Curso: FARMÁCIA Disciplina: Bioquímica Clínica Título da Aula: Doseamento de Uréia, Creatinina, AST e ALT. Professor: Dr. Fernando Ananias NOME: RGM: ATIVIDADE PRÁTICA 2 1) DETERMINAÇÃO DE URÉIA E CREATININA URÉIA ES Princípio A uréia é determinada de acordo com as seguintes reações: Urease Uréia + 4 H 2 O NH + 3 + CO 2 + 3 H 2 O Nitroprussiato (NP) NH + 3 + fenil formiato de sódio + hipoclorito dicarboxi indofenol (azul de indofenol) A intensidade da cor formada é diretamente proporcional à concentração de uréia na amostra. Materiais e Métodos Metodologia: Enzimático-colorimétrico (Berthelot) Amostra: Soro, plasma ou urina (diluída 1/100). A uréia na amostra é estável por vários dias entre 2-8º C, entretanto não é recomendado, principalmente nas amostras de urina, para evitar a contaminação bacteriana. Procedimento Em 3 tubos marcados B (Branco), P (Padrão) e T (teste), pipetar: BRANCO TESTE PADRÃO Amostra - 10 µl - Padrão - - 10 µl Uréase Tamponada 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml Misturar e incubar 5 min a 37 o C. Adicionar a seguir Oxidante de uso 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml Misturar e incubar 5 min a 37 o C
O nível da água no banho deve ser superior ao nível do reagente nos tubos de ensaio. Determinar as absorbâncias do teste e padrão em 600 nm acertando o zero com o branco. A cor é estável por até 2 horas. Cálculos Soro ou plasma Uréia (mg/dl) = teste do. padrão x 70 soro: 10-50 mg/dl Urina: 15-30 g/24hs CREATININA Princípio A creatinina reage com a solução de picrato em meio alcalino, formando um complexo vermelho que é quantificado espectrofotometricamente. A adição de um acidificante abaixa o ph para 5,0 promovendo a decomposição do picrato de creatinina, permanecendo inalterada a cor derivada dos cromogênios que também é quantificado espectrofotometricamente. A diferença entre as duas leituras fornece o valor da creatinina verdadeira. meio alcalino Creatinina + picrato --------------------> complexo vermelho (picrato de creatinina) medir espectrofotometricamente acidificante picrato de creatinina -------------------> picrato + creatinina Medir espectrofotometricamente. A diferença entre as duas leituras fornece o valor da creatinina verdadeira. Materiais e Métodos Metodologia: químico-colorimétrico (Labtest) de ponto final Amostra: Soro, plasma (heparina, EDTA, fluoreto, oxalato e citrato). As amostras de urina de 24 h devem ser conservadas em geladeira durante todo o período da colheita. Para o clearence de creatinina, dosar a creatinina do soro e da urina utilizando as metodologias propostas. O sangue pode ser obtido em qualquer momento do período da colheita da urina. Procedimento Para a dosagem na urina, diluir a amostra 1:25 (0,2 ml de urina + 4,8 ml de água destilada). Multiplicar o resultado obtido por 25 (fator de diluição). Em 3 tubos marcados B (Branco), P (Padrão), T1 (teste soro 1), pipetar: BRANCO T1 PADRÃO tampão no 2 2,0 ml 2,0 ml 2,0 ml Soro - 0,25 ml - água destilada 0,25 ml - - Padrão - - 0,25 ml
