Química Analítica Ambiental II Prof. Morun Bernardino Neto, DSc ESPECTROFOTOMETRIA II INSTRUMENTOS E APLICAÇÕES BREVE REVISÃO O gráfico abaixo mostra o espectro de absorção de um protetor solar que absorve a radiação solar prejudicial com comprimento de onda abaixo de 350 nm 1
Exemplo 1: Que fração da radiação ultravioleta e transmitida através do protetor solar mostrado na figura acima no pico de absorbância próximo de 300 nm? T = P P 0 A = logt (Resposta: aproximadamente 45%) Exemplo 2: Se você dobrar a camada de protetor solar aplicada sobre a pele, qual será a transmitância próxima a 300nm e que porcentagem da radiação ultravioleta é bloqueada? T = P P 0 A = logt (Resposta: 0,20; 80% são bloqueados) 2
ESPECTROFOTÔMETRO DE FEIXE SIMPLES P0 é a energia radiante que chega ao detector quando o compartimento de amostra não contém o analito; P é a energia radiante que chega ao detector quando o compartimento de amostra contém o analito No espectrofotômetro de feixe simples duas amostras diferentes devem ser posicionadas alternadamente no caminho do feixe de radiação. Existe erro caso a intensidade da fonte de radiação ou a resposta do detector varie entre as duas medidas. ESPECTROFOTÔMETRO DE FEIXE DUPLO No espectrofotômetro de feixe duplo existe um alternador de feixe que faz a luz passar várias vezes pela amostra e pela cubeta de referência alternadamente, assim, P0 é a energia radiante que emerge da cubeta de referência (branco) e P é a energia radiante que emerge da amostra. 3
FONTES DE RADIAÇÃO Duas lâmpadas fornecem radiação na região do espectro visível e ultravioleta: (1) uma lâmpada de tungstênio comum (filamento opera em 3000K) produz radiação na região do espectro visível e do infravermelho (320 nm a 2500nm) (2) para espectroscopia na região do ultravioleta normalmente é empregado uma lâmpada de deutério. Uma descarga elétrica provoca a dissociação D2 e emissão de radiação ultravioleta de 200nm a 400nm. A troca das lâmpadas é feita em 360 nm MONOCROMADOR O monocromador dispersa a radiação nos comprimentos de onda que a compõem e seleciona uma faixa estreita de comprimentos de onda para passar pela amostra. Esses raios atingem uma rede de difração, onde os componentes da radiação, correspondentes a diferentes comprimentos de onda, são difratados em diferentes ângulos. A radiação difratada incide então em um segundo espelho côncavo, que focaliza cada comprimento de onda em um ponto diferente do plano focal. A rede direciona uma estreita faixa de comprimentos de onda na direção da fenda de saída do monocromador. No monocromador de rede, a radiação policromática, proveniente da fenda de entrada, e colimada (forma-se um feixe com raios paralelos) por um espelho côncavo A rotação da rede permite que comprimentos de onda diferentes passem através da fenda de saída. 4
DETECTOR Um detector produz um sinal elétrico quando e atingido por fótons. Em um espectrofotômetro de feixe simples o ajuste de transmitância 100% deve ser corrigido toda vez que o comprimento de onda for mudado para se obter o máximo de rendimento que pode ser obtido do detector para cada comprimento de onda. As leituras subsequentes são escalonadas em relação a leitura de 100%. ANÁLISE DE UMA MISTURA Quando existe mais de uma espécie que absorve radiação em uma solução, a absorvância em qualquer comprimento de onda e a soma das absorvâncias de todas as espécies naquele comprimento de onda: A: absorvância ε: absortividade molar b: caminho óptico [x]: concentração da substância X A = ε x b X + ε y b Y + +ε z b Z Se medirmos os espectros dos componentes puros de uma determinada mistura em experimento a parte poderemos decompor matematicamente o espectro da mistura nos espectros dos seus componentes. 5
