ADESÃO E CAPACIDADE OSTEOGÊNICA DE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS DERIVADAS DE TECIDO ADIPOSO DE CÃES ASSOCIADAS A ALFA FOSFATO TRICÁLCICO POROSO

ADESÃO E CAPACIDADE OSTEOGÊNICA DE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS DERIVADAS DE TECIDO ADIPOSO DE CÃES ASSOCIADAS A ALFA FOSFATO TRICÁLCICO POROSO Autor: Rafael da Silva Cezar Orientadora: Maiele Dorneles Resumo As células-tronco mesenquimais (MSC's) são adequadas para a engenharia de tecidos, neste trabalho foram isoladas, caracterizadas e associadas ao biomaterial α-tcp poroso, MSC's caninas, mostrando-se promissoras para tratamentos regenerativos ósseos. Palavras-chave: Células-tronco, Cimento de alpha-fosfato tricálcico, Osteogênese, Engenharia de tecidos. Área Temática: Ciências da Saúde (SD). 1. Introdução As células-tronco consistem de uma população heterogênea de células aderentes, que são capazes de autorrenovação (Nardi, 2005; Bunnell, 2008; Samsonraj, 2013) e na geração de pelo menos um tipo de célula diferenciada. Isto significa que estas células têm a capacidade de se dividirse em tipos de células idênticas ou especializadas, que podem ser aplicadas para o de tratamento para várias doenças que requerem a reparação de tecidos (Hamze et al., 2009). Células-tronco mesenquimais (MSCs), um tipo de células-tronco adultas, mostraram plasticidade e são imunorreguladoras, o que é desejável para aplicações médicas regenerativas (Kim et al., 2014). Como estas células são imunomoduladores, eles também podem ser transplantadas de um indivíduo da mesma espécie para outra (Laffey et al., 2012). Células-tronco adiposo derivadas (ADSCs) são abundantes, células-tronco adultas de fácil obtenção, com características semelhantes às células-tronco da medula óssea derivadas, mas em comparação, suas colônias celulares são mais homogêneas e mais fácil de manter em cultura (Ahn, 2014). Esta é uma vantagem significativa, uma vez que é importante purificar e expandir a fração de células-tronco iniciais por cultivo antes da utilização terapêutica. O cultivo pode, contudo, induzir alterações indesejadas na biologia básica e o potencial reparador das células (Rubio et al., 2005). O uso destas células, ou seja, terapia celular, é uma estratégia promissora para o tratamento de uma variedade de doenças em animais, por exemplo, lesões ósseas, cartilaginosas e feridas que não respondem às abordagens terapêuticas convencionais (Spaas et al., 2013). Ensaios clínicos já demonstraram o potencial terapêutico dessas células, e que são incluídos, por exemplo em estudos de engenharia de tecidos. As ADSCs podem ser associadas com biomateriais e biomoléculas, em que os biomateriais agem como suportes para as células e muitos deles participam ativamente nos processos celulares, tais como a diferenciação celular. Fatores de crescimento e de transcrição diretamente influenciam em vários processos de diferenciação (Barbanti et al, 2005. Kim et al, 2014). 1

Os biomateriais devem proporcionar um suporte estrutural para as células e o tecido recémformado, ou mesmo induzir a formação, atuando, assim, como uma matriz extracelular para os processos naturais de regeneração de tecido (Lee e Shin, 2007). O fosfato de alfa-fosfato tricálcico (α-tcp) é um biomaterial cerâmico bastante utilizado. Encontra-se disponível em três tipos diferentes: alfa-tcp, o TCP alfa' e beta-tcp. Todos têm a mesma composição química, mas as estruturas e características físicas diferentes. 