ponto de vista clínico, a introdução de imunoquimioterapia

Identificação de Produto N.º Cat. Descrição 44602 FOXP1 0,1 R (SP133) 44603 FOXP1 1 R (SP133) 44290 FOXP1 RTU R (SP133) Definições Dos Símbolos P C A E S DIL DOC# DIS pronto a usar concentrado ascite soro sobrenadante intervalo de diluição do concentrado número do documento distribuído pela Utilização Pretendida Este anticorpo destina-se a ser utilizado no diagnóstico in vitro (IVD). Anticorpo FoxP1 é destina-se a ser utilizado em laboratórios qualificados para a identificação qualitativa, através de microscopia óptica, da presença de antigénios associados em secções de tecido impregnado em parafina e fixado em formol, utilizando métodos de teste IHC (imuno-histoquímica). Este anticorpo é indicado para ser utilizado, na sequência de um diagnóstico diferencial clínico, como um auxiliar na identificação e sub-classificação de linfoma difuso de grandes células B dentro do contexto de um painel de anticorpos, do historial clínico do doente e de outros testes de diagnóstico avaliados por um patologista qualificado. Resumo E Explicação O linfoma difuso de grandes células B (DLBCL), embora esteja considerado numa única categoria na classificação da Organização Mundial de Saúde, representa muito provavelmente diferentes entidades clínicopatológicas que, por sua vez, são difíceis de separar utilizando uma técnica padrão. 1,2 Do ponto de vista clínico, a introdução de imunoquimioterapia no tratamento de DLBCL melhorou consideravelmente os resultados destes doentes, comparativamente à quimioterapia isoladamente. 3,4 Contudo, quase um terço destes doentes tornaram-se refractários ou entraram, eventualmente, em recaída. 5 Por conseguinte, é muito importante identificar e estratificar os factores biológicos e/ou clínicos para os doentes que apresentam um risco superior de recaída. Os estudos de análise dos perfis da expressão genética (GEP) demonstraram que o linfoma difuso das grandes células B (DLBCL) pode ser dividido, de forma reproduzível, nos subtipos importantes a nível do prognóstico do tipo células B do centro germinativo (GCB), tipo células B activadas (ABC) e DLBCL não classificado. 2,6,7 Quando tratados com um regime contendo ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina e prednisona (CHOP) ou outros regimes tipo CHOP (tratamento com CHOP), os doentes com GCB-DLBCL apresentam uma melhor sobrevivência independente do Índice Prognóstico Internacional. 3-5,8 O valor prognóstico da classificação GEP continua a ser significativo para os doentes com DLBCL tratados com rituximab e CHOP ou uma terapêutica semelhante a CHOP (tratamento com R-CHOP). 8 Os subtipos GCB e ABC possuem mecanismos patogenéticos diferentes que irão afectar o desenvolvimento das terapêuticas alvo. 6 Outros estudos GEP caracterizaram, igualmente, o linfoma mediastinal primário de grandes células B (PMBL) como sendo distinto dos restantes subtipos de DLBCL e com um bom prognóstico semelhante a GCB-DLBCL. 9 Apesar da robustez de GEP na sub-classificação de DLBCL, as técnicas GEP não são aplicáveis à prática clínica de rotina devido ao tempo substancial, conhecimentos tecnológicos e escassos recursos necessários. Assim, é benéfico para a aplicação translacional da classificação GEP na expressão de proteínas através de células tumorais ser desenvolvida através da coloração imuno-histoquímica (IHC) de tecidos fixados em formol e impregnados em parafina. Recentemente, foram desenvolvidas diferentes abordagens utilizando algoritmos imunofenotípicos com pequenos painéis de marcadores de anticorpos para proceder à translação das informações robustas dos DIS A.Menarini Diagnostics S.r.l. Via Sette Santi, 3 50131 Firenze Italy DOC# MEN35031000 PT Rev. 0,0 Cell Marque Corporation 6600 Sierra College Blvd Rocklin California 95677 USA EMERGO EUROPE Molenstraat 15, 2513 BH The Hague NL

