GLUT e Neoplasias (Tumores):

GLUT e Neoplasias (Tumores): Os tumores, ao crescerem provocam um aumento da captação de glicose e da taxa de glicólise. Para que esta (glicólise) ocorra é necessário haver oxigénio e, há medida que a quantidade deste diminui os tumores começam a ficar hipóxidos (pouco oxigénio). Ao ficarem hipóxidos libertam o factor HIF (Hipoxy Induced Factor), muito importante na sobrevivência do tumor, que provoca uma adaptação metabólica, esta vai aumentar a expressão das proteínas envolvidas no metabolismo da glicose e no número de transportadores GLUT 1 e 3, sendo a glicose captada pela célula. Como não há oxigénio, ocorre fermentação láctea, processo que vai fornecer energia (ATP) e permitir o crescimento das células. Para compensar a falta de oxigénio, as células tumorais ao libertarem o factor HIF produzem outro factor, o UEGF (factor de crescimento endotelial vascular) que provoca um aumento da irrigação. Se fosse possível manter o tumor em hipoxia, o seu crescimento seria impedido. Alguns tipos de neoplasias apresentam nas suas membranas transportadores de glicose que não são expressos no tecido saudável, estando relacionada a expressão de alguns tipos de transportadores ao grau de malignidade dos tumores. As células malignas possuem maior expressão de GLUT1 e 3. Quanto maior a expressão destes transportadores, mais sombrio é o prognóstico. A expressão de GLUT1 está relacionada com o potencial maligno de neoplasias mamárias, tumores hepáticos, pancreáticos, esofagianos, cerebrais, renais, ovarianos e cutâneos. Já a presença elevada de GLUT3 encontra-se associada a neoplasias gástricas, ovarianas e pulmonares. Contudo estes transportadores não são comuns quando os órgãos estão sadios. Os transportadores GLUT5 presentes em tumores mamários, também não são encontrados neste tecido, quando normal. Recentemente descoberto o GLUT12 está expresso em células prostáticas e mamárias neoplásicas, sendo que nos adultos também se encontra expresso na musculatura cardíaca, esquelética e no tecido adiposo normal. Tumores do ovário, com maior produção de estradiol, podem estimular a expressão de GLUT no tecido neoplásico e piorar o diagnostico. Ionóforos: Os iões são substâncias muito pequenas, contudo essenciais para o correcto funcionamento celular. Devido há existência de uma bicamada lipídica com regiões hidrofóbicas, os iões (por possuírem carga) tem dificuldades em atravessar para o meio intracelular. Deste modo, podem atravessar a membrana através de canais proteicos, ou serem carregados por ionóforos. Os ionóforos são moléculas sintéticas (não existem fisiologicamente) de pequenas dimensões, que ao mascararem a carga dos iões vão permitir que estes se difundam através da bicamada lipídica. Têm poder antibiótico. Os ionóforos dividem-se em: - Transportadores móveis O transporte depende da fluidez membranar, sendo que os ionóforos realizam um movimento de flip-flop através desta. É muito específico relativamente ao tipo de iões que transporta; 37

- Formadores de canais O canal transportador encontra-se fixo à membrana, formando um poro hidrofílico que permite a passagem de iões, é um transporte menos específico. Efectuou-se uma experiência para distinguir os dois tipos de ionóforos, para isso estudou-se a condutância dos vários transportadores de acordo com variações na temperatura. Verificou-se que num transportador móvel (Ex. Valinomicina) quanto maior for a fluidez membranar, maior o transporte efectuado. Quando a fluidez da membrana é nula, também o transporte se aproxima de zero. No caso de transportadores formadores de canais (Ex. Gramicidina A), são geralmente mais rápidos, não se verificando grandes variações com a alteração da temperatura. Transportadores móveis Dependem das propriedades físicas da membrana, mais precisamente da fluidez da membrana, que também afecta, embora em menor escala, o transporte de outros ionóforos. À medida que se vai enriquecendo a membrana em colesterol, ela vai ficando menos fluida, sendo menor o transporte efectuado por estes transportadores. Ex. Valinomicina: Como exemplo de um ionóforo móvel podemos considerar a valinomicina, uma molécula de pequena dimensão (circular com 4 resíduos peptídicos) que transporta iões na seguinte escala decrescente de preferência: Rb + > K + > Cs + > NH 4 + > Na + Preferência por iões K + relativamente a Na +. (Raio Iónico do K + > Na + : 1,33 Ǻ e 0,95 Ǻ respectivamente) É um valente antibiótico, pois ajuda a destruir o gradiente iónico membranar dos microorganismos. Na valinomicina, o ião é englobado na molécula e a sua carga passa a ser irrelevante. É um transportador móvel característico, tem uma zona interna que complexa o ião, escondendo a sua carga. É um ionóforo específico para K + que se forma espontaneamente se houver muitos iões no meio. A valinomicina transporta potássio, ligando uma outra molécula. Esta é transportada para um lado e o potássio para o outro. Quando se fala em especificidade do ionóforo, devemos ter em conta dois factores: - O raio do ião; - A energia de dessolvatação (energia de ligação do ião às moléculas de água que lhe permitem circular na água) ΔG associada a hidratação. Os ionóforos do tipo móvel são mais selectivos devido a estes factores, enquanto os outros formam apenas poros. No poro, não é necessário ter a energia de dessolvatação 38

em linha de conta. Quando se utiliza um ionóforo, aumenta-se a permeabilidade da membrana, mas o transporte dá-se sempre no sentido do gradiente. Este ionóforo tem a particularidade de envolver completamente o potássio, mantendo a electronegatividade. Os oxigénios no centro do anel da valinomicina formam um local de ajuste perfeito para o catião, daí que o raio do catião seja crítico. Iões muito grandes requerem grande distorção do peptídeo, de forma a ajustá-los. Outro aspecto que confere especificidade quanto ao ião a transportar é a ΔG associada a hidratação do mesmo. Quanto mais negativa é a ΔG associada, mais estável é o sistema, logo maior quantidade de energia é necessária para desidratar o ião. O Na + tem uma ΔG de - 72 Kcal/mol enquanto K + possui ΔG = - 55 Kcal/mol, logo é energeticamente mais dispendioso desidratar Na +. Ex. Monensina: É um ionóforo para Na +. É um transportador móvel com sistema antiporte Na + /H +. A monensina tem vários grupos carboxilo e, para transportar o ião, tem de perder os protões, fechando. Quando não se encontra complexada ao ião é uma molécula linear aberta e neutra. Para poder ligar os iões, a monensina tem de alterar a sua estrutura, para isso é desprotonada nos grupos carboxilo, fechando sobre si mesma. Deste modo assume a conformação cíclica que liga Na +, ficando novamente neutra, o que lhe permite atravessar a membrana. Quando o sódio é libertado no interior celular, a monesina volta a ligar H + (protonação dos grupos carboxilo) ficando novamente neutra, podendo assim atravessar a membrana sem problemas. Como este sistema transporta H + para um lado e Na + para outro há uma compensação de cargas, sendo o transporte electroneutro. Ex. X-537A: Foi dos primeiros antibióticos a ser descoberto e um dos mais usados, embora na actualidade não o seja. Transporta catiões monovalentes e bivalentes, por troca com protões. A molécula X-537A não é muito específica. Os seus grupos carboxilo são desprotonados quando o ião se liga. No caso de um ião bivalente, são necessárias duas moléculas de X-537A e duas desprotonações, formando-se um dímero. Ex. A23187: Trata-se de uma molécula aberta que se fecha quando complexa o ião, sendo que as suas extremidades se unem através de uma ligação de hidrogénio. É um ionóforo carboxílico móvel para catiões bivalentes, nomeadamente cálcio (Ca 2+ ). Funciona da mesma maneira que o ionóforo anterior. Como o ião cálcio tem duas cargas positivas, são necessárias duas moléculas do ionóforo, que realizam a transferência electricamente neutra dos iões, ou seja, juntamente com o cálcio são transportados dois aniões ou um catião bivalente, para o lado oposto. O objectivo final é, sempre, manter a electroneutralidade. A utilização de ionóforos de cálcio contribuiu decisivamente para a compreensão do papel do Ca 2+ nos processos celulares. Não é possível injectar cálcio nas células, mas 39

recorrendo a este ionóforo o transporte deste ião torna-se é possível. Muitas respostas fisiológicas normalmente accionadas pela ligação de hormonas a receptores membranares de superfície podem ser deduzidas pela utilização de ionóforos de cálcio que fazem elevar os níveis de Ca 2+ intracelular. Ex. Nigericina: Ionóforo carboxílico, mas com elevada especificidade para K + e H +. Possui função complementar à da valinomicina, dissipando o gradiente de K +, mas mantendo o potencial de membrana devido ao antiporte com H +. Funciona como protonóforo, sendo um transporte electroneutro. Conclusões: Os ionóforos móveis são geralmente cíclicos (Ex. valinomicina), mas também podem ser ácidos carboxílicos, que formam um anel através da junção das extremidades por ligações de H (Ex. A-23187). O ião aprisionado no interior do anel estabelece interacções com os átomos electronegativos do ionóforo de forma a compensar as ligações que anteriormente estabelecera com o solvente. O elevado número de resíduos apolares na periferia do anel permitem que o transportador se difunda no interior hidrofóbico da membrana. Formadores de canais: Estes ionóforos são muito menos selectivos para os iões a transportar, contudo o seu transporte é bem mais rápido. Existe um poro pelo qual ocorre transporte inespecífico. Ex. Gramidicina: É um ionóforo para catiões monovalentes que estabelece poros hidrofílicos na membrana formados por duas moléculas helicoidais. Este peptídeo forma espontaneamente dímeros na membrana, estes estão ligados pelo terminal formil e formam o canal transmembranar. A formação destes dímeros é um processo reversível. Num sistema fisiológico em que existe gramidicina, ela vai desfazer os gradientes, mas não sendo específica para os iões, os transportes dão-se de acordo com os gradientes, até se estabelecer equilíbrio. Protonóforos (Ionóforos de protões): São moléculas de baixa densidade de carga, em que esta está localizada no anel, ou seja, está deslocalizada. São ácidos fracos, lipossolúveis, que penetram nas membranas biológicas quer na forma protonada quer na desprotonada, transportando protões segundo um gradiente de concentração. Ex. Dinitrofenol: De nome químico 2,4-dinitrofenol, é um ácido fraco. Seria de esperar que a sua base conjugada, 4-dinitrofenolato, não atravessa-se a membrana, mas na verdade a sua 40

