FITOPATOLOGIA MORTE SÚBITA DOS CITROS MARCOS ANTONIO MACHADO 1, MARIA LUÍSA PENTEADO NATIVIDADE TARGON 1, HELVÉCIO DELLA COLETTA-FILHO 1 e GERD WALTER MÜLLER 2 RESUMO A morte súbita dos citros (MSC) surgiu como um grande desafio à citricultura por afetar combinações enxertadas sobre limão Cravo, principal porta-enxerto no Estado de São Paulo, e apresentar provável etiologia viral com vetores eficientes. Embora inicialmente restrita à região norte paulista e ao Triângulo Mineiro, ela tem sido detectada em outros municípios do Estado. Uma vez que está associada ao porta-enxerto, todas as variedades-copa apresentam-se igualmente suscetíveis. Como controle, tem sido recomendada a subenxertia com porta- -enxertos tolerantes. O Centro APTA Citros Sylvio Moreira tem desenvolvido trabalhos objetivando a identificação do agente causal e a disponibilização de novos porta-enxertos para avaliação. Termos de indexação: Citrus spp, doença, tristeza, MSC, etiologia, controle. SUMMARY CITRUS SUDDEN DEATH Citrus sudden death (CSD) became a great challenge to the citrus industry because affects all varieties grafted on Rangpur lime, the main rootstock used in the State of São Paulo, Brazil, and because it seems to have a viral ethiology with 1 Centro APTA Citros Sylvio Moreira IAC, Rod. Anhangüera, km 158, Caixa Postal 04,13490-970 Cordeirópolis (SP). 2 Professor Visitante, bolsista do CNPq - Núcleo de Pesquisa em Biotecnologia Aplicada - Universidade Estadual de Maringá. ARTIGO TÉCNICO
70 MARCOS ANTONIO MACHADO et al. efficient vectors. Althought initially limited to north area of São Paulo and Triângulo Mineiro, it has been detected in others counties. Since the disease is associated to the rootstock species, all scions varieties seems to be equally susceptible. Innarching with tolerant rootstocks has been recommend as control. The Centro APTA Citros Sylvio Moreira has developed activities on ethiology e control with new rootstocks. Index terms: CSD, ethiology, citrus tristeza, control. 1. INTRODUÇÃO A morte súbita dos citros (MSC), assim denominada em vista da rapidez com que as plantas morrem na fase final da doença (INFORMATIVO CENTRO DE CITRICULTURA, 2001) pode ser considerada uma das mais importantes doenças a desafiar a citricultura brasileira nesse começo do século. Descrita pela primeira vez no início de 2001 (GIMENES FERNANDES & BASSANEZI, 2001; MÜLLER et al., 2002a,b), e inicialmente restrita à região norte paulista e ao Triângulo Mineiro, já tem sido detectada em outros municípios mais ao sul do Estado de São Paulo, no eixo da Rodovia Washington Luís. Até o início de 2003, já tinham sido contabilizadas cerca de 1.200.000 plantas com sintomas da moléstia, numa área com extensão de 156 km 2, no sentido norte-sul (BASSANEZI et al., 2003). As árvores afetadas apresentam, inicialmente, paralisação de crescimento, folhas de coloração verde pálido com tendência a amarelecimento, progressiva morte apical de ramos, sintomas de murcha generalizada, seguido de pronunciada queda de folhas e de frutos. No estádio final, praticamente todas as folhas caem e a árvore sofre colapso rápido com morte da planta, permanecendo, não raro, ainda com frutos. Em plantas com grande carga de frutos próximos à maturação, pode ocorrer murcha e morte rápida (súbita), permanecendo os frutos aderidos à árvore seca. Os sintomas, que já foram encontrados até em plantas com 22 meses de idade, são mais freqüentes em árvores com mais de seis anos, e mais pronunciados na primavera. As árvores geralmente morrem cerca de seis meses após o aparecimento dos primeiros sintomas. Exames dos tecidos do câmbio do porta-
