ASPECTOS QUANTITATIVOS E QUALITATIVOS DA FOLICULOGÊNESE PRÉ- NATAL NA ESPÉCIE CAPRINA

Ciência Animal 1998, 8(2):47-56 ASPECTOS QUANTITATIVOS E QUALITATIVOS DA FOLICULOGÊNESE PRÉ- NATAL NA ESPÉCIE CAPRINA (Quantitative and qualitative aspects of pre-antral folliculogenesis in caprine species) Marcelo Barbosa BEZERRA 1, Davide RONDINA 2, Ana Kelen Felipe LIMA 1, Lis Christina OLIVEIRA 1, Riccardo CECCHI 2, Carolina Madeira LUCCI 1, Alessandro GIORGETTI 2 & José Ricardo de FIGUEIREDO 1* 1 Universidade Estadual do Ceará/Faculdade de Veterinária; 2 Universidade de Florença UNIFI, Itália RESUMO O objetivo do presente trabalho foi estudar aspectos quantitativos e qualitativos da foliculogênese na fase pré-antral na espécie caprina. Ovários de fetos caprinos SRD (n=25) foram subdivididos em 6 grupos gestacionais: (a) 60 a 70 dias (n=4), (b) 71 a 80 dias (n=4), (c) 81 a 90 dias (n=5); (d) 91 a 100 dias (n=4), (e) 101 a 110 dias (n=5) e (f) 111 a 124 dias de gestação (n=3). Os ovários foram fixados em Bouin por 24 horas, cortados seriadamente, montadas a cada 10ª secção e corados com hamatoxilina-eosina. Os diâmetros médios ± DP dos folículos primordiais, de transição, primários, secundários e terciários foram respectivamente 33 ± 7,5 mm; 40,7 ± 9,4 mm; 49,8 ± 12,0 mm; 83 ± 25 mm e 158 ± 31,9 mm. No tocante à análise quantitativa, foi observada uma grande variação individual (zero a 37.368) no número de folículos ovarianos a partir do 81º dia de gestação. A proporção das diferentes classes foliculares foi apresentada em percentual, havendo uma maior predominância dos folículos primordiais (93%). Referentes aos aspectos qualitativos, a taxa de degeneração foi maior (P<0,05) nos folículos primordiais. A picnose do núcleo oocitário foi o parâmetro de degeneração mais observado. Cronologicamente, os primeiros folículos foram visualizados no grupo A aos 62 dias de gestação e a ativação folicular observada aos 73 dias de gestação. Os folículos terciários surgiram aos 101 dias de gestação com diâmetro mínimo de 130 µm. Este estudo mostra pela primeira vez alguns aspectos da foliculogênese em fetos caprinos e demonstra que este processo se inicia antes do nascimento nesta espécie. Palavras-chave: foliculogênese, caprino, feto, histologia. ABSTRACT The aim of this work was to study the quantitative and qualitative aspects of folliculogenesis in caprine species. Ovaries from caprine fetus of an undefined breed (n = 25) were divided into 6 gestational groups: (a) 60 to 70 days (n = 4), (b) 71 to 80 days (n = 4), (c) 81 to 90 days (n = 5); (d) 91 to 100 days (n = 4), (e) 101 to 110 days (n = 5) and (f) 111 to 124 days of gestation (n = 3). The ovaries were fixed in Bouin fluid for 24 hours, serially sectioned, mounted every 10 th section and stained with hematoxilin and eosin. The mean diameters of primordial, transition, primary, secondary and tertiary follicles were respectively 33 ± 7.5 mm; 40.7 ± 9.4 mm; 49.8 ± 12.0 mm; 83 ± 25 mm and 158 ± 31.9 mm. With regard to quantitative analysis, a large individual variation (zero to 37.368) *Autor para correspondência Av. Paranjana, 1700 60740-000 Fortaleza, Ceará e-mail: jrf@roadnet.com.br 47

in the number of follicles was observed. A significant increase in the number of follicles was observed from 81 th days of gestation. The proportion of different follicular classes was expressed in percentual (%) and a high predominance of primordial follicles (93%) was observed. Picnosis of the oocyte nucleus was the most commonly observed aspect of degeneration. Chronologically, the first follicles were seen in group A at 62 days of gestation and follicular activation observed at 73 days of gestation. The first tertiary follicles appeared at 101 days of gestation with a minimum diameter of 130 µm. This study shows for the first time some aspects of early folliculogenesis in caprine fetus and demonstrates that this process begins before birth in this species. Key words: Folliculogenesis, caprine, fetus, histology. 