/11 1. APLICAÇÃO

Platelia Rubella IgG 1 placa 96 72850 DETECÇÃO QUANTITATIVA DE ANTICORPOS IgG PARA VIRUS DA RUBEOLA EM SORO OU PLASMA HUMANO POR ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO 881141 2013/11 1. APLICAÇÃO O ensaio Platelia Rubella IgG é um ensaio imunoenzimático ELISA indirecto para a detecção quantitativa de anticorpos IgG para rubéola vírus em soro ou plasma humano. 2. VALOR CLÍNICO A rubéola é uma doença de etiologia viral, disseminada pelo mundo inteiro. A infecção pela rubéola apresenta-se quase sempre benigna na criança ou no adulto. As manifestações clínicas desta doença são: febre moderada, dores de cabeça, dores de garganta e uma erupção cutânea generalizada. Contudo, esta doença é mais grave no caso de infecção na mulher grávida, com várias complicações congénitas devidamente documentadas, incluindo surdez, cataratas, atraso mental e morte do feto. A vacinação das crianças até aos 4 anos de idade permitiu reduzir, de forma significativa, a incidência das epidemias de rubéola, mas ainda existe a necessidade de uma monitorização precisa da estado imunitário, especialmente para mulheres em idade de conceber. A detecção de anticorpos de classe IgG contra a rubéola nas mulheres, antes da sua gravidez, assegura a protecção do feto de uma possível infecção viral da rubéola no decorrer da gravidez. A eficácia da vacinação é demonstrada comprovando-se a presença de anticorpos de classe IgG contra a rubéola no soro, após imunização. O isolamento do vírus da rubéola foi realizado em 1962; a detecção dos anticorpos específicos contra este vírus é importante, dado o risco teratogénico do virus. Foram desenvolvidos diversos métodos de teste, incluindo a neutralização sérica, a fixação do complemento e a técnica de imunofluorescência. Estes métodos são de realização delicada num meio laboratorial de rotina ou geram resultados irregulares ou instáveis. As técnicas de inibição da hemaglutinação vieram permitir um diagnóstico rápido da infecção aguda, bem como do estado imunitário dos doentes. Em 1971, Engvall e Perlmann descreveram os primeiros testes imunoenzimáticos. O desenvolvimento de tais métodos veio a contribuir para melhorar a especificidade e a sensibilidade das técnicas de detecção de uma ampla variedade de antigénios e de anticorpos. As interpretações de sucessivos testes serológicos, demonstrando a presença de IgM, o aparecimento ou um aumento significativo do título de anticorpos IgG (duplicação do título) nas duas amostras séricas obtidas num intervalo mínimo de três semanas, devem ser consideradas como provas da exposição ao vírus da rubéola, mesmo no caso da inexistência de sinais patognomónicos clínicos desta infecção. 3. PRINCÍPIO O ensaio Platelia Rubella IgG é um teste quantitativo para a detecção de anticorpos IgG para a Rubéola virus em soro ou plasma humano utilizando um método imunoenzimático ELISA indirecto. Os antigénios da rubéola virus são utilizados para revestir a microplaca. Um anticorpo monoclonal marcado com peroxidase, o qual é específico para cadeias gama humanas (anti-igg), é utilizado como conjugado. O teste utiliza as seguintes etapas: Etapa 1 As amostras dos pacientes e calibradores são diluídos 1/21 e depois distribuídos pelos poços da microplaca. Durante esta incubação de uma hora a 37 C, os anticorpos IgG para rubéola virus presentes na amostra unem-se ao antigénio rubéola revestido nos poços da microplaca. Após a incubação, os anticorpos não específicos e outras proteínas séricas não ligadas são removidos por lavagem. Etapa 2 O conjugado (anticorpo monoclonal marcado com peroxidase específico para cadeias gama humanas) é adicionado aos poços da microplaca. Durante esta incubação de uma hora a 37 C, o anticorpo monoclonal marcado une-se ao soro IgG capturado pelo antigénio rubéola. O conjugado não ligado é removido por lavagens no fim da