carga negativa encontra-se repartida por toda a estrutura, tendo por isso de um modo geral baixa densidade de carga, o que lhe confere vantagem para se difundir pela membrana. Encontra-se na forma protonada quando o ph é menor e na desprotonada quando é maior. O protonóforo liga o protão na face externa da membrana e, no interior da célula, após passar pela membrana, desliga-o. Funciona como desacoplador da fosforilação oxidativa, pois dissipa o gradiente electroquímico transportando H + para o interior da matriz. Ex. FCCP: É um ácido fraco, lipossolúvel na forma protonada e desprotonada. Tem um comportamento semelhante ao do DNP dissipando de igual forma o gradiente electroquímico da membrana. Liga H + no exterior, formando-se FCCPH que passa pela membrana e, no interior o H + é libertado, regressando o FCCP ao exterior. Na presença deste desacoplador a ATP sintetase deixa de funcionar como sintetase de ATP e passa a ter função de ATPase, hidrolizando ATP de forma a repor o gradiente de H +. Protonóforos Cadeia Respiratória e Fosforilação Oxidativa: Nas mitocôndrias, há síntese de ATP e gasto de oxigénio. Estes organelos têm uma dupla membrana, em que a primeira é permeável a quase tudo e serve apenas para isolar, e a mais interior é praticamente impermeável. O espaço intermembranar é muito importante. O número de protões ejectados pela cadeia respiratória é grande, e estas partículas associam-se á fosforilação. Na fosforilação oxidativa mitocondrial (ocorre na membrana interna) existem quatro complexos enzimáticos, onde ocorre transporte de electrões, cuja consequência é a redução do oxigénio a água. Os complexos I, III e IV ejectam protões para o espaço intermembranar, gerando-se um gradiente de protões, que contribui para um potencial eléctrico de membrana particular. O complexo V, ATP-sintetase, sintetiza ATP por fosforilação de ADP (que só ocorre se houver fosfato), quando se dá a passagem de protões pelo complexo. Os ionóforos provocam a ruptura do gradiente protónico. Quando ocorre fosforilação oxidativa, o processo é desacoplado na presença de dinitrofenol, pois este protonóforo transporta protões para o interior da mitocôndria. Na presença de FCCP, também ocorre um aumento de protões no interior da mitocôndria, sendo a velocidade de ejecção maior (processo mais rápido). A baixa densidade e a deslocalização da sua carga permitem que o FCCP atravesse a bicamada com a mesma facilidade tanto no estado protonado como no desprotonado. A cadeia continua a funcionar, consome-se muito oxigénio e não há produção de ATP, mesmo que haja ADP, uma vez que a ATP sintetase não funciona sem o gradiente. Os protonóforos podem ser designados, portanto, de dissociadores energéticos. O dinitrofenol e o FCCP podem levar à morte celular. 41

Aplicação dos Ionóforos: 1. Estudos bioenergéticos, por exemplo sobre a capacidade da membrana interna para sintetizar ATP com base num gradiente electroquímico; 2. Impedir a respiração para que não haja síntese de ATP natural, e assim estudar o efeito de diversos compostos; 3. Estudos bioquímicos, especialmente de permeabilidade membranar. Transporte activo: Refere-se ao transporte de solutos contra um gradiente de concentração, é um processo endergónico estando por isso muitas vezes associado a reacções exergónicas, como hidrólise de ATP, absorção de luz, transporte de electrões e fluxo de outras substâncias a favor do gradiente. Por exemplo o transporte de K + : O transporte de potássio de fora para dentro, onde está mais concentrado, é um processo endergónico (não ocorre espontaneamente) que requer gasto de energia, pois a ΔG = +5 Kcal/mol. Na célula este processo requer transportadores, as ATPases. Transporte activo primário O transporte dos iões está associado ao gasto directo de ATP, utilizando a energia proveniente da hidrólise deste. Um exemplo é a Na + /K + ATPase, entre outras ATPases. Transporte activo secundário Utiliza a energia conservada num gradiente iónico para transportar solutos contra o gradiente de concentração, por um sistema antiporta. Este movimento não está associado à hidrólise de ATP. Um exemplo é o Cotransporte Glicose/Na + nas células epiteliais do intestino. Nota: O co-transporte é o transporte de duas substâncias ao mesmo tempo. Ele pode traduzir o movimento das duas substâncias no mesmo sentido Simporta, ou em sentidos opostos, em que uma entra e outra sai Antiporta. ATPases (Classificação, Funções e Patologias): São proteínas associadas ao transporte activo primário, encontram-se em membranas biológicas e utilizam a energia libertada na hidrólise de ATP para transportarem iões contra o gradiente electroquímico. A manutenção das várias concentrações de iões no meio intracelular é fulcral para a viabilidade das células. No meio citoplasmático é estritamente necessário manter elevadas concentrações de K + e baixas concentrações de Na + e Ca 2+, geralmente o ph é mantido neutro. Deste modo, uma porção significativa da energia disponível na célula é utilizada para manter o gradiente de concentração destes iões (K +, N +, Ca 2+, H + ) através das membranas. 42

Classes de ATPases responsáveis pela manutenção do gradiente iónico: Classe P: 1. Classe P 2. Classe F 3. Classe V 4. Superfamília ABC Foram as primeiras a ser descritas, são as mais conhecidas, as mais abundantes e as que apresentam a estrutura mais simples. São constituídas por 4 subunidades transmembranares, 2α e 2β, as subunidades α contêm o local de ligação do ATP, enquanto que as subunidades β têm função reguladora. Durante o transporte, pelo menos uma das subunidades α é fosforilada e pensa-se que o transporte se dá através dessa subunidade. O transporte de iões por estas ATPases está sempre associado a um ciclo de fosforilação/desfosforilação. O fosfato resultante da hidrólise de ATP é transferido para um resíduo de aminoácido da ATPase, o que conduz a uma alteração conformacional. Pensa-se que é esta alteração que determina a afinidade do transportador pelo ião a ser transportado. A esta classe pertencem as ATPases: - Na + /K + ATPase (Membrana plasmática dos eucariotas); - H + ATPase (Membrana de plantas, fungos e bactérias); - H + /K + ATPase (Membrana plasmática do estômago de mamíferos) - Ca 2+ ATPase (Células eucarióticas, na membrana plasmática e na membrana do retículo sarcoplasmático das células musculares); - Ca 2+ /K + ATPase (Retículo endoplasmático e sarcoplasmático); - K + ATPase (E.coli). Na + /K + ATPase da membrana plasmática: Funciona como antiporta, lançando 3 Na + para fora e 2 K + para dentro. É por isso um sistema electrogénico, que cria um movimento net de 1 + para fora, gerando uma carga negativa dentro da célula. O mecanismo pelo qual esta bomba actua é simples: Os iões de Na + e o ATP ligam-se ao transportador quando este se encontra na conformação E1 (face citosólica da membrana). O ATP é desfosforilado e o fosfato resultante vai fosforilar um resíduo de aspartato do transportador, induzindo uma alteração conformacional da forma E1 para a E2. Os iões de Na + são libertados para o espaço extracelular, ligando-se de seguida dois iões de K + ao transportador (face exoplasmática). Esta ligação promove a remoção do grupo fosfato, levando a nova alteração conformacional. Finalmente os iões de K + são libertados completando o transporte de iões. 43

A ouabaína e a digoxigenina são duas drogas capazes de inibir a função desta bomba. Ligam-se à face exoplasmática, competindo directamente com o K + pelo local de ligação ao transportador e inibindo deste modo a desfosforilação do resíduo de aspartato e consequentemente a função da ATPase. Experiências realizadas em proteoliposomas com Na + /K + ATPases na membrana provaram que é possível sintetizar ATP. Ao induzirmos um interior celular com elevada concentração de K + e um exterior rico em Na +, verifica-se que o transporte se efectua no sentido oposto ao observado nas células, dissipando-se o gradiente gerado artificialmente. O resultado é a produção de ATP a partir de ADP + Pi. Isto vem provar que as ATPases podem também funcionar como ATP sintetases. Nota: Bactérias, fungos e plantas não possuem esta bomba iónica. Nestes organismos o Δψ de membrana é gerado por outras proteínas. Bactérias anaeróbias possuem H + ATPases, que usam o ATP resultante da glicólise para gerar um gradiente de protões. A energia é então conservada num gradiente iónico sendo utilizada para transportar solutos contra o gradiente de concentração (transporte activo secundário). Bactérias aeróbias e mitocôndrias funcionam de forma semelhante. Na cadeia respiratória ocorre transporte de electrões, e associado a este a expulsão de H +. A energia libertada no processo de transferência de electrões é armazenada num gradiente de H + sendo depois utilizada na síntese de ATP. Ca 2+ ATPase das células musculares: Encontra-se presente na membrana plasmática e na membrana do retículo sarcoplasmático. Esta bomba transporta Ca 2+ activamente para fora do citosol, quer para o espaço extracelular, quer para o interior do RS. As biomembranas são relativamente impermeáveis a Ca 2+, sendo fundamental para a funcionalidade da célula que a concentração intracelular deste ião seja baixa. Em virtude de um estímulo hormonal (alteração da voltagem) os canais de Ca 2+ (de reservatórios intracelulares ou do exterior) abrem, levando a um aumento da sua concentração no citoplasma. Este aumento desencadeia várias respostas, como a contracção muscular e a fosforilação de enzimas. A principal fonte de cálcio para a contracção muscular consiste naquele que é libertado pelo retículo sarcoplasmático. 44

