DIFERENTES MATRIZES PARA MICROENCAPSULAÇÃO DE Bifidobacterium longum 5 1A E SUA VIABILIDADE NO TRATO GASTROINTESTINAL SIMULADO B.S.P. Bernucci 1 ; I.C. Lacerda 2 ; J.R. Nicoli 3 ; M.C. Oliveira 4 ; S.C. A. Lopes 5 ; E.S. Oliveira 6 1- Departamento de Alimentos - Universidade Federal de Minas Gerais - Faculdade de Farmácia - CEP: 31270-901 Belo Horizonte MG Brasil, Telefone: (31) 98657-1688 e-mail: (psbeatriz@yahoo.com.br) 2- Departamento de Alimentos - Universidade Federal de Minas Gerais - Faculdade de Farmácia - CEP: 31270-901 Belo Horizonte MG Brasil, Telefone: (31) 3409-6925 e-mail: (inayarac@farmacia.ufmg.br) 3- Departamento de Microbiologia - Universidade Federal de Minas Gerais Instituto de Ciências Biológicas - CEP: 31270-901 Belo Horizonte MG Brasil, Telefone: (31) 3409-2737 e-mail: (jnicoli@icb.ufmg.br) 4- Departamento de Produtos Farmacêuticos - Universidade Federal de Minas Gerais - Faculdade de Farmácia - CEP: 31270-901 Belo Horizonte MG Brasil, Telefone: (31) 3409-6961 e-mail: (itabra2001@yahoo.com.br) 5- Departamento de Produtos Farmacêuticos - Universidade Federal de Minas Gerais - Faculdade de Farmácia - CEP: 31270-901 Belo Horizonte MG Brasil, Telefone: (31) 3409-6961 e-mail: saviacal@gmail.com 6- Departamento de Alimentos - Universidade Federal de Minas Gerais - Faculdade de Farmácia - CEP: 31270-901 Belo Horizonte MG Brasil, Telefone: (31) 3409-6915 e-mail: (evelynsolopes@yahoo.com.br) RESUMO Probióticos devem resistir ao processamento de alimentos e sobreviver à passagem pelo trato gastrointestinal para exercer seus efeitos benéficos. No entanto, são micro-organismos sensíveis, tornando o processo de microencapsulação uma excelente tecnologia para proteger as células das condições adversas do meio. Este estudo avaliou a eficácia de diferentes matrizes (alginato de cálcio com amido resistente, quitosana, inulina ou frutooligossacarídeos) pelo método de emulsão, e a matriz de proteínas do leite por spray drying para manter a viabilidade Bifidobacterium longum 5 1A durante o armazenamento. Foi também avaliado o efeito de crioprotetores (glicose, sacarose e lactose) na viabilidade do probiótico microencapsulado e verificada a sua resistência ao trato gastrintestinal simulado. As cápsulas de spray drying asseguram maior viabilidade diante das condições simuladas do trato gastrointestinail, sendo que glicose foi o melhor crioprotetor para manter a viabilidade durante o teste in vitro. A presença de prebióticos não aumentou a viabilidade durante o armazenamento. ABSTRACT Probiotics must resist processing and survive the passage through the gastrointestinal tract to exert their beneficial effects. However, it is sensitive and encapsulation is exactly a technology which has been developed to protect bacteria cells against an adverse environment. This study evaluated the efficacy of different matrix (calcium alginate with resistant starch, chitosan, inulin or fructooligosaccharides) by emulsion method, and milk protein matrix by spray drying for the
maintenance of Bifidobacterium longum 5 1A viability during storage. It also aimed at studying the effect of cryoprotectants (glucose, sucrose and lactose) on the viability of an entrapped probiotic to check their ability to be delivered all along the simulated gastro-intestinal tract. The spray drying microbeads assure greater viability under similar conditions of simulated gastrointestinal experiments and about the different cryoprotectants tested, glucose was the best. The presence of the prebiotics fructooligosaccharides and inulin did not enhance viability during freeze-drying or powder storage. PALAVRAS-CHAVE: microencapsulação; Bifidobacterium; viabilidade. KEYWORDS: microencapsulation; Bifidobacterium; viability. 