Aumentando o tempo de residência em fluxo monossegmentado ANÁLISE EM FLUXO MONOSSEGMENTADO (MSFA) Aumento de tempo de residência sem aumento de dispersão C. Pasquini, W.A. de Oliveira, Anal. Chem. 57 (1985) 2575 Transportador Ar Zona de Amostra Ar Transportador B.F. Reis, M.F. Giné, E.ªM Kronka; A análise por injeção em fluxo contínuo. Quim. Nova 12 (1989) 82. C. Pasquini, W.A. Oliveira; Monosegmented system for continuous flow analysis. Spectrophotometric determination of chromium (VI), ammonia and phosphorus. Anal. Chem. 57 (1985) 2575. Introdução das bolhas de ar Remoção das bolhas 12 µl Avaliação do sistema com corante T1-bobina de incubação (comprimento variável, 2 mm d.i.) S amostra J cela de permeação 60 µl V = frequência de amostragem = 3600/t B, onde t B = largura de pico na linha de base Tempo de Volume de amostra = 300 µl; > 120 análises/h residência Não precisa atingir equilíbrio Determinação de amônia Determinação de amônia R5 =NaOCl 0,5% (m/v) R6 = Fenol 2% (m/v) e prussiato de sódio 1% (m/v) R7 = EDTA 5% (m/v em NaOH 0,5M T4 = 300 cm. 2mm d.i. monochloramine benzoquinonechlorimine indophenol 1
Determinação de Fosfato Determinação de Cr(VI) R1 = molibdatode amônio 5 mm em HNO 3 0,2M R2 = ácido ascórbico 0,5% (m/v) T2 = 150 cm, 2 mm d.i. R3 = H 2 SO 4 2M R4 = Difenilcarbazida0,2% (m/v) em ácido acético 25% (v/v) T3 = 100 cm, 2 mm d.i. MSFA vs. SCFA vs. FIA Principais vantagens do MSFA sobre SCFA são a possibilidade de trabalhar com menores volumes de amostra e maior simplicidade instrumental (introdução e remoção de bolhas é feita sem tubos de bombeamento adicionais) Frequência de amostragem em MSFA é aproximadamente o dobro de SCFA para reações lentas e pode aumentar ainda mais para reações rápidas Principal vantagem de MSFA sobre FIA é a possibilidade de aumentar o tempo de residência sem aumento de dispersão e sem diminuição da frequência de amostragem Para amostras que não requeiram alta sensibilidade e a reação é rápida, FIA é vantajosa sobre MSFA e SCFA 1) Definir o analito 2. a) Estudar a literatura sobre diferentes métodos possíveis FIA, SCFA, Métodos Oficiais, outros; b) Estudar a literatura sobre o desempenho e propriedades: Princípios químicos, seletividade, sensibilidade, faixa de resposta linear c) Estudar a necessidade de pré-tratamento. 3) Investigar a cinética de reação e avaliar a possibilidade de adaptar a um sistema FIA, disponibilidade, preço e toxicidade dos reagentes, disponibilidade de cela de detecção em fluxo. 4) Projete o sistema de fluxo considerando aspectos como dispersão, faixa de concentrações de trabalho, sensibilidade, efeitos de matriz, etc. Para máxima sensibilidade, aumente o volume de amostra, aumente a vazão do transportador e diminua a vazão dos reagentes. Minimizar a influencia da matriz compatibilize o transportador com a amostra (ph, força iônica, viscosidade, etc). Para maximizar a frequência de amostragem, diminua o volume de amostra, aumente a vazão total e diminua o comprimento e diâmetro da bobina de reação 5.Realizar testes iniciais, avaliando: estabilidade da linha base, determinar o coeficiente de dispersão, injetar um padrão e comparar com o sinal obtido pelo método estático, o ph do efluente está dentro do planejado? Realizar a varredura espectral do produto obtido para verificar se o comprimento de onda está adequado; verifique o formato do pico para confirmar que o grau de mistura está sendo apropriado, realizar uma parada de fluxo. 