a) Ca 2+ ATPase da membrana do Retículo Sarcoplasmático: Constitui mais de 80% do total de proteínas membranares do RS e realiza o transporte de Ca 2+ do citosol para o interior do retículo. O RS é um organelo com grade capacidade de armazenamento de Ca 2+, a sua libertação para o citosol provoca a contracção muscular e a sua remoção por estes transportadores (Ca 2+ ATPase) induz o relaxamento. No interior do RS existem duas proteínas solúveis que ligam Ca 2+ : - Calsequestrina É uma proteína extremamente ácida (37% dos seus aminoácidos são resíduos de aspartato e glutamato). Cada molécula destas é capaz de ligar 43 átomos de Ca 2+. No entanto, e apesar da sua grande capacidade de ligar Ca 2+, possui um K m elevado (K m = 1 mm) o que significa que só liga Ca 2+ quando este está presente em grande quantidade baixa afinidade. - Proteína ligadora de Ca 2+ de alta afinidade É outra proteína presente no interior do RS que auxilia na função de reservatório de Ca 2+. Apesar de ter menor capacidade para se ligar a este ião possui uma afinidade bastante mais elevada (K m = 3-4 μm) A importância destas duas proteínas reside no facto de ambas funcionarem como reservatório intracelular de Ca 2+. Desta forma reduzem a concentração deste ião livre no interior do RS (o gradiente de concentração de determinada substância depende essencialmente da sua quantidade livre no solvente). O gradiente iónico diminui e consequentemente é necessária menor quantidade de energia para promover o transporte activo de Ca 2+ para o interior do RS pelas Ca 2+ ATPases. O mecanismo de funcionamento destas ATPases é igualmente simples. O transporte de Ca 2+ está acoplado à hidrólise de ATP, desta forma, a fosforilação do resíduo de aspartato (pelo fosfato libertado pelo ATP) promove uma alteração conformacional da enzima (Ca 2+ ATPase) de E1 para E2, permitindo a libertação de Ca 2+. Mais especificamente, os locais de grande afinidade para o catião (Ca 2+ ) estão voltados para o citosol (E1), após a ligação de dois iões de Ca 2+, o ATP também se liga à proteína, sendo que esta ligação necessita de um co-factor (Mg 2+ ), ou seja de uma Mg 2+ ATPase. O ATP é então hidrolisado e o fosfato resultante liga-se a um resíduo de aspartato, formando uma ligação aspartil-p altamente energética (E1-P). Induz-se uma alteração conformacional da ATPase para a forma E2, levando a uma perda de afinidade da enzima pelo Ca 2+, que é libertado lúmen do RS. Depois desta libertação, a ligação aspartil-p é hidrolisada, o que provoca uma nova alteração conformacional da enzima para a forma inicial (E1). Neste momento os locais de ligação de Ca 2+ virados para o lúmen ficam inactivos e os do lado citosólico são activados. 45

Experiência de Mitchell Reversibilidade das ATPases: Num meio apropriado, foram colocadas vesículas do RS isoladas e purificadas, juntamente com ATP e Ca 2+. Devido à existência de um gradiente de concentração e energia (ATP), o Ca 2+ é transportado para o interior das vesículas por acção da Ca 2+ ATPase. De seguida transferiram-se as vesículas carregadas com Ca 2+ para uma solução contendo ADP + Pi e nenhum Ca 2+. O resultado é a dissipação do gradiente de Ca 2+ e formação de ATP. Deste modo Mitchell provou que os gradientes iónicos contêm energia suficiente, que pode ser utilizada na síntese de ATP, neste caso, no exterior da vesícula. Provou também a reversibilidade destas proteínas. b) Ca 2+ ATPase da membrana plasmática: É importante para o correcto funcionamento celular manter os níveis de Ca 2+ baixos no citosol, existindo, para tal efeito, na membrana plasmática de várias células, Ca 2+ ATPases, que expelem o Ca 2+ para o espaço extracelular. O aumento da concentração de Ca 2+ no citosol é um sinal de activação de várias respostas celulares, contudo após estas respostas é necessário que a concentração deste ião retome níveis normais no citosol. Deste modo, a célula pode ser estimulada novamente, note-se que elevados níveis de Ca 2+ no citosol podem conduzir à morte celular. O cálcio é excluído pela ATPase para o exterior celular e para o interior de alguns organelos, como o retículo endoplasmático e as mitocôndrias. No entanto, o RE apesar de apresentar grande afinidade para este composto não apresenta grande capacidade de armazenamento, e as mitocôndrias apesar de possuírem grande capacidade de armazenamento não possuem grande afinidade. Como a afinidade é reduzida, este organelo funciona como reservatório apenas em situações de doença, em que a concentração de Ca 2+ é muito elevada. Ou seja, funciona como tampão em situações de disfunção celular (doença). Calmodulina (CaM): Encontra-se grandemente distribuída no citosol e funciona de uma forma simples. É uma proteína com grande afinidade para o Ca 2+, que regula a actividade da Ca 2+ ATPase presente na membrana plasmática de eritrócitos e de outras células, ligando-se alostericamente à enzima, activando-a. Possui 4 locais de ligação para iões Ca 2+ com motivos hélice-loop-hélice (zonas EF). Normalmente possui uma conformação aberta, mas quando a concentração deste ião aumenta acima dos 5x10-7, ele liga-se à CaM e esta sofre uma alteração conformacional, que a torna mais compacta, expondo o seu domínio hidrofóbico. Este serve de interface para a interacção com a Ca 2+ ATPase. Um aumento na concentração intracelular de Ca 2+ induz a ligação de iões Ca 2+ à calmodulina, conduzindo a uma activação alostérica (pela CaM) da Ca 2+ ATPase. Esta altera o K m de 80 μm para 10 μm, aumentando a velocidade de transporte. Assim, a expulsão de Ca 2+ para o exterior aumenta, diminuindo a concentração de Ca 2+ no citosol. 46

Inibidores da Calmodulina: A actividade da calmodulina pode ser inibida pela utilização de Trifluoperazina (TFP) ou de outros agentes anti-psicóticos. Estes ligam-se ao domínio hidrofóbico da calmodulina, ocupando assim, o local de interacção entre a calmodulina e a Ca 2+ ATPase. Esta ocupação impede a activação alostérica do transportador e consequentemente a saída de Ca 2+. Note-se que a ligação de TFP à calmodulina está dependente da ligação de Ca 2+ a esta. Só quando o Ca 2+ se liga à CaM é que o domínio hidrofóbico é exposto e o TFP pode actuar. H + ATPases: A H + ATPase das células vegetais é uma enzima fundamental, desempenhando o papel de bomba de protões para o apoplasto. Desta forma controla o ph intra e extracelular, alcalinizando o citosol e desencadeando a síntese de ácido málico. Este vai afectar o ciclo de Krebs e consequentemente a razão NADH/NAD +. Outras funções são reguladas pela actividade desta ATPase, como a abertura e fecho dos estomas e o desenvolvimento da polaridade nas plantas jovens. É totalmente inibida por DES e Vandato, este último é muito generalista, pois é análogo do fosfato, inibindo todas as fosfatases ácidas, alcalinas e todas as ATPases do tipo P. Classe F: Podem encontrar-se nas membranas mitocondriais, nos cloroplastos (nos tilacóides, no interior dos grana, onde se dá a fotossíntese) e na membrana plasmática de bactérias. Todas as ATPases deste grupo são protónicas, ou seja, promovem o movimento de protões (H + ) e utilizam o seu gradiente para fosforilar ATP, sem a formação de um intermediário fosforilado (não ocorre ciclo de fosforilação/desfosforilação). São constituídas por 8 a 13 peptídeos divididos em dois domínios diferentes: - Domínio hidrofóbico F0 Encontra-se embebido na membrana e forma o canal protónico; - Domínio hidrofílico F1 Local catalítico que promove a síntese de ATP. Estas ATPases sintetizam ATP através do gradiente de protões e, no sentido inverso, usam ATP para transportá-los. Funcionam de forma inversa ás restantes ATPases, pois o gradiente de protões é utilizado para a formação de ATP a partir de ADP + Pi. Contudo, em situações de anoxia (sem respiração), ocorre uma reversão, na qual o ATP é usado para manter os gradientes (ΔH + ), Têm actividade reversa, ou seja, funcionam como ATP sintetases, apenas se os H + fluírem a favor do gradiente de concentração. 47

Classe V: Bastante semelhantes ás do tipo F, sendo também protónicas (transportam exclusivamente H + ), utilizam a energia da hidrólise de ATP sem no entanto formarem um intermediário fosforilado. Mas ao contrário das F, promovem um transporte unidireccional de H + gerando um potencial. Existem na membrana dos vacúolos de plantas, leveduras e outros fungos, nas membranas dos endossomas e lisossomas (mantendo sempre um ph baixo necessário à funcionalidade destes organelos) das células animais e na membrana plasmática dos osteoclastos e das células tubulares dos rins. São formadas por muitas subunidades sendo que algumas estão associadas à hidrólise de ATP e outras à translocação de H +. Dividem-se em dois domínios: - Domínio Vo Forma o canal protónico (o O em índice deriva de oligomicina, um composto que inibe especificamente a passagem por este componente); - Domínio V1 Apresenta actividade catalítica. A acidificação (ph baixo) provocada por estas bombas permite uma melhor acção de clivagem de enzimas digestivas, pois causa desnaturação. São importantes no crescimento dos ossos. ATPases tipo V (em vacúolos): Regulam a concentração de iões e sacarose no interior de vacúolos de plantas. Por exemplo, com a fotossíntese realizada durante o dia há um excesso na produção de sacarose, este excesso é armazenado nos vacúolos. Durante a noite, esta mesma sacarose sai para o citosol onde é metabolizada com consequente produção de ATP. A membrana dos vacúolos possui dois tipos de bombas, H + ATPases (Tipo V) e Pirofosfatases (Bombas protónicas exclusivas de vacúolos de plantas). Estas bombas ao ejectarem H + no interior do vacúolo, conduzem a um decréscimo do ph, bem como a um potencial eléctrico positivo ao longo da face interna da membrana vacuolar. Devido a este gradiente eléctrico ocorre entrada de aniões Cl - e NO 3- através de canais proteicos (Transporte activo em resposta a um gradiente eléctrico Transporte secundário). A entrada destes aniões vai compensar o excesso de cargas positivas presente no interior do vacúolo, dissipando o gradiente eléctrico. Esta dissipação permite a contínua entrada de H + reduzindo assim o valor de energia necessário ao seu transporte activo. Na membrana de vacúolos é também possível encontrar transportadores antiporta, activados pelo gradiente de H +, que vão acumular Na +, Ca 2+, e sacarose no interior do vacúolo, ao mesmo tempo que expelem H + para o citosol. 48