incubação. Etapa 3 A presença de imunocomplexos (antigénio rubéola, anticorpos IgG para rubéola virus, conjugado anti-igg) é demonstrada pela adição em cada poço de uma solução de desenvolvimento enzimática. Etapa 4 Após a incubação a temperatura ambiente (entre +18 C e +30 C), a reacção enzimática é parada pela adição de uma solução 1N de ácido sulfúrico. A leitura da densidade óptica obtida com um espectrofotómetro a 450/620 nm é proporcional à quantidade de anticorpos IgG para a Rubéola virus presente na amostra. IU/ml através do uso de uma curva calibrada de encontro WHO International Standard RUBI 1-94. 1

4. INFORMAÇÃO DO PRODUTO As quantidades fornecidas de reagentes foram calculadas para permitir 96 testes. Todos os reagentes são exclusivamente para utilização em diagnóstico in vitro. Etiquetagem Natureza dos reagentes Apresentação R1 R2 Microplate Concentrated Washing Solution (20x) R3 Calibrator 0 R4a Calibrator 15 R4b Calibrator 60 R4c Calibrator 200 R6 R7 R9 Conjugate (51x) Diluent Chromogen TMB Microplaca (pronta para utilização) 12 tiras com 8 poços quebráveis, revestidos com antigénio rubéola inactivo Solução de lavagem concentrada (20x) Tampão TRIS-NaCl (ph 7,4), 2% Tween 20 Conservante: 0,04% ProClin 300 Calibrador 0 : Soro negativo para anticorpos IgG para rubéola Conservante: 0,1% ProClin 300 Calibrador 15 UI/ml: Soro humano reactivo para anticorpos IgG para Rubéola e negativo para antigénio HBs, anti-hiv1, anti- HIV2 e anti- HCV Conservante: 0,1% ProClin 300 Calibrador 60 UI/ml: Soro humano reactivo para anticorpos G para Rubéola e negativo para antigénio HBs, anti-hiv1, anti- HIV2 e anti- HCV Conservante: 0,1% ProClin 300 Calibrador 200 UI/ml: Soro humano reactivo para anticorpos G para Rubéola e negativo para antigénio HBs, anti-hiv1, anti- HIV2 e anti- HCV Conservante: 0,1% ProClin 300 Conjugado (51x) Anticorpo monoclonal murino anti-cadeias gama humanas marcado com peroxidase Conservante: 0,16% ProClin 300 Diluente para amostras e conjugados (prontos para utilização) Tampão Tris-NaCl (ph 7,6), glicerol, 0,1% Tween 20, vermelho de fenol Conservante: 0,15% ProClin 300 Cromogénio (pronto para utilização) 3,3,5,5 tetrametilbenzidina (< 0,1%), H 2 O 2 (<1%) 1 1 x 70 ml 1 x 0,75 ml 1 x 0,75 ml 1 x 0,75 ml 1 x 0,75 ml 1 x 0,7 ml 1 x 80 ml 1 x 28 ml R10 Stopping Solution Solução de paragem (pronta para utilização) Solução de ácido sulfúrico 1N 1 x 28 ml Consulte as indicações da caixa para obter informações sobre as condições de armazenamento e data de validade. 5. ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES A fiabilidade dos resultados depende da implementação correcta das boas práticas de laboratório indicadas a seguir: Não utilize reagentes cujo prazo de validade tenha expirado. Não misture nem associe dentro de um dado ensaio analítico reagentes provenientes de diferentes lotes. OBSERVAÇÃO: Para a solução de lavagem (R2, identificação da etiqueta: 20x cor verde), Cromogénio (R9, identificação da etiqueta: TMB cor turquesa) e solução de paragem (R10, identificação da etiqueta: 1N cor vermelha), é possível utilizar outros lotes para além dos incluídos no kit, desde que estes reagentes sejam estritamente equivalentes e o mesmo lote seja utilizado dentro do mesmo ensaio analítico do teste. OBSERVAÇÃO: Não é possível usar o diluente (R7) provenientes de outros lotes, Também não é possível usar o diluente (R7) do Platelia Rubella IgM kits (Ref. 72851). OBSERVAÇÃO: Para além disso, a solução de lavagem (R2, identificação do rótulo : cor verde 20x) pode ser misturada com as outras 2 soluções de lavagem incluídas nos kits de reagentes Bio-Rad (R2, identificações dos rótulo: cor azul 10x ou cor laranja 10x) quando adequadamente reconstituídas, desde que apenas uma mistura seja utilizada num determinado ensaio. 2

