Disciplina de Métodos Purif. e Anál. de Proteínas Curso de Ciências Biológicas Síntese Proteica e Modificação Pós-Traducionais Prof. Marcos Túlio de Oliveira mtoliveira@fcav.unesp.br www.fcav.unesp.br/mtoliveira Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho
Disciplina de Métodos Purif. e Anál. de Proteínas Curso de Ciências Biológicas Agradecimento à doutoranda Flávia Campos Freitas Vieira Prof. Marcos Túlio de Oliveira mtoliveira@fcav.unesp.br www.fcav.unesp.br/mtoliveira Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho
Dogma Central da Biologia Molecular
A importância da síntese de proteínas As proteínas são os produtos finais da maioria das vias de informação. Componentes e mecanismos utilizados pela maquinaria de síntese proteica são bem conservados em todas as formas de vida, de bactérias a eucariotos.
É o mais complexo processo de biossíntese que envolve ao todo quase 300 macromoléculas diferentes, quase todas dentro do ribossomo. Chega a consumir 90% do total de energia utilizada por uma célula para reações biossintéticas.
Apesar da complexidade podem produzir proteínas de forma rápida. Ex: um polipeptídeo de 100 resíduos é sintetizado em 5 seg em uma célula de E. coli (a 37ºC). Os processos de endereçamento e degradação devem estar sincronizados com o de síntese.
O código genético
Propriedades do código genético Os aminoácidos são formados a partir de códons A, G, U, C 4¹ = 4 4² = 16 4³ = 64
Os códons são lidos de maneira sucessiva e sem sobreposição Os códons não compartilham nucleotídeos.
Um primeiro códon específico na sequência estabelece a fase de leitura Todo mrna tem três fases de leitura possíveis. Os códons e, consequentemente, os aminoácidos codificados, são diferentes em cada fase de leitura. Apenas uma fase codifica uma dada proteína.
O código genético é degenerado e Um aminoácido pode ser codificado por mais de um códon. A degeneração não é uniforme. Os códons dos aminoácidos são idênticos em quase todas as espécies estudadas. universal
Tradução do código genético A decifração do código genético é tida como uma das mais importantes descobertas científicas do século XX.
Existem códons com funções especiais Códon de iniciação: AUG Met Códons de parada: UAA UAG UGA Não codificam nenhum aminoácido
Fase de leitura aberta (ORF) É uma fase de leitura sem um códon de parada entre 50 ou mais códons. Longas ORFs geralmente correspondem a genes que codificam a proteínas. Ex: proteína de 60 kda 500 códons ou mais
Fase de leitura aberta (ORF)
A terceira base de um códon é oscilante O trna possui três bases (anticódon) que pareiam com o códon no mrna. As duas primeiras letras de um códon são determinantes primários da especificidade. A terceira letra é oscilante. Pareia de forma frouxa e permite rápida dissociação entre o trna e seu códon.
Degeneração do código genético O código é extremamente resistente aos efeitos deletérios dos tipos mais comuns de mutações. Mutações sem sentido (missense): Mutações silenciosas; Mutações de transição. G C A=T; GUU (Val) CUU (Leu) AUU (Ile).
Síntese Proteica
4 Estágios da Síntese Proteica
Componentes-chave na biossíntese de proteínas trna ribossomos
Ribossomos Bacterianos 65% rrna + 35% proteína Constituídos por no mínimo uma grande subunidade de rrna + proteínas ribossomais. As proteínas são elementos secundários. Ribossomo bacteriano
RNA transportador São compostos por uma única fita de RNA dobrada em uma estrutura tridimensional precisa. Existe pelo menos um trna para cada aminoácido.
RNA transportador
aminoácido + trna + ATP Mg 2+ aminoacil-trna + AMP + PP i
Síntese Proteica: Estágio 2 A síntese é feita na direção: Aminoterminal (5 ) carboxiterminal (3 )
Estágio 2 Dois trnas para o códon AUG. Em bactérias, cloroplastos e mitocôndrias: Um para iniciar a síntese: N-formilmetionina (trna fmet ); Outro para a tradução da met em posições internas (trna Met ). Em eucariotos: Existem dois trna Met.
Estágio 2 A iniciação em Procariotos
Estágio 2 A iniciação em Procariotos Sequência Shine-Dalgarno Sinal de iniciação que pareia com a extremidade 3 do rrna 16S.