Em suma existem três grandes tipos de transportadores nas membranas vacuolares: Bombas protónicas, canais proteicos, e transportadores antiporta. Renovação óssea Osteoclastos: Os osteoclastos ligam-se ao osso, e fecham um pequeno espaço extracelular entre a membrana plasmática e a superfície deste. Apresentam H + ATPases na membrana que excluem H + para o exterior de forma a baixar o ph externo e dissolver o osso. A solução acídica gerada dissolve a matriz mineral óssea constituída essencialmente por CaCo 3 e hidroxiapatite (fosfato de cálcio). Após terminar o crescimento de um indivíduo, o organismo equilibra a formação de novo tecido ósseo (pelos osteoblastos) com a dissolução da matriz óssea (pelos osteoclastos). Na membrana plasmática dos túbulos renais, existe uma H + ATPase muito importante, pois contribui para a manutenção do equilíbrio ácido-base do organismo ao secretar protões para a urina em formação. A acidez contribui para a destruição de bactérias e para a fluência. ATPases da Superfamília ABC: Recentemente descoberta, todos os membros desta família possuem dois domínios transmembranares (T Formados por 6 α-hélices), que constituem um canal de passagem de solutos, conferindo especificidade a cada membro desta família. Estas ATPases apresentam ainda dois domínios citosólicos (A) de ligação ao ATP. Estes domínios apresentam cerca de 30 a 40% de homologia em todos os membros desta superfamília, evidenciando uma origem evolutiva comum. Algumas proteínas desta superfamília apresentam ainda uma subunidade reguladora, que liga ao substrato. Nesta superfamília não se tem conhecimento da formação de intermediários fosforilados, ou seja, elas utilizam a energia libertada na hidrólise de ATP para efectuar o transporte de solutos. Transportam fosfolípidos, drogas lipofílicas, colesterol e outras moléculas pequenas, na membrana plasmática de mamíferos, e aminoácidos, açúcares e peptídeos, na membrana plasmática de bactérias. Existe uma relação entre estes transportadores e a quimioterapia, uma vez que transportam a adimicina para o exterior da célula assim que ela entra, impedindo a sua acção anti-tumoral. A ideia de que estas ATPases só existem em situações patológicas é falsa, pois estas proteínas encontram-se normalmente nas células. Os aspectos terapêuticos só foram descobertos posteriormente. 49

Permeases da Membrana Plasmática de Bactérias: As bactérias possuem numerosas permeases da superfamília ABC, que as ajudam a captar aminoácidos, açúcares, vitaminas, péptidos, etc. Dado que a maioria destas bactérias vive em solos e charcos com baixas concentrações de solutos, estas proteínas permitem-lhes concentrar nutrientes dentro da célula contra um gradiente de concentração. As bactérias gram (-), como a E.coli, importam solutos através de permeases ABC, que utilizam uma proteína solúvel ligadora de substrato presente no espaço periplasmático. A quantidade de proteína solúvel transportadora presente na membrana é regulada pela concentração de nutrientes no meio, e pelas necessidades metabólicas da bactéria. A Histidina permease é uma permease ABC típica, possui dois domínios transmembranares e dois citosólicos de ligação ao ATP. As bactérias gram negativas possuem a membrana externa separada por um espaço periplasmático da membrana interna. Isto complica a importação de histidina pois obriga-a a atravessar duas membranas. A histidina entra, através de uma porina da membrana externa, para o espaço periplasmático, onde se liga a uma proteína solúvel e específica. Esta vai transportar a histidina directamente para as subunidades T da permease ABC, que por sua vez a transportam para o citosol, à custa da energia libertada pela hidrólise de ATP. MDR1 (Multidrug Resistance Transporte Protein): Algumas células cancerígenas tornam-se frequentemente resistentes a várias drogas quimioterapêuticas. Biólogos celulares observaram que, culturas de células resistentes a uma toxina em particular, muitas vezes se tornavam também resistentes a outras drogas. Estudos subsequentes revelaram que esta resistência se devia à expressão de um transportador proteico conhecido como MDR1. Uma glicoproteína transmembranar pertencente à superfamília ABC que possui as 4 subunidades fundidas numa única unidade, e exporta drogas do citosol para o meio extracelular. As drogas transportadas por esta proteína são pequenas moléculas hidrofóbicas que se difundem através da membrana plasmática para o citosol, a MDR1 ao expelir estas substâncias de volta ao espaço extracelular faz com que maiores concentrações de toxina sejam necessárias para um tratamento quimioterapêutico. A MDR1 existe principalmente em órgãos como o fígado, intestinos e rins, locais onde se executa a remoção de produtos naturais tóxicos ao organismo. E nestes casos, a função de MDR1 é o transporte de vários produtos para a bílis, lúmen intersticial ou urina. Pensa-se que durante a evolução, esta proteína tenha adquirido a capacidade de transportar drogas semelhantes a estas toxinas naturais. Nas células cancerígenas do fígado, os hepatomas, as células tendem a sobre expressar esta proteína tornando-se resistentes a muitos agentes terapêuticos. 50

Possível modelo de acção da MDR1 Modelo Flipase: Este modelo propõe que a substância lipossolúvel se difunda passivamente através do folheto citoplasmático da membrana, até alcançar o local de ligação do transportador MDR1, localizado no interior da bicamada lipídica. O composto a transportar tem sempre uma parte polar e uma parte apolar e, alinhando-se com as zonas hidrofílicas e hidrofóbicas das membranas, é depois integrado entre as subunidades T. De seguida, e à custa da energia da hidrólise de ATP, estas subunidades sofrem um movimento de flip-flop, sendo a droga transportada para o folheto externo da membrana plasmática e depois excretada no meio extracelular. De acordo com este modelo, cada transportador tem um único local de ligação para a droga. Como o transporte se dá de uma zona menos concentrada para uma zona mais concentrada, o transporte é activo e dá-se com gasto de ATP. Este modelo de flipase fundamenta-se no mecanismo de acção de uma proteína homóloga, a MDR2, existente na membrana plasmática dos hepatócitos. Esta promove o flip de fosfolípidos do folheto citosólico da membrana para o folheto extracelular. Estes fosfolípidos vão fazer parte essencial da bílis. Existe ainda um outro modelo, o do transportador tipo bomba. Neste modelo a droga é transportada segundo um mecanismo semelhante às restantes ATPases, com gasto de ATP. Fibrose Cística (Mucoviscidose): É uma doença genética, comum entre caucasianos, que está associada a mutações autossómica recessivas em ABC ATPases. Caracteriza-se por uma obstrução dos sistemas respiratório e gastrointestinal, que leva a infecções bacterianas. Os indivíduos que sofrem desta doença exprimem uma proteína membranar mutante, a CFTR, constituída por 12 α-hélices transmembranares e estruturalmente semelhante à MDR1. A proteína CFTR normal (presente nas membranas dos pulmões e do pâncreas), funciona como um canal específico para cloro, que aumenta a sua actividade quando fosforilado. Mutações no gene codificante para esta proteína podem ter os seguintes efeitos: - A proteína não se insere adequadamente na membrana; - A proteína é inserida correctamente na membrana mas não é fosforilada. 51

Qualquer um dos casos resulta num canal de Cl - não funcional. Normalmente, as células epiteliais que revestem a superfície interna dos pulmões secretam uma substância mucosa, que aprisiona e mata as bactérias invasoras, sendo estas expelidas para o exterior com a ajuda do movimento dos cílios das células do trato respiratório. Em indivíduos saudáveis, o muco é uma solução com baixa concentração de NaCl, infelizmente em pacientes com fibrose cística a concentração de NaCl é elevada, o muco é mais espesso e as trocas gasosas são mais difíceis (eficiência grandemente reduzida). Existe um trocador Cl - /CO 3 -. Sendo a CFTR um canal de Cl -, se esta proteína não estiver a funcionar correctamente (mutada), não há exportação deste anião. Não ocorre saída de cloreto, logo os gradientes de Cl - e Na + ficam alterados (no muco). A capacidade bactericida do muco é diminuída. Sistemas Simporta e Antiporta e Regulação do ph citosólico: Para que as células possam crescer e dividir-se correctamente, o ph citosólico é um factor importante, devendo ser muito bem regulado e mantido sempre dentro dos estreitos limites. No interior celular, são muitas as reacções metabólicas de que resultam ácidos fracos, estes dissociam-se e aumentam a concentração de H + livre no citosol. São por isso necessários sistemas membranares para transportar os H + para o espaço extracelular, só assim se consegue prevenir a acidificação do citoplasma. Co-transportador Na + HCO 3 - /Cl - : Este transportador importa 1 Na + segundo o seu gradiente - de concentração, juntamente com 1 HCO 3 contra o seu gradiente. - Uma vez dentro da célula o HCO 3 combina-se com um H +, proveniente do metabolismo celular, originando H 2 O e CO 2, que se difunde para fora da célula. Desta forma, o correcto funcionamento deste transportador contribui para a manutenção do ph citosólico, uma vez que reduz o número de H + livres no citoplasma. Antiporta H + /Na + : Conjuga a entrada de Na + segundo o seu gradiente de concentração com a saída de H + contra o gradiente de concentração deste. Antiporta Cl - /HCO 3 - : É um transportador presente na membrana plasmática das células animais (semelhante à banda 3 de eritrócitos) que contribui para a manutenção do ph extracelular. Este transportador combina a saída de 1 HCO 3 - citosólico em troca com a entrada de 1 Cl - a favor do seu gradiente de concentração, é um transporte electroneutro. Baixa o ph citosólico ao exportar o excesso de OH -. 52

A actividade destes três transportadores (Co-transportador Na + HCO 3 - /Cl -, Antiporta H + /Na + e Antiporta Cl - / HCO 3 - ) depende do ph do meio. As células encontram-se assim equipadas com mecanismos bastante eficientes para regular o seu ph. Quando o ph desce, o antiporta Na + /H + e o co-transporte Na + HCO 3 - /Cl - são activados. A sua função é baixar a concentração de H + livres no citosol, elevando o ph. Quando o ph está acima de 7 é o antiporta Cl - /HCO 3 - que fica activo, expelindo HCO 3 - até o ph baixar para valores fisiológicos. Banda 3 Antiporta Cl - /HCO 3 - : O seu nome deriva do facto de ser a terceira banda a aparecer num gel de um eritrócito. Existe nos eritrócitos, mas também nas células parietais do estômago. É um transportador essencial ao nosso organismo, pois permite o eficiente transporte de CO 2 pelos eritrócitos. Este transportador promove um antiporta electroneutro, com saída e entrada de 1 anião monovalente, mas é também capaz de efectuar a reacção inversa, dependendo a direcção do transporte apenas do gradiente de concentração. a) Capilares Sistémicos: O CO 2 resultante do metabolismo é libertado nos capilares, difundindo-se para os eritrócitos. Ao combinar-se com a H 2 O (pela acção da anidrase carbónica) origina H 2 CO 3 (ácido carbónico), que rapidamente se dissocia em HCO 3 - e H +. Este processo é simultâneo à libertação de O 2 pela hemoglobina, induzindo uma alteração conformacional desta, o que possibilita a ligação de H + ao resíduo de histidina. A remoção de H + - pela histidina provoca uma deslocação da reacção H 2 O + CO 2 HCO 3 + H + para a direita, no sentido de produzir mais H +. Assim a concentração de HCO - 3 no interior do eritrócito aumenta muito. É neste momento que o transportador (Banda 3) promove a troca entre Cl - /HCO - - 3, exportando HCO 3 e importando Cl -. Este sistema é de grande importância para o organismo pois permite o transporte de CO 2 dos tecidos para os pulmões, sendo que cerca de 80% do CO 2 produzido pelo metabolismo celular é exportado desta forma. É também importante uma vez que sem a - troca de aniões, o ph do citosol dos eritrócitos ficaria muito mais básico. A troca de HCO 3 por Cl - permite manter do ph citosólico perto da neutralidade. b) Capilares Pulmonares: Nos capilares pulmonares, a direcção de troca é inversa. O CO 2 transportado pelos eritrócitos difunde-se pela membrana e é expelido na respiração. Há um decréscimo na concentração de CO 2, deslocando a reacção acima descrita no sentido inverso, produzindo-se mais CO 2 e H 2 O (esta reacção também é catalizada pela anidrase carbónica). 53

