1 2,37 74,9 1,98 FÊMEAS Controle 88,3 3,52 86,2 2,42 82,1 3,36 9, 4,65 1 mg/kg 9,7 2,8 87,4 1,8 8,2 2,89 85,5 3,35 5 mg/kg 82,8 2,29 87,9 3,82 83,3 3,15 73,7 1,54 25 mg/kg 82, 2,55 87,6 2,44 8,1 2,29 78,67 2,63

G lic e m ia (m g /d L ) G lic e m ia (m g /d L ) G lic e m ia (m g /d L ) 54 2 G lic e m ia M a c h o s 8 6 4 2 2 D o s e (m g /K g ) Gráfico 8 - Segunda Glicemia de ratos Wistar tratados com Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5. 3 G lic e m ia M a c h o s 8 6 4 2 2 D o s e s (m g /K g ) Gráfico 9 - Terceira Glicemia de ratos Wistar tratados com Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5. 3 G lic e m ia F ê m e a s 8 6 4 2 D o s e (m g /K g ) Gráfico 1 - Terceira Glicemia de ratas Wistar tratadas com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5. 2

55 4.4.3 Consumo de água e ração Os resultados, mostrados nas tabelas 6 e 7, revelaram que a administração prolongada provocou alterações estatisticamente significativas no consumo de água e alimento de machos e fêmeas tratados diariamente com diferentes doses do EEBCRDg. Os machos diminuíram o consumo de água na 2ª semana (Gráfico 12) na dose de 5 mg/kg, 3ª, 4ª e 5ª semanas (Gráficos 13, 14 e 15, respectivamente) nas doses de 5 e 25 mg/kg, 7ª semana (Gráfico 16) nas doses de 1, 5 e 25 mg/kg, 8ª e 11ª semanas (Gráficos 17 e 18, respectivamente) na dose de 5 mg/kg. As fêmeas demonstraram aumento no consumo de água na 2ª (Gráfico 2), 7ª (Gráfico 21), 8ª (Gráfico 22) na dose de 1 mg/kg, diminuiu o consumo de água na 2ª (Gráfico 2) nas doses de 5 e 25 mg/kg, já na 9ª, 1ª, 11ª e 12ª semanas diminuiu o consumo de água na dose de 5 mg/kg.

56 Tabela 6 - Consumo semanal de água por ratos Wistar durante os 9 dias de tratamento crônico com diferentes doses do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg). Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p,5. Semanas 1ª 2ª 3ª 4ª 5ª 6ª 7ª MACHOS Controle 198,2 4,76 22,5 5,64 196,8 4,15 196,1 4,13 187,5 3,18 192,5 7,33 29,6 4,4 1 mg/kg 27,9 9,9 217,5 7,7 179,6 7,92 191,1 8,91 172,5 8,46 191,5 7,53 184,6 6,1 5 mg/kg 185, 6,46 177,9 3,88 17,4 3,3 161,4 3,37 157,9 4,8 173,2 4,59 165, 4,72 25 mg/kg 192,5 6,35 192,9 5,23 172,9 8,1 173,6 3,37 162,9 7,26 177,5 6,69 189,3 3,18 FÊMEAS Controle 17, 4,89 171,8 6,28 165,7 5,81 167,9 7,33 151,4 7, 165, 5,22 149,6 1,76 1 mg/kg 187,9 9,3 26,8 7,91 182,9 6,79 166,1 7,25 173,2 6,3 171,8 6,5 171,8 8,15 5 mg/kg 171,8 5,71 142,5 4,56 146,8 2,85 144,3 3,66 144,3 4,22 147,5 4,12 136,1 5,6 25 mg/kg 148,6 4,73 148,9 6,65 15,7 6,33 147,1 7,16 141,4 6,28 151,1 5,36 15, 6,9

57 Tabela 6 - Consumo semanal de água por ratos Wistar durante os 9 dias de tratamento crônico com diferentes doses do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg ). Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p,5. (Continuação) Semanas 8ª 9ª 1ª 11ª 12ª MACHOS Controle 184,3 5, 198,6 7,37 186,4 3,83 21,4 6,58 188,9 3,32 1 mg/kg 173,2 5,87 172,9 9,98 175, 5,91 181,8 6,83 18,7 5,2 5 mg/kg 163,9 4,75 175, 3,78 171,8 3,5 176,4 2,89 181,1 2,35 25 mg/kg 181,1 2,89 178,2 8,15 178,9 4,39 183,9 4,81 181,8 3,69 FÊMEAS Controle 14,7 4,47 155, 3,82 16,7 3,77 162,9 2,76 163,6 2,43 1 mg/kg 16,4 5,94 155,4 7,14 163,6 5,7 16,7 6,11 167,9 4,88 5 mg/kg 133,2 3,3 118,6 5,33 138,6 4,7 14,7 3,55 144,3 3,51 25 mg/kg 141,8 6,17 136,8 7,96 147,5 5,71 147,1 6,79 155, 5,93

C o n s u m o (m L ) C o n s u m o (m L ) C o n s u m o (m L ) 58 Á g u a M a c h o s C r ô n ic o 2 4 C o n tro le 2 2 m g /k g m g /k g 2 1 8 1 6 2 m g /k g 1 4 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 1 1 2 S e m a n a s Gráfico 11 - Consumo de Água por ratos Wistar machos tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg). durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). Oneway ANOVA/ Tukey.p<,5. 3 2 S e m a n a Á g u a M a c h o s 2 2 D o s e s (m g /K g ) Gráfico 12 - Segunda semana do consumo de água por ratos Wistar tratados com Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). Oneway ANOVA/ Tukey.p<,5. 2 3 S e m a n a Á g u a M a c h o s 2 1 2 D o s e s (m g /K g ) Gráfico 13 - Terceira semana do consumo de água por ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5.

