ESTUDOS DOS GRUPOS MICROBIANOS NO SISTEMA DE MANEJO AGRÍCOLA EM TERRAS ALTAS POR MÉTODOS MOLECULARES Alana de Almeida Valadares 1 ; Waldesse Piragé de Oliveira Júnior 2 1 Aluna do Curso de Engenharia Ambiental; Campus de Palmas; e-mail: alanavaladares@hotmail.com - PIBIC/CNPq 2 Orientador do Curso de Engenharia Ambiental; Campus de Palmas; e-mail: waldessejunior@uft.edu.br RESUMO Os microrganismos desempenham papel essencial no funcionamento dos ecossistemas e constitui a fração viva da matéria orgânica do solo, sendo responsável por uma gama de processos biológicos e bioquímicos. A compreensão das funções exercidas por eles e o entendimento das suas interações com outros componentes da biodiversidade geram benefícios científicos. Neste trabalho objetivou-se avaliar as mudanças na estrutura da comunidade fúngica presente em solo com atividade agrícola e em solo de cerrado nativo. O DNA foi extraídos das amostras de solo com ele foram feitas análises moleculares pela técnica de PCR-ARISA com os primers 3126Tr e 2234Cf-FAM. Os atributos físico-químicos das amostras de solo também foram avaliados. Pela análise dos dados obtidos foi possível observar que a estrutura das comunidades de microfungos é diferente no solo amostrado entre os anos de 2013 e 2014 em diferentes tipos de uso da terra. Atributos como saturação de bases, ph e ferro explicam as diferenças entre os solos estudados de cerrado e solo sob plantio. Palavras-chave: agricultura; ARISA; microbiota; solo. INTRODUÇÃO Os microrganismos desempenham papel essencial no funcionamento sustentável dos ecossistemas, atuando nos processos de fragmentação e decomposição da matéria orgânica e na disponibilidade de nutrientes no solo (MOREIRA e SIQUEIRA, 2002). A biomassa microbiana constitui a fração viva da matéria orgânica do solo e é responsável por uma gama de processos biológicos e bioquímicos, apresentando relação direta com as condições as quais o solo é submetido. Esses organismos são extremamente sensíveis às condições do meio, fatores modificáveis em curto prazo, como umidade e temperatura, e outros de médios e longos prazos como disponibilidade de energia e nutrientes, além do manejo a que estes solos estão submetidos podem provocar modificações na população microbiana (ANDRADE et al., 1995; BALOTA, 1997). A compreensão das funções exercidas pelas comunidades microbianas nos ambientes e o entendimento das suas interações com outros componentes da biodiversidade, são benefícios Página 1
científicos esperados quando se tem conhecimento a respeito da diversidade microbiana (COLWELL, 1997; HUNTER, 1998). A comunidade microbiana se caracteriza como um conjunto complexo de interelações entre organismos de diferentes níveis tróficos. Duas implicações da diversidade microbiana podem ser destacadas, a primeira é que a diminuição na habilidade do sistema biológico em responder a perturbações geralmente é consequência da queda da diversidade e a segunda é que a diversidade reflete o estado e a história de influências do microambiente, indicando o nível de distúrbio ao qual o sistema tem sido submetido (JOHNSEN et al., 2001). MATERIAL E MÉTODOS A amostragem de solo foi feita na área de plantio de soja e no cerrado nativo na Fazenda Barreiro Branco, município de Paraíso do Tocantins/TO, que utiliza sistema de manejo do solo voltado para produção de soja. Para a coleta das amostras de solo utilizou-se a metodologia descrita por Fidalgo et al. (2005). Na coleta das amostras utilizaram-se tubos de PVC de 15 cm de comprimento e 5 cm de diâmetro, devidamente esterilizados. As amostras foram coletadas a uma profundidade de 10 cm, sem que fossem