Como a concentração de O 2 no exterior (pulmões) é elevada, este tem tendência a entrar para o interior do eritrócito (difusão) e a ligar-se à hemoglobina, que, por sua vez, sofre uma alteração conformacional e liberta o H + ligado ao resíduo de histidina. - Devido a todos estes factores a concentração de HCO 3 no interior do eritrócito diminui, e por isso, a Banda 3 promove a sua entrada em troca com Cl -. Assim, a influência do H + no citosol diminui, ficando o ph menos ácido. c) Células Parietais do Estômago: O estômago dos mamíferos contém uma solução 0,1 M de ácido clorídrico (HCl). Este ácido elimina muitas bactérias ingeridas e desnatura proteínas, que depois vão ser degradadas por enzimas proteolíticas actuantes a ph ácido (Ex. Pepsina). As células parietais têm como função secretar HCl para o lúmen do estômago, tornando-o ácido, pois as enzimas que aqui actuam, só funcionam neste ph. No entanto, o ph destas células dever ser mantido em valores fisiológicos. A membrane apical das células parietais possui H + /K + ATPases, bem como canais proteicos de Cl - e K +. A membrana basolateral contém antiportas Cl - /HCO 3 -. Nas células parietais, H 2 O dissociase em H + e OH -, e este último reage com CO 2 formando HCO 3 -, que, por acção da antiporta Cl - / HCO 3 - é trocado por cloreto. O H + é transportado para o lúmen por troca com K + (acção da H + /K + ATPase). O transporte de K + é cíclico, uma vez que ele é transportado para o citosol, pela ATPase, saindo de novo para o lúmen, pelos canais proteicos. Assim, o K + entra para o citosol por troca com H + (ATPase), que sai para o lúmen. No entanto o Cl - que entra no citosol (por troca com HCO 3 - ) volta a sair, saindo também um K + (pelo canal proteico) para compensar as cargas, mantendo-se a electroneutralidade. O ph do interior mantém-se constante, porque saem iões H +, mas também grupos OH - (CO 2 + OH - HCO 3 -, por acção da anidrase carbónica). Se estes últimos não saíssem, o ph tornar-se-ia básico. Daí a importância do antiporta Cl - /HCO 3 -. Assim, a combinação dos diferentes transportes, com a acção da anidrase carbónica, permite acidificar o lúmen do estômago, mantendo o ph das células parietais electroneutro. Co-transporte Glicose/Na + (Células Epiteliais do Intestino): Nas células epiteliais do intestino, a concentração celular de Na + é mantida muito baixa devido à acção de uma Na + /K + ATPase (Transporte primário), localizada na membrana basolateral, que expele Na + para o exterior contra um gradiente de concentração. Em resposta a este mesmo gradiente de concentração, o Na + tem tendência a entrar na célula, e esta utiliza a energia conservada no gradiente iónico para transportar glicose, juntamente com Na +, contra o gradiente de concentração (Cotransporte Transporte secundário). 54

Este co-transportador Glucose/Na + encontra-se na membrana apical e liga 2 Na + e uma molécula de glicose na face externa da membrana. Quando os iões de Na + são libertados no meio intracelular, o transportador sofre uma alteração conformacional, perdendo afinidade pela molécula de glicose que é então libertada no interior da célula. Dentro da célula, a molécula de glicose atravessa a membrana basolateral através de outro transportador, o GLUT2, que permite a difusão facilitada da glicose, passando esta para a corrente sanguínea. Antiporta de Na + /Ca 2+ (Células Musculares e Nervosas): É bastante importante regular os níveis de Ca 2+ no interior das células. Ligeiras variações na concentração deste ião são responsáveis por muitos processos biológicos, como a contracção muscular, secreção em glândulas e transmissão do impulso nervoso. No entanto, depois da resposta ser efectuada, convém que os níveis de Ca 2+ retomem valores normais, para isso existem dois transportadores importantes a Ca 2+ ATPase (referida anteriormente, que utiliza a hidrólise de ATP para excluir Ca 2+ ) e o transportador Na + /Ca 2+, que é o principal responsável pela exclusão de Ca 2+ em células nervosas e musculares. O transportador Na + /Ca 2+ efectua um movimento antiporte e electrogénico. Não há compensação de cargas, uma vez que entram três cargas positivas (3 Na + ) e saem duas (1 Ca 2+ ). Este transporte é electroforético, pois acontece à custa de um estímulo (campo eléctrico). Trata-se de um transportador activo secundário, pois o Ca 2+ é excluído devido a um gradiente de concentração de Na +, este é, no entanto, criado pela Na + /Ca 2+ ATPase. Inibidores Cardiotónicos: Estes compostos levam à diminuição do ritmo cardíaco, inibindo as bombas de K + e Ca 2+. Aumentam a força de contracção do músculo cardíaco. A oubaína é um inibidor cardiotónico, é uma droga terapêutica usada em casos de insuficiência cardíaca. Drogas como esta são frequentemente referidas como glicosídeos cardíacos, pois possuem resíduos de açúcares, embora estes não contribuam para a sua função, mas sim para a sua solubilidade no fluido intersticial. Os glicosídeos ligam-se exclusivamente à face citosólica da Na + /K + ATPase, formando um complexo muito estável, impedindo que o K + se ligue e seja importado pela célula. A inibição da Na + /K + ATPase provoca um aumento da concentração de sódio no interior da célula, que conduz à activação da Na + /Ca 2+ ATPase. No entanto, este trocador não funciona normalmente se a concentração de sódio dentro da célula aumentar, uma vez que o gradiente de concentração de Na + regula a actividade do antiporte Na + /Ca 2+. Logo, a bomba Na + /Ca 2+ fica inactiva, levando a um aumento da concentração de cálcio no interior celular (citosol). 55

Concentrações elevadas deste ião (no citosol) promovem um aumento da força de contracção muscular. Devido à acumulação de cargas positivas no interior celular, o potencial eléctrico ao longo da membrana diminui e o Cl - extracelular entra (em condições normais o potencial eléctrico sobrepõem-se à sua entrada, mas neste caso essa barreira é desfeita). Com a entrada destes iões, a concentração iónica intracelular é elevada e a água tende a entrar para contra-balançar a osmolaridade. Por esta razão as células que revestem os vasos sanguíneos aumentam de volume e consequentemente dá-se um aumento da pressão arterial. Os glicosídeos são, por este motivo, utilizados com agentes terapêuticos em casos de insuficiência cardíaca. No entanto podem funcionar como um veneno em casos de hipertensão (elevados níveis de glicosídeos). Existem várias plantas (Ex. Dedaleiro) e animais (Ex. Borboleta Monarca) que produzem glicosídeos ou esteróides cardiotónicos, de forma a poderem defender-se dos predadores. Sistemas Transportadores em Procariotas: Em procariotas o transporte de nutrientes é mais difícil e não é efectuado da mesma forma que em eucariotas devido a dois factores: elevado. - O meio em que habitam difere muito em termos de composição nutricional; - Têm de concentrar nutrientes contra um gradiente de concentração muito Durante o processo evolutivo as bactérias desenvolveram e sistemas de transporte poderosos, capazes de funcionar mesmo quando o gradiente de concentração é de 100 vezes, entre interior e exterior celular. Normalmente, as permeases presentes nas bactérias são indutíveis, ou seja, a quantidade de transportadores na membrana depende da concentração de nutrientes no meio extracelular e das necessidades metabólicas da célula. De uma forma geral existem três tipos de transportadores em procariotas: 1. Sistema simporta Lactose/H + ; 2. Sistema de Fosfotransferase (Translocação de um grupo fosfato); 3. Bacteriorodopsina (Bomba protónica). 1. Sistema Simporta Lactose/H + em E. coli: Muitas bactérias obtêm a energia de que necessitam a partir da oxidação de glucose em CO 2. Durante este processo os electrões são transferidos para intermediários metabólicos, como o piruvato e o NADH, ou para o O 2 no final da respiração. Os transportadores de electrões nas bactérias são proteínas integrais membranares, semelhante ao que acontece nas mitocôndrias. Ao longo da cadeia respiratória os electrões vão sendo bombeados para o espaço extracelular, por um transporte activo primário do qual resulta um potencial eléctrico de membrana (cerca de 100 mv no interior) e um gradiente de H +. A energia conservada neste gradiente electroquímico de H + é utilizada para sintetizar ATP e para importar nutrientes para o interior do procariota. 56