ANÁLISE DE UMA MISTURA Para analisar uma mistura, normalmente escolhemos comprimentos de onda correspondentes a absorção máxima para os componentes individuais. A exatidão aumenta se o composto Y absorve fracamente no comprimento de onda máximo para o composto X, e se este absorve fracamente no comprimento de onda máximo para Y. Escolhendo os comprimentos de onda λ e λ correspondentes aos máximos de absorção para cada substância (X e Y) podemos escrever uma expressão para a lei de Beer para cada comprimento de onda: A = ε x b X + ε y b Y A = ε x b X + ε y b Y Exemplo1: Dado o espectro, na região do visível, dos complexos de peróxido de hidrogênio com Ti(IV) (1,32 mm), de V(V) (1,89 mm) e de uma mistura desconhecida contendo ambos os íons. Todas as soluções contém 0,5% m/m de H2O2 e H2SO4 ~ 0,01 M em uma cubeta de 1,00 cm de caminho ótico. Chegamos à: Sendo que uma mistura de X e Y em uma célula de 1,00 cm apresentou uma absorvância A = 0,722 a 406 nm e A = 0,641 a 457 nm. Determine as concentrações de X e Y na mistura. (Resposta: 6, 47 10 4 e 1, 21 10 3 ) 6
Exemplo 2: Considerando a situação descrita, se a absorbância da mistura e 0,600 a 406 nm e 0,500 a 457 nm. Determine [X] e [Y]. (Resposta: 0,610 mm e 0,758 mm) IMUNOENSAIOS EM ANÁLISES AMBIENTAIS IMUNOENSAIOS Uma aplicação importante do fenômeno de luminescência e em imunoensaios, que utilizam anticorpos para detectar o analito. Um anticorpo e uma proteína produzida pelo sistema imunológico de um ser vivo em resposta a uma molécula estranha ao organismo, que e chamada de antígeno. O anticorpo reconhece e se liga ao antígeno que estimulou a sua síntese. 7
PRINCÍPIOS DO TESTE ELISA (Enzime-Linked Immunosorbent Assay) O anticorpo (específico para o analito de interesse) está ligado a um suporte O anticorpo (específico para o analito polimérico; de interesse) está ligado a um suporte analito é incubado com o polímero polimérico; O anticorpo (específico para o analito ligado ao anticorpo para formação do O de analito interesse) é incubado está ligado com a um o polímero suporte complexo antígeno-anticorpo; ligado polimérico; ao anticorpo para formação do A fração dos sítios anticorpo que se complexo O analito é antígeno-anticorpo; incubado com o polímero ao analito é proporcional à A ligado fração ao dos anticorpo sítios do para anticorpo formação que do se concentração do analito na amostra liga complexo ao antígeno-anticorpo; analito é proporcional à desconhecida; concentração A fração dos sítios do analito do anticorpo na amostra que se A superfície do polímero é lavada para desconhecida; liga ao analito é proporcional à remover as substâncias que não A concentração superfície do do polímero analito é na lavada amostra para aderiram à sua superfície; remover desconhecida; as substâncias que não O A superfície complexo do polímero antígeno-anticorpo é lavada para e liga ao analito proporcional liga ao analito é proporcional à concentração do analito na amostra concentração do analito na amostra PRINCÍPIOS desconhecida; DO TESTE ELISA (Enzime-Linked Immunosorbent Assay) desconhecida; superfície do polímero lavada para A superfície do polímero é lavada para remover as substâncias que não remover as substâncias que não aderiram sua superfície; aderiram à sua superfície; complexo antígeno-anticorpo O complexo antígeno-anticorpo e tratado com um segundo anticorpo tratado com um segundo anticorpo que reconhece uma região diferente que reconhece uma região diferente do analito (antígeno). Uma enzima que do analito (antígeno). Uma enzima que será usada em uma fase futura do será usada em uma fase futura do processo foi ligada covalentemente ao processo foi ligada covalentemente ao segundo anticorpo antes desse segundo anticorpo antes desse procedimento procedimento Anticorpos que não aderiram Anticorpos que não aderiram à superfície do polímero são lavados; superfície do polímero são lavados; 8