MORTE SÚBITA DOS CITROS 71 -enxerto mostram uma coloração amarela intensa, com limite nítido que a separa da cor branca a creme dos tecidos internos da casca da copa. Essa coloração amarela é, ainda, o mais característico sintoma para diagnosticar a doença, e precede os sintomas na copa (ROMÁN, 2004). Não se observa incompatibilidade típica (formação de goma marrom) na região de enxertia, comum em várias doenças associadas à enxertia. O sistema radicular de árvores afetadas tem poucas ou nenhuma radicelas e há diferentes níveis de podridão das raízes da ponta para a base, podendo-se observar a ocorrência de fungos oportunistas, Fusarium spp, principalmente, invadindo o lenho do porta-enxerto e da copa. Todas as variedades-copa das laranjas e tangerinas parecem ser igualmente suscetíveis quando enxertadas em limão Cravo. Plantas sobre tangerina Cleópatra e Sunki e citrumelo Swingle mostram-se tolerantes. Quanto ao limão Volkameriano ainda há dúvidas sobre a sua tolerância (INFORMATIVO CENTRO DE CITRICULTURA, 2003). Provavelmente, as diferenças observadas até o momento reflitam diferenças genéticas no limão Volkameriano, o que precisa ser ainda comprovado. 2. TRANSMISSÃO E EPIDEMIOLOGIA Após a constatação das primeiras plantas doentes, a moléstia pode atingir de 30 a 100% das árvores do talhão em menos de dois anos. Normalmente, a velocidade do aparecimento de novas plantas com sintomas é maior a partir do início da estação chuvosa na primavera (de setembro a novembro) e mais reduzida no outono-inverno (de março a agosto). O padrão espacial da MSC é compatível com aquele de uma doença infecciosa, transmitida por vetor (BASSANEZI et al., 2002, 2003). 3. ETIOLOGIA A partir do descobrimento da MSC, levantaram-se várias hipóteses visando determinar seu agente causal. Algumas delas levavam em conta que fatores abióticos, como estresse ambiental e/ou nutricional, e manejo inadequado do pomar pudessem ser responsáveis pela doença. No entanto, essas hipóteses foram colocadas em segundo plano quando os dados
72 MARCOS ANTONIO MACHADO et al. epidemiológicos foram analisados e, também, quando pomares muito bem conduzidos começaram a apresentar plantas com sintomas da doença. O fato de esta ter sido transmitida por união de tecidos reforça a hipótese de que um agente biótico seja o responsável (INFORMATIVO CEN- TRO DE CITRICULTURA, 2003; YAMAMOTO et al., 2003). Patógenos de solo, suspeitos de estarem envolvidos com a MSC, foram descartados em vista da constatação de que as populações de Phytophthora, Fusarium e nematóides eram baixas em talhões com alta incidência de plantas afetadas. Também se eliminaram as hipóteses de que bactérias e fitoplasmas pudessem ser os agentes causais, em razão dos sintomas e da ausência do patógeno nas plantas afetadas (MÜLLER et al., 2002a,b). A hipótese de serem viróides também foi descartada, pois os mesmos não têm vetores e são transmitidos por borbulhas e ferramentas infectadas (MÜLLER & COSTA, 1980). Como a distribuição espacial da doença aponta para a existência de um vetor (BASSANEZI et al., 2003), a hipótese de um vírus, especialmente um ou mais variantes do Citrus tristeza virus (CTV), ser o causador da MSC vem sendo uma das mais aceitas. O CTV é endêmico no Brasil e pode ser encontrado em todas as espécies e variedades de citros. Considerado um dos mais complexos vírus de plantas, foi incluído no grupo dos Closterovirus. Seu genoma é composto de uma molécula de RNA simples fita, de 19259 a 19296 bases (PAPPU et al., 1994; KARASEV et al., 1995; MAWASSI et al., 1996; VIVES et al., 1999; TARGON et al., 2000; RUBIO et al., 2001), dependendo do isolado, polaridade positiva, encapsidado por duas proteínas do capsídeo (p25 e p27) em partículas flexíveis, longas e filamentosas, de aproximadamente 10-12 nm de diâmetro por 2.000 nm de comprimento. O CTV é o agente causal da tristeza dos citros, uma das mais importantes doenças que atingiram a cultura. A tristeza foi detectada pela primeira vez na África do Sul, em 1928, quando foi observada uma incompatibilidade de laranja doce enxertada em laranja Azeda. No Brasil, foi observada em 1937, quando praticamente dizimou todas as plantas com a combinação laranja doce/ Azeda em pomares do Vale do Paraíba (SP). Os sintomas da MSC assemelham-se ao declínio rápido de laranja doce enxertada sobre laranja Azeda e causada pelo CTV.