Em E. coli a lactose é acumulada no interior através de uma permease Lactose/ H + simporta, constituída por 12 α-hélices transmembranares, que formam um canal central, permitindo a passagem de H + e lactose. Ocorre um influxo (entrada) de H + segundo um gradiente de concentração acoplado ao transporte de lactose na mesma direcção. Trata-se de um transporte activo secundário. Demonstração do Co-transporte de Lactose/H + : Utilizando um inibidor como o cianeto, podemos observar como este movimento é dependente da fosforilação oxidativa E.coli envenenadas com cianeto são incapazes de acidificar o meio extracelular, através de uma bombagem activa de H + (bomba protónica inibida), e, consequentemente, acumular lactose. O ph interno e externo igualam-se. Se adicionar-mos HCl ao meio (acidificação) estamos a fornecer H +, não havendo assim, qualquer limitação ao simporta Lactose/H +. Neste caso as bactérias adquirem capacidade para acumular lactose, utilizando a energia contida neste gradiente de H + artificial, o simporta dá-se mais rapidamente. A acumulação de lactose requer um potencial de H + (força protomotriz). A eficiência das mitocôndrias deve-se à acumulação de H + no espaço intermembranar, o mesmo acontece nas bactérias que possuem duas membranas. Uma outra experiência que demonstra este co-transporte consiste em adicionar valinomicina a uma cultura de E.coli mutante, que não expressa a permease Lactose/H +. A valinomicina é um ionóforo de K +, que ao transportá-lo para o exterior cria um potencial eléctrico capaz de sustentar o transporte de lactose. Devido ao gradiente de concentração, o K + tende a entrar na célula e ao fazê-lo promove também a entrada da lactose. 2. Sistema de Fosfotransferase (Translocação de um grupo fosforil): Quando células eucarióticas executam a importação de substâncias, como a glicose ou aminoácidos, quer por difusão facilitada ou simporta, as moléculas são transportadas de forma intacta, e, uma vez dentro da célula são modificadas (por exemplo fosforiladas) de forma a impedir a sua saída e a manter o gradiente de concentração da substancia em questão. 57

Contrariamente, em bactérias alguns nutrientes são modificados enquanto se processa o transporte para o interior (da bactéria) por um processo denominado translocação de grupo. Outra diferença que se verifica neste tipo de transporte é a utilização de PEP (Fosfo-enol-piruvato) em vez de ATP como molécula dadora de grupo fosforil. Isto justifica-se porque a ΔG resultante da hidrólise desta molécula é maior, favorecendo a ocorrência de reacções mais endotérmicas em simultâneo, e, porque o PEP é um intermediário do catabolismo da glicose a piruvato, podendo tornar-se um ponto de regulação. Sistema de Fosfotransferase em E.coli: A importação de açúcares para E.coli é um movimento muito específico, cada açúcar é importado por uma enzima II (E2) específica, trata-se de uma enzima integral da membrana plasmática que forma um canal e ao mesmo tempo transfere um grupo fosfato para o açúcar, enquanto este se desloca pela membrana. O mecanismo de acção é bastante simples, embora um pouco confuso. Este pode ser dividido em duas fases, na primeira estão envolvidas duas proteínas citoplasmáticas solúveis, E1 e HPr (pequeno peptídeo). O primeiro passo é a passagem do fosfato do PEP para a proteína E1, o segundo é a transferiência deste mesmo fosfato de E1 para HPr. A segunda fase envolve outras duas enzimas, E2 e E3. O HPr tranfere o seu grupo fosfato para a enzima E3 e esta por sua vez vai passa-lo para E2. Esta ao funcionar como um canal transmembranar, permite a passagem de açúcares, sendo o fosfato proveniente do PEP transferido para o açúcar em questão. Nota: No transporte de açúcares, as enzimas E1 e HPr são generalistas, ou seja, actuam em todos os casos, no entanto as enzimas E2 e E3 são específicas para cada tipo de açúcar. Se uma mutação afectar a enzima E1 ou o HPr, todos os transportes de açúcares são afectados, enquanto que, se a mutação ocorrer na enzima E2 ou na E3, só o transporte de um determinado tipo de açúcar é que é afectado. Se a E2 for específica para a glicose, também o é a E3, pois funcionam acopladas. Este sistema para além das funções de transporte tem também funções reguladoras. De facto a abundância de açúcares acumulados por este sistema (PTS Phosphotransferase System) vai inibir outros sistemas de transporte activo de açúcares. 3. Bacteriorodopsina (Bomba protónica): Encontra-se presente em Halobacterium halobium, uma bactéria que vive em ambientes muito salinos e pouco oxigenados (Ex. Mar Morto, Salinas da Figueira da Foz). Na presença de O 2 esta bactéria oxida substratos para obter energia química (ATP), contudo, a elevadas concentrações de sal, a solubilidade deste gás é baixíssima, pelo que o metabolismo é baixo. A luz é então utilizada como fonte de energia alternativa, ou seja, em condições anaeróbias estas bactérias utilizam a energia luminosa para criar um 58

gradiente electroquímico de H +, sendo este utilizado para sintetizar ATP ou para transportar substâncias para o interior celular. É composta por 7 α-hélices transmembranares. Possui um grupo retinal (cromóforo fotossensível envolvido no processo de absorção de luz) localizado na zona mediana interior da proteína, rodeado pelas 7 hélices. Este grupo está ligado a uma lisina da cadeia polipeptídica, através de uma Base de Shiff protonada. Quando o grupo retinal absorve luz, sofre uma isomerização, passando de retinal all-trans (protonado) para retinal 13-cis (desprotonado), libertando-se um H + para o meio extracelular. Esta forma (retinal 13-cis) volta a receber um protão do citoplasma, regressando ao isómero inicial (por cada ciclo de isomerização é libertado um H + ). O interior da bacteriorodopsina forma um canal iónico constituído por duas subunidades que nunca estão directamente em contacto, sendo que a ligação entre estas é estabelecida pelo grupo retinal. Os resíduos de Asp85 (localizado na subunidade virada para o meio externo) e Asp96 (localizado na subunidade virada para o citosol) formam o cabo condutor de H +, que é uma cadeia de ligação de H + formada pelo alinhamento das cadeias laterais destes dois resíduos de aminoácidos no interior do canal iónico. Resumindo: 1. Na ausência de luz a Base de Shiff está protonada e o grupo retinal encontra-se na forma all-trans; 2. Ao absorver luz, o grupo retinal sofre uma isomerização para a forma 13-cis e liberta um protão (H + ) para o resíduo Asp85; 3. Uma rede de ligação de H é formada pelo alinhamento dos resíduos laterais de aminoácidos, e funciona como um cabo condutor de transferência de H + ; 4. O H + é transferido através desta rede para o meio extracelular; 5. A re-protonação da Base de Shiff é feita por cedência de um H + pelo resíduo Asp96 que por sua vez o retirou do citosol; 6. O grupo retinal retoma a sua conformação all-trans. Interiorização celular de macromoléculas: A endocitose é o processo pelo qual uma pequena região da membrana plasmática invagina, formando uma vesícula membranar intracelular. Existem dois tipos de endocitose: - Pinocitose: Não específica; - Endocitose mediada por receptores: Um receptor específico na superfície da membrana plasmática liga-se à proteína extracelular que reconhece (ligando). A região da membrana que contém o complexo receptor-ligando invagina, tansformando-se numa vesícula de transporte. A taxa de endocitose de um ligando por este processo depende da quantidade de receptor específico disponível. Através deste processo os complexos receptor-ligando são selectivamente incorporados em vesículas de 59

transporte, sendo todas as outras proteínas membranares excluídas da vesícula endocitada. A endocitose mediada por receptores ocorre via poços e vesículas de clatrina (actua como um esqueleto flexível). Os poços revestidos por clatrina formam quase 2% da superfície membranar dos hepatócitos e dos fibroblastos. Alguns receptores aglomeram-se nos poços de clatrina mesmo sem ligando, outros difundem-se livremente pela membrana, mas quando se ligam à proteína, os complexos (receptor-ligando) ao passarem por um poço de clatrina ficam lá retidos, formando-se uma vesícula. Receptores como LDL e transferina são frequentemente encontrados associados a estas vesículas de clatrina. Pensa-se que a polimerização espontânea da clatrina provoca a expansão dos poços e consequentemente, a formação de vesículas. Após serem endocitadas, as vesículas perdem o revestimento de clatrina, formando vesículas de superfície lisa. Os receptores endocitados são geralmente reciclados intactos, regressando ao ponto de origem. Endocitose mediada por receptores de LDL: A LDL (Low Density Lipoprotein) é uma proteína transportadora de triglicerídeos e colesterol endógenos, do fígado para os tecidos. Está presente na corrente sanguínea. As células obtêm colesterol principalmente por meio de endocitose mediada por receptores de LDL, sendo que a maioria das células produz receptores específicos para esta proteína. Ocorre como descrito em cima. Na maior parte dos casos o receptor e o ligando dissociam-se após a endocitose, o receptor regressa à superfície celular enquanto o ligando é transportado para lisossomas, onde é degradado. O colesterol não é hidrosolúvel, logo necessita de um transportador que o seja. A LDL é uma esfera com cerca de 20 nm de diâmetro, cuja superfície exterior é uma monocamada membranar de fosfolípidos e colesterol, onde uma molécula proteica muito grande (apoproteína-b) se encontra. No interior existe um núcleo extremamente apolar, composto por ésteres de colesterol. O receptor de LDL é uma glicoproteína de cadeia sinples de 839 aminoácidos. Cerca de 50 aminoácidos do terminal C estão virados para o citosol e alguns destes estão envolvidos na ligação do receptor ao poço de clatrina. No terminal N há 320 aminoácidos, extremamente ricos em pontes dissulfito de resíduos de cisteína, é neste terminal que se encontra o local de ligação para LDL. Só quando o receptor é danificado é que é transportado para um lisossoma, onde é degradado. Enquanto funcionar correctamente é sempre reciclado e retorna à membrana plasmática para transportar mais LDL. A LDL liga-se a um receptor específico na membrana e inicia o processo de endocitose, forma-se um endossoma (vesícula) que a transporta, juntamente com o seu receptor associado, para o interior da célula. Nos endossomas (vesículas) ocorre a separação ligando-receptor, as vesículas possuem uma parte esférica que contém os ligandos e prolongamentos cilíndricos que contêm os receptores. 60