estudos moleculares numa plataforma clínica de rotina. 10-14 Foi o utilizado um painel de anticorpos: CD10, BCL6, MUM1/IRF4, GCET1, FoxP1, LMO2 e BCL2 para determinar a origem de GCB ou não GCB e cada algoritmo possui diferentes limiares de percentagem para a coloração positiva. 10-14 No algoritmo de Colomo 10, o fenótipo não GCB foi estabelecido se MUM1/ IRF4 tiver sido positivo ( 25% de células tumorais). Os casos que foram negativos para MUM1/IRF4 e positivos ( 25% de células tumorais) para CD10 foram considerados como sendo o fenótipo GCB. Os casos negativos para MUM1/IRF4 e CD10 e positivos para BCL6 ( 25% de células tumorais) foram, igualmente, atribuídos ao grupo GCB. Por último, os casos negativos para os 3 marcadores foram considerados como não classificados. 10 No algoritmo de Hans 11, os tumores foram atribuídos ao fenótipo GCB se CD10 ( 30% das células tumorais) isoladamente ou tanto CD10 como BCL6 ( 30% das células tumorais) tiverem sido positivos. Se tanto CD10 e BCL6 forem negativos, o caso foi considerado como não tendo origem GCB. Se tanto o BCL6 como o MUM1/IRF4 ( 30% de células tumorais) tiverem sido positivos, o caso é atribuído a uma origem não GCB, ao passo que se MUM1/IRF4 tiver sido negativo (< 30% de células tumorais), o caso é atribuído ao fenótipo GCB. 11 O algoritmo Hans apresentou uma elevada concordância com os resultados de GEP (86%). 11 De acordo com o algoritmo de Muris 12, os casos positivos ( 30% de células tumorais) para CD10 foram atribuídos ao fenótipo GCB. Os casos que foram negativos para CD10 foram diferenciados em termos de fenótipo ABC ou GCB, de acordo com a expressão de MUM1/IRF4 ( 30% de células tumorais). A partir dai, a imunocoloração com BCL2 foi utilizada para separar 2 grupos prognósticos diferentes (1 e 2). 12 Os 2 passos do algoritmo de Muris foram utilizados para avaliar o estado de GCB versus ABC, tendo sido aplicado o impacto prognóstico dos algoritmos. 12 Embora o algoritmo de Muris tivesse uma concordância relativamente elevada com os resultados de GEP, apresentava uma baixa sensibilidade e especificidade. O algoritmo de Choi 13 demonstrou que os casos positivos para GCET1 ( 80% de células tumorais) e MUM1/IRF4 ( 80% de células tumorais) e/ ou FoxP1 ( 80% de células tumorais) ou negativos para CD10 e BCL6 ( 30% de células tumorais) foram atribuídos ao grupo não GCB. Os casos positivos para CD10 ( 30% de células tumorais), GCET1 ( 80% de células tumorais) sem expressão de MUM1 ou positivos para BCL6 sem expressão de FoxP1 foram classificados como GCB. 13 Este estudo indicou a importância do FoxP1 na sub-classificação de DLBCL. Choi et al modificaram, depois, a sua abordagem à sub-classificação de DLBCL, concentrando-se no FoxP1. Os tumores que foram positivos para FoxP1 e GCET1 são atribuídos ao subgrupo GCB, mas, se forem positivos para FoxP1 e negativos para GCET1, os tumores pertencem ao fenótipo ABC. Se um caso for negativo para FoxP1 mas positivo para MUM-1/IRF4, continua a pertencer ao fenótipo ABC, desde que não se verifique uma expressão de CD10. Este método modificado destacou o papel do FoxP1, MUM1/IRF4 e GCET1 na sub-classificação de DLBCL. 15 O algoritmo de Choi apresentou uma concordância muito elevada com os resultados de GEP (87%). 13, 15 Na classificação do tipo de células B activadas modificada por Nyman 14, os casos que expressaram MUM1/IRF4 ou FoxP1 foram considerados como pertencendo ao subgrupo ABC, tendo os restantes casos sido atribuídos como subtipo GCB. No algoritmo Tally descrito recentemente 15, o método incluía um número igual de marcadores GCB (GCET1 e CD10) e marcadores não GCB (FoxP1 e MUM1/IRF4). Este algoritmo foi construído a partir do par de imuno-fenótipos com mais antigénios positivos. Uma vez que são utilizados dois anticorpos para cada tipo, o antigénio LMO2 determina o fenótipo (GCB ou não GCB) quando a classificação é igual nas duas categorias. 15 Destes algoritmos publicados, o algoritmo Choi é o mais preditivo dos resultados de GEP e sobrevivência mas é o menos fácil de utilizar. Este algoritmo implica a utilização de cinco anticorpos, sendo que dois dos quais não habitualmente utilizados pela maioria dos laboratórios de imuno-histoquímica (GCET1 e FoxP1). Os imuno-corantes para BLC6 são tecnicamente difíceis de aplicar e interpretar. 