C o n s u m o (m L ) C o n s u m o (m L ) C o n s u m o (m L ) 59 4 S e m a n a Á g u a M a c h o s 2 2 1 2 D o s e s (m g /K g ) Gráfico 14 - Quarta semana do consumo de água por ratos Wistar tratados com Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). Oneway ANOVA/ Tukey.p<,5. 2 5 S e m a n a Á g u a M a c h o s 2 1 2 D o s e s (m g /K g ) Gráfico 15 - Quinta semana do consumo de água por ratos Wistar tratados com Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). Oneway ANOVA/ Tukey.p<,5. 2 7 S e m a n a Á g u a M a c h o s 2 1 2 D o s e s (m g /K g ) Gráfico 16 - Sétima semana do consumo de água por ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). Oneway ANOVA/ Tukey.p<,5.

C o n s u m o (m L ) C o n s u m o (m L ) C o n s u m o (m L ) 6 8 S e m a n a Á g u a M a c h o s 2 2 1 2 D o s e s (m g /K g ) Gráfico 17 - Oitava semana do consumo de água por ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). Oneway ANOVA/ Tukey.p<,5. 2 1 1 S e m a n a Á g u a M a c h o s 2 1 2 D o s e s (m g /K g ) Gráfico 18 - Décima primeira semana do consumo de água por ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5. Á g u a F ê m e a s C r ô n ic o 2 2 2 C o n tro le m g /k g 1 8 1 6 m g /k g 2 m g /k g 1 4 1 2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 1 1 2 S e m a n a s Gráfico 19 - Consumo de Água por ratas Wistar fêmeas tratadas com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). Oneway ANOVA/ Tukey.p<,5.

C o n s u m o (m L ) C o n s u m o (m L ) C o n s u m o (m L ) 61 2 S e m a n a Á g u a F ê m e a s 2 2 1 2 D o s e s (m g /K g ) Gráfico 2 - Segunda semana do consumo de água por ratas Wistar tratadas com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5. 2 7 S e m a n a Á g u a F ê m e a s 2 1 2 D o s e s (m g /K g ) Gráfico 21 - Sétima semana do consumo de água por ratas Wistar tratadas com Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). Oneway ANOVA/ Tukey.p<,5. 8 S e m a n a Á g u a F ê m e a s 2 1 2 D o s e s (m g /K g ) Gráfico 22 - Oitava semana do consumo de água por ratas Wistar tratadas com Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). Oneway ANOVA/ Tukey.p<,5.

C o n s u m o (m L ) C o n s u m o (m L ) C o n s u m o (m L ) 62 9 S e m a n a Á g u a F ê m e a s 2 1 2 D o s e s (m g /K g ) Gráfico 23 - Nona semana do consumo de água por ratas Wistar tratadas com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). Oneway ANOVA/ Tukey.p<,5. 2 S e m a n a Á g u a F ê m e a s 1 2 D o s e s (m g /K g ) Gráfico 24 - Décima semana do consumo de água por ratas Wistar tratadas com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5. 2 1 1 S e m a n a Á g u a F ê m e a s 1 2 D o s e s (m g /K g ) Gráfico 25 - Décima primeira semana do consumo de água por ratas Wistar tratadas com Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5.

C o n s u m o (m L ) 63 1 2 S e m a n a Á g u a F ê m e a s 2 1 2 D o s e s (m g /K g ) Gráfico 26 - Décima segunda semana do consumo de água por ratas Wistar tratadas com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5. Os machos diminuíram o consumo de ração na 3ª, 4ª, 6ª, 7ª, 1ª, 11ª e 12ª semanas (Gráficos 28, 29, 31, 32, 34, 35 e 36) na dose de 5 mg/kg e na 3ª, 4ª, 5ª, 9ª, 1ª e 11ª (Gráficos 28, 29, 3, 33, 34 e 35) na dose de 25 mg/kg. As fêmeas demonstraram aumento no consumo de ração na 7ª e 8ª semanas (Gráficos 4 e 41, respectivamente) na dose de 1 mg/kg, diminuíram na 9ª semana (Gráfico 42) na dose de 5 mg/kg e na 2ª, 5ª, 9ª e 11ª (Gráficos 38, 39, 42 e 43) na dose de 25 mg/kg.

64 Tabela 7 - Consumo semanal de ração durante os 9 dias do ensaio de toxicidade crônica com diferentes doses do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg ). Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p,5. Semanas 1ª 2ª 3ª 4ª 5ª 6ª 7ª MACHOS Controle 131,8 1,6 118, 5,2 133, 4,2 127,6 2,8 121,3,6 13, 4,1 121,4 1,1 1 mg/kg 133,1 4,1 127, 2,4 125,3 2,8 126,2 3,8 19,8 5,4 128,2 3,3 124, 2,5 5 mg/kg 13,1 4,5 117, 2,8 113,8 1,3 114, 3,7 112,4 1,4 113,2 1,9 113,9 1,9 25 mg/kg 123, 3, 113,8 2,5 115, 1,9 111,4 2,5 11,9 3,4 12,9 3,5 12,5 2, FÊMEAS Controle 92,66 2,1 86,35 2,1 91,71 4, 88,33 3,4 82,91 1,7 87,51 4, 81,36 2,2 1 mg/kg 92,88 2,4 93,96 1,6 99,69 4,8 92,52 4,9 86,18 1,3 9,13 2,5 89,5 2,2 5 mg/kg 95,2 2,2 79,56 3,5 84,71,9 87,95 4,2 78,11 2,6 89,61 1,8 78,28 2,5 25 mg/kg 85, 2,3 74,91 2,9 87,2 7,3 8,69 2,8 74,78 1,4 83,26 2,5 77,32 1,3

