Avaliação comparativa do tratamento com derivados nitroimidazólicos e triazólicos na evolução da infecção de camundongos pelo Trypanosoma cruzi

UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS Avaliação comparativa do tratamento com derivados nitroimidazólicos e triazólicos na evolução da infecção de camundongos pelo Trypanosoma cruzi AUTOR: Sérgio Caldas ORIENTADORA: Maria Terezinha Bahia COORIENTADORES: Alzira Batista Cecílio André Talvani Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, como parte integrante dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas, área de concentração: Imunobiologia de protozoários. Ouro Preto, junho de 2011

C145a Caldas, Sérgio Avaliação comparativa do tratamento com derivados nitroimidazólicos e triazólicos na evolução da infecção de camundongos pelo Trypanosoma cruzi [manuscrito] / Sérgio Caldas. - 2011. xv, 121 f.: il., color.; grafs.; tabs. Orientadora: Profª. Drª. Maria Terezinha Bahia. Coorientadora: Profª. Drª. Alzira Batista Cecílio. Prof. Dr. André Talvani. Tese (Doutorado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas. Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas. Área de concentração: Imunobiologia de Protozoários. 1. Trypanossoma cruzi - Teses. 2. Chagas, Doença de - Teses. 3. Quimioterapia - Teses. 4. Parasitismo - Teses. 5. Reação em cadeia de polimerase (PCR) em tempo real - Teses. I. Universidade Federal de Ouro Preto. II. Título. Catalogação: sisbin@sisbin.ufop.br CDU: 576.89:616.937 II

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DEDICATÓRIA Aos meus pais, Angelo e Helena, razão do meu viver, aos meus irmãos, Ivo e Walace, pelo apoio e amizade, à Marcela por todo carinho e compreensão. Amo vocês! IV

AGRADECIMENTOS À Professora Maria Terezinha Bahia, pela grande amizade, ótima orientação, e suporte em tudo que eu precisei para executar este trabalho com qualidade; Ao André Talvani, pela coorientação, por ser um grande amigo e pela gentileza de estar sempre disposto a ajudar; À Alzira Batista Cecílio, pela coorientação, amizade, convívio e por ter me dado condições para que eu desenvolvesse meu trabalho com muita dedicação; Aos professores Riva de Paula Oliveira e Wanderson Geraldo de Lima pelas colaborações referentes ao PCR em tempo real e à histopatologia; A todos os professores do Nupeb pelos conhecimentos transmitidos, e por serem inspirações para a minha desejada vida acadêmica; Ao DNDi (Drugs for Neglected Diseases Initiative), FAPEMIG (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais), FUNED (Fundação Ezequiel Dias) e UFOP (Universidade Federal de Ouro Preto) pelo suporte financeiro; À Cida, sempre disponível e muito agradável; A todos os colegas do mestrado e doutorado pela longa caminhada juntos; A todos os amigos que fiz na UFOP, em especial Girley, Isabel, Jaqueline, Lívia, Paulo, Vanja e Wendel. Amigos que sempre lembrarei com carinho! A todos os amigos da Funed pelo convívio e apoio, em especial Ana Caroline, Cláudio, Dário, Fernanda, Pollyana, Robson e Suellen; Enfim, a todos que colaboraram direta ou indiretamente na realização deste trabalho! V

SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO... 17 1.1 O Trypanosoma cruzi... 18 1.2 A doença de Chagas... 19 1.3 Reposta imunológica do hospedeiro x doença de Chagas... 21 1.4 Tratamento da doença de Chagas... 24 1.4.1 Compostos nitro-heterocíclicos... 25 1.4.2 Compostos triazólicos... 30 1.4.3 Monitoramento do tratamento... 32 2 OBJETIVOS... 35 2.1 Objetivo geral... 36 2.2 Objetivos específicos... 36 3 METODOLOGIA... 37 3.1 Delineamento experimental... 38 3.2 Parasito... 39 3.3 Fármacos... 39 3.4 Infecção dos animais... 40 3.5 Curvas de parasitismos... 40 3.6 Tratamento... 41 3.7 Preparação do DNA... 42 3.7.1 Extração de DNA genômico do sangue total... 42 3.7.2 Extração de DNA genômico em tecido cardíaco... 43 3.8 Geração dos Padrões da PCR... 43 3.9 PCR em tempo real... 44 3.10 Análise quantitativa das lesões cardíacas... 45 3.10.1 Avaliação histopatológica... 45 3.10.1.1 Técnica de Hematoxilina & Eosina... 46 3.10.1.2 Técnica de Tricrômico de Masson... 46 3.11 Ensaios imunoenzimáticos (ELISA)... 46 VI

SUMÁRIO 3.12 Detecção indireta de óxido nítrico... 48 3.13 Análise estatística... 48 4 RESULTADOS... 49 4.1 PCR em tempo real quantitativa... 50 4.1.1 Curvas padrão... 50 4.1.2 Sensibilidade analítica... 51 4.1.3 Consistência e reprodutibilidade... 52 4.1.4 Apresentação e interpretação das curvas de amplificação e de dissociação... 53 4.2 Análises da evolução natural da infecção em camundongos inoculados com a cepa VL-10 do Trypanosoma cruzi.... 55 4.2.1 Avaliação do parasitismo dos animais ao longo da infecção através do exame de sangue a fresco e da PCR em tempo real.... 55 4.2.2 Avaliação da inflamação cardíaca e da resposta imune ao longo da infecção 58 4.3 Influências dos tratamentos com benznidazol, itraconazol, fexinidazol e posaconazol na evolução da infecção de camundongos infectados pela cepa VL-10 do Trypanosoma cruzi (resistente ao benznidazol).... 61 4.3.1 Análises comparativas dos perfis de parasitismos sanguíneo e tecidual observados nos animais infectados pelo T. cruzi e tratados com os diferentes fármacos.... 66 4.4 Análise da influência do tratamento específico sobre a intensidade das lesões cardíacas.... 70 4.5 Análise da influência do tratamento específico sobre os níveis plasmáticos de CCL2, CCL5, IL-10 e NO...... 76 5 DISCUSSÃO... 81 6 CONCLUSÃO... 99 7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 101 VII

ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1 - Curva padrão gerada com 7 diluições seriadas dos DNA extraídos do sangue de camundongos saudáveis acrescidos de epimastigotas da cepa VL-10 do Trypanosoma cruzi. As linhas pretas referem-se ao DNA do T. cruzi e as cinza ao DNA do TNF-α. (A) Curvas de amplificação do T. cruzi demonstrando amplificação nas 7 diluições seriadas do DNA proveniente de 5 x 10 7 parasitos/0,1 ml de sangue e do TNF-α em 5 diluições seriadas. (B) Curvas padrão geradas a partir da região linear de cada curva de amplificação.... 51 Figura 2 - Sensibilidade analítica da PCR em tempo real. Os quadrados pretos referemse ao DNA do parasito quantificado no tecido cardíaco e os cinza ao DNA do Trypanosoma cruzi quantificado no sangue de camundongos. O limite de quantificação foi de 0,1 parasitos equivalentes por 50 ng de DNA em ambos, sangue e tecido cardíaco.... 51 Figura 3 - Gráfico de amplificação ( Rn x ciclo) do DNA do parasito e do controle endógeno. Apresentação em escala logarítmica para ajustes do Threshold do Trypanossoma cruzi (linha preta) e do TNF-α (linha cinza).... 54 Figura 4 - Curva de dissociação do DNA amplificado de Trypanosoma cruzi (linhas pretas) com pico em torno de 81 o C e do DNA de TNF-α (linhas cinza) com pico em torno de 79,3 o C.... 55 Figura 5 - Média da parasitemia detectada pela PCR em tempo real (colunas pretas) e pelo exame de sangue a fresco-esf (colunas brancas), em camundongos infectados pela cepa VL-10 do Trypanosoma cruzi. Asteriscos denotam diferença significativa entre as duplas analisadas (p < 0,05).... 56 Figura 6 - Percentagem de resultados positivos detectados pelo exame de sangue a fresco (ESF) e pela PCR em tempo real sanguínea (PCR-Sangue) e tecidual (PCR- Tecido), ao longo da infecção, em camundongos inoculados com 5 x 10 3 formas tripomastigotas da cepa VL-10 do Trypanosoma cruzi. Os dados representam a média de dois experimentos independentes.... 57 VIII

ÍNDICE DE FIGURAS Figura 7 - Parasitismos detectados por PCR em tempo real no tecido cardíaco (PCR- Tecido) e no sangue (PCR-Sangue) em camundongos infectados com 5 x 10 3 formas tripomastigotas do Trypanosoma cruzi (cepa VL-10), nos dias 10, 16, 30, 60 e 120 após a infecção. Os dados representam a média de dois experimentos independentes. Asteriscos denotam diferença significativa entre os exames realizados nos diferentes dias (p < 0,05). O insert representa análises de correlação dos parasitismos sanguíneo e tecidual, sendo Pearson (R) = 0.8068 e p < 0.001.. 58 Figura 8 Análises histopatológicas de secções do coração de camundongos infectados pela cepa VL-10 do Trypanosoma cruzi. (A) Análises da inflamação em camundongos infectados (I) e não infectados (NI) aos 10, 30 e 120 dias de infecção (d.i.). Diferenças foram consideradas significativas quando p < 0,05. (B) Secções de miocárdio de camundongos não infectados e (C) de camundongos infectados aos 30 d.i. (H&E, aumento 40x).... 59 Figura 9 - Perfil das quimiocinas CCL2 (A) e CCL5 (B), de óxido nítrico (C) e da citocina IL-10 (D) detectados aos 10, 30 e 120 d.i. no plasma de camundongos infectados pela cepa VL-10 do Trypanosoma cruzi (I) e de camundongos não infectados (NI). Diferenças foram consideradas significativas quando p < 0,05... 60 Figura 10 - Parasitismo detectado por exame de sangue a fresco (ESF), PCR em tempo real no sangue (PCR-S) e no tecido cardíaco (PCR-T) em camundongos tratados com benznidazol e infectados com 5 x 10 3 tripomastigotas da cepa VL-10 do Trypanosoma cruzi. O tratamento foi realizado nos dias 10 a 30 após a infecção. Símbolos diferentes indicam diferença significativa (p < 0,05).... 62 Figura 11 - Parasitemia detectada por exame de sangue a fresco (ESF) e parasitismos detectados por PCR em tempo real no sangue (PCR-S) e no tecido cardíaco (PCR- T) após o tratamento com itraconazol de camundongos inoculados com 5 x 10 3 formas tripomastigotas do Trypanosoma cruzi (cepa VL-10). O tratamento foi realizado nos dias 10 a 30 após a infecção. Símbolos diferentes indicam diferença significativa (p < 0,05).... 63 IX

ÍNDICE DE FIGURAS Figura 12 - Parasitismo sanguíneo detectado por exame de sangue a fresco (ESF) e parasitismos detectados por PCR em tempo real no sangue (PCR-S) e no tecido cardíaco (PCR-T) em camundongos infectados com 5 x 10 3 tripomastigotas da cepa VL-10 do Trypanosoma cruzi e tratados com posaconazol. O tratamento foi realizado nos dias 10 a 30 após a infecção. Símbolos diferentes indicam diferença significativa (p < 0,05).... 65 Figura 13 - Parasitismo sanguíneo detectado por exame de sangue a fresco (ESF) e parasitismos detectados por PCR em tempo real no sangue (PCR-S) e no tecido cardíaco (PCR-T) em camundongos infectados com 5 x 10 3 tripomastigotas da cepa VL-10 do Trypanosoma cruzi e tratados com fexinidazol. O tratamento foi realizado nos dias 10 a 30 após a infecção. Símbolos diferentes indicam diferença significativa (p < 0,05).... 66 Figura 14 - Parasitismo sanguíneo detectado por exame de sangue a fresco após o tratamento com benznidazol (Bz), fexinidazol (Fex), itraconazol (Itz) e posaconazol (Pz) de camundongos inoculados com 5 x 10 3 formas tripomastigotas do Trypanosoma cruzi (cepa VL-10). O tratamento foi realizado entre os dias 10 e 30 após a infecção. Símbolos diferentes indicam diferença significativa (p < 0,05) e símbolos iguais indicam valores similares.... 67 Figura 15 - Parasitismo sanguíneo detectado por PCR em tempo real após o tratamento com benznidazol (Bz), fexinidazol (Fex), itraconazol (Itz) e posaconazol (Pz) de camundongos inoculados com 5 x 10 3 formas tripomastigotas do Trypanosoma cruzi (cepa VL-10). O tratamento foi realizado entre os dias 10 e 30 após a infecção. Símbolos diferentes indicam diferença significativa (p < 0,05) e símbolos iguais indicam valores similares.... 68 Figura 16 - Parasitismo cardíaco detectado por PCR em tempo real após o tratamento com benznidazol (Bz), fexinidazol (Fex), itraconazol (Itz) e posaconazol (Pz), de camundongos inoculados com 5 x 10 3 formas tripomastigotas do Trypanosoma cruzi (cepa VL-10). O tratamento foi realizado entre os dias 10 e 30 após a X