AMPLICAÇÃO DO SINAL POR MEIO ENZIMÁTICO A enzima ligada covalentemente ao anticorpo pode ser usada para amplificar o sinal na análise química de duas maneiras diferentes: Como cada molécula de enzima catalisa a mesma reação diversas vezes, são produzidas várias moléculas coloridas (ou fluorescente) para cada molécula do antígeno, o que amplifica o sinal na análise química. Esses testes conseguem identificar concentrações menores que 1 ng de analito. USO DE IMUNOENSAIOS EM CIÊNCIAS AMBIENTAIS RASTREIO DE PESTICIDAS, TOXINAS MICROBIANAS E PRODUTOS QUÍMICOS INDUSTRIAIS Imunoensaios estão disponíveis para uso em campo (kits) para rastrear pesticidas, produtos químicos industriais e toxinas microbianas em concentrações entre partes por trilhão (ppt) e partes por milhão (ppm) em lençóis d agua, solo e alimentos. 9
USO DE IMUNOENSAIOS EM CIÊNCIAS AMBIENTAIS RASTREIO DE PESTICIDAS, TOXINAS MICROBIANAS E PRODUTOS QUÍMICOS INDUSTRIAIS VANTAGENS Kits estão disponíveis para uso em campo na análise de: (1) produtos químicos industriais, (2) pesticidas e (3) toxinas microbianas; Pode ser usado em análises de solo, lenções d agua e alimentos; Regiões que não requerem muita atenção são identificadas rapidamente; Em alguns casos o imunoensaios em campo pode ser de 20 a 40 vezes mais barato do que uma análise cromatográfica em laboratório; Os imunoensaios requerem menos que 1 ml de amostra; Podem ser completados em 2-3 h. As análises cromatográficas podem demorar vários dias, pois o analito deve ser primeiro extraído ou concentrado a partir de amostras; PROCEDIMENTO (KITS PARA IMUNOENSAIOS EM CAMPO) Na etapa 1 o anticorpo do analito que se deseja determinar e adsorvido no fundo de um poço microtitulador, que e uma depressão numa placa contendo até 96 poços para análises simultâneas. 10
PROCEDIMENTO (KITS PARA IMUNOENSAIOS EM CAMPO) Na etapa 2, volumes iguais da amostra e de soluc a o-padra o contendo a enzima ligada ao analito são adicionados ao poço. PROCEDIMENTO (KITS PARA IMUNOENSAIOS EM CAMPO) Na etapa 3 o analito na amostra compete com o analito ligado a enzima pelos sítios de ligação no anticorpo. Esta e a etapa principal: quanto maior a concentração do analito na amostra desconhecida, mais ele se ligara ao anticorpo e menos o analito ligado a enzima será capaz de se ligar. Após um período de incubação a amostra não ligada e o padrão são removidos por lavagem. 11
PROCEDIMENTO (KITS PARA IMUNOENSAIOS EM CAMPO) Na etapa 4 uma substância cromogênica e adicionada ao poço. Trata-se de uma substância incolor que reage na presença da enzima, produzindo um composto colorido. PROCEDIMENTO (KITS PARA IMUNOENSAIOS EM CAMPO) Na etapa 5 o produto colorido e determinado visualmente, por comparação com padrões, ou quantitativamente, com um espectrofotômetro. Quanto maior a concentração do analito na amostra desconhecida, mais clara será a cor na etapa 5. 12
EXERCÍCIOS (1) As absortividades molares de X e Y foram determinadas com amostras puras de cada um deles: Uma mistura de X e Y em uma cubeta de 1,000 cm apresentou absorvância A = 0,957 em 272 nm, e A = 0,559 em 327 nm. Determine as concentrações de X e Y na mistura. (2) A transferrina e a proteína transportadora de ferro encontrada no sangue. Possui uma massa molecular de 81 000 e transporta dois íons Fe 3+. A desferrioxamina B e um poderoso agente quelante de ferro usado no tratamento de pacientes com excesso de ferro no organismo. Possui uma massa molecular de cerca de 650, e cada molécula pode se ligar a um íon Fe 3+. A desferrioxamina pode retirar o ferro do sangue de várias regiões do corpo, e e excretada (com o ferro ligado) pelos rins. As absortividades molares desses compostos (saturados com ferro) em dois comprimentos de onda são vistas na tabela a seguir. Ambos os compostos são incolores (nenhuma absorção no visível) na ausência de ferro. 1 (a) Uma solução de transferrina apresenta uma absorvância de 0,463 em 470 nm numa célula de 1,000 cm de caminho o ptico. Calcule a concentração de transferrina em mg/ml e a concentração de ferro em µg/ml. (b) Após a adição de desferrioxamina (que dilui a amostra), a absorvância em 470 nm foi de 0,424 13