CAPÍTULO 3 MATERIAL E MÉTODOS

CAPÍTULO 3 MATERIAL E MÉTODOS 3. LOCAL DOS EXPERIMENTOS O trabalho foi realizado na Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP - Campinas, SP), em casa de vegetação do Departamento de Fisiologia Vegetal do Instituto de Biologia. Este departamento possui os equipamentos utilizados para as determinações analíticas (pigmentos: Clorofilas a e b/carotenóides; área foliar e massa seca) deste trabalho experimental. 3. MONTAGEM DOS EXPERIMENTOS Foram montados dois experimentos em condições de casa de vegetação no Departamento de Fisiologia Vegetal (UNICAMP), em delineamento experimental inteiramente casualizado, sendo o primeiro montado em 8 de agosto de 000 e o segundo em 6 de março de 00. No primeiro experimento foi utilizado o espectroradiômetro Spectron SE 590. No segundo, além deste equipamento, foram utilizados o espectroradiômetro FieldSpec e também a esfera integradora Licor 800 acoplada ao Spectron SE 590. A cultivar de soja utilizada foi a IAC 7, que é precoce, com ciclo em torno de 00 dias. As sementes de soja foram colocadas para germinar em bandejas contendo vermiculita lavada e mantidas em casa de vegetação. Foram utilizadas 6 caixas plásticas de cor preta, com dimensões de 60cm x 40cm x 0cm, nas quais a soja foi transplantada quando estavam no estádio VC (Tabela.), em substrato edafológico comum, constituído de 00 litros de terra preta, 400 litros de Latossolo Vermelho eutroférrico, 0 litros de Neossolo quartzarênico, 80 litros de vermiculita e kg de adubo químico NPK (4-4-8) para o preenchimento de todas as caixas, recebendo cada uma em torno de 40 litros. A análise química do substrato 57

encontra-se no Apêndice A. O espaçamento utilizado foi de 8 cm, tanto entre linhas como entre plantas (Figura 3.). Fig. 3. Caixas plásticas com plantas de soja. No experimento, após o plantio, a superfície do solo (substrato) foi recoberta por dois outros tipos de solo espectralmente diferentes (um tipo de solo para cada 8 caixas). Foi utilizado um solo com resposta espectral alta [solo de cor clara Solo A-, representado por um Neossolo Quartzarênico (EMBRAPA, 999)] e um solo com resposta espectral baixa [solo de cor escura Solo B -, representado por um Latossolo Vermelho eutroférrico (EMBRAPA, 999)] (Figura 3.). No experimento, foi utilizado como cobertura somente o Latossolo Vermelho eutroférrico. (A) (B) Fig. 3. (A) Solo recoberto com Neossolo Quartzarênico; (B) Solo recoberto com Latossolo Vermelho eutroférrico. 58

3.3 EQUIPAMENTOS Foram utilizados os seguintes equipamentos para a coleta de dados: a) Espectroradiômetro Spectron SE 590 (Figura 3.3), com resolução espectral de 6 nm, com FOV (5 º ) projetando um diâmetro de 40 cm a uma altura de 50 cm no topo do dossel com um ângulo de iluminação de 5 o em relação ao nadir a uma distância de 0 cm do centro de visada. Os dados obtidos foram processados no programa ESPECTRO desenvolvido pelo LARAD/INPE, para poder trabalhar com planilhas eletrônicas, como o Excel; Fig. 3.3 Equipamento Spectron SE 590. b) Esfera Integradora LiCor 800, que é um instrumento que mede a radiação que é refletida ou transmitida do material amostral. Uma fonte externa de luz (lâmpada) halógena, de 6 volts e 0 Watts presente em uma cone que restringe a iluminação na folha, com um diâmetro de,4 cm. A esfera possui cinco portas, e a porta onde se coloca a amostra de folha mede,45 cm de diâmetro e a porta para observação é de 0,64 cm de diâmetro. As outra três portas existentes são cada uma, para reflectância, referência e transmitância. A parte interna da esfera é recoberta com sulfato de bário. A esfera foi acoplada ao espectroradiômetro Spectron SE 590, do LARAD/INPE e feito leituras na parte ventral das folhas. 59

c) Espectroradiômetro FieldSpec (Figura 3.4), portátil com "Full Range" de 0.3 a.5µm da Analytical Spectral Devices (ASD). Com FOV (5 o.) projetando um diâmetro de 4 cm a uma altura de 50 cm no topo do dossel com um ângulo de iluminação de 5 o em relação ao nadir a uma distância de 0 cm do centro de visada. Os dados obtidos foram processados e posteriormente foram analisados em planilhas eletrônicas, como o Excel; Fig. 3.4 Equipamento FieldSpec. d) Placa de Sulfato de Bário para calibração dos equipamentos. e) Espectrofotômetro utilizado para as determinações das concentrações de pigmentos (Clorofila a, Clorofila b, Clorofila total e Carotenóides) (Figura 3.5); Fig. 3.5 Espectrofotômetro e cubetas utilizados para as determinações de clorofilas e carotenóides. 60

f) Máquina fotográfica digital Sony F-73; g) Medidor eletrônico de área foliar da LiCor (Figura 3.6) h) Régua milimetrada; Fig. 3.6 Medidor de área foliar (LiCor). i) Estufa do Departamento de Fisiologia Vegetal (UNICAMP) e j) Balança digital de precisão (Figura 3.7). Fig. 3.7 Balança digital de precisão utilizada para fazer as determinações de peso verde e seco das plantas de soja. 6