ÍNDICE DE FIGURAS infecção. Símbolos diferentes indicam diferença significativa (p < 0,05) e símbolos iguais indicam valores similares.... 69 Figura 17 - Determinação por PCR em tempo real do padrão de resistência da cepa VL- 10 do Trypanosoma cruzi aos compostos benznidazol, itraconazol, fexinidazol e posaconazol.... 70 Figura 18 - Contagem de núcleos celulares de secções de miocárdio de camundongos infectados pela cepa VL-10 do Trypanosoma cruzi e não infectados, tratados ou não com benznidazol aos 10, 30 e 120 dias de infecção (d.i.). Diferenças foram consideradas significativas quando p < 0,05.... 71 Figura 19 - Contagem de núcleos celulares de secções de miocárdio de camundongos infectados pela cepa VL-10 do Trypanosoma cruzi e não infectados, tratados ou não com itraconazol aos 10, 30 e 120 dias de infecção (d.i.). Diferenças foram consideradas significativas quando p < 0,05.... 72 Figura 20 - Contagem de núcleos celulares de secções de miocárdio de camundongos infectados pela cepa VL-10 do Trypanosoma cruzi e não infectados, tratados ou não com posaconazol aos 10, 30 e 120 dias de infecção (d.i.). Diferenças foram consideradas significativas quando p < 0,05.... 72 Figura 21 - Contagem de núcleos celulares de secções de miocárdio de camundongos infectados pela cepa VL-10 do Trypanosoma cruzi e não infectados, tratados ou não com fexinidazol aos 10, 30 e 120 dias de infecção (d.i.). Diferenças foram consideradas significativas quando p < 0,05.... 73 Figura 22 - Análises histopatológicas de secções do coração de camundongos infectados pela cepa VL-10 do Trypanosoma cruzi. (A) Análises da inflamação em camundongos não infectados (NI) e infectados (I), tratados com benznidazol (Bz), itraconazol (Itz), posaconazol (Pz) e fexinidazol (Fex), aos 10, 30 e 120 dias de infecção (d.i.). Diferenças foram consideradas significativas quando p < 0,05. (B) Secções de miocárdio de camundongos infectados e (C) não infectados. Secções de miocárdio de camundongos infectados e tratados com (D) benznidazol, (E) XI

ÍNDICE DE FIGURAS posaconazol, (F) itraconazol e (G) fexinidazol, aos 120 d.i. (H&E, aumento 40x).... 74 Figura 23 - Análise da área ocupada por colágeno em secções do coração de camundongos infectados pela cepa VL-10 do T. cruzi (A) Análises da fibrose em camundongos não infectados (NI) e infectados (I), tratados com benznidazol (Bz), itraconazol (Itz), posaconazol (Pz) e fexinidazol (Fex), aos 120 dias de infecção (d.i.). Diferenças foram consideradas significativas quando p < 0,05. (B) Secções de miocárdio de camundongos infectados e (C) não infectados. Secções de miocárdio de camundongos infectados e tratados com (D) benznidazol, (E) posaconazol, (F) itraconazol e (G) fexinidazol, aos 120 d.i. (Tricrômico de Masson, aumento 40 x).... 75 Figura 24 - Níveis plasmáticos de CCL2, CCL5, IL-10 e NO detectados no plasma de animais não infectados e tratados durante 20 dias com benznidazol (Bz), itraconazol (Itz), posaconazol (Pz) e fexinidazol (Fex) em comparação ao detectado no plasma dos animais não tratados (NT) no mesmo período.... 76 Figura 25 - Níveis da quimiocina CCL2 presente no plasma de camundongos infectados pela cepa VL-10 do Trypanosoma cruzi e tratados com benznidazol (Bz), itraconazol (Itz), posaconazol (Pz) e fexinidazol (Fex) aos 10 dias de infecção - d.i.- (antes do tratamento), 30 d.i. (último dia de tratamento) e 120 d.i. (90 dias após o tratamento) em comparação aos animais não infectados (NI) e infectados não tratados (I).... 77 Figura 26 - Níveis da quimiocina CCL5 presente no plasma de camundongos infectados pela cepa VL-10 do Trypanosoma cruzi e tratados com benznidazol (Bz), itraconazol (Itz), posaconazol (Pz) e fexinidazol (Fex) aos 10 dias de infecção - d.i.- (antes do tratamento), 30 d.i. (último dia de tratamento) e 120 d.i. (90 dias após o tratamento) em comparação aos animais não infectados (NI) e infectados não tratados (I).... 78 Figura 27 - Níveis da citocina IL-10 presente no plasma de camundongos infectados pela cepa VL-10 do Trypanosoma cruzi e tratados com benznidazol (Bz), XII

ÍNDICE DE FIGURAS itraconazol (Itz), posaconazol (Pz) e fexinidazol (Fex) aos 10 dias de infecção - d.i.- (antes do tratamento), 30 d.i. (último dia de tratamento) e 120 d.i. (90 dias após o tratamento) em comparação aos animais não infectados (NI) e infectados não tratados (I).... 79 Figura 28- Níveis de óxido nítrico (NO) presente no plasma de camundongos infectados pela cepa VL-10 do Trypanosoma cruzi e tratados com benznidazol (Bz), itraconazol (Itz), posaconazol (Pz) e fexinidazol (Fex) aos 10 dias de infecção - d.i.- (antes do tratamento), 30 d.i. (último dia de tratamento) e 120 d.i. (90 dias após o tratamento) em comparação aos animais não infectados (NI) e infectados não tratados (I).... 80 XIII

ÍNDICE DE TABELAS Tabela 1 - Consistência de duas reações de PCR em tempo real para a detecção de DNA de T. cruzi e do normalizador TNF-α no sangue e no tecido cardíaco de camundongos.... 52 Tabela 2 - Reprodutibilidade de dois ensaios independentes de PCR em tempo real para a quantificação do T. cruzi no sangue e no tecido cardíaco de camundongos infectados pela cepa VL-10.... 53 Tabela 3 - Resultados positivos observados no sangue e no coração de camundongos infectados pela cepa VL-10 do T. cruzi e tratados com benznidazol.... 61 Tabela 4 - Resultados positivos observados no sangue e no coração de camundongos infectados pelo T. cruzi (cepa VL-10) e tratados com itraconazol.... 62 Tabela 5 - Resultados positivos observados no sangue e no tecido cardíaco de camundongos infectados pelo T. cruzi (cepa VL-10) e tratados com posaconazol. 64 Tabela 6 - Resultados positivos observados no sangue e no coração de camundongos infectados pelo T. cruzi (cepa VL-10) e tratados com fexinidazol... 65 XIV