ácido pícrico 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml Misturar e colocar em banho-maria à 37 o C, durante 10 minutos. Determinar as absorbâncias dos testes e do padrão em 510 nm, acertando o zero com o branco. As absorbâncias dos testes será A1 Acidificante 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml Misturar e deixar na temperatura ambiente durante 5 minutos Determinar as absorbâncias dos testes em 510 nm, acertando o zero com o branco. As absorbâncias dos testes será A2 O nível da água no banho deve ser superior ao nível do reagente nos tubos de ensaio. Cálculos Creatinina no soro (mg/ dl) = A1 A2 do. padrão x 4 Soro: 0,4-1,3 mg/dl Urina: homens: 21-26 mg/kg peso/24hs Mulheres: 16-22 mg/kg peso/24 hs Clearence de Creatinina (Depuração de Creatinina) Aplicar os resultados (soro e urina) na equação abaixo Depuração (ml/ minuto) = S U x VM Onde: U = creatinina na urina (mg/ dl) S = creatinina no soro (mg/ dl) VM = volume minuto (volume de 24 h, em ml, dividido por 1440) A depuração deverá ser corrigida pela a superfície corporal do paciente que é obtida através de nomograma correlacionando peso-altura. Multiplicar o valor da depuração por 1,73 e dividir pela superfície corporal do paciente. Volume urinário em 24 h = ml Volume urinário por minuto = ml/ min. Creatinina sérica = mg/ dl Creatinina urinária = mg/ dl Clearence de creatinina sem corrigir pela superfície corporal = ml/ min. Clearence de creatinina corrigido pela superfície corporal = ml/ min/ m 2
Linearidade: A reação é linear até 12 mg/ dl. Para valores maiores, diluir a amostra com NaCl 150 mmol/ L. Homens: 97 127 ml/ min./ 1,73m 2 Mulheres: 88-128 ml/ min./ 1,73 m 2 2) DOSAGENS DE MARCADORES DE FUNÇÃO HEPÁTICA TRANSAMINASES E FOSFATASE ALCALINA. TRANSAMINASES Determinação da atividade transaminase glutâmico-oxalacética (TGO ou GOT), também conhecida como AST (aspartato aminotransferase) e transaminase glutâmico-pirúvica (TGP ou GPT) também conhecida como ALT (alanina aminotransferase), no soro sangüíneo. Fundamento do método: A AST catalisa a seguinte reação: aspartato + alfa-cetoglutarato glutamato + oxaloacetato A ALT catalisa a seguinte reação: alanina + alfa-cetoglutarato glutamato + piruvato O piruvato formado (o oxalacetato é instável e transforma-se parcialmente em piruvato), reage com o reativo 2,4 DNFH (2,4-dinitrofenilhidrazina), produzindo-se em meio alcalino, um composto colorido que é medido a 505 nm. Colorimetria: Em dois tubos marcar: AST ALT Reagente de Trabalho (1) 1,0 ml - AST Reagente de Trabalho (2) ALT - 1,0 ml Colocar em banho-maria 37º C por 2 minutos. Adicionar: Soro 0,1 ml 0,1 ml Misturar e incubar em BM a 37º C por 5 minutos. Adicionar, mantendo intervalo de 30 segundos entre um tubo e outro. Fazer a leitura da absorbância inicial (A1) Misturar e deixar em repouso por 20 minutos à temperatura ambiente. Adicionar, mantendo intervalo de 30 segundos entre um tubo e outro.disparando imediatamente o cronômetro. Repetir a leitura após 2 minutos (A2)
Ler em espectrofotômetro a 350 nm, zerando o aparelho com água destilada. A cor da reação é estável por 30 minutos. Cálculos: A/minuto (Teste) = (A1 A2)/2 Atividade da enzima = A/minuto(Teste) x 1746 Mulheres: 10 37 U/L Homens: 11 39 U/L ATIVIDADE Considere um paciente do sexo masculino com os seguintes resultados: Volume urinário em 24 h = 2140 ml Creatinina sérica = 1,2 mg/ dl Creatinina urinária = 98 mg/ dl Altura: 1,82 Peso: 79 k Depuração/Clearance da Creatinina Clearance (ml/min/área superficial) = U x V. 1, 73 S A U = creatinina urinária (mg/dl) V = volume de urina por tempo cronometrado (min.). Volume dividido pelo tempo em min. S = creatinina sérica (mg/dl) A = área de superfície corporal (peso-altura). Calcula-se: A= P 0,425 x A 0,725 x 0,007184 Calcule o Clearence de creatinina, compare com os valores referência e levante alguns possíveis diagnósticos para esse paciente.