48 INTRODUÇÃO O estudo da foliculogênese é de grande importância para a pesquisa fundamental, servindo ainda como referencial para estudos aplicados. Em relação aos aspectos quantitativos e qualitativos da foliculogênese, estudos histológicos têm sido realizados em diferentes espécies, como bovinos (ERICKSON, 1976 a,b; ERICKSON et al., 1976; LUSSIER et al., 1987), ovinos (CAHILL et al., 1979; CAHILL & MAULÉON, 1980; DUFFOUR & GUIBAULT, 1984; JORIO et al., 1991), caninos (McDOUGALL et al., 1997) e humanos (MOORE et al., 1974; GOUGEON & CHAINY, 1987). Em caprinos, estes estudos têm se restringido à dinâmica folicular em relação ao ciclo estral (SURESHKUMAR & JANAKIRAMAN, 1993; GINTHER & KOT, 1994), e estudos relativos a foliculogênese na fase fetal são inexistentes ao nosso conhecimento. No sentido de preencher esta lacuna, o objetivo do presente trabalho foi estudar os aspectos quantitativos e qualitativos da foliculogênese em ovários de fetos caprinos Sem Raça Definida (SRD). MATERIAL E MÉTODOS Origem dos Ovários Foram utilizados ovários de fetos caprinos SRD, obtidos de fêmeas gestantes, abatidas em matadouros, com períodos gestacional entre 60º e 124º dias e oriundos de matadouros localizados na região metropolitana de Fortaleza, Ceará, Brasil. Avaliação da Idade Gestacional A idade gestacional foi estimada segundo o método descrito por GALL et al. (1994), baseado no comprimento dos fetos, medido da articulação atlanto-occiptal à base da cauda. Os fetos foram subdivididos em 6 grupos em função da idade gestacional, sendo: (A) 60 a 70 dias (n=4), (B) 71 a 80 dias (n=4), (C) 81 a 90 dias (n=5), (D) 91 a 100 dias (n=4), (E) 101 a 110 dias (n=5), (F) 111 a 124 dias (n=3). Processamento Histológico dos Ovários Os ovários dos fetos (um por animal) foram coletados cerca de 20 minutos após abate das fêmeas gestantes. Imediatamente após a coleta, os ovários foram fixados em Bouin por 24 horas, desidratados em séries crescentes de etanol, diafanizados e incluídos em parafina para obtenção de cortes histológicos à espessura de 8 µm. As lâminas foram montadas a cada 10a secção e coradas com hematoxilina-eosina. Classificação dos Folículos Ovarianos Os folículos ovarianos foram divididos em 5 classes baseadas nas características morfológicas e no número de camadas de células da granulosa que circundam o oócito, a saber: a) folículos primordiais (oócito circundado por células achatadas da pré-granulosa); b) folículos de transição (oócito circundado por uma camada contendo tanto células achatadas quanto cúbicas); c) folículos primários (oócito contendo uma camada de células cúbicas em seu redor); d) folículos secundários (duas ou mais camadas de células cúbicas em torno do oócito) e e) folículos terciários (folículos contendo em seu

interior uma cavidade antral). Avaliação Morfométrica dos Folículos Ovarianos Para este fim, foi analisado um total de 1.000 folículos oriundos de 6 diferentes grupos estudados. O diâmetro folicular, oocitário e do núcleo oocitário nas classes acima citadas foram determinados utilizando-se uma ocular micrométrica. Somente folículos sadios, sem sinais de degeneração e que apresentam oócito com núcleo visível, foram considerados. Avaliação Quantitativa Para estimativa da população folicular, somente foram contados os folículos cujos núcleos oocitários foram claramente visíveis nas secções estudadas. O número de folículos por ovário foi estimado segundo GOUGEON & CHAINY (1987) utilizando o fator de correção abaixo: PF = NF x NS x EC NSO x ø NOoc Onde: PF= População Folicular NF= Número de Folículos (primordial, transição, primário, secundário e terciário) contados no ovário NS= Número total de secções EC= Espessura do corte NSO= Número de secções observadas ø NOoc= Diâmetro médio do núcleo do oócito (primordial; transição; primário, secundário e terciário) Avaliação