RESUMO A doença de Chagas é causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi e afeta milhões de pessoas as quais podem desenvolver alterações cardíacas e digestivas. Decorridos mais de 100 anos da descrição do primeiro caso clínico da enfermidade, a cura é ainda um desafio. A necessidade de novas alternativas de tratamento é clara, mas os investimentos globais em pesquisa e desenvolvimento de fármacos são insuficientes, principalmente devido ao desinteresse em pesquisas para melhorar a terapêutica de doenças consideradas não lucrativas para as indústrias farmacêuticas. Neste contexto, este trabalho propõe estudar o efeito anti-t.cruzi de dois grupos de compostos, com mecanismos de ação distintos, utilizando camundongos infectados pela cepa VL-10 do T. cruzi, considerada resistente ao benznidazol. Assim, foram avaliados dois derivados nitroimidazólicos, o benznidazol (utilizado no tratamento convencional) e o fexinidazol (um candidato ao tratamento da doença de Chagas) e dois derivados triazólicos, o itraconazol (triazol de 1 a geração) e o posaconazol (triazol de 2 a geração e também forte candidato a fármaco alternativo para o tratamento desta enfermidade). A análise qualitativa e quantitativa da parasitemia e do parasitismo cardíaco dos animais infectados foi realizada após a padronização da PCR em tempo real especificamente para tal finalidade. Também foram realizados exame de sangue a fresco, análises imunológicas e quantificações da inflamação e fibrose cardíaca dos animais experimentais para confrontar e enriquecer os dados da PCR. A PCR em tempo real permitiu a observação de distintos padrões de resistência da cepa VL-10 do T. cruzi aos fármacos benznidazol, itraconazol, posaconazol e um padrão de sensibilidade ao composto fexinidazol. O modelo experimental (camundongo Swiss, cepa VL-10 do T. cruzi e PCR em tempo real como método principal) mostrou-se adequado para estudos da infecção chagásica e para investigações envolvendo a quimioterapia experimental da doença e os benefícios do tratamento, no que se refere ao parasitismo, e à resposta inflamatória. Esse modelo possibilita a seleção de compostos com atividade anti-t.cruzi in vivo, pois permite quantificar o parasitismo sanguíneo e tecidual dos animais experimentalmente infectados submetidos aos diferentes tratamentos avaliados auxiliando na escolha do fármaco (ou associação medicamentosa) com melhor ação antiparasitária sanguínea e tecidual frente à determinada população do T. cruzi. XV

ABSTRACT Chagas disease is caused by the protozoan Trypanosoma cruzi and affects millions of people who can develop cardiac and digestive alterations. After more than 100 years of the first clinical description, the cure still remains as a challenge. The need for new therapies is obvious, but the overall investment in research and drug development is insufficient. One factor aggravating this situation has been that the major world centers are not interested in conducting research to improve therapy for diseases considered not profitable for pharmaceutical companies internationally. In this context, this work was intended to study the effectiveness of two groups of compounds that have different mechanisms of action, to eliminate or reduce the parasite load of mice infected with T. cruzi VL-10 strain, which is considered resistant to benznidazole. Thus, we evaluated two nitroimidazole derivatives, benznidazole (used in conventional treatment) and fexinidazole (a candidate for the treatment of Chagas disease) and two triazoles, itraconazole (first-generation triazole) and posaconazole (2nd generation triazole and also a strong candidate for an alternative drug for the treatment of this disease). The qualitative and quantitative analysis of blood and cardiac parasitism of infected animals was performed after standardization of real-time PCR specifically for this purpose. Were also carried out microscopic fresh blood examination (FBE), immunological analysis and quantification of cardiac lesions of experimental animals to confront and improve real-time PCR data. The real-time PCR showed that the VL-10 strain of T. cruzi has distinct patterns of resistance to the drugs benznidazole, itraconazole, posaconazole, and a pattern of sensitivity to the compound fexinidazole. The experimental model (Swiss mice, VL-10 strain of T. cruzi and real-time PCR as a primary tool) was suitable for studies of T. cruzi infection and may prove useful in investigations involving experimental chemotherapy of the disease and the benefits of treatment in relation to parasitism, and the inflammatory response. This model allows the selection of compounds with trypanocidal activity in vivo, since it allows quantifying the blood and tissue parasitism of experimentally infected animals subjected to different treatments. This enables the choice of drug (or combination therapy) with better action against a particular population of T. cruzi in blood and tissue. XVI

1 INTRODUÇÃO

INTRODUÇÃO 1.1 O Trypanosoma cruzi O Trypanosoma cruzi, é um protozoário hemoflagelado pertencente à ordem Kinetoplastida, família Trypanosomatidae, cuja constituição gênica mostrou ser predominantemente diplóide (El-Sayed e cols., 2005). Sob condições naturais, o ciclo de vida deste parasito se alterna entre hospedeiros invertebrados, mais de 130 hemípteras da família Reduviidae, e entre hospedeiros vertebrados, mais de 100 espécies de mamíferos de diferentes ordens (Zeledon & Rabinovich, 1981; Lambrech, 1965). Apesar do grande número de triatomíneos serem vetores do T. cruzi, o Triatoma infestans, T. brasiliensis, T. dimidiata, T. sordida, Panstrongylus megistus e Rhodinius prolixus são os principais transmissores na América do Sul (WHO, 2007). Na natureza, a doença de Chagas consegue se manter como uma enzootia, passando de animal em animal através do inseto vetor. Entre os reservatórios estão os vertebrados domésticos (homem, cão, gato e roedores) e silvestres (marsupiais, quirópteros, carnívoros, edentados, roedores e primatas). O homem entra ocasionalmente no ciclo e o faz porque convive não apenas com o triatomíneo domiciliado, mas também com mamíferos infectados (Ceballos e cols., 2006; Gonzalez e cols., 2006, Coura 2007) A contaminação de mamíferos pode ocorrer através da penetração das formas tripomastigotas metacíclicas, depositadas pelo triatomíneo sobre a pele lesada do vertebrado por ação da sua probóscida, ou através da penetração por membranas mucosas. Os tripomastigotas metacíclicos, ao penetrarem no hospedeiro vertebrado, invadem os fagócitos mononucleares sendo capazes de escapar dos mecanismos de destruição dos fagócitos e se diferenciarem em amastigotas, no citoplasma destas células, aproximadamente 35 horas depois da infecção. Após a multiplicação, no citoplasma das células hospedeiras, os amastigotas diferenciam-se em formas tripomastigotas. Posteriormente, são liberados por ruptura celular e alcançam o sistema circulatório, sendo potencialmente infectantes para qualquer célula nucleada (Ceballos e cols., 2006; Gonzalez e cols., 2006). No homem, além do contágio através de excretas dos triatomíneos infectados, a transmissão do T. cruzi pode ocorrer através de transfusões sanguíneas, transplantes de órgãos, transmissão congênita (Brener & 18