Antes da utilização, espere 30 minutos para que os reagentes atinjam a temperatura ambiente (+18 C a +30 C). Proceda cuidadosamente à reconstituição ou diluição dos reagentes evitando possíveis contaminações. Não realize o teste na presença de vapores reactivos (vapores ácidos, alcalinos ou aldeídicos) ou poeira que possa alterar a actividade enzimática do conjugado. Utilize material de vidro bem lavado e enxaguado com água desionizada ou, de preferência, material descartável. A lavagem da microplaca é um passo crucial no procedimento: siga o número recomendado de ciclos de lavagem e certifique-se de que os poços enchem completamente sendo, em seguida, completamente esvaziados. As lavagens incorrectas podem levar a resultados imprecisos. Não deixe a microplaca secar entre o fim da operação de lavagem e a distribuição dos reagentes. Nunca utilize o mesmo recipiente para distribuir o conjugado e a solução de desenvolvimento. A reacção enzimática é muito sensível à presença do metal ou de iões metálicos. Consequentemente, não permita que nenhum elemento metálico entre em contacto com as várias soluções que contenham o conjugado ou o cromogénio. A solução de cromogénio (R9) deve ser incolor. A presença de uma cor azul indica que o reagente não pode ser utilizado, devendo este ser substituído. Utilize uma nova ponta de pipeta para cada amostra. Verifique as pipetas e outros equipamentos para o funcionamento preciso e correcto. Instruções relativas à saúde e segurança O material de origem humana utilizado na preparação dos reagentes foi testado e considerado não reactivo para o antigénio de superfície da hepatite B (HBs Ag), anticorpos para o vírus da hepatite C (anti-hcv) e para os vírus da imunodeficiência humana (anti-hiv1 e anti-hiv2). Porque nenhum método pode garantir em absoluto a ausência de agentes infecciosos, manuseie os reagentes de origem humana e as amostras de pacientes como possíveis transmissores de doenças infecciosas. Qualquer material, incluindo soluções de lavagem, que entre em contacto directo com amostras ou reagentes contendo materiais de origem humana deve ser considerado como possível transmissor de doenças infecciosas. Utilize luvas descartáveis ao manusear as amostras e os reagentes. Não pipete com a boca. Evite derrames de amostras ou de soluções que contenham amostras. Os derrames devem ser lavados com lixívia diluída a 10%. No caso de derrame de um ácido, este deve ser primeiro neutralizado com bicarbonato de sódio e depois lavado com lixívia diluída a 10% e seco com papel absorvente. O material utilizado na limpeza deve ser eliminado num recipiente de resíduos contaminados. As amostras dos pacientes, os reagentes contendo material de origem humana, assim como os materiais e produtos contaminados devem ser eliminados após descontaminação apenas: - por imersão em lixívia a uma concentração final de 5% de hipoclorito de sódio durante 30 minutos; - ou por autoclavagem a 121 C durante 2 horas no mínimo. ATENÇÃO: Não introduza soluções contendo hipoclorito de sódio na autoclave Evite qualquer contacto dos reagentes, mesmo dos considerados não perigosos, com a pele e as mucosas. Os resíduos químicos e biológicos devem ser manuseados e eliminados de acordo com as boas práticas de laboratório. Todos os reagentes incluídos no kit são exclusivamente para utilização em diagnóstico in vitro. Para obter recomendações relativas a perigos e precauções relacionadas com alguns componentes químicos neste kit de teste, consulte as ilustrações indicadas nos rótulos e as informações fornecidas no final das instruções de utilização. A Ficha de Dados de Segurança encontra-se disponível em www.bio-rad.com. 6. RECOLHA DO ESPÉCIME, PREPARAÇÃO E ARMAZENAMENTO 1. O soro e o plasma (EDTA, heparina ou citrato) são os tipos de amostra recomendados. 