3.4 MÉTODOS 3.4. - DADOS AGRONÔMICOS: Semanalmente eram feitas as seguintes determinações: a) Altura das plantas que foi realizada a partir do colo da planta até o último nó visível, com auxílio de uma régua milimetrada; b) Massa de matéria verde e massa de matéria seca. Como neste trabalho a parte da planta de interesse é a aérea, as plantas coletadas foram separadas em raiz, folhas e caules + pecíolos, sendo as raízes descartadas e feita a determinação da massa verde em balança de precisão. O material foi seco em estufa a 80 o C, por no mínimo 48 horas e a massa de matéria seca foi determinada; c) Índice de área foliar (IAF), foi obtido pela contagem das plantas por linha de plantio e pelas medidas de área foliar; d) Porcentagem de cobertura de vegetação verde sobre o solo, por meio de fotografias digitais, que foram processadas pelo software de processamento de imagens SPRING (INPE, 999); e) Fases fenológicas, identificadas durante todo o ciclo da cultura, conforme Alvares Filho (988) (Tabela., página 30). f) Determinação da concentração de pigmentos (Clorofila a, Clorofila b e Carotenóides) em laboratório, utilizando discos foliares com massa de 5 mg que eram retirados da última folha completamente expandida do topo do dossel. Estes discos foram colocados em tubo de ensaio com DMSO (Dimetil Sulfóxido), e que foram mantidas no escuro e em seguida levados para banhomaria até retirada completa dos pigmentos. Depois de fria, a solução era colocada em cubetas que eram colocados em espectrofotômetro onde foram realizadas leituras em 470, 646 e 663 nm de comprimento de onda; em seguida estas leituras foram utilizadas nas equações sugeridas por Lichtenthaler (987): 6

Clorofila a = (, x A 663 ) - (,8 x A 646 ) (3.) Clorofila b = (0,3 x A 646 ) - (5,03 x A 663 ) (3.) ( 000xA470) (3,7xCa) (04,0 xcb) Carotenóides + Xantofilas= (3.3) 9 Onde A é a absorbância a 470, 646 e 663 nm. Com o objetivo de avaliar se o desenvolvimento da cultura em condições de casa de vegetação foi normal, foi realizada uma análise de crescimento, conforme os parâmetros fisiológicos indicados a seguir: Determinação da razão de área foliar que foi realizada pela seguinte fórmula: RAF = A MS folhas total (3.4) dada em cm /g, onde RAF é a razão de área foliar, A é a área e MS é a matéria seca (Beadle, 993); Determinação das taxas médias de assimilação líquida (TAL) e as taxas médias de crescimento relativo (TCR) que foram calculadas para o período de desenvolvimento da cultura (das fases VC a R8) pelas seguintes fórmulas (Beadle, 993): TAL = M t M ln A ln t A A A (3.5) ln M ln M TCR = t t (3.6) onde M = massa da matéria seca total no tempo t (mg); M = massa da matéria seca total no tempo t (mg); A é a área foliar total no tempo t ; A é a área foliar total no tempo t ; t tempo da primeira coleta e t tempo da segunda coleta. 63

Os dados foram analisados estatisticamente através de análises de variância simples e testes de médias (Tukey), significativos ao nível de 5% de probabilidade de acordo com Pimentel Gomes (985), com o objetivo de comprovar quantitativamente as diferenças, quando existentes. 3.4. DADOS RADIOMÉTRICOS: Para a obtenção dos dados radiométricos, as caixas eram levadas para uma sala escura onde estavam montados os equipamentos. Foram realizadas semanalmente, em cada uma das caixas, três leituras com os referidos equipamentos e os dados foram plotados em planilha eletrônica (Excel). Para se verificar as influências das respostas espectrais da cultura e analisar as relações entre os componentes vegetais e a resposta espectral, os dados provenientes dos espectroradiômetros foram analisados ainda através das seguintes técnicas: Posição do ponto de inflexão (PI) da borda vermelha no espectro de reflectância: foi determinada como o ponto de interseção com a linha zero da segunda derivada do espectro de reflectância, que foi calculado pelo módulo HyperSpec para MatLab, idealizada por Tsai e Philpot (998). Comprimento de onde de mínima reflectância no vermelho (Vmin): na banda de absorção do vermelho da Clorofila a, foi determinada através da interseção com a linha zero da primeira derivada do espectro de reflectância. Estes cálculos também foram realizados pelo módulo HyperSpec para MatLab (Tsai e Philpot, 998). Através dos dados radiométricos obtidos, os índices espectrais para determinação do conteúdo de clorofilas e carotenóides nas diferentes fases da cultura foram calculados. Os índices estudados foram: RARS (Chappelle et al., 99), PSSR (Blackburn, 998b) e PSND (Blackburn, 998b), apresentados no Capítulo Fundamentação Teórica, pág. 5 e 5. 64

Os resultados obtidos pelos índices e os dados referentes à concentração de pigmentos obtidos em laboratório, foram estudados por análise de regressão simples (Neter e Wasserman, 974), para se verificar as relações existentes entre eles. Para esta fase foram utilizados 60% dos dados obtidos e os restantes 40% serviram para validar ou não os modelos de regressão obtidos. 65