2. Referencial Teórico e Trabalhos Relacionados Uma variedade de biomateriais tridimensionais (scaffolds) biodegradáveis é utilizada como substitutos artificiais para a matriz extracelular. Estes materiais podem ser constituídos de moléculas naturais e/ou polímeros sintéticos. Os componentes purificados e derivados da matriz extracelular são escolhas lógicas de scaffolds, pois mantém a estrutura e composição química das matrizes encontradas naturalmente. Os scaffolds podem ser constituídos de diferentes biomoléculas como o colágeno, a fibrina e o ácido hialurônico que são potencialmente menos imunogênicos e têm uma estrutura propícia ao crescimento celular. Estes materiais têm sido utilizados com sucesso como substratos para adesão celular e reparação tecidual (revisado por Yannas, 2013). Na substituição óssea, os biomateriais facilitam a sinalização bioquímica e possuem rigidez mecânica parecida com a do osso e taxa de degradação proporcional à cura óssea. Além disso, a química, topologia, arquitetura, porosidade, interconectividade e rigidez/elasticidade, degradação são todas propriedades a serem finamente ajustadas para se obter um bom scaffold (Wagoner Johnson e Herschler, 2011). Acredita-se que o sucesso do tratamento de perda óssea requer uma combinação de sinais osteoindutivos, de matriz osteocondutiva e de resposta celular ao potencial osteogênico (Gonçalves et al., 2011). O biomaterial que será utilizado neste estudo inclui cimento de α-tcp poroso (Morejón Alonso et al., 2012). Este produto é sintetizado no Departamento de Materiais da Faculdade de Engenharia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, tendo sido depositados pedidos de patente para os mesmos. O fosfato de alfa tricálcico (α-tcp) é um dos materiais cerâmicos mais utilizados. Está disponível em 3 tipos diferentes: alfa-tcp, alfa -TCP e beta-tcp. Alfa -TCP é instável, se convertendo em alfa-tcp. Todos possuem a mesma composição química - α-ca3(po4)2 e βca3(po4)2 -, porém estruturas e características físicas diferentes (Passuti, 2000). O α-tcp apresenta ótimas características para aplicação em reparo ósseo. Além de não apresentar toxicidade in vitro ou in vivo, é biodegradável. Apresenta maior capacidade de biossorção quando comparado com hidroxiapatita e β-tcp, apresentando uma maior capacidade de ser substituído pelo osso em comparação aos outros biomateriais (TOQUET et al., 1999). 2. Objetivos Este presente trabalho tem como objetivo caracterizar a adesão e a capacidade osteogênica de células-tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo de cães associadas a alfa fosfato tricálcico poroso para aplicação futura na engenharia de tecidos. 3. Metodologia Todos os protocolos experimentais envolvendo o uso de animais foram aprovados pelo comitê de ética local para o uso de animais (Universidade Luterana do Brasil; 2010-1P). Amostras de tecido adiposo foram coletadas em cinco cães machos saudáveis de raça desconhecida. Antes de os animais participarem do estudo, o consentimento dos proprietários foi obtido. 2

Amostras de tecido adiposo (5-10 g) foram coletadas da região inguinal dos animais, utilizando-se procedimentos cirúrgicos convencionais (Deimling et al., 2012). As amostras de tecido foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e digerido com colagenase de tipo I (1 mg / ml). Após inativação da enzima, foi feita com um volume igual de DMEM, as células foram lavadas com solução salina e centrifugadas (400 X g/10 min). Os conteúdos celulares obtidos após a centrifugação foram ressuspendidos em garrafas de cultivo com 150 cm² com meio de cultura completo (HDMEN), antes disso foi feita a contagem de células viáveis usando o método por exclusão com azul tripan. A proliferação celular foi avaliada a partir de plaqueamento cadscs a uma densidade de 1.10 4 células/cm 2. Quando as células atingiram cerca de 85% de confluência, foram trispsinizadas e a mesma densidade foi plaqueada e as células recuperadas foram contadas a cada passagem. Os ensaios foram realizados com células derivadas de 5 animais. A plasticidade de culturas ASC foi analisada por incubação de até quatro semanas em meio de cultura suplementado com fatores específicos para diferenciação adipogênica, osteogênica ou condrogênica como descrito na literatura (Silva Meirelles et al, 2006. Deimling et al, 