2. Observe as seguintes recomendações para o manuseamento, processamento e armazenamento das amostras de sangue: Recolha todas as amostras de sangue com precaução de rotina durante a venipunctura. No soro, permita que as amostras coagulem completamente antes da centrifugação. Mantenha sempre os tubos fechados. Após a centrifugação, separe o soro ou plasma do coágulo ou glóbulos vermelhos num tubo de armazenamento bem fechado. Os espécimes podem ser armazenados entre 2 C e 8 C se o teste for realizado dentro de 7 dias. Se o teste não for concluído ou enviado para transporte dentro de 7 dias, congele as amostras a pelo menos -20 C. Não utilize amostras que tenham sido descongeladas mais do que cinco vezes. Os espécimes previamente congelados devem ser eficazmente homogeneizados (vórtice) após descongelação, antes de serem testados. 3. As amostras contendo 90 g/l de albumina ou 100 mg/l de bilirrubina não conjugada, as amostras lipémicas contendo o equivalente a 36 g/l de trioleína (triglicerídeo) e as amostras hemolisadas contendo até 10 g/l de hemoglobina não afectam os resultados. 4. As amostras não devem ser aquecidas. 3

7. PROCEDIMENTO DO ENSAIO 7.1 Materiais necessários não fornecidos Agitador de vórtice. Leitor de microplacas equipado com filtros de 450 nm e 620 nm (*). Incubadora de microplaca termostaticamente definida para 37±1 C (*). Lavador de microplacas automático, semi-automático ou manual (*). Água destilada ou desionizada esterilizada. Luvas descartáveis. Viseira ou óculos de protecção. Papel absorvente. Pipetas ou multipipetas automáticas ou semi-automáticas, ajustáveis ou predefinidas para medir e distribuir 10 µl a 1000 µl e 1 ml, 2 ml e 10 ml. Provetas graduadas com capacidade de 25 ml, 50 ml, 100 ml e 1000 ml. Hipoclorito de sódio (lixívia) e bicarbonato de sódio. Recipiente para resíduos de risco biológico. Tubos descartáveis. (*) Consulte o nosso departamento técnico para obter informações detalhadas relativamente ao equipamento recomendado. 7.2 Reconstituição dos reagentes R1: Mantenha os reagentes durante 30 minutos a temperatura ambiente (entre +18 C e +30 C) antes de abrir o saco. Retire o tabuleiro de transporte, devolva imediatamente as tiras não utilizadas no saco e verifique a presença de dissecante. Torne a selar cuidadosamente o saco e armazene-o a uma temperatura entre +2 C e 8 C. R2: Dilua 1/20 de solução de lavagem R2 em água destilada: por exemplo 50 ml de R2 e 950 ml de água destilada para obter a solução de lavagem pronta para utilização. Se lavar manualmente, prepare 350 ml de solução de lavagem diluída para uma placa de 12 tiras. R3, R4a, R4b, R4c: Dilua 1/21 em diluente (R7) (exemplo: 15 µl de R3 + 300 µl de R7). R6+R7: O conjugado (R6) encontra-se concentrado a 51x e deve ser homogeneizado antes de ser utilizado. Dilua 1/51 em diluente (R7). Para uma placa, dilua 0,5 ml de conjugado (R6) em 25 ml de diluente (R7). Divida estes volumes por 10 para obter o volume necessário para uma tira. 7.3 Armazenamento e validade dos reagentes abertos e/ou reconstituídos O kit deve ser armazenado a uma temperatura entre +2 C e +8 C. Quando o kit é armazenado entre +2 C e +8 C antes de ser aberto, cada componente pode ser utilizado até à data de validade indicada na etiqueta externa do kit. R1: Uma vez aberto o kit, as tiras permanecem estáveis durante 8 semanas se forem armazenadas entre +2 C e +8 C no mesmo saco cuidadosamente fechado (verifique a presença de dissecante). R2: Uma vez diluída, a solução de lavagem pode ser guardada durante 2 semanas a uma temperatura entre +2 C e +30 C. A solução de lavagem concentrada armazenada a uma temperatura entre +2 C e +30 C, na ausência de contaminação, é estável até à data de validade indicada na etiqueta. R3, R4a, R4b, R4c, R6, R7: Uma vez abertos e sem qualquer contaminação, os reagentes armazenados a uma temperatura entre +2 C e +8 C são estáveis durante 8 semanas. R6+R7: Uma vez diluída, a solução de acção conjugada é estável durante 8 horas a temperatura ambiente (entre +18 C e +30 C) ou durante 2 semanas a uma temperatura entre +2 C e +8 C. R9: Uma vez aberto e sem qualquer contaminação, o reagente armazenado a uma temperatura entre +2 C e +8 C é estável durante 8 semanas. R10: Uma vez aberto e sem qualquer contaminação, o reagente armazenado a uma temperatura entre +2 C e +8 C é estável até à data de validade indicada na etiqueta. 