11 Para além destes problemas, o algoritmo Choi utiliza vários cutoffs para determinar a positividade dos anticorpos e requer uma interpretação sequencial dos resultados. Uma tentativa para abordar algumas destas questões resultou no exame de dois algoritmos adicionais. Devido aos problemas com BCL6, este foi removido do algoritmo Hans, resultando num novo algoritmo (Hans*). A capacidade global do algoritmo Hans* de prever a célula de origem e sobrevivência foi semelhante à do algoritmo Hans original. Esta pequena diferença na capacidade prognóstica é compensada pela facilidade de utilização do algoritmo Hans modificado. A remoção de BCL6 do algoritmo Choi, redisposição da ordem de exame dos anticorpos e padronização da positividade (30% de células tumorais) resultaram num novo algoritmo (Choi*) que era mais fácil de utilizar do que o original e possuía uma capacidade semelhante de prever a célula de origem e EFS. A predição de OS, embora estatisticamente significativa, foi ligeiramente reduzida comparativamente ao algoritmo original; contudo, esta redução foi compensada pela facilidade de utilização. Todos os algoritmos possuem uma característica semelhante: determinados anticorpos têm precedência em relação a outros devido à ordem de exame. Ao eliminar a ordem de exame e classificando os resultados de quatro anticorpos seleccionados, foi criado um algoritmo Tally. Este algoritmo Tally inclui os antigénios específicos de GCB, CD10 e GCET1, e os antigénios específicos de ABC, MUM1 e FoxP1. O antigénio específico de GCB, o LMO2, só é utilizado como um elemento de desempate para classificar o tumor. O algoritmo Tally mostra uma melhor capacidade de prever a célula de origem do que qualquer algoritmo examinado neste estudo. O algoritmo Tally também divide os doentes com DLBCL em dois grupos com níveis significativamente diferentes de OS e EFS. Embora o algoritmo Tally seja o melhor para prever a célula de origem, também tem desvantagens. Primeiro, utiliza três anticorpos que estão comercialmente disponíveis mas não são habitualmente utilizados por muitos laboratórios de imuno-histoquímica: GCET1, FoxP1 e LMO2. Segundo, a interpretação de GCET1, FoxP1 e LMO2 pode ser problemática, uma vez que alguns tumores revelam uma elevada coloração de fundo ou não específica. Por conseguinte, o FoxP1 é útil na sub-classificação de DLBCL e é necessário um elevado cutoff ( 80%) para FoxP1 para obter uma elevada especificidade para o subtipo ABC. Princípios E Procedimentos O anticorpo primário indicado pode ser utilizado como o anticorpo primário para a coloração imuno-histoquímica de secções de tecido impregnado em parafina e fixado em formol. Regra geral, a coloração imuno-histoquímica em conjunto com um sistema de detecção de estreptavidina-biotina permite a visualização de antigénios através da aplicação sequencial de um anticorpo específico (anticorpo primário) ao antigénio, um anticorpo secundário (anticorpo de ligação) ao anticorpo primário, um complexo enzimático e um substrato cromogénico com etapas de lavagem intercaladas. Em alternativa, pode ser utilizado um sistema de detecção de polímero sem biotina. A activação enzimática do 2

cromogéneo resulta num produto de reacção visível no local do antigénio. A amostra pode depois ser sujeita a um contrastante e coberta por uma lamela. Os resultados são interpretados utilizando um microscópio óptico e auxiliam no diagnóstico diferencial de processos fisiopatológicos, que podem ou não estar associados a um determinado antigénio. Os produtos pré-diluídos são diluídos de forma ideal para utilizar com uma série de kits de detecção disponibilizados por outros fabricantes. Materiais E Métodos Consultar o rótulo do produto para obter informações específicas do lote relativamente ao seguinte: 1. Concentração de imunoglobulina do anticorpo 2. Pormenores sobre a origem Reagentes Fornecidos Pré-diluído O produto de anticorpo primário indicado contém reagente pronto a utilizar. O intervalo de concentração da imunoglobulina pré-diluída para este produto é 2,5-10 µg/ml. Concentrado O produto de anticorpo primário indicado contém reagente concentrado. Tanto o formato pré-diluído como o concentrado deste anticorpo são diluídos em Tampão Tris, ph 7,3-7,7, com 1% de BSA e <0,1% de azida de sódio. O intervalo de concentração da imunoglobulina concentrada para este produto é 125-375 µg/ml. O intervalo de diluição de trabalho recomendado para o produto concentrado é 1:100-1:500 e está indicado no rótulo do produto. Isótipo: IgG Reconstituição, Homogeneização, Diluição E Titulação O anticorpo pré-diluído está pronto a utilizar e é optimizado para coloração. Não é necessária qualquer