2012). Os adipócitos, osteoblastos e condrócitos foram identificados com soluções corantes específicos (Oil Red O, Vermelho de Alizarina S e azul Alcian, respectivamente). Para todos os procedimentos, as culturas de controlo negativo, ou seja, as culturas foram incubadas indiferenciadas. As fotomicrografias foram tiradas com uma câmera digital (AxioCam MRc, Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanha) e analisadas usando software AxioVision 3.1 (Carl Zeiss). As células foram cultivadas com 80-85% de confluência e contou-se a cada passagem (P) de P3 a P15. O tempo de duplicação celular (PDT) foi expresso em horas. O PDT de diferentes culturas foi calculado de acordo com a seguinte fórmula: log (número de células final) - log (número de células inicial = K x t, onde K é a constante geração (0,008963) e t é o tempo em dias (Roth, 2006). Passagens P3 ao P10 são referidos como "Iniciais", enquanto P11 a P15 são referidas como "Intermediarias". A clonogenicidade das cadscs foi analisada em triplicata, cultivando as células em diluição limitante. As células foram tripsinizadas, centrifugadas, ressuspendidas em MCC, contadas e plaqueadas em placas de 96 poços (100 ul / poço), em três concentrações diferentes (5, 10 ou 50 células / ml). Após duas semanas, as culturas foram lavadas com PBS, fixadas com etanol (5 min temperatura / ambiente) e corados com Giemsa (5 min). O potencial clonogênico foi determinado a partir do número de poços com grupos de 5 células, em relação ao número total de células plaqueadas no ensaio. A diferenciação das cadscs foi induzida com plaqueamento de células a uma densidade de 2,2 x 10 3 mm 2 e cultivando estas células durante quatro semanas nos meios específicos. O meio indutor foi trocado a cada três dias. Para a diferenciação osteogênica, MCC foi complementado com dexametasona (10-8 M), ácido ascórbico 2-fosfato (5 mg / ml) e de beta-glicerofosfato (10 mm). Para identificar a deposição de cálcio em culturas diferenciadas, as células foram fixadas com paraformaldeído em PBS (4% v / v, 15-30 min, temperatura ambiente) e coloração com Vermelho de Alizarina S de acordo com as instruções do fabricante. Para a diferenciação adipogênica, cadscs foram cultivadas em MCC suplementado com dexametasona (10-8 M), insulina (2,5 mg / ml), indometacina (100 mm; Merck, Darmstadt, Alemanha), e a rosiglitazona (3,5 mm; GlaxoSmithKline, Middlesex, Reino Unido). Os adipócitos foram fixados com paraformaldeído e lavados com PBS (4% v / v, 1 h, temperatura ambiente) e a coloração (5 min, temperatura ambiente) com uma solução de Vermelho de Óleo O (um v / v mistura de 3,75% de óleo Vermelho O em 3:0 isopropanol e água destilada). O biomaterial investigado neste estudo foi o cimento poroso α-tcp (Morejón-ALONSO et al., 2012). Este produto é sintetizado no Departamento da Faculdade de Engenharia de Materiais da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, os pedidos de patente foram apresentados para o mesmo. 3

Com o objetivo de quantificar a interação entre os scaffolds e as células foi feita a quantificação da taxa de adesão celular. As células foram associadas ao biomaterial com uma densidade de 1,10 4 e 5,10 4, em 50 ul de HDMEM, antes as placas foram incubadas (3 h, 37 C, 5% CO2). Após o período de incubação, todos os materiais foram lavados com MCC (200 µl), a fim de remover todas as células não aderentes. Os biomateriais foram transferidos para uma nova placa e mantidos durante três dias (37 C, 5% CO2), para posterior análise da proliferação celular. A placa contendo as células, que não aderem aos biomateriais, foram centrifugadas (1800 rpm, 5 min), antes de serem coradas com Giemsa (10 minutos) para determinação subsequente do número de células aderidas ao fosfato. As células aderentes foram depois incubadas durante quatro semanas em meio osteogênico. Para identificar a diferenciação osteogênica no construto foi