65 Tabela 7 - Consumo semanal de ração durante os 9 dias do ensaio de toxicidade crônica com diferentes doses do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg ). Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p,5. ( Continuação) Semanas 8ª 9ª 1ª 11ª 12ª MACHOS Controle 116,2 1,3 128,3 5,1 126,5 4, 114,8 3,7 114,8 1,9 1 mg/kg 115,6 2,4 123,6 4,2 112,4 3,6 98, 4,3 17,2 5,1 5 mg/kg 11,9 1,6 115,4 1,5 95,83 4,4 93,65 5, 95,3 4, 25 mg/kg 114,6 1,8 1,4 3,1 18,8 3,2 12, 3,4 113, 3,3 FÊMEAS Controle 74,36 1,6 86,99 5,8 8,7 3, 82,71 3,7 82,26 3,3 1 mg/kg 82,56 1, 6 84,21 4,5 83,78 2,8 84,64 3,8 84,24 3,3 5 mg/kg 74,27 1,7 7,1 3,1 71,77 2,3 71,76 2,6 72,62 2,6 25 mg/kg 7,89 2, 67,8 1,9 72,59 1,6 7,62 2,1 72,44 3,

C o n s u m o (g ) C o n s u m o (g ) C o n s u m o (g ) 66 R a ç ã o M a c h o s C r ô n ic o 1 C o n tro le 1 2 5 2 7 5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 1 1 2 1 3 S e m a n a s Gráfico 27 - Consumo de Ração por ratos Wistar machos tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg ) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). Oneway ANOVA/ Tukey.p<,5. 2 3 º S e m a n a R a ç ã o M a c h o s 1 2 D o s e s (m g /K g ) Gráfico 28 - Terceira semana do consumo de ração por ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg ). durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5. 4 º S e m a n a R a ç ã o M a c h o s 1 2 D o s e s (m g /K g ) Gráfico 29 - Quarta semana do consumo de ração por ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5.

C o n s u m o (g ) C o n s u m o (g ) C o n s u m o (g ) 67 5 º S e m a n a R a ç ã o M a c h o s 1 2 D o s e s (m g /K g ) Gráfico 3 - Quinta semana do consumo de ração por ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg ) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). Oneway ANOVA/ Tukey.p<,5. 2 6 º S e m a n a R a ç ã o M a c h o s 1 2 D o s e s (m g /K g ) Gráfico 31 - Sexta semana do consumo de ração por ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg ) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). Oneway ANOVA/ Tukey.p<,5. 1 7 º S e m a n a R a ç ã o M a c h o s 2 D o s e s (m g /K g ) Gráfico 32 - Setíma semana do consumo de ração por ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg ) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5.

C o n s u m o (g ) C o n s u m o (g ) C o n s u m o (g ) 68 9 º S e m a n a R a ç ã o M a c h o s 2 1 2 D o s e s (m g /K g ) Gráfico 33 - Nona semana do consumo de ração por ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg ) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). Oneway ANOVA/ Tukey.p<,5. 1 º S e m a n a R a ç ã o M a c h o s 2 D o s e s (m g /K g ) Gráfico 34 - Décima semana do consumo de ração por ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg ) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5. 1 1 1 º S e m a n a R a ç ã o M a c h o s 2 D o s e s (m g /K g ) Gráfico 35 - Décima primeira semana do consumo de ração por ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5.

C o n s u m o (g ) C o n s u m o (g ) 69 1 2 º S e m a n a R a ç ã o M a c h o s 1 2 D o s e s (m g /K g ) Gráfico 36 - Décima segunda semana do consumo de ração por ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5. R a ç ã o F ê m e a s C r ô n ic o 1 2 5 C o n tro le 7 5 2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 1 1 2 1 3 S e m a n a s Gráfico 37 - Consumo de Ração de ratas Wistar fêmeas tratadas com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg ) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). Oneway ANOVA/ Tukey.p<,5. 15 2º Semana Ração Fêmeas Consumo (g) 1 5 Controle 1 5 Doses (mg/kg) 25 Gráfico 38 - Segunda semana do consumo de ração por ratas Wistar tratadas com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg ) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5.

C o n s u m o (g ) C o n s u m o (g ) C o n s u m o (g ) 7 5 º S e m a n a R a ç ã o F ê m e a s 1 2 D o s e s (m g /K g ) Gráfico 39 - Quinta semana do consumo de ração por ratas Wistar tratadas com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg ) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). Oneway ANOVA/ Tukey.p<,5. 1 7 º S e m a n a R a ç ã o F ê m e a s 2 D o s e s (m g /K g ) Gráfico 4 - Sétima semana do consumo de ração por ratas Wistar tratadas com Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg ) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). Oneway ANOVA/ Tukey.p<,5. 1 8 º S e m a n a R a ç ã o F ê m e a s 2 D o s e s (m g /K g ) Gráfico 41 - Oitava semana do consumo de ração por ratas Wistar tratadas com Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg ) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). Oneway ANOVA/ Tukey.p<,5.

C o n s u m o (g ) C o n s u m o (g ) 71 9 º S e m a n a R a ç ã o F ê m e a s 1 2 D o s e s (m g /K g ) Gráfico 42 - Nona semana do consumo de ração por ratas Wistar tratadas com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg ) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). Oneway ANOVA/ Tukey.p<,5. 1 1 1 º S e m a n a R a ç ã o F ê m e a s 2 D o s e s (m g /K g ) Gráfico 43 - Décima primeira semana do consumo de ração por ratas Wistar tratadas com Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5. 4.4.4 Variação da evolução ponderal Nos machos, ocorreu uma perda significativa de peso na 5ª, 6ª e 11ª semanas (Gráficos 45, 46 e 48, respectivamente) na dose de 1 mg/kg. Uma perda significativa de peso na 6ª semana (Gráfico 46), e um ganho significativo de peso na 12ª semana (Gráfico 49) na dose de 5 mg/kg. Na dose de 25 mg/kg ocorreu perda significativa de peso na 5ª, 6ª semana (Gráfico 45 e 46, respectivamente) e um ganho significativo de peso na 7ª e 12ª semana (Gráfico 47 e 49, respectivamente).