reconstituição, homogeneização, diluição ou titulação. O anticorpo concentrado é optimizado para ser diluído dentro do intervalo de diluição. O utilizador tem de validar a diluição de trabalho do produto concentrado. As diferenças ao nível do processamento de tecidos e dos procedimentos técnicos no laboratório podem dar origem a uma variabilidade significativa nos resultados e exigem, por consequência, a utilização regular de controlos. (Consultar a secção Procedimentos de controlo de qualidade) Materiais E Reagentes Necessários Mas Não Fornecidos Poderão ser necessários os seguintes reagentes e materiais para a coloração, mas não são fornecidos com o anticorpo primário: 1. de controlo positivo e negativo 2. Lâminas de microscópio, com carga positiva 3. Estufa de secagem com capacidade para manter uma temperatura de 58 60 C ± 5 C 4. Tinas ou banhos de coloração 5. Cronómetro 6. Xilol ou substituto de xilol 7. Etanol ou álcool de grau reagente 8. Água desionizada ou destilada 9. Panela de pressão eléctrica para a etapa de pré-tratamento do tecido 10. Sistema de detecção e cromogénio 11. Soluções de lavagem 12. Hematoxilina ou outro contrastante 13. Diluentes de anticorpo 14. Bloco de peróxido para utilização com HRP 15. Bloco de avidina-biotina 16. Reagente de controlo negativo 17. Meio de montagem 18. Lamelas de cobertura 19. Microscópio óptico (40 400x) Conservação E Manuseamento Conservar a 2 8 C. Não congelar. Para garantir uma correcta distribuição do reagente e a estabilidade do anticorpo após cada execução, deve-se voltar a colocar a tampa e o frasco deve ser imediatamente colocado no frigorífico em posição vertical. Cada reagente de anticorpo tem indicada a respectiva data de validade. Quando correctamente conservado, o reagente permanece estável até à data indicada no rótulo. Não utilizar o reagente depois de ultrapassada a data de validade para o método de conservação indicado. Não existem quaisquer sinais definitivos que indiquem a instabilidade deste produto, como tal, deverão ser processados simultaneamente controlos positivos e negativos com as amostras desconhecidas. Contactar o serviço de apoio ao cliente da A.Menarini Diagnostics caso haja suspeita de instabilidade do reagente. Colheita Das Amostras E Preparação Para Análise Os tecidos processados regularmente, fixados em formol neutro tamponado e impregnados em parafina, são adequados para utilização com este anticorpo primário. O fixador de tecido recomendado é o formol neutro tamponado a 10%. Poderão ocorrer resultados variáveis em consequência de fixação prolongada ou processos especiais, tais como a descalcificação de preparações de medula óssea. Cada secção deve ser cortada com a espessura apropriada (aproximadamente 3 µm) e colocada numa lâmina de vidro com carga positiva. As lâminas que contêm a secção de tecido podem ser aquecidas durante pelo menos 2 horas (mas não mais de 24 horas) numa estufa a 58 60 C ± 5 C. Advertências E Precauções 3

1. Tomar as precauções razoáveis ao manusear os reagentes. Usar luvas descartáveis e batas laboratoriais ao manusear substâncias que se suspeite serem cancerígenas ou materiais tóxicos (por exemplo: xilol). 2. Evitar o contacto dos reagentes com os olhos e as membranas mucosas. Se os reagentes entrarem em contacto com áreas sensíveis, lavar com água abundante. 3. As amostras de doentes e todos os materiais que entrem em contacto com as mesmas deverão ser manuseados como materiais que constituem perigo biológico e devem ser eliminados com as devidas precauções. Nunca pipetar com a boca. 4. Evitar a contaminação microbiana dos reagentes, pois tal poderia produzir resultados incorrectos. 5. O utilizador tem de validar os tempos e temperaturas de incubação. 6. Os reagentes pré-diluídos, prontos a utilizar têm uma diluição ideal e uma nova diluição pode originar a perda de coloração do antigénio. 7. Os reagentes concentrados podem ser diluídos numa diluição ideal com base na validação por parte do utilizador. Qualquer diluente utilizado que não seja especificamente recomendado neste documento tem de ser também validado pelo utilizador, em relação à sua compatibilidade e ao efeito na estabilidade. 