feita a análise da fosfatase alcalina (ALP): 2D-C (células semeadas em placas, bidimensional, incubadas com MCC), 2D (células semeadas em placas, bidimensional, incubadas com MCP-O), 3 D-C (células semeadas em placas, tridimensional, incubadas com MCC) e 3D-S (células semeadas em placas, tridimensional, incubadas com MCP-O). Depois de quatro semanas de diferenciação osteogênica, as culturas foram lavadas com PBS e incubadas outra vez (2 h, 37 C) com 200 ul de kit de substrato BCIP / NBT (Invitrogen, EUA). Após a adição de 200 ul de SDS-10% de HCl, as células foram incubadas durante a noite (37 C, 5% CO2). A densidade óptica (DO) do sobrenadante foi determinada espectrofotometricamente a 595 nm e os resultados são expressos como a densidade óptica de culturas menos diferenciadas culturas de controle. Os dados estão expressos como valores médios ± desvio padrão. Os resultados foram analisados e os gráficos gerados com o software GraphPad Prism 5 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EUA). ANOVA foi realizado seguido de Tukey ou o teste t de Student. Os valores foram considerados estatisticamente significantes para P <0,05. 4. Resultados e Discussões A diferenciação osteogênica tem sido cada vez mais explorada, o que é principalmente devido às suas potenciais aplicações no tratamento de doenças ósseas. As ADSCs são amplamente utilizadas em medicina regenerativa veterinária, especialmente nas patologias de tendões e ossos. No entanto, ainda há poucos resultados concretos na formação óssea in vitro utilizando células caninas, e pouco conhecimento sobre a tríade: biomaterial + celular + biomolécula é necessário. Embora a eficiência do isolamento das cadsc foi relativamente baixa em comparação com o descrito por Schwarz et al. (2012). O número de células obtidas a partir do isolamento com o tratamento de colagenase foi suficiente para estabeleceras culturas e a utilização de células para análises posteriores. Os níveis de proliferação seguiram o esperado na bibliografia para diferentes populações celulares, a partir da P10 o rendimento começou a cair gradualmente. 4

Figura 01: Mostra a capacidade clonogênica das células-tronco derivadas de tecidos adiposo de diferentes cães, o 131016 (1), 131010 (2), 130918 (3), 130904 (4), 120815 (5) e 130821 (6) para seu potencial clonogênico, em diferentes concentrações, sendo as primeiras 50 células por ml, as segundas 10 células por ml e as terceiras 5 células por ml, em passagens iniciais e intermediarias. Os resultados mostram que a capacidade clonogênica vai diminuindo conforme as células vão avançando em cultura. A capacidade de cadscs para formar novas colônias diminuiu significativamente em passagens de longo prazo (>P10), que podem ser consideradas como um contratempo para a sua utilização em protocolos de terapia celular e de engenharia de tecidos. Uma diminuição na clonogenicidade para P>P10 também foi descrito em hadscs (Markarian et al., 2013). 5

Figura 02: Quantificação da fosfatase alcalina dos cães 231002, 130904, 130821, em cultura 2D (placas de cultivo como controle, e em cultivos 3D (Células + α-tcp), com células apenas com meio controle (MCC) e meio indutor osteogênico (MCP-O). O cultivo 2D e o 3D teve maior quantificação de fosfatase alcalina em diferenciações de 11 dias em comparação com a diferenciação em 3 dias. A fosfatase alcalina (ALP) é um marcador para a diferenciação osteogênica de células encontradas em diferentes espécies, incluindo cães (Lu et al., 2012). Em análises envolvendo hadscs, a quantificação de ALP é rotineiramente aplicada. Quando a osteogênese é induzida em hadscs um aumento da atividade de ALP é observada, mesmo quando os hadscs estão ligados a biomateriais mostra-se um aumento (Frazier et al., 2013). Nossos resultados confirmam os níveis detectáveis de ALP quando as cadscs ficaram em contato com o MCC e CCM-O em cultivo, mostrando um valor maior para células em contato com o CCM-O em culturas 2D e 3D. As células utilizadas neste estudo foram obtidas a partir de animais de tamanho adequado e de massa corporal para a sua idade. 