SUBSÍDIOS PARA O ESTUDO DA LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA NA CIDADE DE FORTALEZA, CEARÁ

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS JOSÉ CLAUDIO CARNEIRO DE FREITAS SUBSÍDIOS PARA O ESTUDO DA LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA NA CIDADE DE FORTALEZA, CEARÁ FORTALEZA-Ce 2011

JOSÉ CLAUDIO CARNEIRO DE FREITAS SUBSÍDIOS PARA O ESTUDO DA LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA NA CIDADE DE FORTALEZA, CEARÁ Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor em Ciências Veterinárias. Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Linha de Pesquisa: Reprodução e sanidade de carnívoros, onívoros, herbívoros e aves. Orientador(a): Profa. Dra. Diana Célia Sousa Nunes-Pinheiro. FORTALEZA-Ce 2011

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Estadual do Ceará Biblioteca Central Prof. Antônio Martins Filho F566s Freitas, José Cláudio Carneiro de Subsídios para o estudo da leishmaniose visceral canina na cidade de Fortaleza, Ceará / José Cláudio Carneiro de Freitas. 2011. 146 f. : il. color., enc. ; 30 cm. Tese (Doutorado) Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Medicina Veterinária, Curso de Doutorado em Ciências Veterinárias, Fortaleza, 2011. Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Orientação: Profª. Drª. Diana Célia Sousa Nunes Pinheiro. 1. Cães. 2. Leishmania chagasi. 3. Perfil de imunoglobulinas. 4. Parâmetros histológicos. 5. Parâmetros laboratoriais. I. Título. CDD: 616.9364

JOSÉ CLAUDIO CARNEIRO DE FREITAS SUBSÍDIOS PARA O ESTUDO DA LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA NA CIDADE DE FORTALEZA, CEARÁ Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor em Ciências Veterinárias. Aprovada em 09 / 12 / 2011 BANCA EXAMINADORA Profª Dra Diana Célia Sousa Nunes-Pinheiro Universidade Estadual do Ceará Orientadora Profº Dr Alexandre Barbosa Reis Universidade Federal de Ouro Preto Examinador Profª Dra Romélia Pinheiro Gonçalves Universidade Federal do Ceará Examinadora Dr. Francisco Valdeci Ferreira Universidade Federal do Ceará Examinador Dr Wendel Coura Vital Universidade Federal de Minas Gerais Examinador Profª Dra Erika Freitas Mota Universidade Federal do Ceará Examinadora

À Deus, pelo apoio e bênçãos que a mim foram concedidos e que muito me auxiliaram e fortaleceram no decorrer do curso e da minha. Nos momentos mais difíceis foi a Ele quem procurei em primeiro lugar, e, com certeza, sempre fui prontamente atendido e compreendido. Pela obra é que se conhece o autor. À minha amada esposa, Cyntia Rafaelle Amaral de Abreu, que, com toda certeza, sem o seu apoio e sua companhia muito mais difícil seria a execução de todos os trabalhos. Então, declaro que, todas as virtudes obtidas com a execução dos trabalhos têm participação igual dessa maravilhosa pessoa que Deus me deu de presente. Aos meus queridos sobrinhos, João Lucas Rodrigues de Freitas, Ana Catarina Rodrigues de Freitas e Maria Tereza Carneiro de Freitas Cavalcante (Eza), que só pela suas existências no nosso meio torna o nosso mundo melhor e muito mais feliz. Dedico

AGRADECIMENTOS À Universidade Estadual do Ceará por viabilizar minha formação integral e continuada, fornecer subsídios para a execução desse trabalho e contribuir decisivamente à construção de novos conhecimentos. À Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico (FUNCAP) pelo auxílio financeiro, que nos foi concedido na forma de bolsa, para a execução dos trabalhos. À Profª Dra Diana Célia Sousa Nunes-Pinheiro, pelo seu valoroso auxílio e orientação ao longo de todos esses anos, colocando-se sempre à disposição para colaborar. Mesmo nos momentos familiares mais difíceis ela nos vem com palavras de força e estímulo para que continuemos a enfrentar as turbulências naturais da nossa vida. Ao Profº Dr Alexandre Barbosa Reis, pela confiança que nos foi dispensada com a disposição dos estabelecimentos e equipamentos que estão sob sua responsabilidade na Universidade Federal de Ouro Preto, que, com certeza, muito contribuiu para a qualificação da proposta de trabalho. Ao grande amigo Dr Wendel Coura Vital, pela valiosa colaboração que nos foi dada na execução dos trabalhos, além de, com muita paciência, sempre nos atender em todas as situações em que foi necessária sua valiosa opinião. Sempre que entramos em contato em busca de socorro, imediatamente éramos atendidos. Ao Profº Dr Francisco Valdeci de Almeida Ferreira, que muito abrilhantou nosso trabalho com o seu vasto conhecimento adquirido ao longo dos anos, nunca se furtando de nos atender e da melhor maneira possível dar seu auxílio. Além disso, sempre colocou a nossa disposição as suas instalações de trabalho, bem como a prestação de serviços de seus funcionários, que dessa forma agilizou bastante a execução das técnicas empregadas.