INTRODUÇÃO Gazzinelli, 1997), alimentos contaminados com as formas tripomastigotas do parasito e acidentes em laboratório (Prata, 2001; Lambrech, 1965). 1.2 A doença de Chagas A Tripanossomíase Americana ou doença de Chagas, descoberta em 1909 por Carlos Ribeiro Justiniano das Chagas (1909), é uma zoonose causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi. Decorridos mais de 100 anos da sua descoberta, a doença é ainda epidemiologicamente relevante, afetando cerca de 10 milhões de pessoas em todo mundo, principalmente na América Latina, onde ela é endêmica (WHO, 2010). Atualmente o T. cruzi tem grande importância como patógeno oportunista emergente causador de infecções fatais em pacientes imunossuprimidos (Diaz, 2007; Gascon e cols., 2007). De um modo geral, a infecção do homem resulta da invasão de ecótopos naturais, bem como da colonização de vetores nas habitações humanas devido às más condições sócio-econômicas principalmente das populações rurais das regiões endêmicas (Gurtler e cols., 2008). Várias centenas de milhares de indivíduos chagásicos também podem estar vivendo na América do Norte, Europa e outros países, como resultado da migração para essas áreas em busca de uma vida melhor (Schmunis, 2007), demonstrando que a doença de Chagas é um problema de saúde pública de ampla abrangência. Significantes avanços no controle da transmissão vetorial e transfusional do T. cruzi têm sido alcançados em algumas partes do continente, particularmente devido à iniciativa do Cone Sul que levou à interrupção da transmissão vetorial e por transfusão sanguínea no Uruguai, Chile e Brasil nos últimos anos e da significativa redução da prevalência global (de 20 milhões no início dos anos 90 para cerca de 12 milhões em 2006) e da população em risco (100 para 40 milhões no mesmo período) (Dias e cols., 2002, Schofield e cols., 2006, Dias e cols., 2007). Entretanto, são muitos os desafios para se atingir o controle total ou a eliminação da doença, devido ao desigual progresso dos programas de controle vetorial e transfusional em outras partes do continente, limitações dos métodos de diagnóstico, resultados muitas vezes insatisfatórios para o tratamento específico e sintomático dos indivíduos infectados pelo parasito, e limitações 19

INTRODUÇÃO da quimioterapia atualmente disponível (Urbina & Docampo, 2003; Pinto Dias, 2006; Reithinger e cols., 2009). A doença de Chagas se inicia com uma fase aguda caracterizada pela presença de parasitos na corrente sanguínea e em diferentes tecidos do indivíduo infectado. Sintomas não específicos e miocardite são observações comuns nos estágios iniciais da infecção (Dias, 1992). As manifestações clínicas da fase aguda começam por volta do sexto dia após a infecção, e duram entre 2 a 4 meses (Miles, 2003). Nessa fase ocorre uma inflamação mononuclear, em vários órgãos, desencadeada pela ruptura das células parasitadas. Uma pequena percentagem de crianças, geralmente menores de dois anos de idade, apresenta uma forma aguda grave, e pode falecer em decorrência da insuficiência cardíaca ou meningoencefalite que, eventualmente se instalam (Coura & de Castro, 2002). A maioria dos indivíduos sobrevive à fase aguda e evolui para a fase crônica apresentando uma forma assintomática da doença, denominada forma indeterminada, na qual os parasitismos sanguíneo e tecidual são escassos. Esta forma da doença é silenciosa e pode perdurar por muitos anos ou por toda a vida do indivíduo. Entretanto, cerca de 25% a 30% dos pacientes evoluem para as formas sintomáticas, cujas lesões afetam, irreversivelmente, órgãos internos como coração, esôfago, cólon e sistema nervoso periférico, caracterizando as formas cardíaca, digestiva e mista ou associada (cardíaca e digestiva) da enfermidade (WHO, 2007). A mais comum manifestação destas formas da doença é a cardiopatia chagásica crônica, a qual aparece tipicamente décadas após a infecção inicial, e pode resultar em arritmias cardíacas, aneurisma ventricular, insuficiência cardíaca congestiva, tromboembolismo e morte súbita. Esta condição é a forma mais comum de doença miocárdica de etiologia não isquêmica (Hayes & Schofield, 1990) sendo a principal causa de doença e morte cardíacas em populações rurais carentes e/ou comunidades urbanas originadas de áreas rurais (Rassi e cols., 2009; Rassi, Jr. e cols., 2000). Embora o papel do T. cruzi na patologia da fase aguda da doença de Chagas e a importância do tratamento etiológico nesta fase sejam amplamente aceitos (Kirchhoff, 1993; Brener & Gazzinelli, 1997; Bahia-Oliveira, 2000) a participação do parasito na patogênese da doença crônica tem sido objeto de décadas de controvérsias (Cunha-Neto e cols., 1995; Kalil & Cunha-Neto, 1996; Tarleton & Zhang, 1999; Tarleton, 2001; Tarleton, 2003). Evidências experimentais suportam duas hipóteses sobre a patogênese 20

INTRODUÇÃO da cardiopatia chagásica crônica. Na primeira, chamada teoria da autoimunidade, a infecção pelo T. cruzi induz respostas imunológicas contra constituintes tissulares normais, que seriam parcialmente independentes da presença parasitária (Kalil & Cunha-Neto, 1996; Bellotti e cols., 1996). Cunha Neto e cols., (1995) descreveram a existência de reação cruzada entre epítopo específico da miosina cardíaca com antígeno do T. cruzi, sugerindo o possível envolvimento de tal epítopo como o iniciador de uma reação autoimune no coração durante a doença de Chagas. Na segunda hipótese, o parasitismo tissular persistente seria diretamente responsável pelas reações inflamatórias, acarretando em dano miocárdico irreversível (Bellotti e cols., 1996; Levin, 1996). Esta segunda hipótese vem sendo fortalecida por estudos mais recentes utilizando técnicas de imunohistoquímica e PCR, que tem associado consistentemente a presença do parasito com sítios de lesão em pacientes chagásicos com envolvimento cardíaco ou gastrointestinal (Vago e cols., 2000; Schijman e cols., 2004; Benvenuti e cols., 2008). Assim, há um crescente consenso de que a persistência do parasito, juntamente com o desequilíbrio da resposta imune em alguns indivíduos, leva a uma sustentada resposta inflamatória que fundamenta as lesões características da infecção. 1.3 Resposta imunológica do hospedeiro x doença de Chagas A ativação inicial do sistema imune, na doença de Chagas, está aparentemente relacionada com a resistência do hospedeiro à infecção. Vários estudos têm demonstrado que metabólitos do óxido nítrico (NO), citocinas e quimiocinas como interferon-gamma (IFN-γ), tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), CC Chemokine Ligand-2/Monocyte chemotactic protein-1 (CCL2/MCP-1) e CC Chemokine Ligand- 5/Regulated upon Activation, Normal T-cell Expressed, and Secreted (CCL5/RANTES) estão relacionados com inflamação e progressão da doença (Aliberti e cols., 2001; Fichera e cols., 2004; Reed, 1988; Silva e cols., 1995; Torrico e cols., 1991). Por outro lado, acredita-se que citocinas como interleucina-4 (IL-4) e interleucina-10 (IL-10) exerçam papel fundamental na regulação de processos inflamatórios envolvendo lesões teciduais causadas por diferentes infecções parasitárias (Gazzinelli e cols., 1996a; Hunter e cols., 1997) e doenças autoimunes (Weiner e cols., 1994; Moore e cols., 1993). 21