8. Quando utilizado de acordo com as instruções, este produto não é classificado como substância perigosa. O conservante presente no reagente é a azida de sódio numa quantidade inferior a 0,1% e não cumpre os critérios da UE em matéria de registo, avaliação, autorização e restrição dos produtos químicos (REACH) relativamente a substâncias perigosas na concentração indicada. 9. O utilizador deverá validar quaisquer outras condições de conservação que não as especificadas no folheto informativo incluído na embalagem. 10. O diluente pode conter albumina sérica bovina e o sobrenadante pode conter soro bovino. Os produtos que contêm soro bovino fetal e os produtos que contêm albumina sérica bovina foram comprados em fornecedores comerciais. Os Certificados de Origem relativos à origem animal utilizada nestes produtos encontram-se nos arquivos da Cell Marque. Os certificados confirmam que os materiais de origem bovina são provenientes de países com risco negligenciável de BSE e indicam que são originários dos EUA e Canadá. 11. Tal como com qualquer produto derivado de origem biológica, devem ser utilizados procedimentos de manuseamento correctos. Instruções De Utilização Procedimento Detalhado Protocolos de coloração recomendados para o anticorpo primário indicado: Coloração Manual 1. Desparafinação, reidratação e recuperação de epítopos, o método preferido é a utilização de técnicas de recuperação do epítopo induzida por calor (HIER). O método preferido permite a desparafinação, reidratação e recuperação de epítopos simultâneas. Após a conclusão, enxagúe com 5 soluções de água destilada ou desionizada. 2. Se utilizar o sistema de detecção de HRP, coloque as lâminas num bloqueio de peróxido durante 10 minutos; lave. Se utilizar o sistema de detecção de FA, omite esta etapa. 3. Aplique o anticorpo e incube durante 10 a 30 minutos; lave. 4. Para uma detecção de polímeros de 2 passos, o sistema aplica um amplificador de acordo com as instruções do fabricante 5. Aplique o reagente de detecção durante o número de minutos recomendado pelo fabricante e enxagúe. 6. Aplique a quantidade de amostra de cromogéneo e incube durante 1 a 10 minutos; lave. 7. Desidrate e cubra. Procedimentos De Controlo De Qualidade Controlo Tecidular Positivo Com cada procedimento de coloração efectuado deverá ser processado um controlo tecidular positivo. Este tecido poderá conter componentes tecidulares ou células de coloração negativa e positiva e servir como tecido de controlo positivo e negativo. Os tecidos de controlo deverão ser amostras recém-colhidas de autópsia, biopsia ou cirurgia, preparados ou fixados o mais cedo possível de forma idêntica às secções de teste. A utilização de uma secção de tecido fixado ou processado de forma diferente da amostra de teste servirá como controlo para todos os reagentes e etapas do método, excepto para a fixação e o processamento de tecidos. Um tecido com coloração positiva fraca é o mais adequado para um controlo de qualidade ideal e para a detecção de níveis reduzidos de degradação dos reagentes. O controlo tecidular positivo para a série de anticorpo primário indicado pode incluir o seguinte: Controlo Tecidular Positivo Amígdala Nódulo linfático Visualização Nuclear Nuclear Os controlos tecidulares positivos conhecidos deverão ser utilizados apenas para monitorizar o correcto desempenho dos tecidos processados e dos reagentes de teste, e não para auxiliar na determinação de um diagnóstico específico de amostras de doentes. Se os controlos tecidulares positivos não demonstrarem uma coloração positiva adequada, os resultados das amostras de teste têm de ser considerados inválidos. Controlo Tecidular Negativo Poderá ser utilizado como controlo tecidular negativo o mesmo tecido utilizado para o controlo tecidular positivo. Os vários tipos de células presentes na maioria das secções de tecidos apresentam locais de controlo negativo interno, mas tal deverá ser confirmado pelo utilizador. Os componentes que não coram deverão demonstrar a ausência de coloração específica e fornecer uma indicação de coloração de fundo não específica. Se ocorrer uma coloração específica nos locais de controlo tecidular negativo, os resultados das amostras dos doentes têm de ser considerados inválidos. Discrepâncias Inexplicáveis Quaisquer discrepâncias inexplicáveis nos controlos deverão ser imediatamente comunicadas ao Serviço de apoio ao cliente da A.Menarini 4