Aos colaboradores e amigos do Laboratório de Imunologia e Bioquímica Animal (LIBA), Glauco Jonas Lemos dos Santos e Belarmino Eugênio Lopes Neto, que sempre se colocaram a disposição e muito colaboraram na execução de todas as fases do trabalho. Aos valiosos irmãos da Augusta e Respeitável Loja Simbólica Cavaleiros de York nº 111 e da mui respeitável Grande Loja Maçônica do Estado do Ceará, que muito clamaram ao Grande Arquiteto do Universo e, dessa forma, me ajudaram no aperfeiçoamento dos meus conhecimentos e na correção de meus erros, transmitindo sempre conhecimento e fraternidade a todos aqueles que necessitem. De uma forma toda especial, a todos os meus familiares, Pais, Irmãos e Irmã, que desde sempre estiveram ao meu lado, sempre se colocando à disposição para me amparar e confortar nos momentos mais difíceis. A todos, os quais a limitação de inspiração e ingrata lembrança me impediram de citar nessas poucas linhas, mas que, com certeza, têm os seus nomes gravados na história de minha vida e sempre estarão em minhas preces e quando precisarem podem contar com esse humilde servo, que com todas as minhas limitações estarei à disposição.

O sábio não é aquele que senta para lamentar, e sim o que se põe alegremente de pé para corrigir os erros cometidos. William Shakespeare

RESUMO A leishmaniose visceral canina (LVC) é uma doença infecciosa crônica causada por protozoários pertencentes ao gênero Leishmania e o cão doméstico é apontado como principal hospedeiro reservatório e responsável pela manutenção da cadeia epidemiológica da doença. O Brasil apresenta várias regiões endêmicas, sendo o município de Fortaleza carente de informações que envolvem a patologia no animal. O objetivo deste trabalho foi avaliar os parâmetros laboratoriais, sorológicos, parasitológicos e histológicos relacionados à leishmaniose visceral em cães soropositivos da cidade de Fortaleza. O protocolo experimental foi aprovado pelo CEUA/UECE, SPU n 08622833-1. Após exame clínico, onde foram observados sinais clínicos característicos de LVC, e sedação, amostras de medula óssea e sangue de 85 cães adultos, sendo 68 cães com infecção clínica (CC), 10 com infecção subclínica (CS) e 7 cães negativos (CN) para LVC, foram coletadas para avaliação dos parâmetros hematológicos, bioquímicos e sorológicos. Em seguida, todos os animais foram pesados e eutanasiados. Baço e fígado foram dissecados para mensuração dos pesos relativos. Amostras de baço, fígado, linfonodo poplíteo e pele foram coletadas e submetidas aos procedimentos de histologia clássica e imunohistoquímica. Foram considerados positivos os animais com títulos de RIFI 1:40 e pelo exame parasitológico das formas amastigotas de Leishmania chagasi em esfregaços de medula óssea. O principal achado hematológico foi anemia, enquanto os achados bioquímicos séricos foram uremia, hiperproteinemia e hiperglobulinemia, no grupo CC. Os animais infectados (CS e CC) apresentaram aumento no título de anticorpos específicos anti-leishmania associado às classes IgG, IgA e IgE e subclasses IgG1 e IgG2 em relação a CN. Foram observados que IgG2 (r=0,12) e IgM (r=0,38) apresentaram forte correlação com a sintomatologia compatível com LVC, enquanto IgG total (r=-0,28), IgG1 (r=-0,13) e IgA (r=-0,62) apresentaram correlação negativa e IgE (r=0,0) não apresentou correlação. Foi observado aumento significativo nos valores médios do peso relativo de baço e fígado dos cães infectados (CS e CC). Na avaliação histológica do baço foram observadas hipoplasia de polpa vermelha e branca, espessamento de cápsula, fibrose subcapsular, hipertrofia de polpa vermelha e branca e congestão. Avaliação de fragmentos de fígado demonstrou infiltrado inflamatório peri-portal, hipertrofia/hiperplasia de células de Küpffer, congestão, espessamento de cápsula e granulomas intralobulares. Avaliação de