INTRODUÇÃO Interessantemente, há relatos na literatura de que o NO modula a resposta inflamatória (Calkins e cols., 2001; Giustizieri e cols., 2002; Machado e cols., 2008). O NO é derivado do oxigênio molecular e do nitrogênio guanidino da L-arginina (de Oliveira e cols., 1997). A produção de NO é catalizada por um grupo de enzimas denominadas óxido nítrico sintases (NOS), sendo três as enzimas conhecidas. NOS-1 (ou NOS neuronal) e NOS-3 (ou NOS endotelial) são constitutivas e cálciodependentes, enquanto o tipo NOS-2 (ou NOS induzível) é cálcio-independente e é a principal enzima induzida por estímulo pró-inflamatório (Nathan & Xie, 1994; Pfeilschifter e cols., 2001). O NO produzido por ação de NOS endotelial expresso constitutivamente (NOS-3) também pode influenciar as funções das células imunes e/ou contribuir para lesões no coração. Assim, além de ser uma importante molécula envolvida na citotoxicidade contra parasitos, o NO tem participação no relaxamento vascular, e também atua como um neurotransmissor no cérebro e sistema nervoso periférico (Lowenstein & Snyder, 1992). Durante a infecção pelo T. cruzi, concentrações aumentadas de NO são produzidas por miócitos cardíacos (Machado e cols., 2008). A infecção aguda pelo parasito é acompanhada por uma intensa reação inflamatória em muitos tecidos, incluindo o coração, a qual é crítica para o controle da proliferação parasitária. O processo inflamatório pode progredir para fibrose e remodelagem cardíaca, resultando em uma cardiomiopatia dilatada acompanhada por disfunção miocardial, (Higuchi e cols., 2003) comum no estágio crônico da doença. Na fase crônica da infecção, infiltrados inflamatórios, são compostos principalmente de células mononucleares, linfócitos e macrófagos, embora ocasionalmente neutrófilos e eosinófilos sejam também detectados (Reis e cols., 1993; Higuchi e cols., 1997; dos Santos e cols., 2001). Entre os linfócitos, células T CD8 + superam células T CD4 + nos infiltrados cardíacos focais e difusos de pacientes com cardiopatia chagásica crônica (Reis e cols., 1993; Higuchi e cols., 1997) e em modelos experimentais cronicamente infectados (dos Santos e cols., 2001; Medeiros e cols., 2009). Entretanto, os fatores que regulam o enriquecimento das miocardites por células TCD8 +, bem como o papel funcional de células inflamatórias no controle do parasitismo e da cardiomiopatia ainda são pouco conhecidos (Lannes-Vieira e cols., 2009). 22

INTRODUÇÃO A efetiva defesa celular do hospedeiro implica em um orientado tráfego e preciso posicionamento de células efetoras. Para a imunidade protetora, é essencial que subpopulações específicas de leucócitos exibam receptores de superfície celular para a orientação de seu direcionado fluxo periférico e apropriado recrutamento nos tecidos inflamados (Mackay, 2001; Luster, 2002). O papel fundamental da migração celular através de tecidos linfóides e periféricos já é reconhecido há quatro décadas (Marchesi & Gowans, 1964; Gowans & Knight, 1964). Atualmente, existe um conhecimento aprofundado sobre os mecanismos moleculares envolvidos neste processo. Em 1987, Yoshimura e cols descreveram a habilidade de certas citocinas em atrair leucócitos. Em 1993, estas citocinas foram denominadas de quimiocinas e caracterizadas como uma família de pequenas citocinas quimiotáticas com peso molecular de aproximadamente 8-10 kda. Cerca de 50 quimiocinas humanas e 20 receptores de quimiocinas são conhecidos atualmente (Zlotnik & Yoshie, 2000; Ritter & Korner, 2002). Estas pequenas moléculas quimiotáticas podem ser subdivididas em quatro subfamílias (CXC ou α, CC ou β, C ou γ, CX 3 C ou δ) (Proudfoot e cols., 2003). Além de seu papel crucial no tráfego regular de leucócitos para órgãos linfóides e não linfóides, e no recrutamento destas células para sítios de lesão e infecção, tem sido demonstrado que as quimiocinas e seus receptores estão envolvidos em vários eventos biológicos, incluindo a proliferação de células T (Taub e cols., 1993), diferenciação Th1/Th2 (Gao e cols., 1997), e resistência à infecção (Machado e cols., 2000; Proudfoot, 2002; Teixeira e cols., 2002). Quimiocinas tais como CCL2 e CCL5 têm sido observadas em macrófagos e cardiomiócitos humanos e murinos infectados pelo T. cruzi (Villalta e cols., 1998; Aliberti e cols., 1999; Machado e cols., 2000). Vários autores têm descrito o papel atrativo destas quimiocinas para leucócitos, preferencialmente células T CD8 + e o seu provável envolvimento no controle da multiplicação do T. cruzi e na produção de NO (Sallusto e cols., 1998; Cook e cols., 1999; Villalta e cols., 1998; Aliberti e cols., 1999; Machado e cols., 2000). É difícil estudar os eventos iniciais relativos à produção de quimiocinas in vivo. Entretanto, a incubação in vitro de leucócitos periféricos humanos com Leishmania demonstrou que monócitos infectados expressam CCL2, a qual poderia numa situação 23

INTRODUÇÃO in vivo, atrair outros monócitos e macrófagos ou outras células CCR2 + (células com receptor para CCL2, tais como células NK) para o sítio da infecção (Ritter & Moll, 2000). Stegelmann e cols (2005) demonstraram que células T CD8 + humanas induzem a expressão de CCL5 e granulisina após o reconhecimento de macrófagos infectados por Mycobacterium tuberculosis. Segundo estes autores, CCL5 atrai eficientemente macrófagos infectados pela micobactéria, mas falham em exibir atividade microbicida, a qual é exercida pela granulisina. Juntos, CCL5, granulisina e perforina, colocalizados em subgrupos de células T CD8 + conferem ação quimiotática, citolítica e microbicida a tais células possibilitando a atração de macrófagos infectados e a morte de patógenos intracelulares. A excessiva ativação da resposta imune celular pelo T. cruzi, no entanto, acaba ocasionando efeitos deletérios no hospedeiro, principalmente por favorecer o desenvolvimento da miocardite com suas lesões teciduais e neurais (Golgher D & Gazzinelli RT, 2004). Sendo assim, essa doença deve ser tratada primariamente como uma infecção e não como uma condição autoimune 1.4 Tratamento da doença de Chagas Embora os esforços no controle da transmissão vetorial do T. cruzi tenham sido bem sucedidos, os resultados destas medidas não beneficiam diretamente os milhões de indivíduos infectados, nem tampouco os pacientes com manifestações clínicas da doença (Coura & de Castro, 2002). Portanto, faz-se necessário o fortalecimento de programas de pesquisas que visam o desenvolvimento de novos fármacos, promovendo ações de integração social, científica e tecnológica (Dias & Dessoy, 2009). Apesar dos empíricos esforços de numerosas investigações, com uma variedade de compostos de diferentes classes químicas, a doença de Chagas permanece sem um tratamento eficaz, várias décadas após a sua descrição original. A longa história da quimioterapia da doença de Chagas pode ser dividida em três fases principais (de Castro, 1993; Coura & de Castro, 2002). A primeira compreende o estágio inicial da descoberta da doença, de 1909 até 1935, e é marcada pela morte de Carlos Chagas (em novembro de 1934) e pelo lançamento do Manual de Doenças Tropicais e Infectuosas (em 1935), escrito por Carlos Chagas em coautoria com seu filho Evandro Chagas. A 24