6. Estudar a influência do ph na reação (solução transportadora e reagentes efetuar parada de fluxo). 7. Estudar a influência da temperatura na bobina de reação (25 a 50 o C) 8. Otimizar o sistema com as variáveis: Volume de amostra Vazão (Transportador) Composição do transportador Vazão do Reagente Composição do reagente Comprimento da bobina Diâmetro interno Set-up instrumental Temperatura 9. Realizar estudo de interferentes 10. Validação do Método: Linearidade e sensibilidade Limite de detecção e quantificação Análise de amostras reais Exatidão -Estudos de recuperação, comparação com métodos de referência, análise de amostras certificadas Precisão - Reprodutibilidade e repetibilidade Testes de estabilidade de amostras e reagentes Robustês B. Karlberg, G. E. Pacey, FlowInjectionAnalysis. A PracticalGuide. Elsevier, Amsterdam, 1989 Acompanhe o efeito das alterações com paradas de fluxo e determinações de D 2
1. Analito= Fe em águas concentrações entre 0 e 1,0 mg/l 2. Possíveis reagentes colorimétricos: (A) o- fenantrolina (B) 2,4,6 tri 2-piridil-1,3,5 triazina(tptz) (C) 3-(2-piridil)-5,6-bis (4-fenilsulfonato)-1,2,4 triazina(ferrozina) Reagente Absortividade Molar (L mol -1 cm -1 ) A 11100 B 22600 C 27900 Ferrozina: maior sensibilidade; estequiometria 3:1, ph 4-4,5; outros íons metálicos podem interferir, mas estão em concentrações muito menores; Ferrozinareage com Fe(II), mas não com Fe(III) requer etapa de redução; polifosfatos complexam ferro (pré-tratamento necessário (HClou perssulfatode potássio) 3. Ferrozinapreenche as características necessárias para a análise (sensibilidade, seletividade e disponibilidade comercial) 4. Para maior sensibilidade deve-se trabalhar com baixa dispersão da zona de amostra: Aumentar volume de amostra e vazão de transportador, diminuir a vazão dos reagentes C1 R1 R2 ml/min 2,0 0,3 0,3 200 µl D = 1,3 30/0,7 30/0,7 560 nm C1 = água destilada R1 = Reagente combinado: Ferrozina + redutor (cloridrato de hidroxilamina) R2 = Solução Tampão HAc/NaAc Concentração dos reagentes, considerando a amostra mais concentrada como 1,0 mg/l em Fe total: Após o primeiro ponto de confluência, R1 dilui a amostra por um fator de 2/(2+0,3), de modo que a concentração máxima de amostra a partir desse ponto seria 0,87 mg/l (0,0156 mm). R1 é diluído na razão de 0,3/(2+0,3) = 0,13 Estequiometria 1 Fe : 3 Ferrozina. Portanto se C Fe = 0,156 mm, C ferrozina = 0,0468 mm (teórica). Usar um excesso de pelo menos 5 x a concentração estequiométrica. Portanto, a C ferrozina na bobina deveria ser 0,234 mm Como o reagente é diluído na razão 0,13, a C ferrozina no frasco estoque deve ser 0,234/0,13 = 1,80 mm Cloridrato de hidroxilamina = 3,5 % (m/v) - grande excesso 5. Testes iniciais (D experimental = 1,11) Absorbância esperada: 200 µg/l = 3,58 x 10-6 M A = [(3,58 x 10-6 )/1,1]*27900 = 0,91 Linha base estável, mas com distorção na base do pico (efeito de matriz) Reação rápida Magnitude do sinal (~0,1 U.A.) é coerente com o coeficiente de absortividade molar do complexo (27900 L mol -1 cm -1 ) 6. Diferentes valores de ph (3,6 a 6) não alteraram o sinal 7. Efeito da Temperatura T ( o C) U.A. 14 0,399 24 0,417 35 0,449 48 0,470 Ganho de sinal não compensa os problemas associados com o aquecimento da bobina de reação Paradas de fluxo em diferentes temperaturas e diferentes tempos comprovam que a reação é praticamente instantânea 8. Otimização. Curva analítica construída com soluções de referência de concentrações entre 0,25 e 0,90 mg/l 8. Otimização Para eliminar a distorção do pico: Usar válvula com by-pass ou Adicionar um outra linha de fluxo: C1 C2 R1 R2 200 µl D exp = 1,5 30/0,7 30/0,7 30/0,7 570 nm d.i.= 0,7 mm melhor que 0,5 mm (melhora a mistura) C ferrozina(r1) variada de 0,93 a 0,75 g/l C tampão(r2) 8 a 10% (m/v) Distorção na linha de base dificulta leitura do pico em baixas concentrações (gradiente de índice de refração) 3