5. Considerações Finais Os resultados deste estudo sugerem que é possível obter quantidades suficientes de cadscs de apenas alguns gramas de tecido adiposo, o que reduz significativamente o risco de comorbidade dos pacientes. Além disso, as células podem ser mantidas in vitro, sem alteração da sua morfologia. No entanto, as características típicas de MSCs, tais como a formação de colônias e a proliferação são diminuídos nas passagens intermediarias. Quando cadscs foram colocados em contato com o biomaterial α-tcp, observamos taxas quase quantitativas de adesão celular. Após aderirem ao α-tcp e de serem mantidas em MCC e MCP-O, que exibiu um perfil osteogênico padrão, com níveis mais elevados de ALP. O mesmo experimento também revelou que o próprio α- TCP tem potencial de indução osteogênica. Ainda serão analisadas as quantificações gênicas por 6

PCR-RT e será feito a citometria de fluxo para anticorpos de caracterização para assim analisarmos mais a fundo os resultados, recomenda-se a busca do desenvolvimento de protocolos de engenharia de tecidos ideais com o uso de cadscs, especialmente por mais testes e análises de outros genes em momentos diferentes. Referências Ahn, H.H., Lee, I.W., Lee, H.B., Kim, M.S., 2014. Cellular behavior of human adipose derived stem cells on wettable gradient polyethylene surfaces. Int J Mol Sci 15, 2075-86. Albee, F., Morrison, H. Triple calcium phosphate as a stimulus to osteogenesis. Studies in bone growth. Am. J. Med. Sc., p. 32 39. 1920. Barbanti, S.H., Zavaglia, C.A.C., Duek, E.A.R., 2005. Polímeros Bioreabsorvíveis na Engenharia de Tecidos. Polímeros: Ciência e Tecnologia 15, 13-21. Bernardo, M.E., Zaffaroni, N., Novara, F., Cometa, A.M., Avanzini, M.A., Moretta, A., Montagna, D., Maccario, R., Villa, R., Daidone, M.G., Zuffardi, O., Locatelli, F., 2007. Human bone marrow derived mesenchymal stem cells do not undergo transformation after longterm in vitro culture and do not exhibit telomere maintenance mechanisms. Cancer Res 67, 9142-9149. Bunnell, B.A., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C., 2008. Adipose-derived stem cells: Isolation, expansion and differentiation. Methods 45, 115-20. Chung, C., Fujita, N., Kawahara, N., et al., 2013. A Comparison of Neurosphere Differentiation Potential of Canine Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells and Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells. The Journal of Veterinary Medical Science, 1-29. Da Silva Meirelles, L., Chagastelles, P. C., Nardi, N. B., 2006. Mesenchymal stem cells reside in virtually all post-natal organs and tissues. Journal of Cell Science 119, 2204-2213. Deimling, L.I., Franke, C., Faganello, S.B., Witz, M.I., Chem, E.M., Camassola, M., Nardi, N.B., Nance, B., 2012. Interaction of Human, Canine and Murine Adipose-Derived Stem Cells with Different Biomaterials. Jobbágy A, Magjarevic R (eds) 5th European Conference of the International Federation for Medical and Biological Engineering IFMBE Proceedings 37, 1315-1321. Dorozhkin, Sergey V. "Bioceramics of calcium orthophosphates". Biomaterials 31.7 (2010): 1465-1485. Hamzé, A.L., Pacheco, A.M., Bérgamo, M., et al., 2009. Células-tronco na Medicina Veterinária. Revista Científica Eletrônica de Medicina Veterinária 7, 1-4. Kang, B.J., Ryu, H.H., Park, S.S., Kim, Y., Woo, H.M., Kim, W.H., Kweon, O.K., 2012. Effect of matrigel on the osteogenic potential of canine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. J. Vet Med Sci 74, 827-36. Kim, E.Y., Lee, K.B., Kim, M.K., 2014. The Potential of Mesenchymal Stem Cells Derived from Amniotic Membrane and Amniotic Fluid for Neuronal Regenerative Therapy. BMB Rep. 7

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