INTRODUÇÃO segunda fase, no período de 1936 a 1960, corresponde à avaliação biológica de inúmeras substâncias químicas, extratos e misturas de componentes, sendo marcada por resultados controversos e de significado clínico questionável (Dias & Dessoy, 2009). A última fase, a partir de 1961, é caracterizada por estudos que demonstram claramente, através de modelos experimentais de infecção com o T. cruzi em camundongos, a eficácia de alguns compostos como, por exemplo, a nitrofurazona (de Castro, 1993; Dias & Dessoy, 2009). Foi nesta última fase (final dos anos 60) que o fármaco benznidazol começou a ser utilizado no tratamento da doença de Chagas e ainda hoje é o medicamento de escolha para esta enfermidade. O principal problema encontrado na quimioterapia da doença de Chagas é a dificuldade da eliminação do T. cruzi, em grande parte dos indivíduos infectados, com o tratamento disponível atualmente. Fármacos para o tratamento desta enfermidade não são do interesse das indústrias farmacêuticas, estando na raiz do problema o alto custo dos investimentos e a falta de um mercado potencial e seguro nos países em desenvolvimento. Algumas das indústrias que produzem os medicamentos destinados a tais doenças não demonstram interesse em dar continuidade a esta produção em virtude do baixo lucro que ela proporciona. Exemplo disso foi o que ocorreu em três de março de 2003, quando o grupo farmacêutico suíço Roche anunciou a doação ao governo brasileiro do direito de patente e de uso da tecnologia do medicamento Rochagan, à base do fármaco benznidazol. Nos últimos 25 anos, apenas 1% de todos os medicamentos desenvolvidos foi para tratar alguma doença negligenciada (Chirac & Torreele, 2006). Na ausência de novas alternativas terapêuticas para doenças cada vez mais graves, os médicos se vêem ainda obrigados a recorrer a medicamentos e tratamentos antigos, que se tornam cada vez mais ineficazes (Dias & Dessoy, 2009). Neste cenário, a identificação de novos compostos e a avaliação do impacto do tratamento antiparasitário sobre a prevenção da morbidade dos indivíduos infectados permanecem como os principais desafios na busca da promoção da saúde e controle da doença (Urbina, 2001). 1.4.1 Compostos nitro-heterocíclicos Até 1970 não havia nenhum medicamento disponível para o tratamento da doença de Chagas, quando então dois fármacos nitro-heterocíclicos foram introduzidos, 25

INTRODUÇÃO nifurtimox e benznidazol. O nifurtimox e o benznidazol contêm um grupo nitro ligado ao anel furano ou imidazólico, respectivamente. Estes agentes atuam como prófármacos necessitando da ativação mediada por nitrorredutases para apresentarem efeitos citotóxicos. O nifurtimox (descontinuado no Brasil), atua através da redução do seu grupo nitro, resultando na formação de radicais nitroaniônicos instáveis (R-NO.- 2 ) que reduzem o oxigênio molecular formando o íon superóxido (O.- 2 ), o qual é captado pela enzima superóxido dismutase gerando peróxido de hidrogênio (H 2 O 2 ) que na presença de íons Fe III, forma o radical hidroxila (. OH) (Diaz de Toranzo e cols., 1988; Romanha e cols., 2002). A esta espécie tem sido atribuído o efeito anti-t.cruzi por mecanismos complexos que envolvem ligação a lipídeos, proteínas e ao DNA do T. cruzi (Maya e cols., 2003). O T. cruzi é deficiente em mecanismos de detoxificação para metabólitos oxigenados, sendo mais sensível ao stress oxidativo que as células dos vertebrados (Maya e cols., 2003). O benznidazol é um composto nitroimidazólico que atua sobre o genoma do T. cruzi e inibe a síntese de DNA, RNA e proteínas (Stoppani, 1999). Este fármaco age através de stress redutivo e não depende diretamente de espécies reativas do metabolismo do oxigênio (Maya e cols., 2003). No caso do benznidazol, os radicais nitroaniônicos instáveis (R-NO.- 2 ) resultantes do processo iniciado com a redução do seu grupo nitro, estariam envolvidos no efeito anti-t.cruzi através da formação de ligações covalentes com macromoléculas do T. cruzi (e.g., DNA e citocromo P450) (Diaz de Toranzo e cols., 1988; Fairlamb & Cerami, 1992). É descrito ainda que o benznidazol aumenta a fagocitose e lisa o T. cruzi através de um mecanismo dependente de interferon-gama (IFN-γ) (Romanha e cols., 2002), e inibe o crescimento do parasito através da enzima NADH-fumarato redutase (Turrens e cols., 1996). Os metabólitos formados através do mecanismo de ação do nifurtimox e do benznidazol podem atuar também em outros sistemas, especialmente do hospedeiro (humano), devido a sua alta reatividade. Esta baixa especificidade de ação em vias bioquímicas definidas do parasito contribui para os efeitos citotóxicos observados no tratamento dos pacientes. Os efeitos mais comuns para o composto nifurtimox são perda de peso, sonolência, além de algumas manifestações digestivas, tais como náuseas, vômitos e cólicas intestinais (Castro e cols., 2006). Já para o benznidazol, os efeitos colaterais mais frequentes podem ser agrupados de três formas: (1) manifestações de hipersensibilidade, como dermatite com erupção cutânea, edema periorbital ou 26