72 Nas fêmeas, ocorreu um ganho significativo de peso na 2ª semana (Gráfico 52) na dose de 1 mg/kg. Uma perda significativa de peso na 1ª semana (Gráfico 51), e um ganho significativo de peso na 2ª e 6ª semanas (Gráfico 52 e 53, respectivamente) na dose de 5 mg/kg.

73 Tabela 8 - Variação da evolução ponderal de ratos tratados com diferentes doses do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg ) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5. Semanas 1ª 2ª 3ª 4ª 5ª 6ª MACHOS Controle 45,8 1,93 53,4 1,62 31,3 2,26 19, 5,3 23,9 2,54 27,1 2, 1 mg/kg 46,4 4,2 4, 5,4 26, 5,15 16,9 3,7 13,2 1,66 16,2 1,6 5 mg/kg 36,6 2,75 41,5 3,31 29,2 1,52 26, 2,2 18, 1,65 19,2 1,32 25 mg/kg 45,8 3,38 4,3 3,79 22,6 3,32 19,7 3,24 13,5 3,11 19,9 1,88 FÊMEAS Controle 16,1 3,89-2,5 1,42 2,7 2,87-1, 2,6 4,6 2,67 -,6 1,71 1 mg/kg 15, 1,78 6, 1,31 4,2 3,27-3,3 2,23 7,3 3,3 6,3 3,49 5 mg/kg 4,9 2,34 9,4 3, 3,6 3,38 2,1 1,61 2,5 2,41 1,2 2,57 25 mg/kg 12,3 2,45 2,6 2,7 7,5 1,56 -,3 2,54 3, 1,72 4,9 1,41

74 Tabela 8 - Variação da evolução ponderal de ratos tratados com diferentes doses do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg ) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5. ( Continuação) Semanas 7ª 8ª 9ª 1ª 11ª 12ª MACHOS Controle 6,4 2,48 16,2 2,73 15, 1,7 3,9 1,13 14,3 1,78 5, 1,2 1 mg/kg 9,7 1,33 13,4,7 12,2 2,8 4,9,78 6,2 2,76 5,9 1,7 5 mg/kg 14,6 2,82 13,3 4,24 11, 2,11 4,7 1,36 11, 1,72 1,5,91 25 mg/kg 7,6 1,77 12,2 1,7 11,8 1,66,6 2, 8,5 1,82 9,6,99 FÊMEAS Controle -2,3 4,6-2,2 1,93 -,2 2,8 5,7 2,5 -,2 4,13 2,8 4,3 1 mg/kg 1,5 2,53 -,1 2,57-4,,89 5,2 2,81-2,4 1,63 5, 1,75 5 mg/kg -9, 2,36,8 1,4,6,96 -,4 2,12 1,2 1,48-2,3 2,56 25 mg/kg -7,44 2,2-2,5,98,5,8,25 1,6-3,25,88 4,75 3,39

E v o lu ç ã o P o n d e r a l ( g ) E v o lu ç ã o P o n d e r a l ( g ) E v o lu ç ã o P o n d e r a l ( g ) 75 E v o lu ç ã o P o n d e r a l M a c h o s 6 4 3 C o n tro le m g /k g m g /k g 2 m g /k g 2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 1 1 2 S e m a n a s Gráfico 44 - Evolução ponderal de ratos Wistar tratados com Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5. 5 S e m a n a E v o lu ç ã o P o n d e r a l M a c h o s 4 3 2 D o s e s (m g /K g ) 2 Gráfico 45 - Quinta semana da evolução ponderal de ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg ) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). Oneway ANOVA/ Tukey.p<,5. 4 6 S e m a n a E v o lu ç ã o P o n d e r a l M a c h o s 3 2 D o s e s (m g /K g ) 2 Gráfico 46 - Sexta semana da evolução ponderal de ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg ) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). Oneway ANOVA/ Tukey.p<,5.

E v o lu ç ã o P o n d e r a l ( g ) E v o lu ç ã o P o n d e r a l ( g ) E v o lu ç ã o P o n d e r a l ( g ) 76 7 S e m a n a E v o lu ç ã o P o n d e r a l M a c h o s 3 2 D o s e s (m g /K g ) 2 Gráfico 47 - Setíma semana da evolução ponderal de ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg ) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). Oneway ANOVA/ Tukey.p<,5. 2 5 1 1 S e m a n a E v o lu ç ã o P o n d e r a l M a c h o s 2 1 5 5 D o s e s (m g /K g ) 2 Gráfico 48 - Décima primeira semana da evolução ponderal de ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg ) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5. 1 2 S e m a n a E v o lu ç ã o P o n d e r a l M a c h o s 1 5 5 D o s e s (m g /K g ) 2 Gráfico 49 - Décima segunda semana da evolução ponderal de ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5.