As partes esféricas fundem-se com lisossomas, onde a apoproteína-b é degradada em aminoácidos, e os ésteres de colesterol hidrolisados a colesterol e ácidos gordos. Os receptores de LDL retornam à superfície celular. O colesterol é incorporado na membrana plasmática ou re-esterificado e armazenado como lípido dentro da célula, para uso posterior. Os ácidos gordos são utilizados para fabricar fosfolípidos e triglicerídeos. As apoproteínas-b são constituídas por muita gordura e pouca proteína, sendo por isso consideradas como mau colesterol. Transportam o colesterol do fígado para os tecidos, no plasma. A diferença entre mau e bom colesterol deve-se às diferentes apoproteinas. Na parede dos vasos existem receptores para as apoproteinas-b, fazendo com que estas sejam absorvidas para a região subendotelial, formando os ateromas por acumulação (Aterosclerose). O facto de não haver receptores paras as apoproteínas-a faz com que estas prossigam o seu percurso, não sendo absorvidas. Hipercolesterolémia Familiar: O nível celular de colesterol é auto-regulado. Quando existe um excesso de colesterol na célula a hidroximetil glutaril CoA reductase (HMG CoA reductase) impede a síntese de colesterol, impedindo a síntese de um dos seus intermediários, o ácido meavónico. No entanto activa a ACAT (colesterol acil transferase), que promove a esterificação e o armazenamento do colesterol captado da corrente sanguínea. Numa situação de excesso é igualmente interrompida a síntese de receptores de LDL, diminuindo a captação do sangue. É uma doença hereditária que provoca, nas pessoas afectadas, a produção de receptores de LDL defeituosos. Caracteriza-se por: - Elevados níveis de colesterol; - Receptores de LDL mutantes; - Morte dos homozigóticos ainda muito jovens (antes dos 20 anos) por ataque cardíaco (aterosclerose). É comum, afecta 1 em 106 indivíduos. Nos homozigóticos pode acontecer um dos três casos: - O receptor não é produzido, não liga ou liga fracamente as LDL; - O segmento transmembranar não é produzido, embora o mutante ligue as LDL normalmente, não consegue ancorar à membrana plasmática e é secretado da célula; 61

- O receptor está distribuído uniformemente na membrana plasmática, não estando presente em grande quantidade nos poços. Nos heterozigóticos: - Apenas 50% dos receptores são normais; - O nível de colesterol no sangue é mais elevado que o normal, mas mais baixo do que em indivíduos homozigóticos; - As pessoas afectadas estão sujeitas a ataques cardíacos, sobretudo depois dos 40 anos. Mecanismos de acção de fármacos reguladores do conteúdo celular de colesterol: Com o objectivo de diminuir o conteúdo em colesterol do sangue existem diversos fármacos com diferentes estratégias. O colesterol produzido no fígado, e que incorpora os ácidos biliares, pode, em situação normal, ser reciclado a partir do intestino e reposto na circulação sanguínea. Existem medicamentos capazes de se ligarem aos ácidos biliares no intestino, impedindo a reciclagem e obrigando o colesterol a ser excretado nas fezes. Desta forma as células hepáticas têm menos uma fonte de colesterol, sendo obrigadas a produzir mais receptores LDL e a captar mais colesterol do sangue, baixando os seus níveis neste fluído. Outros medicamentos inibem a síntese intracelular de colesterol a partir de Acetil- CoA, obrigando a célula a recorrer à captação aumentada de LDL sanguíneo para manter os níveis celulares de colesterol, situação que é conseguida através da produção aumentada de receptores LDL. Sinalização Celular: Em organismos multicelulares, nenhuma célula é capaz de viver isolada. A sobrevivência depende de uma complexa rede de comunicações intercelular que coordena o crescimento, diferenciação e metabolismo das células dos diversos tecidos e órgãos. É frequente que, em pequenos grupos de células, estas comuniquem por contacto directo célula-a-célula. Algumas recorrem a junções especializadas da membrana plasmática que lhes permite a passagem de pequenas moléculas e a coordenação de respostas metabólicas. Outras junções entre células adjacentes determinam a forma e a rigidez de determinado tecido. Entre diferentes tipos de células, a comunicação dá-se quando uma certa proteína de uma célula se liga a uma proteína receptora, na superfície de outra célula, desencadeando a sua diferenciação. Este processo é essencial para a organização de novos tecidos. Como é que as células comunicam através de moléculas sinalizadoras extracelulares? As moléculas sinalizadoras extracelulares podem ser pequenas moléculas derivadas de aminoácidos, peptídeos ou proteínas. Têm a capacidade de se difundirem para o exterior, podendo também ser transportadas pela corrente sanguínea, possibilitando uma comunicação a longa distância. 62

O processo de sinalização envolve normalmente 6 passos: 1. Síntese da molécula sinalizadora; 2. Libertação da molécula sinalizadora; 3. Transporte do sinal para célula alvo; 4. Detecção do sinal por receptores específicos na célula alvo; 5. Alterações do metabolismo celular, afectando a função ou o desenvolvimento (accionadas pelo complexo sinal/receptor); 6. Remoção do sinal, terminando a resposta celular. As células alvo promovem a transdução de sinal, ou seja, convertem o sinal extracelular em respostas celulares, actuando sobre enzimas metabólicas (alteração do metabolismo), genes que regulam proteínas (alteração da sua expressão) e proteínas do citosqueleto (alteração da forma e movimento das células alvo). Existem compostos químicos libertados por certos organismos eucariotas, como as leveduras, bolores, protozoários, algumas algas e animais, que vão alterar o comportamento ou a expressão genética de outros organismos da mesma espécie, são um tipo de sinalização próxima. Estes compostos denominam-se por feromonas. Em animais e plantas evidenciam-se as moléculas de sinalização extracelular que actuam dentro do organismo, controlando todas as suas actividades. Tipos de sinalização intercelular em animais: A sinalização intercelular existente ao nível dos animais (e das plantas) inclui: (a) Endócrina; (b) Parácrina; (c) Autócrina; (d) Sinalização directa por proteínas ligadas à membrana plasmática. A sinalização intercelular ocorre através da libertação de uma molécula secretora extracelular, que percorre alguns µm antes de ligar à célula alvo (b e c), ou metros (a). (a) Sinalização Endócrina: Caracteriza-se pela existência de hormonas, nos animais, estas são libertadas para a corrente sanguínea, actuando em células alvo distantes do local de síntese (células das glândulas endócrinas). (b) Sinalização Parácrina: Os neurotransmissores são exemplos de moléculas sinalizadoras libertadas pelas células, que apenas afectam células alvo próximas. São libertados por exemplo, na condução de um impulso nervoso de uma célula nervosa para outra, ou de uma célula nervosa para uma célula muscular (induzindo ou inibindo a contracção muscular). 63

(c) Sinalização Autócrina: Ocorre quando a célula responde a substâncias que ela própria liberta. Muitos factores de crescimento actuam por este processo, por exemplo, as células em cultura secretam factores de crescimento que estimulam o seu próprio crescimento e proliferação. Este tipo de sinalização, numa situação anormal, pode originar células tumorais, provocando cancro. (d) Sinalização directa por proteínas ligadas à membrana plasmática: Proteínas ligadas à membrana plasmática de uma célula interagem directamente com receptores de uma célula adjacente. Existem compostos que actuam em 2 ou mais tipos de sinalização: EGF (Epidermal Grow Factor Hormona): Esta proteína é sintetizada como parte exoplasmática de uma proteína membranar que pode ligar e comunicar com uma célula adjacente por contacto directo (Sinalização de proteínas ligadas à membrana plasmática). No entanto pode ser clivada por uma protease e libertada na corrente sanguínea actuando assim como um agente endócrino em células alvo distantes (Sinalização endócrina); Epinefrina (derivada de aminoácidos): Actua como neurotransmissor (Sinalização parácrina) ou como hormona sistémica (Sinalização endócrina). As hormonas: 1. Modulam actividades enzimáticas em células-alvo; 2. Alteram propriedades ou taxas de síntese de proteínas existentes; 3. Induzem a síntese de novas proteínas. Efeitos Pleiotrópicos: Diferentes tipos de células-alvo respondem ao mesmo conjunto de sinais mas de um modo diferente. Especificidade do receptor: Receptores são glicoproteínas que ligam reversivelmente compostos químicos específicos que, ao contrário das enzimas, não os alteram quimicamente. Receptores específicos são responsáveis por mediar as respostas celulares. 64

O receptor tem alta afinidade pelo ligando (1º mensageiro) e a ligação entre eles desencadeia uma resposta celular, determinada pelo tipo de receptor (especificidade efectora) e pelas reacções desencadeadas pela ligação do complexo ligando-receptor. A ligação do ligando ao seu receptor específico causa uma alteração conformacional no receptor que é activado, sendo responsável por iniciar um programa molecular que leva à resposta celular específica. Assim, a resposta celular a uma hormona específica é determinada por: 1. Tipo de receptor; 2. Reacções intracelulares iniciadas pelo complexo L R. Diferentes respostas podem ocorrer com: - O mesmo ligando a ligar a receptores diferentes em células diferentes; - O mesmo receptor para o mesmo ligando, em células diferentes; - Numa mesma célula, receptores diferentes específicos para ligandos diferentes. No entanto, não é necessária uma afinidade de sinais para regular todos os processos. A mesma molécula sinalizadora pode ligar-se a diferentes receptores (geralmente localizados em células diferentes), desencadeando respostas igualmente distintas. Exemplo: Acetilcolina Existem receptores para esta molécula em células musculares esqueléticas (A), cardíacas (B) e em células acinares pancreáticas (C), contudo, em cada tipo de células a resposta induzida é diferente. Em A promove a contracção muscular, em B desacelera o ritmo e força da contracção cardíaca e em C induz a secreção de enzimas de digestão. A acetilcolina liga-se a: 1. Receptores diferentes, em A e C.: 2. Receptores idênticos, em B e C. Por vezes, diferentes complexos receptor-ligando podem induzir a mesma resposta celular em diferentes tipos de células. Exemplo: Glucagina ou Epinefrina em células hepáticas A glucagina e a epinefrina são ligandos diferentes que desencadeiam a mesma resposta nas células hepáticas. Nestas existem receptores específicos tanto para a epinefrina como para a glucagina, que promovem uma alteração no metabolismo dos açúcares (degradação do glicogénio e libertação de glucose para o sangue). No entanto, nas células do músculo esquelético, só a epinefrina afecta o metabolismo do glicogénio. A glucagina mantém o Status Quo enquanto que a epinefrina promove a alteração do Status Quo, preparando o organismo para a resposta inesperada e imediata. Estes exemplos mostram que o receptor é caracterizado pela especificidade da ligação (para um ligando particular), sendo que o complexo R L resultante exibe especificidade efectora (regula uma resposta celular específica). 65