Diagnostics. Se os resultados do controlo de qualidade não estiverem em conformidade com as especificações, os resultados dos doentes são inválidos. Consultar a secção Resolução de problemas deste folheto. Identificar e corrigir o problema e, em seguida, repetir todo o procedimento com as amostras dos doentes. Reagente De Controlo Negativo Deverá ser processado um reagente de controlo negativo para cada amostra, para auxiliar na interpretação dos resultados. É utilizado um reagente de controlo negativo em vez do anticorpo primário para avaliar a coloração não específica. A lâmina deve ser tratada com reagente de controlo negativo, que corresponda à espécie hospedeira do anticorpo primário e que tenha, idealmente, a mesma concentração de IgG. O período de incubação do reagente de controlo negativo deverá ser igual ao período de incubação do anticorpo primário. Interpretação Dos Resultados O procedimento de imunocoloração provoca a precipitação de um produto de reacção com coloração nos locais do antigénio identificados pelo anticorpo primário. Consultar no folheto informativo do sistema de detecção adequado as reacções de cor esperadas. Um patologista qualificado com experiência em procedimentos imuno-histoquímicos tem de avaliar os controlos tecidulares positivos e negativos antes de interpretar os resultados. Controlo Tecidular Positivo O controlo tecidular positivo corado deverá ser examinado primeiro para conferir que todos os reagentes estão a funcionar correctamente. A presença de um produto de reacção com coloração correcta dentro das células alvo indica uma reactividade positiva. Consultar no folheto informativo do sistema de detecção utilizado as reacções de cor esperadas. Dependendo da duração da incubação e da potência da hematoxilina utilizada, a contrastação resultará numa coloração azul clara a escura dos núcleos das células. A utilização excessiva ou insuficiente de contrastante pode comprometer a interpretação correcta dos resultados. Se o controlo tecidular positivo não demonstrar uma coloração positiva adequada, quaisquer resultados das amostras de teste são considerados inválidos. Controlo Tecidular Negativo O controlo tecidular negativo deverá ser examinado depois do controlo tecidular positivo para verificar a marcação específica do antigénio alvo pelo anticorpo primário. A ausência de coloração específica no controlo tecidular negativo confirma a inexistência de reactividade cruzada do anticorpo relativamente às células ou componentes celulares. Se ocorrer uma coloração específica no controlo tecidular negativo, os resultados da amostra do doente são considerados inválidos. A coloração não específica, se existente, terá um aspecto difuso. Poderá ser igualmente observada uma ligeira coloração esporádica do tecido conjuntivo, nas secções de tecidos que não tenham sido devidamente fixados. Deverão ser utilizadas células intactas para a interpretação dos resultados da coloração. As células necróticas ou degeneradas apresentam uma coloração não específica. Do Doente As amostras do doente deverão ser examinadas em último lugar. A intensidade da coloração positiva deverá ser avaliada dentro do contexto de qualquer coloração de fundo do controlo de reagente negativo. Tal como acontece com qualquer teste de imuno-histoquímica, um resultado negativo significa que o antigénio em questão não foi detectado, e não que o antigénio não existe nas células ou nos tecidos analisados. Um painel de anticorpos pode ajudar na identificação de reacções falsamente negativas (consultar a secção Resumo dos resultados esperados). Ao interpretar qualquer resultado de imuno-histoquímica, a morfologia de cada amostra de tecido deverá ser igualmente examinada utilizando uma secção corada com hematoxilina e eosina. Os resultados morfológicos e os dados clínicos pertinentes do doente devem ser interpretados por um patologista qualificado. Limitações 1. Este reagente destina-se a utilização exclusiva por profissionais uma vez que a imuno-histoquímica é um processo de várias etapas que exige uma formação especializada na selecção dos reagentes apropriados, tecidos, fixação, processamento, preparação da lâmina de imuno-histoquímica e interpretação dos resultados da coloração. 