linfonodos poplíteos demonstrou inflamação capsular, congestão, hemossiderose, hipertrofia/hiperplasia de nódulos linfáticos, e hipertrofia/hiperplasia de cortical e medular. Na pele, a principal alteração observada foi infiltrado inflamatório histiolinfocitário. Através da imunohistoquímica foram comprovadas as presenças das formas amastigotas de Leishmania chagasi nos órgãos avaliados, com maior quantidade de parasitos observados na região de polpa branca esplênica. Portanto, pode-se concluir que a resposta imunológica dos cães estudados é compatível com alta produção de anticorpos específicos relacionada aos diferentes estágios clínicos da doença e que apresentam comprometimento de vários órgãos e alterações laboratoriais possivelmente associados a esta resposta. Palavras-chave: Cães. Leishmania chagasi. Perfil de Imunoglobulinas. Parâmetros Histológicos. Parâmetros Laboratoriais.

ABSTRACT Canine visceral leishmaniasis (CVL) is a chronic infectious disease caused by protozoa of the genus Leishmania. The domestic dog has been appointed as the main reservoir host and maintainer of the epidemiological chain of the disease. Brazil has several endemic regions, and the Fortaleza city in need of information involving the animal pathology. The objective of this study was to evaluate the laboratory, serological, parasitological and histological parameters related to visceral leishmaniasis in seropositive dogs of Fortaleza city. The experimental protocol was approved by CEUA/UECE, SPU nº 08622833-1. After clinical examination, where clinical signs characteristic of CVL were observed, and sedation, samples of bone marrow and blood of 85 adult dogs, 68 dogs with clinical infection (CD), 10 with subclinical infection (SD) and 7 dogs negative (ND) to CVL, were collected for evaluation of hematological, biochemical and serological parameters. Then, all animals were weighed and euthanized. Spleen and liver were dissected for measurement of relative weights. Samples of spleen, liver, skin and popliteal lymph node were collected and submitted to the procedures for classical histology and immunohistochemistry. Animals were considered positive with IFAT titers 1:40 and by parasitological examination of Leishmania chagasi amastigotes in bone marrow smears. The main hematological finding was anemia, while the serum biochemical findings were uremia, hyperglobulinemia and hyperproteinemia in CD group. Infected animals (SD and CD) showed an increase in anti-leishmania specific antibody titer associated with IgG, IgA and IgE and IgG1 and IgG2 subclasses in relation to ND. It was observed that IgG2 (r=0.12) and IgM (r=0.38) showed a strong correlation with symptoms compatible with CVL, while total IgG (r=-0.28), IgG1 (r=-0.13) and IgA (r=-0.62) were negatively correlated and IgE (r=0.0) showed no correlation. It was observed significant increase in mean relative weight of spleen and liver of infected dogs (SD and CD). In the histological evaluation of the spleen were observed hypoplasia of the red and white pulp, capsule thickening, subcapsular fibrosis, hypertrophy of red and white pulp and congestion. The evaluation of liver fragments showed periportal inflammatory infiltrate, hypertrophy/hyperplasia of Kupffer cells, congestion, capsule thickening and intralobular granulomas. Evaluation of popliteal lymph nodes showed capsular inflammation, congestion, hemosiderosis, hypertrophy/hyperplasia of lymph nodes, and

hypertrophy/hyperplasia of cortical and medullar. In the skin, the main change observed was histiolymphocyte inflammatory infiltrate. It was confirmed, by immunohistochemistry, the presence of Leishmania chagasi amastigotes, in the organs evaluated, with the largest number of parasites observed in the region of the splenic white pulp. Therefore, it can be concluded that the immune response of dogs is compatible with high production of specific antibodies related to the different clinical stages of disease and who presented damage of several organs and laboratory abnormalities possibly associated with this response. Keywords: Dogs. Leishmania chagasi. Immunoglobulins Profile. Histological Parameters. Laboratory Parameters.