MORTE SÚBITA DOS CITROS 73 No entanto, ainda restam dúvidas de que esse vírus possa ser o responsável pela MSC, pois: 1) testes de iodo não indicaram o acúmulo de amido acima da linha de enxertia das plantas afetadas, como é encontrado algumas vezes na síndrome clássica causada pelo CTV; 2) análises moleculares não indicaram a presença de estirpes com características diferentes dos isolados presentemente conhecidos; 3) o CTV tem infectado, mas não afetado, árvores sobre limoeiro Cravo no Brasil, há décadas, e, mesmo o complexo extremamente forte denominado Capão Bonito não mata as plantas; 4) CTV é considerado mais severo em condições mais frias (ROISTACHER et al., 1974), enquanto os pomares afetados pela MSC estão em áreas mais quentes. A favor da hipótese de o CTV ser o agente causal da MSC, tem-se a considerar o seguinte: 1) raças de CTV causando declínio rápido são conhecidas há muito tempo afetando combinações de laranjas, tangerinas e pomelos enxertados sobre laranja Azeda e lima da Pérsia (COSTA et el., 1949); 2) embora com modificações, os sintomas de MSC lembram aqueles de declínio rápido provocados pelo CTV nas combinações de laranja doce enxertada sobre laranja Azeda ; 3) a tristeza dos citros é endêmica no Brasil, sendo suas formas mais conhecidas e caracterizadas aquelas que induzem caneluras, principalmente em laranjeiras enxertadas em porta-enxertos tolerantes ao vírus; entretanto, todas essas formas são capazes de induzir declínio rápido se as copas estiverem sobre laranja Azeda ; 4) o fato de não haver registro de isolados de CTV causadores de declínio rápido afetando limão Cravo não significa que eles não ocorram, visto que o Brasil é o único país no mundo a plantar extensivamente esse porta-enxerto; 5) não existe relato de proteção cruzada quando o CTV desenvolve a tristeza na forma de declínio rápido (VEGA et al., 1995). Em face dessas considerações, não pode ser descartada a hipótese de se tratar de um mutante de formas de CTV preexistentes no Brasil, de uma nova combinação de raças do CTV que se tenham originado favorecidas por fatores edafoclimáticos locais, ou de uma nova raça inadvertidamente introduzida no País. As fases iniciais da MSC são semelhantes ao declínio dos citros, doença na qual também as copas em porta-enxertos de limão Cravo são afetadas, o que, geralmente, não ocorre quando enxertadas em tangerinas
74 MARCOS ANTONIO MACHADO et al. (RODRIGUEZ et al., 1979; PRATES et al. 1982). Todavia, as plantas afetadas por declínio, por via de regra, não morrem. A doença também tem algumas similaridades com o declínio súbito de laranja Valência sobre limão Volkameriano na Venezuela, onde as plantas morriam oito a dez meses após o início dos sintomas (OCHOA et al., 1993). Finalmente, a doença também lembra o problema de declinamiento ou fruta bolita, em Misiones, Argentina, onde todas as árvores sobre trifoliata declinaram e morreram (PUJOL, 1969). No entanto, as causas desses últimos problemas permanecem desconhecidas. 4. CONTROLE Como a MSC vem ocorrendo somente em copas enxertadas em limoeiro Cravo, deve-se evitar esse porta-enxerto em novos plantios, sendo recomendado o uso das tangerinas Cleópatra e Sunki, citrumelo Swingle e P. trifoliata, que se têm mostrado tolerantes à doença. No entanto, esses porta-enxertos não apresentam a mesma tolerância ao déficit híbrido do limão Cravo, além de apresentarem problemas associados à precocidade e à intolerância a outras moléstias. Medidas de controle de curto prazo em pomares com MSC inclui, principalmente, a subenxertia com porta-enxertos tolerantes. Subenxertias realizadas em larga escala com porta-enxertos alternativos, em propriedades existentes na região onde ocorre a MSC, têm mostrado que, embora essa técnica proporcione uma aparente remissão dos sintomas, por si só não permite a recuperação econômica da planta. As primeiras indicações apontam que a subenxertia poderia ter algum sucesso em plantas com até quatro cinco anos de idade. O produtor deverá proceder a uma avaliação detalhada do custo-benefício dessa técnica, em face dos prejuízos por quebra de produção que fatalmente ocorrerão (INFORMATIVO CENTRO DE CITRICULTURA, 2003). Outra possibilidade de controle da MSC é o interplantio com árvores em porta-enxertos tolerantes. Antes disso, o citricultor tem que examinar a sua situação particular, considerando a idade do pomar e o espaçamento. Iniciar um pomar novo em porta-enxertos tolerantes é, sem dúvida, a melhor