E v o lu ç ã o P o n d e r a l ( g ) E v o lu ç ã o P o n d e r a l ( g ) 77 3 2 E v o lu ç ã o P o n d e r a l F ê m e a s 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 1 1 2 C o n tro le m g /k g m g /k g 2 m g /k g - S e m a n a s Gráfico 5 - Evolução ponderal de ratas Wistar tratadas com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5. 3 1 S e m a n a E v o lu ç ã o P o n d e r a l F ê m e a s 2 D o s e s (m g /K g ) Gráfico 51 - Primeira semana da evolução ponderal de ratas Wistar tratadas com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5. 2 Evolução Ponderal ( g ) 2 1-1 2 Semana Evolução Ponderal Fêmeas Controle 1 5 Doses (mg/kg) 25 Gráfico 52 - Primeira semana da evolução ponderal de ratas Wistar tratadas com Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). Oneway ANOVA/ Tukey.p<,5.

E v o lu ç ã o P o n d e r a l ( g ) 78 6 S e m a n a E v o lu ç ã o P o n d e r a l F ê m e a s 2 - D o s e s (m g /K g ) 2 Gráfico 53 - Primeira semana da evolução ponderal de ratas Wistar tratadas com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5. 4.4.5 Avaliação comportamental 4.4.5.1 Teste no campo aberto Neste experimento, em todos os parâmetros analisados, conforme tabelas 9-13. Houve um aumento estatisticamente significativo no 2º comportamental no ato de levantar das fêmeas da dose de 5mg/kg (Gráfico 56). Houve uma diminuição estatisticamente significativa no 4º comportamental na defecação das fêmeas na dose de 25 mg/kg (Gráfico 58). Houve um aumento estatisticamente significativo no 5º comportamental na ambulação e limpeza das fêmeas na dose de 1 mg/kg (Gráfico 54) e levantar dos machos na dose de 25 mg/kg (Gráfico 55).

A m b u la ç ã o 79 Tabela 9 - Número de Ambulações no experimento de campo aberto, em ratos tratados com diferentes doses Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg). Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p,5. 1 2 3 4 5 MACHOS Controle 28, 4,49 25,2 4,6 19,8 4,82 17,4 2,66 19,6 3,64 1 mg/kg 29,2 6,94 23,4 3,17 15,6 1,36 8,6 2,58 17,2 2,44 5 mg/kg 27, 2,7 19,8 5,18 22,8 7,61 18,4 3,96 18,6 5,7 25 mg/kg 39,2 9,3 19,4 5,33 19,4 4,76 13,6 4,63 25,25 3,18 FÊMEAS Controle 4,6 6,55 35,4 6,63 24,8 4,93 26,2 3,15 17,8 3,5 1 mg/kg 45, 7,4 39, 3,27 34,4 3,27 3,4 2,91 39,8 5,38 5 mg/kg 23, 2,76 22,8 6,89 26,2 6,64 2,2 5,76 26, 5,52 25 mg/kg 37,2 5,74 22,2 2,6 2,2 6,51 11, 4,92 21,5 4,79 5 A m b u la ç ã o F ê m e a 4 3 2 2 D o s e (m g /K g ) Gráfico 54 - Número de execuções de comportamento Ambulação no experimento de campo aberto de ratos Wistar fêmeas tratados com Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg). Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p,5.

R e a r in g 8 Tabela 1 - Número de execuções de comportamento Rearing (levantar) no experimento de campo aberto, em ratos tratados com diferentes doses do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg). Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p,5. DIAS 1 2 3 4 5 Machos Controle 1, 1, 13,2 3,87 6,6 2,71 1,2,8,4,4 1 mg/kg 4, 2,43 7,8 3,9 1,4 5,5 7,6 4,67 1,4,87 5 mg/kg 3, 1,48 8, 3,45 2,8 2,56 13,2 5,42 9,4 2,94 25 mg/kg 1,8 6,57 13,4 8,23 8,4 4,25 12,2 7,72 17,25 6,5 Fêmeas Controle 9,2 2,73 9,4 3,95 1,2 3,25 13,8 3,65 17,4 9,4 1 mg/kg 1,4 1,17 4,6 4,6 5,6 3,89 2,4 1,69,6,4 5 mg/kg 18, 5,53 3,6 6,79 2,4 3,33 19,6 4,6 12,2 5,52 25 mg/kg 5, 2,3 21,2 5,9 16, 6,6 11, 4,92 7,25 3,73 4 5 R e a r in g M a c h o 3 2 2 D o s e s (m g /K g ) Gráfico 55 - Número de execuções de comportamento Rearing ( levantar ) no experimento de campo aberto de ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg). Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p,5.

R e a r in g 81 2 R e a r in g F ê m e a 4 3 2 2 D o s e (m g /K g ) Gráfico 56 - Número de execuções de comportamento Rearing ( levantar ) no experimento de campo aberto de ratas Wistar fêmeas tratadas com Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg). Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p,5. Tabela 11 - Número de execuções de comportamento Grooming ( limpeza ) no experimento de campo aberto, em ratos tratados com diferentes do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg ). Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p,5. DIAS 1 2 3 4 5 Machos Controle 14, 2,17 14, 3,56 9,6 2,32 14,4 3,22 8,4 2,99 1 mg/kg 11,6 2,75 12,2 3,32 9,8 2,27 7,4 2,52 6,2 2,75 5 mg/kg 16,2 2,63 1,8 3,37 9,8 4,43 2,8 3,38 9,8 2,71 25 mg/kg 13,2 2,69 7,4 1,44 4,8 1,63 6,8 2,48 6,5 1,26 Fêmeas Controle 22,4 4,34 14,2 2,62 8,6 2,69 15, 1,92 5,4 2,6 1 mg/kg 28,4 6,34 21,4 4,35 17,4 1,57 18,8 3,68 24,6 2,8 5 mg/kg 16,6 4,86 1,4 3,97 9,6 2,94 15,8 5,65 14, 4,56 25 mg/kg 14,2 2,89 11, 2,21 6, 2,53 7,5 2,47 8,75 2,46