LISTA DE FIGURAS Capítulo 2 Figure 1. Anti-Leishmania antibodies profiles in dogs naturally infected by Leishmania chagasi and showing different clinical forms... 62 Capítulo 3 Figura 1. Peso relativo de baço e fígado de cães naturalmente infectados por Leishmania chagasi, nas diferentes formas clínicas... 83 Figura 2. Alterações histológicas no baço de cães naturalmente infectados com Leishmania chagasi... 84 Figura 3. Alterações histológicas no fígado de cães naturalmente infectados por Leishmania chagasi... 85 Figura 4. Alterações histológicas no linfonodo poplíteo de cães naturalmente infectados por Leishmania chagasi... 86 Figura 5. Alterações histológicas na pele de cães naturalmente infectados com Leishmania chagasi... 87 Figura 6. Amastigotas de Leishmania chagasi detectadas pela técnica de imunohistoquímica em cães naturalmente infectados... 88

LISTA DE TABELAS Capítulo 1 Table 1. Clinical signs observed in dogs in group CD (clinical dogs) naturally infected by Leishmania chagasi, from the zoonosis control center in Fortaleza, Ceará. 44 Table 2. Hematology and platelet parameters in dogs with clinical and subclinical infections, naturally infected by Leishmania chagasi.. 45 Table 3. Leukocyte parameters in dogs with clinical and subclinical infections, naturally infected by Leishmania chagasi.... 46 Table 4. Biochemical parameters in dogs with clinical and subclinical infections, naturally infected by Leishmania chagasi.... 47 Table 5. P value of hematological, platelet, leukocyte, and biochemical assessments of clinical dogs naturally infected by Leishmania chagasi, in relation to subclinical and negative dogs... 48 Capítulo 2 Table 1. Clinical signs observed in dogs, in group CD, naturally infected by Leishmania chagasi.... 61 Table 2. P and r values of anti-leishmania antibodies profiles. Where P compares differences in absorbance of immunoglobulins in different clinical forms (SD and CD) with the negative control group (ND) of naturally infected dogs by Leishmania chagasi.... 61

Capítulo 3 Tabela 1. Parâmetros histológicos do baço de cães naturalmente infectados com L. chagasi em diferentes formas clínicas........... 79 Tabela 2. Parâmetros histológicos do fígado de cães naturalmente infectados com L. chagasi em diferentes formas clínicas... 80 Tabela 3. Parâmetros histológicos do linfonodo poplíteo de cães naturalmente infectados com L. chagasi em diferentes formas clínicas... 81 Tabela 4. Parâmetros histológicos da pele de cães naturalmente infectados com L. chagasi em diferentes formas clínicas... 82

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS % - Percentual ºC Grau Celsius ANOVA Análise de Variância CC Cães com Infecção Clínica CCZ Centro de Controle de Zoonoses CD Clinical Dogs CEP Comitê de Ética em Pesquisa CEUA Comitê de Ética para Uso de Animais CVL Canine Visceral Leishmaniasis CN Cães Negativos CS Cães com Infecção Subclínica DAT Técnica de Aglutinação Direta DTH Hipersensibilidade do Tipo Retardada EDTA - Ethylenediamine Tetraacetic Acid ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay FIOCRUZ Fundação Instituto Oswaldo Cruz FUNCAP Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnoloógico g - Grama g/dl Gramas por Decilitros gp 63 Glicoproteína 63 gp 70 Glicoproteína 70 gp 72 Glicoproteína 72 H&E Hematoxilina e Eosina IDRM Intradermoreação de Montenegro IFA Immunofluorescence Assay IgA Imunoglobulina A IgE - Imunoglobulina E IgG - Imunoglobulina G IgM - Imunoglobulina M IL-2 Interleucina 2 IL-4 Interleucina 4 IL-5 Interleucina 5 IL-6 Interleucina 6 IL-10 Interleucina 10 IL-12 Interleucina 12 IL-13 Interleucina 13 IL-17 Interleucina 17 IL-21 Interleucina 21 IL-22 Interleucina 22 INF-γ Interferon-γ LN Linfonodo Poplíteo LV Leishmaniose Visceral LVC Leishmaniose Visceral Canina mg/kg Miligrama por Kilograma ml Mililitro ND Negative Dogs OMS Organização Mundial de Saúde PBS Phosphate Buffer Saline PCLV Programa de Controle da Leishmaniose Visceral PCR Reação em Cadeia Polimerase ph Potencial Hidrogeniônico PPGCV Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias r Coeficiente de Correlação