1. INTRODUÇÃO O género Bifidobacterium é frequentemente utilizado como probiótico em produtos alimentares (Vasiljevic e Shah, 2008). A manutenção da viabilidade e funcionalidade dos probióticos até chegarem ao seu destino no intestino humano é um dos requisitos fundamentais. Para conferir propriedade funcional, o micro-organismo deve resistir ao processamento, armazenamento de alimentos, sobreviver à passagem pelo trato gastrointestinal, manter-se ativo no intestino e exercer seus efeitos benéficos (Anal e Singh, 2007). No entanto, foi claramente mostrado que os probióticos são sensíveis a ácido, sais biliares e a presença de oxigénio (Gomes e Malcata, 1999; Vaseiljevic e Shah, 2008). A microencapsulação é exatamente uma tecnologia que foi desenvolvida para utilização na indústria de alimentos (alimentos funcionais e bactérias probióticas), não só para proteger as células contra um ambiente adverso, mas também para controlar o local de liberação (Favaro-Trindade et al., 2008). Materiais à base de polímeros naturais representam matrizes promissoras como sistemas de liberação controlada, devido à sua biodegradabilidade, a compatibilidade, a natureza de grau alimentício e ampla disponibilidade (De Vos et al., 2010). 2. MATERIAL E MÉTODOS A manutenção da viabilidade de Bifidobacterium longum 5 1A microencapsulada foi avaliada durante 28 dias de armazenamento. Para tanto, foram produzidas cápsulas pela técnica de emulsão seguindo metodologia de Mokarram et al. (2009) e Brinques e Ayub (2011). As cápsulas de quitosana foram produzidas adicionando-se 10 ml da suspensão de células em 40 ml de alginato de sódio, 2% p/v (Sigma Aldrich, Pool, UK) e levados para emulsificação em 250 g de óleo de Soja (Soya Bunge, Gaspar, Brasil) adicionado de 0,2% p/p de Tween 80 (Merck, Darmstadt, Germany) utilizando agitador automático (IKA Eurostar) a 700 rpm por 10 minutos. Em seguida foi adicionado 500 ml de CaCl 2 a 0,05 M (Vetec, Química Fina, Rio de Janeiro, Brasil) e agitado por 10 minutos à 700 rpm. A mistura foi adicionada em um funil de decantação, a fase aquosa foi centrifugada (1000 X g por 10 minutos) e as cápsulas lavadas e ressuspendidas em água peptonada (0,1% p/v). Para o revestimento das cápsulas com quitosana, adicionou-se 15 g das cápsulas de alginato de cálcio em 100 ml de quitosana 0,4% p/v (Sigma Aldrich, Pool, UK) e agitou-se em shaker a 300 rpm por 20 minutos. Em seguida as cápsulas foram coletadas por centrifugação (1000 X g por 10 minutos), lavadas e ressuspendidas em água peptonada (0,1% p/v) a 4 C. Para produção das cápsulas de amido, inulina ou frutooligossacarídeos, seguiu-se o mesmo esquema sendo que, foi incorporado amido resistente (Ingredion, Brasil) a 2% p/v à solução de alginato sódio, ou inulina (1,5% p/v) ou frutooligossacarídeos (1,5% p/v), com ou sem recobrimento com quitosana. Por fim, 2 ml das suspensões
de cápsulas foram adicionados de crioprotetor (glicose 10%) e dessecadas sob vácuo a -50 C por 24 horas em liofilizador (Liotop L101, Liobras, Brasil). Ao final do processo os frascos foram selados sob vácuo e estocados a -20 C. Já as cápsulas feitas pela técnica de spray drying seguiram metodologia de Fritzen-Freire et al. (2012). Foi usado leite desnatado em pó reconstituído (30% p/v) adicionado de 10 ml do concentrado de células (10 log UFC ml -1 ). A temperatura de entrada para secagem em spray dryer LM MSD 1.0 (Labmaq do Brasil, São Paulo, Brasil) foi de 130 C e saída de 76 ± 5,31 C. A viabilidade das células microencapsuladas foi avaliada nos tempos 0, 7, 14, 21 e 28 em MRS ágar (Acumedia, Lansing, MI, USA) e incubadas em anaerobiose a 37 C por 72 horas. Para tanto, as células foram liberadas das cápsulas feitas por emulsão agitando-as em citrato de sódio (0,1% p/v, ph 6,0) por 5 minutos (adaptado de Mokarram et al., 2009; Krasaekoopt et al., 2004). Já as produzidas por spray drying foram agitadas em tampão fosfato (0,1 M, ph 7.0) por 5 minutos (adaptado de Sheu, Marshall, & Heymann, 1993). Foi também objetivo estudar o efeito de agentes crioprotetores (glicose, sacarose e lactose, todos a 10% p/v) durante a liofilização, sobre a viabilidade