G r o o m in g 82 5 G r o o m in g F ê m e a 3 2 2 D o s e (m g /K g ) Gráfico 57 - Número de execuções de comportamento Grooming ( limpeza ) no experimento de campo aberto de ratas Wistar fêmeas tratadas com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg). Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p,5. Tabela 12 - Número de bolos fecais no experimento de campo aberto, em ratos tratados com diferentes doses do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg). Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p,5. DIAS 1 2 3 4 5 Machos Controle 2,6 1,78 1,,78 2,8 1,72 1,6 1,3 3, 1,38 1 mg/kg 5,4 1,66 4,8 1,39 3, 1,76 2,8,8 2,,77 5 mg/kg 4,6,75 5,2 2,33 4,8 2,18 2,8 1,53 3,8,58 25 mg/kg 5,4 1,57 5,4 2,64 5, 1,3 5, 1,3 4,5 1,26 Fêmeas Controle 4,6 1,29 3,8 1,36 3,8 1,77 3,8 1,27 4,2 1,59 1 mg/kg 3, 1,67 3,2 1,96 5,2 2,27 2,2,8 2, 1,23 5 mg/kg 3,8 1,69 1,8 1,2 2, 1,38,8,58 1, 1, 25 mg/kg 4,2 1,36 2, 1,55 2, 2,,, 1,25 1,25

D e fe c a ç ã o 83 4 D e fe c a ç ã o F ê m e a 6 4 2 2 D o s e (m g /K g ) Gráfico 58 - Número de execuções de comportamento Defecação no experimento de campo aberto de ratas Wistar fêmeas tratadas com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg). Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p,5. 4.4.5.2 Teste no Rota Rod Na avaliação da atividade motora dos animais através do teste no aparelho de Rota Rod não foram registrados alterações estatísticamente significativas em relação ao grupo controle quanto ao tempo de permanência no aparelho, em ambos os sexos nas diferentes doses da experimentação crônica (Tabela 13 a seguir). Tabela 13 - Tempo de permanência (em segundos) na barra giratória do aparelho Rota rod, de ratos durante o tratamento crônico com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg). Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). Oneway ANOVA/ Tukey.p,5. DIAS 1 2 3 4 5 Machos Controle 18,, 18,, 18,, 18,, 179,8,2 1 mg/kg 171,2 8,8 18,, 175,4 4,6 176,8 3,2 179,6,4 5 mg/kg 18,, 18,, 18,, 18,, 179, 1, 25 mg/kg 18,, 176,2 3,8 166,2 13,8 18,, 18,, Continuação

T e m p o d e P e r m a n ê n c ia (s e g ) T e m p o d e P e r m a n ê n c ia (s e g ) 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 84 Fêmeas Controle 17,8 6,46 17,6 9,4 169,4 6,91 172,8 4,93 17,2 9,8 1 mg/kg 18,, 18,, 18,, 18,, 18,, 5 mg/kg 18,, 18,, 18,, 18,, 18,, 25 mg/kg 18,, 18,, 18,, 18,, 18,, R o ta R o d M a c h o 2 1 C o n tro le m g /k g m g /k g 2 m g /k g S e m a n a s Gráfico 59 - Tempo de Permanência (em segundos) na barra giratória do Rota Rod de ratos Wistar tratados com Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5. R o ta R o d F ê m e a s 2 1 C o n tro le m g /k g m g /k g 2 m g /k g S e m a n a s Gráfico 6 - Tempo de Permanência (em segundos) na barra giratória do Rota Rod de ratas Wistar tratadas com Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5.

85 4.4.6 Análise laboratorial do sangue 4.4.6.1 Parâmetros bioquímicos Ocorreram alterações bioquímicas estatísticamente significativas em ambos os sexos, sendo evidenciado uma diminuição na glicose e albumina nos machos da dose de 25 mg/kg (gráficos 61 e 67, respectivamente). Aumento nos níveis de creatinina, LDH e albumina nos machos da dose de 1 mg/kg (Gráficos 62, 65 e 67). Aumentou nos níveis de creatinina, AST, LDH, Proteínas totais, albumina e globulina nos machos da dose de 5 mg/kg (Gráficos 62, 63, 65, 66, 67 e 68). Aumentou nos níveis de AST, ALT, LDH e globulina nos machos da dose de 25 mg/kg (Gráficos 63, 64, 66, 65 e 68). Aumento nos níveis de proteínas totais e globulina nas fêmeas da dose de 5 mg/kg (Gráficos 69 e 7).

86 Tabela 14 - Parâmetros bioquímicos obtidos do sangue de ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg ) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5. Grupos Glicose (mg/dl) Uréia (mg/dl) Creatinina (mg/dl) ÁcidoÚrico (mg/dl) AST (U/I) ALT (U/I) Fosfatase Alcalina (U/I) MACHOS Controle 124,1 9,59 35,88 1,6,63,2 1,84,13 11,5 6,72 67,38 3,4 22,6 17,9 1mg/kg 15,4 3,5 37,56 1,67 64,2 1,98,14 159,3 13,76 66,78 2,41 229,1 2,38 5mg/kg 13,3 6,21 38,57 4,4,7, 2,4,4 27,7 19,76 77,29 5,93 26,9 36,88 25mg/kg 93,43 4,21 41,43 2,,63,2 1,71,12 168,6 19,3 83,71 2,76 27,3 23,41 FÊMEAS Controle 13,5 5,29 35,38,84,69,2 2,19,17 14,6 16,11 77, 8,2 235,4 17,6 1mg/kg 96,78 3,56 39,22,8,76,3 2,69,22 181,9 19,97 69, 3,44 19,8 26,24 5mg/kg 98, 5,19 38,38 2,34,76,3 2,39,32 177,4 33,68 69,38 4,3 27,3 36,68 25mg/kg 94,13 3, 37,38 2,54,69,1 1,9,11 173,5 22,11 72,88 2,44 192,4 19,71