Qualitativa Para a avaliação qualitativa, 200 folículos por animal foram analisados e classificados em folículos morfologicamente normais ou folículos degenerados. Foram considerados degenerados aqueles folículos apresentando oócitos ausentes ou contendo núcleos picnóticos. As células da granulosa picnóticas ou desagrupadas também foram parâmetros indicativos de degeneração. Análise Estatística Os diâmetros dos folículos ovarianos foram expressos em média ± desvio padrão (DP). Os números totais de folículos ovarianos em função da idade gestacional foram expressos em média (± desvio padrão), sendo comparados entre si pelo teste de Whitney-Mann. As proporções de folículos degenerados foram comparadas entre os diferentes grupos gestacionais bem como entre as diferentes classes foliculares (primordial, transição, primários e secundários) utilizando-se o teste Qui- Quadrado. Os resultados foram considerados significativos quando P<0,05. RESULTADOS Aspectos Histológicos A Fig. 1 mostra as diferentes estruturas identificadas nos ovários fetais, as quais foram visualizadas bem distribuídas pela cortical do ovário. Foram observados ovogônias (Fig. 1a) e folículos ovarianos: primordiais, de transição (Fig. 1b), primários (Fig. 1c), secundários (Fig. 1d) e terciários (Fig. 1e), folículos primordiais biovulares (Fig. 1f), sendo estes últimos, observados em quantidades insignificantes, e folículos degenerados (Fig. 5). Morfologicamente, as ovogônias se caracterizam por menor tamanho, maior basofilia nuclear em relação aos oócitos e pela ausência de envolvimento de das células da pré-granulosa. Os folículos se desenvolveram da periferia em direção às camadas mais profundas da cortical e a presença de células tecais foi observada mais freqüentemente associada ao surgimento de folículos secundários e terciários. Dados Morfométricos Os diâmetros oocitários e foliculares foram medidos nas diferentes classes foliculares estudadas e podem ser observados na Tab. 1. Estes dois parâmetros apresentaram uma grande variação individual. Respectivamente para os diâmetros oocitário e folicular, os limites mínimos observados foram de 14 e 18 µm e os máximos de 78 e 216 µm. Os folículos primordiais apresentaram em média (± DP) 26,6 ± 6,7 µm e 33 ± 7,5 µm de diâmetros oocitário e folicular, 49

Figura 1. Estruturas observadas nos ovários: a)ovogônias (x 560); b) Folículos Primordiais (P) e de Transição (T) (x 350); c) Folículos Primários (x 350); d) Folículos Secundários, Células Tecais (ponta de seta) (x 350); e) Folículos Terciários, Células Tecais (ponta da seta) (x 220); f) Folículos primordiais Bi-ovulares (B), Epitélio Germinativo (EG) (x 350). Tabela 1. Média ± DP e limites mínimo e máximo dos diâmetros (µm) oocitário e folicular nas diferentes classes de folículos Diâmetro (µm) Parâmetro Primordial Transição Primário Secundário Terciário Oócito 26,6±6,7 (14 56) 31,7±8,0 (18 60) 38,2±10,0 (22 78) 47,4±8,5 (36 60) 63±7,6 (54 76) Folículo 33±7,5 (18 72) 40,7±9,4 (26 84) 49,8±12,0 128 100 83,0±25,0 (48-100) 158,0±31,9 130 216) N = 780 100 84 20 6

35000 30000 25000 20000 15000 a h b b b 10000 5000 0 a A (60-70) B (71-80) C (81-90) D (91-100) E (101-110) F (111-124) Figura 2. Média de folículos ovarianos em função da idade gestacional Letras diferentes indicam diferenças estatísticas (P<0,05) respectivamente. Os demais folículos ovarianos tiveram os seguintes diâmetros médios (± DP) de oócito e folículo, respectivamente: 31,7 ± 8,0 µm e 40,7 ± 9,4 µm para folículos de transição; 38,2 ± 10 µm e 49,8 ± 12,0 µm para folículos primários; 47,4 ± 8,5 µm e 83 ± 25 µm para folículos secundários e 63 ± 7,6 µm e 158 ± 31,9 µm para folículos terciários. O surgimento da cavidade antral ocorreu, pela primeira vez, em folículos terciários de 130 µm. Avaliação Quantitativa Os resultados obtidos mostraram uma grande variação individual (zero a 37.368) no número de folículos presentes nos