7.4 Procedimento Siga rigorosamente o procedimento de ensaio e as boas práticas de laboratório. Antes da utilização, dê tempo suficiente para que os reagentes atinjam a temperatura ambiente (entre +18 C e +30 C). O uso de poços quebráveis requer uma atenção especial durante o respectivo manuseamento. Utilize todos os calibradores em cada ensaio analítico para validar os resultados do ensaio. 1. Estabeleça cuidadosamente o plano de distribuição e identificação para os calibradores e amostras dos pacientes. 2. Prepare a solução de lavagem diluída (R2) [consulte a secção 7.2]. 3. Retire o tabuleiro de transporte e as tiras (R1) dos respectivos invólucros [consulte a secção 7.2]. 4. Dilua os calibradores R3, R4a, R4b, R4c e as amostras dos pacientes (S1, S2 ) em diluente (R7) para obter uma diluição 1/21: 15 µl de amostra e 300 µl de diluente (R7) [consulte a secção 7.2]. Agite as amostras diluídas no vórtice. 5. Seguindo rigorosamente a sequência indicada abaixo, distribua 200 µl de calibradores e amostras de pacientes diluídas em cada poço: 4

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A R3 S5 S13 B R4a S6 C R4b S7 D R4c S8 E S1 S9 F S2 S10 G S3 S11 H S4 S12 6. Cubra a microplaca com um selante de placa adesivo e prima firmemente a placa para assegurar uma selagem perfeita. Incube imediatamente a microplaca num banho de água controlado por termóstato ou numa incubadora seca durante 1 hora 5 minutes a 37 C 1 C. 7. No fim da primeira incubação, prepare a solução de acção conjugada (R6+R7) [consulte a secção 7.2]. 8. No final da primeira incubação, remova o selante de placa adesivo. Aspire o conteúdo de todos os poços para um recipiente de resíduos de risco biológico (contendo hipoclorito de sódio). Lave a microplaca 4 vezes com 350 µl de solução de lavagem (R2). Inverta a microplaca e passe cuidadosamente o papel absorvente para remover o líquido restante. 9. Distribua 200 µl de solução de acção conjugada (R6+R7) em todos os poços. A solução deve ser agitada suavemente antes de ser utilizada. 10. Cubra a microplaca com um selante de placa adesivo e prima firmemente a placa para assegurar uma selagem perfeita. Incube imediatamente a microplaca num banho de água controlado por termóstato ou numa incubadora seca durante 1 hora 5 minutes a 37 C 1 C. 11. No final da segunda incubação, remova o selante de placa adesivo. Aspire o conteúdo de todos os poços para um recipiente de resíduos de risco biológico (contendo hipoclorito de sódio). Lave a microplaca 4 vezes com 350 µl de solução de lavagem (R2). Inverta a microplaca e passe cuidadosamente o papel absorvente para remover o líquido restante. 12. Num local escuro, distribua rapidamente em cada poço 200 µl de solução de cromogénio (R9). Deixe a reacção ocorrer no escuro, durante 30 minutos ± 5 minutos a uma temperatura ambiente (entre +18 C e +30 C). Não utilize selante de placa adesivo durante esta incubação. 13. Pare a reacção enzimática adicionando 100 µl de solução de paragem (R10) em cada poço. Utilize a mesma sequência e proporção de distribuição da solução de desenvolvimento. 14. Seque cuidadosamente o fundo da placa. Leia a densidade óptica a 450/620 nm, utilizando um leitor de placa, nos 30 minutos após ter parado a reacção. As tiras devem sempre ser guardadas longe da luz antes da leitura. 15. Antes de relatar os resultados, verifique a consonância entre a leitura e o plano de distribuição da placa e amostras. 