2. Exclusivamente para utilização em laboratórios. 3. Para utilização em diagnóstico in vitro. 4. A coloração do tecido depende do manuseamento e do processamento do tecido antes da coloração. Uma incorrecta fixação, congelação, descongelação, lavagem, secagem, aquecimento, seccionamento ou contaminação com outros tecidos ou fluidos pode produzir artefactos, aprisionamento de anticorpos ou resultados falsos negativos. Os resultados inconsistentes podem ser resultantes de variações nos métodos de fixação e impregnação, bem como de irregularidades inerentes ao tecido. 5. A utilização excessiva ou insuficiente de contrastante pode comprometer a interpretação correcta dos resultados. 6. A interpretação clínica de qualquer coloração positiva, ou da sua ausência, tem de ser avaliada dentro do contexto do historial clínico, morfologia, outros critérios histopatológicos e ainda outros testes de diagnóstico. Este anticorpo destina-se a ser utilizado num painel de anticorpos, se aplicável. É da responsabilidade de um patologista qualificado estar familiarizado com os anticorpos, os reagentes, os painéis de diagnóstico e os métodos utilizados na produção da preparação corada. A coloração deve ser efectuada por um laboratório licenciado certificado sob a supervisão de um patologista responsável pelo exame das lâminas coradas e garantia da adequação dos controlos positivos e negativos. 7. Os anticorpos e reagentes prontos a utilizar são fornecidos na diluição ideal para utilização de acordo com as instruções. Qualquer desvio dos procedimentos de teste recomendados pode invalidar os resultados previstos. Têm de ser utilizados e documentados os controlos apropriados. Os utilizadores terão, em qualquer circunstância, de aceitar a responsabilidade da interpretação dos resultados dos doentes. 8. Os produtos são fornecidos no formato concentrado de modo a que o utilizador possa subsequentemente proceder a uma diluição ideal para utilização, sujeita à determinação do utilizador e ao cumprimento de técnicas de validação adequadas. Os utilizadores 5

têm de validar a utilização de outros diluentes não recomendados neste documento. Depois de o componente primário ser validado como sendo adequado para utilização, qualquer desvio dos procedimentos de teste recomendados pode invalidar resultados esperados. Têm de ser utilizados e documentados os controlos apropriados. Os utilizadores terão, em qualquer circunstância, de aceitar a responsabilidade da interpretação dos resultados dos doentes. 9. Este produto não se destina a ser utilizado em citometria de fluxo. 10. Os reagentes podem demonstrar reacções inesperadas em tecidos não testados anteriormente. A possibilidade de surgirem reacções inesperadas, mesmo nos grupos de tecidos testados, não pode ser totalmente eliminada devido à variabilidade biológica da expressão do antigénio em neoplasias ou outros tecidos patológicos. Contactar o serviço de apoio ao cliente da A.Menarini Diagnostics para comunicar quaisquer reacções suspeitas inesperadas documentadas. 11. Os tecidos de indivíduos infectados com o vírus da hepatite B e contendo o antigénio de superfície da hepatite B (HBsAg) podem apresentar coloração não específica com peroxidase de rábano. 12. Quando utilizado em etapas de bloqueio, o soro normal da mesma origem animal que o anti-soro secundário poderá provocar resultados falsos negativos ou falsos positivos devido ao efeito de auto-anticorpos ou anticorpos naturais. 13. Poderão observar-se resultados falsos positivos devido a ligação não imunológica de proteínas ou produtos de reacção dos substratos. Tais resultados poderão ser igualmente provocados por actividade de pseudo-peroxidase (eritrócitos), actividade de peroxidase endógena (citocromo C) ou biotina endógena (exemplo: fígado, cérebro, mama, rins) dependendo do tipo de técnica de imunocoloração utilizada. 14. Tal como acontece com qualquer teste de imuno-histoquímica, um resultado negativo significa que o antigénio não foi detectado, e não que o antigénio não existia nas células ou tecidos analisados. Limitações Específicas 1. Os produtos de anticorpo pré-diluído são optimizados como um produto pronto a utilizar. Devido à possibilidade de variação na fixação e processamento dos tecidos, poderá ser necessário aumentar ou diminuir o tempo de incubação do anticorpo primário em amostras individuais. 