Explicação do caso: A activação quer dos receptores de epinefrina quer dos de glucagina nas células hepáticas induz a síntese de camp (2º mensageiro), o qual regula uma dada resposta metabólica. Conclusão: A especificidade da ligação aos receptores de glucagina e epinefrina é diferente, mas a especificidade efectora é idêntica. No geral, o ligando parece só ter a função de ligação ao receptor: - O ligando não é metabolizado para dar outro ligando útil, não é intermediário em nenhuma actividade celular, nem tem propriedades enzimáticas; - A única função do ligando parece ser alterar as propriedades do receptor, que transmite um sinal à célula que vai desencadear uma resposta. No entanto, muitas vezes as células alvo modificam ou degradam o ligando, resultando modificação ou finalização da resposta na célula e nas células vizinhas. Classificação das hormonas (com base na sua composição química): Hormonas derivadas de aminoácidos: Epinefrina, Norepinefrina, Histamina, Dopa, Dopamina, Tiroxina e Trioiodotironina (hormonas da tiróide) Originadas a partir de aminoácidos; Hormonas Peptídicas: Insulina, ACTH, Factores de crescimento, Glucagina Polipeptídeos ou Proteínas; Hormonas Esteróides: Cortisol, Progesterona, Estradiol, Testosterona derivadas do colesterol Derivadas do Colesterol; Hormonas Eicosanoides: Prostaglandinas, Tromboxanos Derivadas do ácido araquidónico (fosfolípidos). Classificação das hormonas (com base na sua solubilidade em água e lípidos e localização do receptor): A maioria das hormonas insere-se em 3 grandes grupos: 1. Pequenas moléculas lipofílicas que se difundem através da membrana plasmática e interagem com receptores intracelulares; 2. Moléculas hidrofílicas que ligam a receptores da superfície celular; 3. Moléculas lipofílicas que ligam a receptores da superfície celular. Recentemente descobriu-se que um gás, o óxido nítrico (NO), desempenha um papel regulador central no controlo de muitas respostas celulares, no entanto não se inclui em nenhuma das categorias acima referidas. O CO tem também uma acção reguladora no cérebro. 66

1. Hormonas lipofílicas com receptores intracelulares: Geralmente são hormonas esteróides, estas são transportadas na corrente sanguínea por proteínas que as tornam solúveis (lipofílicas). Após se dissociarem das proteínas, perto da célula alvo, as hormonas conseguem difundir-se através da membrana plasmática. Ligam-se a receptores citosólicos (o complexo formado pode posteriormente difundir-se para o núcleo) ou nucleares (através dos poros nucleares) e depois de formado o complexo hormona-receptor, este interage com o DNA nuclear e altera a transcrição de genes específicos, podendo também afectar a estabilidade de RNAm específicos (maior ou menor síntese). Desta forma a síntese de proteínas conduz à resposta celular. Exemplos de hormonas lipofílicas: - Hormonas esteróides (Cortisol, progesterona, estradiol, testosterona, são todas sintetizadas a partir do colesterol); - Vitamina D3 (antiraquítismo), relaciona-se com as hormonas esteróides pois deriva do 7-desidrocolesterol; - Tiroxina, ácido retinóico. As hormonas esteróides podem actuar durante horas ou dias e influenciar o crescimento e a diferenciação de diversos tecidos: - Em galináceos, o estrogénio e progesterona (hormonas sexuais femininas) estimulam a produção das hormonas da clara do ovo e a proliferação celular no oviducto da galinha; - Nos mamíferos, os estrogénios estimulam o crescimento da parede uterina na preparação para a implantação do embrião; - Nos insectos e crustáceos, a ecdisona (quimicamente relacionada com os esteróides) desencadeia a diferenciação e maturação das larvas até ao adulto, tal como os estrogénios, também induz a expressão de produtos de genes específicos. Em plantas também se descobriu uma família de esteróides que regula aspectos do desenvolvimento, actuando também em receptores da superfície celular. São os brassinoesteróides, dos quais o primeiro identificado foi o brassinolídeo, sendo que actualmente se conhecem mais de 60 tipos diferentes, todos derivados do 5-α-colestano. Na tiróide, são produzidos por proteólese intracelular da proteína tiroglobulina, os principais compostos iodados do corpo, a trioxina e triiodotironina, que são imediatamente libertadas no sangue. Estes compostos estimulam a expressão de enzimas citosólicas (Ex: hexocinase do fígado), que catalizam o catabolismo de vários compostos (glucose, lípidos, proteínas) e de enzimas mitocondriais, que catalizam a fosforilação oxidativa. Os retinóides, derivados do retinol (vitamina A), regulam a proliferação, diferenciação e morte celulares. Durante o desenvolvimento, os retinóides actuam como mediadores locais da interacção célula-a-célula. Os animais necessitam de betacarotenos na sua dieta para ter vitamina A. 67

Exemplo: Na formação dos neurónios motores na galinha, uma classe de neurónios motores gera um sinal de retinóide que regula o número e o tipo de neurónios motores diferenciados na vizinhança. 2. Hormonas hidrossolúveis com receptores superficiais: As hormonas hidrossolúveis podem ser: - Hormonas peptídicas: Insulina, Factores de crescimento, Glucagina; - Moléculas de carga reduzida: Epinefrina e Histamina (derivadas de aminoácidos, funcionam como hormonas e neurotransmissores). Produzem efeitos de duração muito variável: - Induzem modificação na actividade de uma ou mais enzimas já existentes Os efeitos são quase imediatos mas persistem pouco tempo; - Podem produzir alterações na expressão de genes Os efeitos podem manter-se horas ou dias; - Podem provocar alterações irreversíveis Caso da diferenciação natural. 3. Hormonas lipofílicas com receptores superficiais (normalmente actuam em sinalizações de proximidade): Neste grupo incluem-se algumas hormonas eicosanoides, como as prostaglandinas (9 classes), prostaciclinas, tromboxanos e leucotrienos. (Imagem 28) As prostaglandinas (PG) (as mais conhecidas) são uma série de ácidos ciclopentanoicos. Os tromboxanos (TX) diferem das prostaglandinas na estrutura do anel que nestas é um ciclopentano e nos tromboxanos é um éter cíclico (anel oxano). A hormonas eicosanoides derivadam maioritariamente do ácido gordo poliinsaturado (com 20 carbonos), o ácido araquidónico. Este por sua vez deriva de fosfolípidos (Ex. Fosfatidilcolina, por acção de fosfolipase A2) e de diacilgliceróis. A fosfolipase A2 pode quebrar a ligação éster de um fosfolípido, libertando o ácido araquidónico, este produz leucotrienos (acção de lipoxigenases ou prostaglandinas sintetases) e endoperóxidos cíclicos (acção de prostaglandina H2), estes, sua vez originam outras prostaglandinas, prostaciclinas e tromboxanos. 68

As prostaglandinas só são conhecidas em animais, tendo as primeiras sido descobertas por Ulf von Euler (Suécia) em 1930. Muitas hormonas desta família estão envolvidas na sinalização Parácrina e Autócrina, degradando-se perto do local de síntese. A prostaglandina endoperoxidase sintetase (PES) é uma enzima existente no retículo endoplasmático, que vai actuar sobre o ácido araquidónico, convertendo-o em prostaglandinas através uma dupla actividade enzimática, ciclooxigenase e peroxidase. As plaquetas desempenham um papel crucial na coagulação do sangue e na regeneração da parede dos vasos sanguíneos (cicatrização). Os tramboxanos (TX2), derivados de prostaglandinas, promovem a agregação de plaquetas sanguíneas, estas aderem às paredes dos vasos sanguíneos (vasoconstrição). As prostaglandinas e prostaciclinas pelo contrário funcionam comos vasodilatadores. O vencedor de vários prémios Nobel, John Vane, descobriu que a aspirina ao produzir acetilação de uma serina ao nível da actividade de cicooxigenases PES, bloqueia a produção de prostaglandinas. Deste modo não se formam tramboxanos por acetilação da prostaglandina H2 sintetase, impedindo-se a agregação de plaquetas e consequentemente a formação de trombos (acumulação de tromboxanos em zonas em que o vaso sanguíneo tenha sofrido uma ruptura). As hormonas PGI2 e TXA2 estão envolvidas no processo inflamatório e na coagulação do sangue, podendo interferir em ataques cardíacos e AVC, com origem na formação de coágulos sanguíneos. A TXA2 promove a agregação de plaquetas sanguíneas, favorecendo a formação de coágulos sanguíneos, enquanto PGI2 relaxa as artérias coronárias e inibe a agregação de plaquetas. A aterosclerose relaciona-se com a redução da síntese de PGI2, por interferência do metabolismo do colesterol, este ao reduzir o número de células endoteliais, que produzem PGI2, leva a uma baixa dos níveis desta hormona. Existem prostaglandinas que se acumulam aquando do nascimento de um bebé, iniciando a contracção das células do músculo liso (facilitam a contracção uterina). Receptores Superficiais: Existe uma grande variedade de receptores superficiais (só ligam ligandos hidro/lipossolúveis) nas células animais, mas todos eles podem ser incluídos em quatro grandes classes: 1. Receptores associados a proteínas G (GPCR); 2. Receptores que são canais iónicos; 3. Receptores associados a tirosina cinase (RTK); 4. Receptores com actividade catalítica intrínseca. 1. Receptores associados a proteínas G (GPCR): A ligação do ligando (epinefrina, glucagina, serotonina) ao receptor provoca uma alteração conformacional na face citosólica deste, activando a proteína G, que por sua vez, activa ou inibi uma enzima (Adenilciclase, fosfolipase, etc.). Esta ligação muitas vezes traduz-se na formação de um segundo mensageiro (camp, IP3, DAG, etc.) ou na modulação de um canal iónico. 69

2. Receptores que são canais iónicos: A ligação ao ligando leva a uma alteração conformacional do receptor, que forma um canal de entrada de iões. Isto acontece, por exemplo, com o receptor de acetilcolina, no contacto entre os neurónios e os músculos. 3. Receptores associados a Tirosina cinase (RTK): Estes receptores geralmente ligam citocinas, interferões e factores de crescimento humanos. Não possuam actividade enzimática intrínseca, mas a ligação do ligando promove a dimerização (associação das duas unidades) do receptor (homodímero ou heterodímero), este reage com uma ou mais proteínas cinases tirosínicas do citosol que, activadas, fosforilam tirosinas do receptor. Os resíduos de fosfotirosina resultantes podem fosforilar os substratos proteicos que a eles se ligam, ficando o receptor com actividade de cinase. Estes receptores são referidos como Superfamília dos Receptores das Citocinas. 4. Receptores com actividade enzimática intrínseca: Possuem actividade enzimática no lado citosólico. Uns catalizam a conversão de GTP em GMPc outros actuam como fosfatases, removendo grupos fosfato de resíduos de tirosina de proteínas substrato. Mas na maioria dos casos a ligação do ligando promove a formação de um homodímero activo, que fosforila (actividade cinase) resíduos do seu próprio domínio citosólico (autofosforilação) e também de várias proteínas substrato. São exemplos os receptores para factores de crescimento e insulina. 70