9. Estudo de interferentes: cloreto, sulfato, sódio, cálcio, magnésio, fosfato, substâncias húmicas, etc. Espécies comumente encontradas em águas. Consultar legislação (CONAMA) para diferentes classes de águas 10. Validação... 1-variação e ruído na linha base 2-bolha de ar (a) pico normal,(b) pico causado por bolha 3-(a) pico com forma normal; (b) pico deformado por pulsação (tubos de bomba deformados) QUÍMICOS Químicos, mecânicos ou ambos? Checar a reação manualmente nas proporções amostra/reagente planejadas antes de iniciar as injeções. Verificar: Concentração dos reagentes (há excesso em relação à quantidade estequiométrica?) O ph está adequado? A cinética da reação permite a adaptação ao sistema FIA? Requer aquecimento? Mecânicos SISTEMA DE PROPULSÃO Checar o sistema de bombeamento com água -trocar tubos de bomba deformados -Lubrificar os tubos com óleo de silicone -Usar pressão correta para o bombeamento (excesso de pressão não aumenta a vazão e diminui a vida útil dos tubos) -Desconectar o injetor e as bobinas para verificar o bombeamento Problemas podem ocorrer quando são usadas várias linhas de fluxo, com diferenças de vazão muito grandes Tubos de bobinas de reação com diâmetros muito pequenos ou outros pontos de restrição podem causar a reversão da direção do fluxo Mecânicos INJEÇÃO Vazão durante aspiração da pressão aspiração diminui pressão e bolhas de ar podem aparecer diminuir a vazão de aspiração da amostra Alça de amostragem suja ou engordurada formação de bolhas e entupimento trocar ou limpar Ativação do injetor após a injeção, retorna adequada e rapidamente à posição de amostragem? Vazão do carregador Existe variação de vazão quando a válvula é incorporada no sistema ou quando é comutada da posição de amostragem para a posição de injeção? Mecânicos/Físicos SISTEMA (MANIFOLD) Checar entupimentos dos tubos e nas conexões. Limpar com detergentes, ácidos ou base. Limpeza mecânica deve ser feita com fios de nylon para evitar ranhuras causadas por metais na superfície interna DETECTOR (Espectrofotométrico) Variação da linha de base -Esperar o aquecimento apropriado -Verificar se bolhas de ar estão se acumulando na cela de fluxo -Purgar a solução transportadora, amostra (se possível) e reagentes -Verificar se há degradação de reagente ou acúmulo de produtos da reação Absorbância de fundo muito alta Cela contaminada limpeza interna (NaOH 5M e muita água) e externa Comprimento de onda está correto? 4
QUÍMICOS DETECTOR (Espectrofotométrico) Formação de precipitado na cela de fluxo Diminuir a concentração dos reagentes Adicionar intermitentemente uma solução de limpeza (ácido, base, EDTA, etc) Não é observado Sinal Após a Injeção Se o detector está funcionando corretamente e a cela de fluxo está alinhada com o feixe óptico, as três causas mais comuns são: ph incorreto Comprimento de onda incorreto Soluções preparadas erroneamente B. Karlberg, G. E. Pacey, FlowInjectionAnalysis. A PracticalGuide. Elsevier, Amsterdam, 1989 5