INTRODUÇÃO generalizado, febre, linfadenopatia, dores musculares e articulares, (2) depressão da medula óssea, incluindo neutropenia, agranulocitose e púrpura trombocitopênica; e (3) polineuropatia periférica, representada por parestesias e polineurite (Castro e cols., 2006). A incidência de tais efeitos colaterais é variável dependendo da idade do indivíduo infectado (menos frequente em indivíduos jovens), área geográfica e a qualidade da supervisão clínica do tratamento (Urbina, 2009). O nifurtimox e o benznidazol apresentam eficácia relativamente alta no tratamento da fase aguda da doença de Chagas, sendo observados índices que variam de 40% a 76% de cura parasitológica (Andrade e cols., 1992; Cançado, 2002). A quimioterapia com o benznidazol também é eficaz no tratamento de crianças, provavelmente na fase crônica recente da doença de Chagas. Sosa-Estani e cols. (1998) na Argentina verificaram pelo menos 62% de cura em triagem clínica para testar a eficácia e tolerância do benznidazol em crianças na fase crônica indeterminada da infecção pelo T. cruzi. Nesse estudo o critério de cura foi estabelecido pela negativação de testes sorológicos após quatro anos do tratamento com benznidazol. No Brasil, Andrade e cols. (2004) verificaram em crianças infectadas pelo T. cruzi, seis anos após o tratamento com benznidazol, 84,7% de negativação dos testes sorológicos e nenhuma alteração eletrocardiográfica. Por outro lado, o tratamento com benznidazol de crianças e adolescentes de duas diferentes regiões rurais da Bolívia induziu níveis de 5,4 e 0% de cura (Yun e cols., 2009). Adicionalmente, os tratamentos com benznidazol e com nifurtimox apresentam baixa eficácia quando administrados durante a fase crônica da doença. Na fase crônica indeterminada os percentuais de cura variam entre zero a 30% (Galvão e cols., 1993; Braga e cols., 2000). Braga e cols. (2000), utilizando a PCR como controle de cura não detectaram cura parasitológica em pacientes crônicos tratados com nifurtimox e benznidazol. As razões para a marcada diferença na eficácia antiparasitária dos compostos nitro-heterocíclicos nas fases aguda e crônica da doença não são bem determinadas (Cançado, 2002). Entretanto, podem estar relacionadas às propriedades farmacocinética desfavoráveis destes compostos, como a meia-vida relativamente curta e a limitada penetração tecidual (Raaflaub & Ziegler, 1979; Raaflaub, 1980; Workman e cols., 1984; Urbina & Docampo, 2003). Estes fatores podem dificultar a sua ação na fase crônica da 27

INTRODUÇÃO doença, quando os parasitos estão confinados profundamente nos tecidos e sofrem lenta replicação (Urbina, 2009; Buckner, 2008). Além disso, verificar com eficácia a cura parasitológica em indivíduos tratados durante a fase crônica, quando os níveis de parasitos circulantes podem ser extremamente baixos, permanece um problema desafiante (Martins e cols., 2008). Em adição, existem ainda muitas controvérsias sobre a eficiência da quimioterapia específica, especialmente em indivíduos chagásicos crônicos. De acordo com a hipótese da importância da presença do parasito na persistência das lesões durante a fase crônica da doença de Chagas, a administração terapêutica pode diminuir a carga parasitária em tecidos infectados e, dessa forma, reduzir a gravidade dos processos inflamatórios associados com as formas crônicas da tripanossomíase americana (Urbina & Docampo, 2003). Porém, os baixos índices de cura detectados em indivíduos tratados durante a fase crônica da doença associados aos riscos desfavoráveis que apresentam os compostos nitrofuranos (nifurtimox) e nitroimidazóis (benznidazol), fazem com que muitos clínicos ainda permaneçam com fortes reservas quanto ao tratamento de pacientes chagásicos crônicos (Urbina & Docampo, 2003). A procura por novos compostos com atividades anti-t.cruzis, com baixas toxicidades e elevados níveis de eficácia durante a fase crônica permanece. O sucesso da combinação nifurtimox-eflornithine no tratamento da Tripanossomíase Africana e do novo nitroimidazol-oxazine (PA-824) para o tratamento da tuberculose (Priotto e cols., 2009; Diacon e cols., 2010) renovou o interesse nos compostos nitro-heterocíclicos para o tratamento de doenças infecciosas. O aumento da atenção para o potencial antimicrobiano destes compostos também levou à retomada dos estudos com o fexinidazol (Hoe 239) como potencial fármaco para o tratamento da doença de Chagas. O fexinidazol estava em desenvolvimento pré-clinico como um antiprotozoário de largo espectro pela Hoechst nos anos 70-80, mas os estudos foram interrompidos quando a Hoechst decidiu encerrar as suas atividades em medicina tropical. Esta molécula foi reativada recentemente pelos esforços da Drugs Neglected Disease Initiative (DNDi) com a finalidade de ser utilizada no tratamento da tripanosomíase africana (www.dndi.org). O fexinidazol também apresenta atividade anti-t. cruzi, tendo sido detectado níveis de atividades superiores aos do benznidazol e do nifurtimox em experimentos realizados em camundongos infectados pelo T. cruzi e tratados durante a 28

INTRODUÇÃO fase aguda da infecção (Raether & Seidenath, 1983). Entretanto, como a metodologia para a avaliação da eficácia do tratamento utilizada pelos autores, exame de sangue a fresco e inoculação do sangue dos animais tratados em novos camundongos, apresenta baixa sensibilidade para o controle de cura, foi realizada uma nova avaliação deste composto em nosso laboratório, utilizando a hemocultura e a PCR como controle de cura. Os nossos resultados confirmaram a potente atividade anti-t.cruzi deste composto, demonstrando ser o fexinidazol eficiente em induzir cura parasitológica em camundongos infectados por cepas resistentes do parasito, como a cepa Colombiana e a VL-10, durante as fases aguda e crônica da infecção murina (dados não publicados). Este fármaco também mostrou atividade no tratamento de infecções pelo Trichomonas foetus, T. vaginalis e Entamoeba histolytica. Os principais metabólitos sulfóxidos e sulfonas do fexinidazol mostraram-se tão ativos quanto o composto parental contra T. cruzi, Trichomonas e E. histolytica em infecções em camundongos e hamsters. Alguns efeitos colaterais, como anemia e redução de peso foram observados em ratos e cães submetidos a altas dosagens do fármaco por prolongado período de administração (90 dias) (Raether & Seidenath, 1983). Camundongos infectados pelo T. brucei, o agente causal da Tripanossomíase Africana, tratados oralmente durante 4 dias com 200 mg/kg de fexinidazol não apresentaram sinais de toxicidade (Sokolova e cols., 2010). O fexinidazol está sendo utilizado em ensaios clínicos para o tratamento da Tripanossomíase Africana, também conhecida como doença do sono. Nos estudos iniciais referentes à utilização do fexinidazol para o tratamento da doença do sono, Winkelmann e Raether (1978) propuseram que os átomos de enxofre neste composto seriam provavelmente metabolizados, in vivo, a grupos sulfonas e/ou sulfóxidos. Análises recentes de amostras de sangue de camundongos tratados oralmente com fexinidazol na dosagem de 200 mg/kg de peso corpóreo confirmaram as proposições de Winkelmann e Raether. Quinze minutos após a administração oral, os níveis de fexinidazol no sangue dos animais apresentaram o pico de 961 ng/ml declinando-se após esse tempo. Os metabólitos sulfóxidos, por sua vez, acumularam-se ao valor de 40.000 ng/ml, 2 horas após a sua administração e os fexinidazóis sulfonas continuaram acumulando no sangue durante as 8 horas avaliadas, atingindo a concentração de 55.000 ng/ml (Sokolova e cols., 2010). Estes achados sugerem que o fexinidazol atua como um pró-fármaco, o qual é oxidado, in vivo, a estas espécies terapeuticamente mais 29