8 CÁLCULO E INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS 8.1 Construção da curva padrão A presença e concentração de anticorpos IgG para o rubéola virus numa amostra serão determinadas por comparação de densidade óptica (DO) dessa amostra relativamente à concentração em unidades internacionales por milílitro (UI/ml) dos calibradores da curva padrão. O ensaio Platelia Rubella IgG está padronizado relativamente à WHO International Standard RUBI 1-94. Desenhe a curva padrão [DO = função (UI/ml)] colocando as leituras de DO dos calibradores R3, R4a, R4b e R4c no eixo vertical (Y) e, em seguida, as respectivas concentrações em UI/ml no eixo horizontal (X). Para cada amostra testada, calcule a titulação de anticorpos IgG anti-rubéola determinando, a partir da curva padrão desenhada, a concentração correspondente à DO medida. Nota: se a DO da amostra for superior à DO de R4c, a amostra pode ser diluída a 1/210 em R7 e novamente testada. Nesse caso, multiplicar por 10 o valor em UI/ml obtido no eixo dos X. 8.2 Controlo de qualidade Inclua todos os calibradores para cada microplaca e para cada ensaio analítico, e analise os resultados obtidos. Para a validação do ensaio, devem ser reunidos os seguintes critérios: Valores da densidade óptica: - DO R4a 0,200 - DO R4b 0,400 Razões da densidade óptica: - DO R4a / DO R3 5,00 - DO R4b / DO R4a 1,50 - DO R4c / DO R4b 1,20 Se estes critérios de controlo de qualidade não forem reunidos, deve repetir-se o ensaio analítico do teste. 5

8.3 Interpretação dos resultados Titulação de anticorpos anti-rubéola (Unidades Internacionales/ml Resultado Interpretação Titulação < 10 UI/ml Negativo Um resultado negativo ou ambíguo indica a ausência de imunidade adquirida, mas não pode excluir uma infecção 10 UI/ml Titulação < 15 UI/ml Titulação 15 UI/ml Ambígua Positivo recente. Se houver suspeitas de contaminação de um paciente, deverá ser analisada uma segunda amostra cerca de duas semanas depois. Um resultado positivo é, geralmente, indicador de uma infecção passada. No entanto, não poderá ser excluída a hipótese de infecção recente, em especial se estiverem presentes anticorpos IgM anti-rubéola. Acima de concentrações de 150 UI/ml, pode observar-se uma maior variação de titulações. 8.4 Guia de detecção e resolução de problemas As reacções não validadas ou impossíveis de repetir são frequentemente causadas por: Lavagens inadequadas da microplaca. Contaminação de amostras negativas com soro ou plasma com uma grande dose de anticorpos. Contaminação da solução de desenvolvimento com agentes oxidantes químicos (lixívia, iões metálicos...). Contaminação da solução de paragem. 9 DESEMPENHOS Foram avaliados os desempenhos do Platelia Rubella IgG em 2 locais num total de 952 amostras de mulheres grávidas e dadores de sangue. Foi feito um estudo comparativo com Platelia Rubella IgG TMB (72912); um segundo estudo foi feito noutro centro, comparando os desempenhos do Platelia Rubella IgG com outros testes EIA disponíveis no mercado. 9.1 Prevalência A prevalência de anticorpos IgG anti-rubéola utilizando o Platelia Rubella IgG foi calculada num painel de 322 amostras de mulheres grávidas monotorizadas durante a gravidez do norte de França. 289 amostras revelaram um resultado positivo para os anticorpos IgG anti-rubéola. A prevalência, medida através do ensaio Platelia Rubella IgG, foi estabelecida a 89,75% (289/322). 9.2 Estudo Comparativo (Centro 1) Foram avaliados os desempenhos do Platelia Rubella IgG num painel de 534 amostras divididas da seguinte forma: 414 soros de dadores de sangue 120 soros de mulheres grávidas Os resultados foram comparados com os obtidos utilizando Platelia Rubella IgG TMB (72912) e considerado como referência. Platelia Rubella IgG TMB (72912) Negativo Ambíguo* Positivo Total Negativo 149 0 0 149 Platelia Rubella IgG (72850) Ambíguo* 4 2 0 6 Positivo 0 2 377 379 Total 153 4 377 534 6