87 Tabela 14 - Parâmetros bioquímicos obtidos do sangue de ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5. (Continuação). Grupos LDH (U/l) Colesterol (mg/dl) Triglicerídeos (mg/dl) MACHOS Amilase (U/dL) Proteínas totais(g/dl) Albumina (g/dl) Globulina (g/dl) Controle 96,1 117,3 68,75 3,95 12,4 7,34 1124 4,1 6,73,8 3,64,4 3,9,9 1mg/kg 223 2,9 74,67 3,15 124,8 9,53 1135 26,16 7,,9 3,84,3 3,16,7 5mg/kg 1917 319,1 72,71 5,32 111, 1,39 1186 39,39 7,59,1 4,2,5 3,58,12 25mg/kg 1734 24,6 63,71 5,24 88,57 7,9 1123 59,7 6,97,9 3,43,9 3,54,5 FÊMEAS Controle 1177 155,4 82,71 5,64 98,75 8,4 79,7 6,9 7,31,19 4,16,1 3,15,11 1mg/kg 1911 195, 97,22 5,48 93,78 13,86 772, 39,46 7,74,14 4,43,6 3,31,1 5mg/kg 1738 297,1 86,88 8,56 14, 13,63 764,4 56,28 8,5,19 4,34,18 3,71,16 25mg/kg 1436 247,5 85,86 4,7 118,6 16,53 862,4 77,57 7,44,1 3,96,16 3,48,9

A S T (U /L ) C re a tin in a (m g /d L ) G lic o s e (m g /d L ) 88 G lic o s e M a c h o 1 2 D o s e (m g /K g ) Gráfico 61 - Dosagem de glicose em ratos Wistar tratados com diferentes doses Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg ) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). Oneway ANOVA/ Turkey, p<,5. C r e a tin in a M a c h o.8.6.4.2. 2 D o s e s (m g /K g ) Gráfico 62 - Dosagem de creatinina em ratos Wistar tratados com diferentes doses do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Turkey, p<,5. A S T M a c h o 2 2 1 2 D o s e (m g /K g ) Gráfico 63 - Dosagem de Aspartato Transaminase (AST) em ratos Wistar tratados com diferentes doses Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Turkey, p<,5.

P r o te in a s T o ta is (g /d L ) L D H (U /L ) A L T (U /L ) 89 A L T M a c h o 8 6 4 2 2 D o s e (m g /K g ) Gráfico 64 - Dosagem de Alanina Aminotransferase (ALT) em ratos Wistar tratados com diferentes doses Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Turkey, p<,5. L D H M a c h o 2 2 1 2 D o s e (m g /K g ) Gráfico 65 - Dosagem de LDH em ratos Wistar tratados com diferentes doses do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). Oneway ANOVA/ Turkey, p<,5. P r o te ín a s T o ta is M a c h o 8 6 4 2 2 D o s e (m g /K g ) Gráfico 66 - Dosagem de proteínas totais em ratos Wistar tratados com diferentes doses do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Turkey, p<,5.

P roteinas Totais (g /dl) G lo b u lin a ( g /d L ) A lb u m in a (g /d L ) 9 A lb u m in a M a c h o 5 4 3 2 1 2 D o s e (m g /K g ) Gráfico 67 - Dosagem de albumina em ratos Wistar tratados com diferentes doses do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Turkey, p<,5. G lo b u lin a M a c h o 4 3 2 1 2 D o s e (m g /K g ) Gráfico 68 - Dosagem de globulina em ratos Wistar tratados com diferentes doses do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Turkey, p<,5. P r o te ín a s T o ta is F ê m e a 8 6 4 2 D o s e (m g /K g ) Gráfico 69 - Dosagem de proteínas totais em ratas Wistar tratadas com diferentes doses do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Turkey, p<,5. 2

G lo b u lin a ( g /d L ) 91 G lo b u lin a F ê m e a 5 4 3 2 1 2 D o s e (m g /K g ) Gráfico 7 - Dosagem de globulinas em ratas Wistar tratadas com diferentes doses do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Turkey, p<,5. 4.4.6.2 Parâmetros hematológicos Após os 9 dias de tratamento com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart, nas análises hematológicas dos machos, foi observado um aumento estatisticamente significativo nas hemácias (Gráfico 71) e hematócritos (Gráfico 72) e diminuição no VCM (Gráfico 73) e CHCM (Gráfico 74) na dose de 5 mg/kg e um aumento do número de leucócitos (gráfico 75) na dose de 25 mg/kg. Em relação as fêmeas aumentou as hemácias (Gráfico 76) e diminuiu o VCM (Gráfico 77) e HCM (Gráfico 78) na dose de 5 mg/kg.

92 Tabela 15 - Parâmetros hematológicos obtidos do sangue de ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg ) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5. Hemácias Hemoglobina Hematócrito VCM HCM CHCM Grupos (1 6 /mm 3 ) (g/dl) (%) (µ 3 ) (µµg) (%) MACHOS Controle 1,88±,15 15,39±,12 48,17±,23 44,43±,53 14,13±,19 31,93±,15 1 mg/kg 11,34±,27 15,8±,26 49,77±1,4 44,5±,42 13,96±,19 31,36±,3 5 mg/kg 12,61±,18 16,4±,27 53,47±,78 42,29±,42 12,97±,15 3,67±,15 25 mg/kg 1,52±,42 15,34±,54 47,96±1,5 45,6±,93 14,74±,35 32,32±,23 FÊMEAS Controle 1,56±,17 15,71±,28 49,7±1, 46,6±,52 14,9±,2 32,3±,24 1 mg/kg 1,76±,18 15,34±,2 49,43±,62 46,±,39 14,25±,13 31,1±,13 5 mg/kg 11,6±,13 15,85±,25 5,82±,53 44,±,58 13,67±,26 31,18±,25 25 mg/kg 1,11±,14 15,2±,28 46,7±,75 46,25±,56 15,1±,25 32,55±,45