Estágio 2 A iniciação em Eucariotos elf3 Subunidade ribossomal 60S -80S
Estágio 2 A iniciação em Eucariotos elf3 Subunidade ribossomal 60S -80S
Estágio 3 Etapa 1 Ligação de um aminoacil-trna
Estágio 3 Etapa 2 Formação da primeira ligação peptídica
Etapa 3 - Translocação Estágio 3
Estágio 4 A terminação Os fatores de terminação contribuem: Hidrólise da ligação peptidil-trna terminal; Liberação do polipeptídeo e do último trna; Dissociação do ribossomo e reciclagem. RF-1 UAG e UAA RF-2 UGA e UAA
Estágio 4 Polissomos É um conjunto de ribossomos adjacentes em uma molécula de mrna que está sendo traduzida simultaneamente. Eucariotos e procariotos.
Inibição da síntese por antibióticos e toxinas A síntese proteica é o alvo de muitos antibióticos e toxinas naturais. Diferenciação entre os processos de procariotos e eucariotos. Cloranfenicol Bloqueia a atividade peptidil-transferase em bactérias, mitocôndrias e cloroplastos Tetraciclinas Bloqueiam o sítio A do ribossomo Estreptomicina Leitura errada do código genético. Inibe a iniciação Ricina Inativa a subunidade 60S dos ribossomos eucarióticos Cicloeximida Bloqueia a peptidil-transferase em eucariotos Puromicina Streptomyces alboniger. Se liga ao sítio A do ribossomo.
Estágio 5 Enovelamento e Processamento Algumas proteínas recém-sintetizadas não adquirem sua conformação final biologicamente ativa até que sofram modificações pós-traducionais.
Modificações Aminoterminais e Carboxiterminais Resíduos como N-formilmetionina (bactérias) e metionina (eucariotos) podem ser removidos para a formação da proteína funcional. Perda das sequências sinalizadoras Sequências sinalizadoras são removidas no final por peptidases específicas.
Modificações de aminoácidos individuais Aminoácidos fosforilados Aminoácidos metilados Ex: caseína do leite Aminoácidos carboxilados Ex: prototrombina Ex: proteínas musculares
Modificações em Histonas Histonas podem ter modificações N-terminais feitas por uma variedade de pequenas moléculas (grupos acetil, metil ou fosfato).
Acetilação associados com regiões no cromossomo de transcrição ativa. Desacetilação associados com regiões na cromatina de transcrição reprimida. Metilação associado com ativação ou repressão da cromatina, dependendo do aminoácido modificado. Fosforilação associada com as cromatinas altamente condensadas de cromossomos mitóticos.
Ligação de cadeias laterais de carboidratos Cadeias laterais de carboidratos de glicoproteínas são ligadas covalentemente durante ou após a síntese. Como proteínas extracelulares, proteoglicanos.
Formação de pontes dissulfeto Algumas proteínas formam pontes dissulfeto entre resíduos de Cys (cisteína). Comuns em proteínas secretadas. Ajudam a proteger a conformação nativa no meio extracelular.
Adição de grupos prostéticos Muitas proteínas exigem a ligação de grupos prostéticos, para sua atividade.
Endereçamento proteico Cloroplastos
Sequência sinal ou peptídeo sinal sequência curta de aminoácidos que direciona a proteína para o seu local apropriado na célula. Nas proteínas que vão para o RE, mitocôndrias ou cloroplastos, a sequência sinal está localizada na porção aminoterminal.
Endereçamento de proteínas em eucariotos
Endereçamento de proteínas em eucariotos No lúmem do RE, as proteínas recém-sintetizadas sofrem modificações (enovelamento, pontes dissulfeto, glicosilação, etc). As proteínas são transportadas para o aparelho de Golgi, para depois serem selecionadas e enviadas para seu destino final.
Degradação de proteínas Evita o acúmulo de proteínas anormais ou não desejáveis; Permite a reciclagem dos aminoácidos. Eucariotos: ubiquitina ligada a proteínas que vão ser degradadas por meio de uma via de ATP no complexo proteossomo.
Tradução https://www.youtube.com/watch?v=dccnmpeutp 4 Modificação Proteica https://www.youtube.com/watch?v=cy5gcjctps4
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