de Bifidobacterium longum 5 1A nas cápsulas de quitosana e verificar a capacidade de sobrevivência das células quando as cápsulas foram expostas ao trato gastrointestinal simulado. Para tanto, seguiu-se metodologia de Annan et al (2008) na qual, 1g de cápsulas ou 1 ml de células livres (8 log UFC ml -1 ) foi adicionado em 10 ml da solução gástrica simulada (HCl 0,08; NaCl 0,2% (p/v); Pepsina 0,3% (p/v); ph 2.5), incubada por 120 minutos a 37 C e coletadas alíquotas em 0, 60 e 120 minutos. Em seguida, a solução gástrica simulada foi centrifugada a 2.792 X g por 10 minutos, o pellet adicionado à 10 ml da solução intestinal simulada (NaH 2 PO 4 0,05 mol.l -1 ; Sais Biliares 0,45 g L -1 ; Pancreatina 1 g L -1 ; ph 8.0) e recolhidas alíquotas nos tempos 60 e 120 minutos. Ao final de cada tempo de incubação o conteúdo de células viáveis foi determinado por contagem em placas. As imagens de microscopia foram obtidas em microscópio de Força Atômica, Nanoscope III. Antes de serem levadas para obtenção das imagens, as amostras foram depositadas em superfície de lâmina de vidro sem nenhum tipo de preparo. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO Os resultados mostraram uma pequena diminuição (0,23 log) na viabilidade de B. longum 5 1A microencapsulado por alginato de cálcio com quitosana pela técnica de emulsão, antendo-se acima de 7 log UFC.g -1 depois de 28 dias de armazenamento a -20 C. A segunda melhor matriz foi leite pela técnica de spray drying, com perda de apenas 0,31 log ao longo do armazenamento. No entanto, a presença dos prebióticos, fruto-oligossacáridos e inulina, não aumentou a viabilidade das células durante a liofilização ou armazenamento das cápsulas, conforme mostra a Tabela 1. Tabela 1 - Efeito de diferentes agentes encapsulantes na viabilidade de B. longum 5 1A microencapsulada durante o armazenamento a -20 C por 28 dias Tempo(dias) / Log UFC.mL -1 Agente encapsulante 0 7 14 21 28 Quitosana 8,22 7,75 8,81 8,17 7,98 Amido 9,42 8,33 8,02 8,15 7,69 Quitosana + FOS 5,88 5,60 4,90 4,72 5,46 Quitosana + Inulina 5,56 5,73 5,83 5,51 6,70 Leite (spray drying) 8,12 8,12 8,05 7,96 7,81 FOS 5,26 5,62 4,97 4,77 5,81 Inulina 4,90 5,07 3,53 3,94 5,10
Sobre os diferentes agentes crioprotetores testados, glicose a 10% foi o melhor para a manutenção da viabilidade do micro-organismo durante o teste in vitro (Tabela 2). Segundo Carvalho et al (2003) o micro-organismo fica mais bem protegido durante a liofilização quando é adicionado do mesmo açúcar presente no meio no qual ele cresceu, que no caso de B longum 5 1A o meio de crescimento tinha glicose como fonte de açúcar. Tabela 2 - Viabilidade de B. longum 5 1A, microencapsulada e adicionada de diferentes crioprotetores, durante a exposição às condições simuladas do trato gastrointestinal Suco gástrico simulado Suco intestinal simulado Crioprotetores /Tempo (min) T0 T60 T120 T60 T120 Quitosana + Sacarose 5,92 5,71 5,41 4,16 3,84 Quiosana + Lactose 5,33 5,23 4,91 3,30 3,15 Quitosana + Glicose 6,91 6,84 6,11 5,27 5,29 No entanto, nenhuma das amostras de células encapsuladas pela técnica de emulsão demonstrou melhora significativa na sobrevivência quando submetido no teste in vitro a altas concentrações de ácidos e de sais biliares nas soluções simuladas do trato gastrintestinal, conforme mostra a Figura 1. Apesar do processo de microencapsulação por spray drying reduzir 1,34 Log UFC g -1 na viabilidade inicial de B. longum 5 1A após a secagem, este método e matriz utilizados para microencapsulação mostraram-se mais vantajosos na proteção das células diante das condições simuladasdo trato gastrointestinal. Além disso, em comparação com células livres, as microesferas produzidas por spray drying também asseguraram maior viabilidade das células durante o teste in vitro, conforme mostra a Figura 1. Figura 1 Eficácia de diferentes matrizes encapsulantes para a manutenção da viabilidade de B. longum 5 1A durante teste in vitro comparado com as células livres Esta maior viabilidade das células encapsuladas por spray drying durante o teste in vitro foi associada a maior capacidade das proteínas do leite protegerem as células das condições adversas do