ovários. Os dados referentes aos números de totais médios dos folículos ovarianos em função da idade gestacional podem ser vistos na Fig. 2. As classes A (60 a 70 dias de gestação) apresentaram um número médio de folículos ovarianos significativamente inferior (P<0,05) aos das demais classes (C, D, E, F). Do 81o até o 124o dias de gestação, o número de folículos ovarianos permaneceu relativamente constante (P>0,05). Cronologia da Fuliculogênese em Fetos Caprinos Os ovários do grupo A (60 a 70 dias de gestação) foram compostos basicamente por ovogônias e células somáticas, as quais foram diferenciadas microscopicamente entre si pelo maior tamanho e formato ovóide das primeiras (Fif. 3a). No tocante ao surgimento dos folículos, os primeiros folículos primordiais foram observados em um animal do grupo A ao 62o dia de gestação. Os ovários do grupo B caracterizaram-se por ainda apresentarem ovogônias remanescentes, além de folículos primordiais (Fig. 3b). Folículos de transição, primários e secundários foram observados pela primeira vez em um animal aos 73 dias de gestação. Nos grupos C e D (Fig. 3c) não foram mais observadas ovogônias, sendo observados apenas folículos pré-antrais. Nos grupos E e F, além da presença de folículos pré-antrais, foram observados folículos terciários (Fig. 3d), ou seja, folículos com a formação de antro. Estes folículos foram observados pela primeira vez em um animal aos 101 dias de gestação. A Tab. 2 mostra de forma resumida a cronologia do desaparecimento das ovogônias e do surgimento

Figura 3.Características principais dos ovários em função da idade gestacional. (a) Grupo A, ovogônias (Ov); (b) Grupo B, folículos primordiais (P); e de transição (T); (c) Grupos C e D, folículos de transição primários (1º), secundários (2º); (d) Grupos E e F, folículos pré-antrais terciários (3º)(a-d)(aumento de140x) 20 15 % 10 14,14a 16,61a 52 5 0 1,76b 0,52c 0,19d Primordial Transição Primário Secundário Total Folículos degenerados Figura 4. Percentual de folículos degenerados em função da categoria folicular Letras diferentes indicam diferença estatística (P<0,05)

Tabela 2. Cronologia do desaparecimento das ovogônias e do surgimento dos diferentes tipos de folículos em função do período gestacional dos diferentes tipos de folículos em função do período gestacional. Com relação à distribuição relativa dos folículos ovarianos, os folículos primordiais estiveram sempre presentes em quantidades consideravelmente superiores às demais classes de folículos. Considerando-se os dados conjuntamente para os grupos gestacionais estudados, a proporção de folículos primordiais, de transição, primários, secundários e terciários foi, respectivamente, de 93,72%, 4,85%, 1,10%, 0,29% e 0,05%. Avaliação Qualitativa A Fig. 4 mostra a percentagem de folículos degenerados durante a vida fetal nas diferentes classes foliculares. Considerando os dados conjuntamente, a taxa de degeneração folicular foi de 16,61%. Pode-se observar que a maior taxa de degeneração (P<0,05) ocorreu em folículos primordiais, sendo significativamente superior às demais classes. A taxa de degeneração diminuiu significativamente (P<0,05) com a progressão nos estágios de desenvolvimento folicular. A degeneração folicular foi caracterizada, na maioria dos casos, pela presença de picnose do núcleo do oócito. Folículos cujos oócitos estavam ausentes também Figura 5. Folículos degenerados, notar núcleos picnóticos e invasão fibroblástica (setas) (x320). foram visualizados. A Fig. 5 ilustra folículos primordiais degenerados. DISCUSSÃO Os resultados obtidos no presente trabalho mostram dados referentes à foliculogênese pré-natal na espécie caprina. A localização e o aspecto morfológico dos diferentes tipos de folículos pré-antrais obedeceu a critérios previamente descritos (HULSHOF et al., 1994a). 53