deformadas, ou seja, mantendo sua estrutura preservada e armazenadas em freezer a -20 C. Nas análises físico-químicas das amostras de solo foram considerados os macro e micronutrientes, Capacidade de Troca Catiônica (CTC), ph, porcentagem de matéria orgânica e textura. Para extração do DNA total do solo foi utilizado o Kit Power Soil DNA Extraction TM (Mo Bio Laboratories, Carlsbad, CA) seguindo as orientações do fabricante. A quantificação das amostras de DNA foi feita em espectrofotômetro tipo NanoDrop 2000 - Thermo Scientific. As reações de PCR-ARISA foram preparadas para o volume final de 25 µl, utilizando Tampão para PCR 10X, MgCl 2 50 mm, dntp s 10 mm, primer 2234Cf-FAM e 3126Tr cada um a 5 pmoles/µl, ambos descritos por Sequerra et al. (1997) DNA 10 ng, Platinum Taq DNA Polymerase (Invitrogen) 5 U/µL e 17,3 µl de água estéril. As reações foram realizadas em termociclador, com as seguintes condições 1 ciclo de 94 C por 3 min, 35 ciclos de 94 C por 30 seg, 59 C por 45 seg, 72 C por 1 min e 1 ciclo de 72 C por 15 min. Os produtos da PCR-ARISA foram purificados utilizando o kit comercial GFX PCR DNA and Gel Band Purification (GE Healthcare), de acordo com as instruções do fabricante. Página 2
A discriminação por eletroforese capilar automatizada requerida pela técnica de ARISA foi feita em um sequenciador automático ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Para o carregamento das amostras no sequenciador foi utilizado 1 µl do produto de PCR purificado, 8,8 µl de formamida HiDi e 0,2 µl de um padrão de comprimento GeneScan TM 500 ROX (Applied Biosystems). Em seguida, as amostras foram denaturadas com o aquecimento a 94 C por 5 minutos e resfriamento a 0 C por 3 minutos e carregadas no sequenciador. Os dados obtidos no sequenciador foram inspecionados visualmente quanto a qualidade das corridas no programa PeakScanner versão 1.0 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Após a confirmação da qualidade das corridas, os dados foram exportados em uma matriz para o programa Excel (Microsoft), onde os dados foram organizados, consideradas os tamanhos do espaço intergênico de 50 a 800 pares de base. As análises estatísticas foram realizadas no programa Canoco for Windows 4.5 (Biometris, Wageningen, Holanda). Com os resultados das análises físico-químicas realizou-se o teste de média, através do Teste de Tukey. RESULTADOS E DISCUSSÃO Realizaram-se duas coletas de solo, sendo a primeira em dezembro de 2013, período de pósplantio da soja. Já a segunda coleta foi realizada em fevereiro de 2014, período que corresponde ao meio do cultivo da soja, totalizando 20 amostras nas duas coletas. As análises físico-químicas avaliou Na, Zn, B, Cu, Fe, Mn, relação entre cálcio e magnésio, Ca, Mg, Al, K, P, S, capacidade de troca catiônica (CTC), saturação de bases, saturação de alumínio, acidez potencial, ph e porcentagem de matéria orgânica. Os dados desta análise foram submetidos ao Teste de Tukey onde se observou que os atributos físico-químicos do solo que apresentaram diferenças significativas foram ferro, saturação de bases, relação cálcio e magnésio e ph. Os resultados das extrações foram verificados pela técnica de eletroforese em gel de agarose para avaliar a qualidade do DNA total extraído das amostras (Figura 1). Figura 1 - Perfil eletroforético de 20 DNAs extraídos. Na quantificação algumas amostras tiveram baixa concentração de DNA, como foi o caso da amostra 22 que apresentou 0,4 ηg.µl -1 e as amostras 24 e 30, ambas com 0,9 ηg.µl -1. Apesar desse resultado inesperado, testes de PCR foram realizados e comprovaram que mesmo as amostras com essa baixa concentração de DNA obtiveram padrões de amplificação de boa qualidade. Os produtos Página 3