Concordância global: 526/526 100,0% [IC 95% = 99,3% - 100,0%] Especificidade relativa: 149/149 100,0% [IC 95% = 97,5% - 100,0%] Sensibilidade relativa: 377/377 100,0% [IC 95% = 99,0% - 100,0%] * Para cálculo da sensibilidade, da especificidade e de concordância, os resultados ambíguos foram excluidos. [IC 95%] = intervalo de confiança de 95%. Também foram estudados 50 soros de 7 vacinações (2 with MERUVAX II vacina, 5 with RUDIVAX vacina) foram avaliados com os dois testes : o aprecimento do anti-rubella de IgG é igual para os dois testes para os 6 dos 7 seguintes. o aperecimento IgG anti-rubeóla estava atrasado 5 dias com Platelia Rubeola IgG. 9.3 Desempenhos (Centro 2) 368 amostras foram estudadas com Platelia Rubeola IgG (72850) e foram divididos do seguinte modo: 44 crianças com menos de 18 anos (27 raparigas e 17 rapazes) 323 adultos (322 mulheres e 1 homem). Amostras de mulheres adultas grávidas ou pós-natal consultas nas semanas seguintes ao parto. 1 soro do controlo de qualidade nacional francês. Os resultados foram comparados com os obtidos através de um outro teste EIA disponível no mercado tomado como referência. Outro teste EIA disponível no mercado Negativo Ambíguo* Positivo Total Negativo 32 2 3 37 Platelia Rubella IgG (72850) Ambíguo* 7 7 6 20 Positivo 1 11 299 311 Total 40 20 308 368 Concordância global: 331/335 98,8% [IC 95% = 97,0% - 99,7%] Especificidade relativa: 32/33 97,0% [IC 95% = 84,2% - 99,9%] Sensibilidade relativa: 299/302 99,0% [IC 95% = 97,1% - 99,8%] * Para cálculo da sensibilidade, da especificidade e de concordância, os resultados ambíguos foram excluidos. [IC 95%] = intervalo de confiança de 95%. As amostras discrepantes foram obtidas através de testes 3º geração EIA. As 4 amostras foram confirmadas negativas com testes 3º geração EIA. 9.4 Reactividade cruzada Para detecção de anticorpos IgG anti-rubéola, foi testado com os ensaios Platelia Rubella IgG (72850) e Platelia Rubella IgG TMB (72912) um painel de 177 amostras, incluindo 147 amostras positivas à toxoplasmose, CMV, EBV, HSV, VZV, papeira, sarampo e VIH, e 30 amostras positivas ao factor reumatóide, auto-anticorpos e anticorpos heterófilos. Demntro das 10 amostras negativas com Platelia Rubeola IgG TMB (72912), 8 foram confirmadas negativas e 2 foram duvidosas com Platelia Rubeola IgG. 9.5 Precisão Precisão dentro da ocorrência (repetibilidade): 7

De forma a avaliar a repetibilidade intra-ensaio, foram testadas uma amostra negativa e três amostras positivas 32 vezes durante a mesma ocorrência. Foi determinada a concentração (UI/ml) para cada amostra. A média de concentrações (UI/ml), o desvio padrão (DP) e o coeficiente de variação (%CV) para cada um dos quatro espécimes são apresentados no quadro seguinte: Precisão dentro da ocorrência (repetibilidade) N=32 Amostra negativa baixa Concentração (UI/ml) alta Média 2,8 26,4 56,1 171,4 DP 0,1 1,4 2,8 14,0 %CV 3,8% 5,2% 5,0% 8,2% Precisão entre ocorrências (reproducibilidade): De forma a avaliar a reprodutibilidade inter-ensaio, cada um dos quatro espécimes (uma amostra negativa e três positivas) foram testados em duplicado em duas ocorrências por dia durante um período de 20 dias. Foi determinada a concentração (UI/ml) para cada amostra. A média de concentrações (UI/ml), o desvio padrão (DP) e o coeficiente de variação (%CV) para cada um dos quatro espécimes são apresentados no quadro seguinte: Precisão entre ocorrências (reproducibilidade) N=80 Amostra negativa baixa Concentração (UI/ml) alta Média 2,4 24,0 56,4 159,4 DP 0,8 2,7 4,6 19,9 %CV 35,6% 11,2% 8,2% 12,5% 9.6 Exactidão e Linearidade Para avaliar a exactidão da calibração foram feitas várias diluições com Standart Internacional WHO RUBI 1-94. Os resultados obtidos demonstraram que o Platelia Rubeola IgG esta calibrada de acordo com Standart Internacional WHO RUBI 1-94 para valores acima dos 60 IU/ml. A