Os folículos de transição foram considerados como uma classe à parte por apresentarem características de ativação folicular, com modificação no formato das células da prégranulosa, de forma pavimentosa para a forma cúbica (ERICKSON, 1986). Foram observados folículos bi-ovulares similares aos da espécie canina (McDOUGALL et al., 1997). O surgimento destes folículos pode estar associado ao início da foliculogênese, mais precisamente ao momento em que os oócitos são envolvidos pelas células da pré-granulosa, podendo, inclusive, resultar em folículos anovulares (McDOUGALL et al., 1997). Os dados relativos aos diâmetros médios dos folículos pré-antrais foram, em geral, semelhantes aos relatados em bovinos (HULSHOF et al., 1994a). Exceto em relação aos folículos secundários, que foram menores na espécie caprina (83 µm vs 101,7 µm), os diâmetros oocitários e foliculares dos folículos pré-antrais observados foram similares àqueles na espécie humana (GOUGEON & CHAINY, 1987). A diferença significativa observada nos diâmetros oocitários e folicular entre os diferentes tipos de folículos ovarianos corrobora com a hipótese de que a diferenciação dos folículos primordiais em primários passa por uma etapa intermediária, denominada neste trabalho como folículo de transição, que se caracteriza não apenas pela modificação no formato das células somáticas circundantes mas também no diâmetro oocitário (MONNIAUX et al., 1997). Uma grande variação individual foi observada no que diz respeito ao número de folículos por ovário. Resultados similares foram relatados em fetos bovinos (ERICKSON, 1966a), bem como em animais adultos (ERICKSON, 1966b; CAHILL et al., 1979). De um modo geral, a população folicular e a distribuição das diferentes classes nos ovários podem ser afetadas por diversos fatores, tais como raça (CAHILL & MAULÉON, 1980), idade (ERICKSON, 1966a,b; MOORE et al., 1974; RÜSSE, 1983), níveis hormonais (PETERS, 1976) e estágio reprodutivo (ERICKSON et al., 1976). No presente trabalho, fatores individuais bem como a cinética do aparecimento dos folículos préantrais podem ter sido responsáveis por esta variação. Nos ovários de fetos caprinos, houve uma predominância de folículos primordiais em relação às demais categorias. Esta característica também é observada em outras espécies e deve-se ao fato de que este tipo de folículo constitui o estoque oocitário que será utilizado ao longo da vida reprodutiva das fêmeas (MARIANA et al., 1989). Assim como observados em bovinos (ERICKSON, 1966a) e ovinos (JORIO et al., 1991), este trabalho mostra que a foliculogênese em caprinos tem início na fase fetal. O número de folículos observados do 60o ao 80o dias de gestação foi significativamente inferior aos demais períodos de gestação, que permaneceram relativamente constantes a partir dos 81 dias de gestação. Isto pode ser devido à predominância das ovogônias nas fases iniciais da gestação, que posteriormente poderão originar os primeiros folículos primordiais ou degeneram-se (ERICKSON, 1966a). O surgimento dos primeiros folículos primordiais em caprinos foi verificado aos 62 dias de gestação, época semelhante à observada em fetos ovinos (em torno de 66 dias de gestação) (RÜSSE, 1983). Entretanto, em bovinos, este surgimento ocorre mais precocemente ao final do primeiro terço da gestação (RÜSSE, 1983). A ativação dos folículos primordiais antes do nascimento foi relatada em ruminantes domésticos (ERICKSON, 1966a; RÜSSE, 1983; WANDJI et al., 1992; HULSHOF et al., 1994b), ou logo após o nascimento em roedores (EPPIG, 1992). Apesar dos mecanismos de ativação dos folículos primordiais permanecerem desconhecidos (WANDJI et al., 1996), sabe-se que estes folículos entram em um estágio de quiescência que pode durar semanas a anos (BUCCIONE et al., 1990). Contudo, nossos achados (folículos de transição, primários e secundários aos 73 dias de gestação) são indicativos de que alguns folículos primordiais são ativados na vida fetal, antes mesmo de entrar em quiescência, conforme descrito em bovinos e ovinos (RÜSSE, 1983). Os primeiros folículos terciários foram observados ainda na vida fetal e apresentaram 54