2. O anticorpo, quando utilizado em conjunto com os sistemas de detecção e acessórios, detecta antigénio(s) que resiste(m) à fixação com formol e ao processamento e seccionamento de tecidos de rotina. Os utilizadores que se desviem dos procedimentos de teste recomendados continuam a ser, como seriam em qualquer circunstância, os responsáveis pela interpretação e validação dos resultados dos doentes. Estudo Normal Positivos Total de Testados Cérebro 0 1 Córtex da supra-renal 0 1 Observações Ovário 1 1 Células estromais +, epitélio - Pâncreas 1 1 Ductos +, Células dos Paratiróide 1 1 Hipófise 0 1 Testículos 0 1 Tiróide 1 1 Mama 0 1 ilhéus - Baço 1 1 Linfócitos + Amígdala 1 1 Células basais +, Linfócitos Timo 1 1 Medula óssea 1 1 Linfócitos + Pulmão 1 1 Coração 0 1 Esófago 1 1 Células basais + Estômago 1 1 Intestino delgado 1 1 Cólon 1 1 Fígado 0 1 Glândula salivar 1 1 Vesícula biliar 1 1 Rim 1 1 glomérulos +/- Bexiga 1 1 Próstata 1 1 Útero 0 1 Trompa de Falópio 1 1 Uréter 1 1 Colo do útero 1 1 Músculo esquelético 0 1 Músculo liso 1 1 Pele 1 1 Nervo periférico 1 1 Mesotélio 0 1 Gordura 0 1 Placenta 1 1 Endotélio + Este anticorpo cora tecidos normais, conforme indicado na literatura. + Resumo Dos Resultados Esperados Consultar as seguintes tabelas de reactividade: Estudo De s Com Doença Positivos Total de Testados Carcinoma colorectal 18 21 Carcinoma ductal invasivo da mama 12 23 Observações 6

Estudo De s Com Doença (continuou) Linfoma difuso de grandes células B Positivos Total de Testados 14 16 Observações Este anticorpo cora tecidos tumorais, conforme indicado na literatura publicada. Resolução De Problemas 1. Se o controlo positivo apresentar uma coloração mais fraca que a esperada, deverão verificar-se os restantes controlos positivos processados durante o mesmo ensaio de coloração no instrumento em questão para determinar se tal situação foi causada pelo anticorpo primário ou por um dos reagentes secundários comuns. 2. Se o controlo positivo for negativo, os outros controlos positivos utilizados no mesmo ensaio devem ser verificados para determinar se tal situação foi causada pelo anticorpo primário ou por um dos reagentes secundários comuns. Os tecidos poderão ter sido colhidos, fixados ou desparafinados incorrectamente. Deverá seguir-se o procedimento correcto para a colheita, conservação e fixação. 3. Se ocorrer uma coloração de fundo excessiva, tal pode ser consequência da existência de níveis elevados de biotina endógena. Deve ser incluída uma etapa de bloqueio de biotina, excepto se estiver a ser utilizado um sistema de detecção sem biotina, caso em que qualquer biotina presente não seria um factor contribuinte para coloração de fundo. 4. Se a parafina não tiver sido retirada na totalidade, o procedimento de desparafinação deve ser repetido. 5. Se as secções de tecido desaparecerem (forem varridas ) da lâmina, as lâminas deverão ser verificadas para garantir que se encontram carregadas positivamente. Outras possibilidades que poderiam ter efeitos adversos na aderência dos tecidos incluem a secagem insuficiente da secção de tecido na lâmina antes da coloração ou fixação em formol que não tenha sido devidamente neutralizado com tampão. A espessura do tecido também pode ser um factor contribuinte. Para acções correctivas, consultar a secção Procedimento detalhado ou contactar o serviço de apoio ao cliente da A.Menarini Diagnostics. 4 Pfreundschuh, M et al. CHOP-like chemotherapy plus rituximab versus CHOP-like chemotherapy alone in young patients with good-prognosis diffuse large-b-cell lymphoma: a randomised controlled trial by the Mab-Thera International Trial (MInT) Group. Lancet Oncol 2006; 7:379-391. 5 Hagberg, H et al. Randomised phase III study of R-ICE versus R-DHAP in relapsed patients with CD20 diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) followed by high-dose therapy and a second randomisation to maintenance treatment with rituximab or not: an update of the CORAL study. Ann Oncol 2006; (17 suppl 4):iv31-32. 6 Rosenwald, A et al. The use of molecular profiling to predict survival after chemotherapy for diffuse large-b-cell lymphoma. N Engl J Med 2002; 346:1937 47. 7 Wright, G, et al. 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