meio. Segundo Huang et al (2014) as proteínas desnaturadas do leite são consideradas responsáveis por melhorar a resistência de estirpes. Por fim, as imagens de Microscopia de Força Atômica revelaram que nas cápsulas feitas por spray drying, as células estão recobertas por estruturas que foram associadas com as micelas de caseína e em raros campos foram observadas células parcialmente recobertas pelo material da matriz, como indicado na seta da Figura 2. Figura 2 Imagem por Microscopia de Força Atômica indicando B. longum 5 1A em rede de proteína de leite nas cápsulas feitas por spray drying 4. CONCLUSÕES Concluiu-se que a microencapsulação por spray drying parece ser promissora para que as células de B. longum 5 1A atinjam o cólon quando forem consumidas, uma vez que se mantiveram com altas contagens de células durante todo experimento in vitro. Estudos futuros devem ser realizados com o intuito de monitorar o efeito da microencapsulação na funcionalidade do micro-organismo, utilizando o teste de hidrofobicidade para ver a capacidade de aderir às células intestinais. 5. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem à FAPEMIG pelo apoio de financiamento, essencial para realizar o projeto. 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Anal, A.K & Singh, H. (2007). Recent advances in microencapsulation of probiotics for industrial applications and targeted delivery. Trends in Food Science and Technology, 18, 240-251. Annan, N.T.; Borza, A.D. & Hansen, L.T. (2008). Encapsulation in alginate-coated gelatin microspheres improves survival of the probiotic Bifidobacterium adolescentis 15703T during exposure to simulated gastro-intestinal conditions. Food Research International. 41, 184 193. Brinques, G.B. & Ayub, M.A.Z. (2011). Effect of microencapsulation on survival of Lactobacillus plantarum in simulated gastrointestinal conditions, refrigeration, and yogurt. Journal of Food Engineering, 103, 123 128. Carvalho, A. S., Silva, J., Ho, P., Teixeira, P., Malcata, F. X., & Gibbs, P. (2003). Effect of different sugars added to the growth and drying medium upon thermotolerance and survival during storage of freeze-dried Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. Biotechnology Progress, 20, 248 254. De Vos, P.; Faas, M.M.; Spasojevic, M. & Sikkema, J. (2010). Encapsulation for preservation of functionality and targeted delivery of bioactive food components. International Dairy Journal, 20, 292 302. Favaro-Trindade, C.S.; Pinho, S.C. & Rocha, G.A. (2008). Revisão: Microencapsulação de ingredientes alimentícios. Brazilian Journal of Food Technology, 11, 103-112. Fritzen-Freire, C.B; Prudêncio, E.S; Amboni, R.D.M.C.; Pinto, S.S.; Negrão-Murakami, A.N. & Murakami, F.S. (2012). Microencapsulation of bifidobacteria by spray drying in the presence of prebiotics. Food Research International,.45, 306 312. Gomes, A.M.P. & Malcata, F. Xavier. (1999). Bifidobacterium spp. and Lactobacillus acidophilus: biological, biochemical, technological and therapeutical properties relevant for use as probiotics. Trends in Food Science & Technology. 10, 139-157. Huang, S.; Yang, Y.; Fu, N.; Qin, Q.; Zhang, L. & Chen, X.D. (2014). Calcium-aggregated milk: a potential new option for improving the viability of lactic acid bactéria under heat stress. Food and Bioprocess Technology, 7, 3147 3155. Mokarram, R.R.; Mortazavi, S.A.; Habibi, M.B.N. & Shahidi, F. (2009). The influence of multi stage alginate coating on survivability of potential probiotic bacteria in simulated gastric and intestinal juice. Food Research International, 42, 1040 1045. Vasiljevic, T. & Shah, N.P. (2008). Probiotics From Metchnikoff of bioactives. International Dairy Journal. 18, 714-728.