um diâmetro mínimo de 130 ìm. A ocorrência de folículos antrais em ovários fetais foi observada na espécie bovina (ERICKSON, 1966a; WANDJI et al., 1992; HULSHOF et al., 1994b). Na espécie ovina, estes folículos surgem imediatamente antes (RÜSSE, 1983) ou logo após o nascimento (JORIO et al., 1991). Com relação ao diâmetro mínimo em que o antro foi formado, resultados similares foram relatados em bovinos (140 ìm LUSSIER et al., 1987). Entretanto, na espécie ovina, o aparecimento do antro foi relatado em folículos a partir de 170 ìm (CAHILL et al., 1979). A alta taxa de folículos primordiais degenerados, observados neste estudo, pode ser devido ao fato de que nas fases iniciais da meiose, mais precisamente nas fases de zigóteno a paquíteno, os folículos são mais suscetíveis à degeneração folicular (ERICKSON, 1966a). O processo de degeneração folicular observado no presente trabalho ocorreu principalmente no núcleo oocitário do folículo primordial. Este resultado concorda com estudos previamente descritos (INGRAM, 1962; ERICKSON, 1966b). Resultados in vitro têm demonstrado que a suscetibilidade dos oócitos, inclusos em folículos pré-antrais, à degeneração é maior que a das células da granulosa circundantes (FIGUEIREDO et al., 1994). Finalmente, este trabalho mostra os aspectos iniciais envolvidos na foliculogênese em fetos caprinos, podendo-se obter as seguintes conclusões: a) os dados relativos à morfometria folicular foram similares aos observados nas espécies bovina e humana; b) cronologicamente o início da foliculogênese pode ser considerado semelhante ao descrito nas espécies bovina e ovina, principalmente pela formação dos primeiros folículos primordiais (próximo ao início do segundo terço da gestação), bem como o surgimento de folículos antrais ainda na vida fetal; c) o número de folículos ovarianos estabelece a partir do 81o dia da gestação com o fim das mitoses oogonais e início da meiose; d) quantitativamente, a população folicular é caracterizada por uma grande variação individual a qual é influenciada pelo período gestacional; e) qualitativamente, os folículos mais suscetíveis à degeneração na vida pré-natal são os folículos primordiais. As informações deste trabalho poderão servir como parâmetros para posteriores estudos in vivo ou in vitro da foliculogênese na espécie caprina. AGRADECIMENTOS Este trabalho foi financiado pela Coordenação de Pessoal do Ensino Superior (CAPES) Brasil e Instituto Italo-Latino Americano (IILA) Itália. Agradecimentos: Os autores agradecem aos Professores G. Bani, G.S. Tomé e à Sra. M.R. Oliveira pela assistência técnica ao longo do experimento. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BUCCIONE, R., SCHROEDER, A.C. & EPPIG, J.J. 1990. Interactions between somatic cell and germ cells throughout mammalian oogenesis. Biol. Reprod., 43: 543-547. CAHILL, L.P. & MAULÉON, P. 1980. Influence of season, cycle and breed on follicular growth rates in sheep. J. Reprod. Fert., 58: 321-328. CAHILL, L.P., MARIANA, J.C. & MAULÉON, P. 1979. Total follicular populations in ewes of high and low ovulation rates. J. Reprod. Fert., 55: 27-36. DUFOUR, J.J. & GUILBAULT, L.A. 1984. Ovarian follicular population changes with the advance of the breeding season in intact and unilaterally ovariectomized ewes. J. Reprod. Fert., 70: 363-368. EPPIG, J.J. 1992. Growth and development of mammalian oocytes in vitro. Arch. Pathol. Lab. Med., 116: 379-382. ERICKSON, B.H. 1966a. Development and radioresponse of the preantral bovine ovary. J. Reprod. Fert., 10: 97-105. ERICKSON, B.H. 1966b. Development and senescence of the postnatal bovine ovary. J. Anim. Sci., 25: 800-805. ERICKSON, B.H., REYNOLDS, R.A. & MURPHREE, R.L. 1976. Ovarian characteristics and reproductive 55

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