cima 60 IU/ml, resultados obtidos estão estimados a volta de 20%. Fazendo várias diluições sucessivas com 5 amostras, intervalo teste Platelia Rubella IgG foram establecida entre 10 e 150 UI/ml. 10 LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO O diagnóstico da infecção por virus do rubéola só pode ser estabelecido com base numa combinação de dados clínicos e biológicos. O resultado de um único teste de titulação de anticorpos anti-rubéola IgG não constitui prova suficiente para o diagnóstico de infecção recente pelo virus do rubéola. O diagnóstico de infecção recente só poderá ser feito com uma informação completa sobre o paciente, incluindo dados clínicos e biológicos (aumento significativo de anticorpos IgG anti-rubéola no soro de 2 pacientes colhido num intervalo de 3 semanas e testado na mesma análise, presença de IgM anti-rubéola a nível significativo, demonstração de baixa avidez de IgG anti-rubéola). A presença de anticorpos IgM anti-rubéola não constitui prova suficiente para confirmar uma infecção recente, visto que o IgM pode persistir vários meses, ou mesmo anos, após a infecção. Quando são detectados IgM, deverá ser realizada uma determinação quantitativa de anticorpos IgG anti-rubéola bem como um acompanhamento da evolução de anticorpos anti-rubéola em, pelo menos, uma segunda amostra de soro três semanas mais tarde. Se uma amostra for testada demasiado cedo durante uma primo-infecção, os anticorpos IgM anti-rubéola poderão não estar ainda presentes. Se existirem suspeitas, deverá ser colhida uma segunda amostra cerca de 3 semanas mais tarde, a qual deverá ser sujeita a novo teste IgM. 11 CONTROLO DE QUALIDADE DO FABRICANTE Todos os reagentes fabricados são preparados de acordo com o nosso sistema de qualidade, desde a recepção da matériaprima até à comercialização do produto final. Cada lote é submetido a testes de controlo de qualidade e só é introduzido no mercado quando estiver em conformidade com os critérios de aceitação predefinidos. Os registos de produção e de controlo de cada lote são mantidos no seio da Bio-Rad. 8

12 REFERÊNCIAS 1. COOPER, L.Z., BUIMOVICI-KLEIN, E. 1985. : Rubella. In Virology: 1005-1020. Edited by Fields, B.N., et al. New York, New York: Raven Press. 2. DORSETT, P.H., MILLER, D.C., GREEN, K., BYRD, F. 1985. : Structure and function of the Rubella virus proteins. Reviews of Infect. Dis., 7 (Suppl. 1): S 150-S 156. 3. FORSGREN, M. 1985. : Standardization of techniques and reagents for the study of Rubella antibody. Rev. Infect. Dis., 7 (Suppl. 1): S 129-S 132. 4. KALKKINEN, N., OKER-BLOM, C., AND PETTERSSON, R.F. 1984. : Three genes code for Rubella virus structural proteins El. E2a, E2b, and C. J. Gen. Virol, 65: 1549-1557. 5. LUCAS, G., et al. April 17-20, 1989. : Serological diagnosis of IgG immunoglobulins ant-rubella by immunoenzymatic assay in a commercially available kit. Nice: 4th European Congress of Clinical Microbiology. 308/PP20. 6. MAURIN, J. 1985. : Le virus de la rubéole. Bulletin de l Institut Pasteur 1969, 67, 483-502. Virologie médicale, chap. 34, 586-604. Flammarion Médecine Sciences. 7. NCCLS Document I/LA6-T Tentative Guideline December 1992 : Evaluation and Performance Criteria for Multiple Component Test and Product intended for the Detection and Quantitation of Rubella IgG Test Products. 8. PETTERSSON, R., et al. 1985. : Molecular and antigenic characteristics and synthesis of Rubella virus structural proteins. Reviews of Infect. Dis., 7 (Suppl. 1): S 140-S 149. 9. WOLINSKY J.S. : Rubella. In Virology, 1990, 2nd Ed. 815-38. Edited by Fields, B.N., and al. New York: Raven Press, Ltd. 9

10

Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincare 92430 Marnes-la-Coquette - France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 2013/11 Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33 881141 www.bio-rad.com 11