obtidos a partir da técnica de PCR-ARISA foram analisados, quanto a sua qualidade, em eletroforese em gel de agarose, apresentando-se de boa qualidade, conforme o perfil dos amplicons da Figura 2. Figura 2 - Perfil de amplicons do produto da PCR-ARISA. Os eletroferogramas gerados com base nos dados obtidos pela técnica de ARISA estão representados na Figura 3. Em prévia análise visual dos eletroferogramas pôde ser percebida diferença na estrutura das comunidades fúngicas estudadas tanto entre o solo com manejo agrícola e o cerrado nativo. Nota-se que alguns picos que estão presentes em um eletroferograma não aparecem em outros, evidenciando fragmentos exclusivos em cada ambiente. Figura 3 - Eletroferogramas gerados pelo ARISA. Os dados percentuais de unidade de fluorescência foram ordenados com os atributos físicoquímico dos solos usando a análise Canonical Correspondence Analysis CCA (Figura 4),que indica que as amostras foram agrupadas sofrendo maior influência da saturação de bases (V), do ph e do ferro, concordando com o Teste de Tukey. Página 4
Figura 4 - CCA baseadas na estrutura de comunidades de microfungos do solo. CONCLUSÃO A técnica de ARISA se mostrou eficiente na análise da estrutura das comunidades de fungo presentes em solo de cerrado e em solo sob plantio de soja. A estrutura das comunidades de microfungos é diferente no solo amostrado entre os anos de 2013 e 2014 em diferentes tipos de uso da terra. A saturação de bases (V), ph e ferro explicam as diferenças entre os solos estudados de cerrado e solo sob plantio. Ressalta-se ainda a importância das propriedades físico-químicas do solo para a estrutura das comunidades microbianas. LITERATURA CITADA ANDRADE, D.S.; COLOZZI-FILHO, A.; PAVAN, M.A.; BALOTA, E.L. & CHAVES, J.C.D. Atividade microbiana em função da calagem em um solo cultivado com cafeeiro. R. Bras. Ci. Solo, 19: 191-196, 1995. BALOTA, E.L. Alterações microbiológicas em solo cultivado sob o plantio direto. In: Peixoto, R.T.G.; Ahrens, D.C. & Samaha, M.J., eds. Plantio direto: caminho para uma agricultura sustentável. Ponta Grossa, IAPAR,PRP/PG, p.222-233, 1997. COLWELL, R. Microbial diversity: the importance of exploration and conservation. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 18:5, 302-307. 1997. FIDALGO, E.C.C.; COELHO, M.R.; ARAUJO, F.O.; MOREIRA, F.M.S.; SANTOS, H.G.; BREFIN, M.L.M.S.; HUISING, J. Levantamento do uso de cobertura da terra de seis áreas amostrais relacionadas ao projeto BiosBrasil (Conservation and Sustainable Management of Below-Groud Biodiversity: Phase I), Município de Benjamin Constant (AM). Rio de Janeiro: Embrapa Solos (Boletim de pesquisa e desenvolvimento/embrapa Solos, ISSN 1678-0892; 71). 2005. HUNTER, C. The value of microbial diversity. Current Opinion in Microbiology, 1: 278-285. 1998. JOHNSEN, K.; JACOBEN, C.S.; TORSVIK, V.; SORENSEN, J. Perticide effects on bacterial diversity in agricultural soils a review. Biology and Fertility of Soils. 33, p. 433-453, 2001. MOREIRA, F. M. S.; SIQUEIRA, J. O. Microbiologia e Bioquímica do Solo. Universidade Federal de Lavras, Lavras. 625 p, 2002. SEQUERRA, J.; MARMEISSE, R.; VALLA, G.; NORMAND, P.; CAPELLANO, A.; MOIROUD, A. Toxonomic position and intraspecific variability of the nodule forming Penicillium nodositatum inferred from RFLP analysis of the ribosomal intergenic spacer and random amplified polymorphic DNA. Mycologinal Resarch, New York, v. 101, p. 465-472, 1997. AGRADECIMENTOS "O presente trabalho foi realizado com o apoio do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico CNPq Brasil" Página 5