MORTE SÚBITA DOS CITROS 75 opção. No entanto, em muitos casos, o pequeno citricultor não tem área para expandir, o que torna o interplantio obrigatório. Visto que a MSC é extremamente grave e que representa séria ameaça ao parque citrícola brasileiro, medidas de contenção foram tomadas no Estado de São Paulo, no sentido de proibir a comercialização e o trânsito de material vegetativo (mudas, borbulhas, porta-enxertos e sementes) produzido a céu aberto, procedente das áreas de ocorrência da doença (PORTA- RIA CDA-9, 2002). 5. PESQUISA SOBRE MSC NO CENTRO APTA CITROS SYLVIO MOREIRA A possibilidade de ocorrência de novos variantes do CTV que pudessem afetar os citros considerados tolerantes sempre foi preocupante. Desse modo, como foi levantada a hipótese de que a MSC seria causada por um novo variante do CTV, e tendo em mente os danos causados pelo Capão Bonito desse vírus, vários trabalhos de avaliação e comparação de isolados associados a plantas afetadas pela doença vêm sendo realizados. A utilização de Bi Directional Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (BD- RT-PCR) com primers do gene da capa protéica do CTV, específicos de isolados severos de Capão Bonito e também de isolados comuns, mostrou a ocorrência de misturas de haplótipos do CTV em plantas coletadas na região afetada pela MSC, alguns semelhantes aos do complexo severo Capão Bonito (TARGON et al., 2002). A reação de plantas afetadas pela MSC e de plantas com complexos comuns do CTV a sete diferentes anticorpos monoclonais produzidos contra a proteína do capsídeo do CTV foi feita. Os resultados não mostraram uma variação significativa nas populações do CTV em plantas afetadas e não afetadas pela MSC (FREITAS-ASTÚA et al., 2003). A comparação de haplótipos do CTV presentes em plantas afetadas pela MSC com haplótipos comuns do vírus, através de single strand conformational polimorphism (SSCP) dos genes da p20, p23, p25, p27 e início da ORF 1, mostrou a ocorrência de variantes heterogêneos, tanto em plantas afetadas pela MSC como nas outras, infectadas com complexos
76 MARCOS ANTONIO MACHADO et al. comuns do CTV (SOUZA et al., 2002; TARGON et al., 2003). Esses mesmos genes foram clonados e seqüenciados, e a comparação das seqüências confirmou a existência de uma mistura de variantes do CTV, ocorrendo em níveis variados nas plantas. O agrupamento das seqüências de cada um dos genes analisados não mostrou a predominância de determinado haplótipo do CTV nas plantas afetadas pela MSC (TARGON et al., 2003). Em algumas seqüências de variantes do vírus em plantas da região afetada pela MSC, detectaram-se somente mutações pontuais, que permitiram o desenho de um par de primers para serem utilizados no diagnóstico precoce da doença. O seqüenciamento do genoma total de isolado do CTV associado à planta de laranja doce var. Valência / Cravo, coletada na região afetada pela MSC, mostrou a ocorrência de variantes do CTV. Esses variantes formaram dois grupos principais, estando suas seqüências sendo comparadas com as do genoma de isolados comuns do CTV. Esse trabalho visa à obtenção de primers específicos de isolados do CTV associados a plantas com MSC para serem usados no diagnóstico da doença. A altíssima variação observada nas populações de CTV em plantas com MSC, comum em quase todas as plantas afetadas por esse vírus, não permitiu obter evidências concretas de que o agente causal da MSC seja um novo variante do CTV. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BASSANEZI, R. B.; BERGAMIN FILHO, A.; AMORIN, L.; GIMENES- FERNANDES, N.; GOTTWALD, T. R. & BOVÉ, J. M. Spatial and temporal analyses of Citrus Sudden Death as a tool to generate hypotheses concerning its etiology. Phytopathology, v. 93, p.502-512, 2003. BASSANEZI, R. B.; YAMAMOTO, P. T. & GIMENES-FERNANDES, N. Progresso dos sintomas de morte súbita em pomares de laranjeiras Valência e Pêra. In: CONGRESSO PAULISTA DE FITOPATOLOGIA, 25, 2002, Espírito Santo do Pinhal. Programa e resumos... Espírito Santo do Pinhal, Sociedade Paulista de Fitopatologia, 2002. p.80. COSTA, A. S.; GRANT, T. J. & MOREIRA, S. Investigações sobre a tristeza dos citrus II: conceitos e dados sobre a reação das plantas cítricas à tristeza. Bragantia, v.9, p.59-80, 1949.
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