93 Tabela 15 - Parâmetros hematológicos obtidos do sangue de ratos Wistar tratados com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg ) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=1). One-way ANOVA/ Tukey.p<,5. Grupos Leucócitos (1 3 /mm 3 ) Neutrófilos (%) Eosinófilos (%) Linfócitos (%) Monócitos (%) Plaquetas (1 3 /mm 3 ) MACHOS Controle 7171±481,9 31,71±2,39 1,57±,3 59,29±2,5 6,86±,7 777429±65717 1 mg/kg 5938±638,9 27,75±1,19 1,26±,13 63,25±,98 7,5±,88 7835±41664 5 mg/kg 5643±56,1 27,86±2,15 1,29±,18 63,43±1,96 6,85±1,5 747571±57417 25 mg/kg 132±118 4,6±3,12 2,±,7 5,8±3,37 7,±,78 72±74866 FÊMEAS Controle 4878±463,6 24,25±,96 1,38±,32 65,5±1,53 8,25±1,1 725±44467 1 mg/kg 4413±319,8 25,88±1,53 1,5±,19 66,38±1,89 6,±,66 73825±43837 5 mg/kg 4967±66,4 29,33±2,5,83±,31 62,83±2,92 6,67±,84 6698±43267 25 mg/kg 6463±587,3 26,5±1,66 2,12±,67 62,63±1,94 8,13±,9 691571±52215

V C M ( 3 ) H é m a c ia s ( 6 /m m ³) 94 H é m a c ia s M a c h o 1 5 5 D o s e (m g /K g ) 2 Gráfico 71 - Dosagem de hemácias obtidas do sangue de ratos tratados com diferentes doses Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg ) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=2). One-way ANOVA/ Turkey, p<,5. H e m a tó c r ito M a c h o H e m a tó c r ito ( % ) 6 4 2 D o s e (m g /K g ) Gráfico 72 - Dosagem de hematócritos obtidos do sangue de ratos tratados com diferentes doses do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=4). One-way ANOVA/ Turkey, p<,5. 2 V C M M a c h o 4 3 2 2 D o s e (m g /K g ) Gráfico 73 - Dosagem de Volume Corpuscular Médio (VCM ) obtidos do sangue de ratos tratados com diferentes doses do extrato Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=4). One-way ANOVA/ Turkey, p<,5.

H é m a c ia s ( 6 /m m ³) L e u c ó c ito s ( /m m ) C H C M ( % ) 95 C H C M M a c h o 4 3 2 2 D o s e (m g /K g ) Gráfico 74 - Dosagem de CHCM obtidos do sangue de ratos tratados com diferentes doses do Extrato Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=4). One-way ANOVA/ Turkey, p<,5. 1 L e u c ó c ito s M a c h o 2 D o s e (m g /K g ) Gráfico 75 - Dosagem de Leucócitos obtidos do sangue de ratos tratados com diferentes doses do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=4). One-way ANOVA/ Turkey, p<,5. 1 5 H é m a c ia s F ê m e a s 5 2 D o s e (m g /K g ) Gráfico 76 - Dosagem de hemácias obtidas do sangue de ratas tratadas com diferentes doses do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=2). One-way ANOVA/ Turkey, p<,5.

H C M ( g ) V C M ( 3 ) 96 V C M F ê m e a 4 3 2 2 D o s e (m g /K g ) Gráfico 77 - Dosagem de Volume Corpuscular Médio (VCM) obtidos do sangue de ratas tratadas com diferentes doses do Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg ) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=4). One-way ANOVA/ Turkey, p<,5. 2 H C M F ê m e a s 1 5 5 2 D o s e (m g /K g ) Gráfico 78 - Dosagem de HCM obtidos do sangue de ratas tratadas com diferentes doses do extrato Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de Dioclea grandiflora Mart. Ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg ) durante o ensaio de toxicidade crônica. Os valores estão expressos em média e.p.m. (n=4). One-way ANOVA/ Turkey, p<,5. 4.4.7 Estudo anatomopatológico No teste de toxicidade crônica, o estudo anatomopatológico incluiu animais de ambos os sexos, submetidos ao tratamento com o Extrato Etanólico Bruto da Casca da Raiz de

97 Dioclea grandiflora Mart. ex Benth (Fabaceae) (EEBCRDg) nas doses 1, 5 e 25 mg/kg. Foram avaliados o coração, pulmão, fígado, rins e cérebro de todos esses animais. Do ponto de vista macroscópico, os órgãos não apresentaram alterações anatômicas. Na avaliação histopatológica dos órgãos dos animais, o coração, fígado, rins e cerebro não apresentaram particularidades histológicas. O exame histopatológico dos pulmões dos machos das doses 1, 5 e 25mg/kg, evidenciou a presença de discreto infiltrado crônico peribronquiolar, sem evidencias de exsudação para a luz. Os alvéolos apresentam-se sem alterações histológicas, revestidos por epitélio simples plano e lâmina própria constituída por tecido conjuntivo frouxo contendo esparso feixes de músculo liso. A rede vascular acompanha a trama brônquica, também sem alterações dignas de nota. A- Pulmão controle (HE 2X); B- Pulmão dose 1 mg/kg (HE 2X); C- Pulmão dose 5 mg/kg (HE 2X); D- Pulmão dose 25 mg/kg (HE 2X).

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