RIFI Reação de Imunofluorescência Indireta rk39 Proteína Recombinante K39 SD Subclinical Dogs SER Secretaria Executiva Regional SLA Antígeno Solúvel de Leishmania TGF-β Fator Transformador de Crescimento β Th0 Linfócitos T Helper 0 Th1 Linfócitos T Helper 1 Th2 Linfócitos T Helper 2 Th17 Linfócitos T Helper 17 TNF-α Fator de Necrose Tumoral α Treg Linfócitos T Regulatórios UECE Universidade Estadual do Ceará UFOP Universidade Federal de Ouro Preto VL Visceral Leishmaniasis

SUMÁRIO RESUMO... ABSTRACT... LISTA DE FIGURAS... LISTA DE TABELAS... LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS... i iii v vi viii INTRODUÇÃO... 12 REVISÃO DE LITERATURA... 15 JUSTIFICATIVA... 23 HIPÓTESES CIENTÍFICAS... 25 OBJETIVOS... 27 CAPÍTULO 1 Clinical and laboratory alterations in dogs naturally infected by Leishmania chagasi... 30 CAPÍTULO 2 Profile of anti-leishmania antibodies related to clinical picture in canine visceral leishmaniasis... 49 CAPÍTULO 3 Histopatologia de órgãos linfóides de cães naturalmente infectados por Leishmania chagasi em diferentes formas clínicas.. 63 CONCLUSÕES GERAIS... 90 PERSPECTIVAS... 92 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 94 ANEXO 1 Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa... 131 ANEXO 2 Parecer do Comitê de Ética para o Uso de Animais... 132 ANEXO 3 Comprovante de Aceite do Artigo Alterações clínicas e

laboratoriais em cães naturalmente infectados por Leishmania chagasi... 135 ANEXO 4 Artigo Geographical variation in clinical signs and prevalence of Leishmania sp. infection among dogs in Fortaleza, Ceará State, Brazil... 136 ANEXO 5 Artigo Perfil sócio-econômico e conhecimento sobre leishmaniose visceral de proprietários de cães da cidade de Fortaleza, Ceará, Brasil... 139 ANEXO 6 Comprovante de Aceite do Artigo Perfil sócio-econômico e conhecimento sobre leishmaniose visceral de proprietários de cães da cidade de Fortaleza, Ceará, Brasil... 142 ANEXO 7 Artigo Aspectos celulares e moleculares da resposta imunitária a Leishmania sp.... 143

Introdução

INTRODUÇÃO As doenças tropicais negligenciadas são responsáveis por mais de um milhão de mortes humanas em todo o mundo por ano, sendo que 50.000 desses óbitos são devido às leishmanioses (OMS, 2010). Desta forma, a leishmaniose visceral (LV) é apontada como problema de saúde pública, e o Brasil está entre os países da América Latina que apresenta maior número de casos humanos, cerca de 90% dos casos anuais diagnosticados (MONTEIRO et al., 2005). Existe uma convenção de que a primeira descrição do parasito Leishmania foi feita em 1903 por William Leishman, na Índia, ao realizar autópsia do cadáver de um soldado, vindo da estação de Dum-Dum, tendo como sintomatologia diarréia e hepatoesplenomegalia (VERONESI e FOCACCIA, 2002). Entretanto, já em 1898 um cientista russo chamado Borovsky fazia a primeira descrição detalhada do parasito oriundo de um paciente humano com a forma cutânea da doença (PESSOA e MARTINS, 1982). A primeira descrição da leishmaniose felina data de 1927 (BONFANTE-GARRIDO et al., 1991). Desde então, a doença vem sendo notificada, em diversas partes do mundo, tanto na forma cutânea quanto na forma visceral (COSTA-DURÃO et al., 1994). A infecção canina, no Brasil, foi primeiramente estudada pela equipe do Dr Joaquim Eduardo Alencar, no interior do estado do Ceará (ALENCAR, 1959). Este trabalho detectou o primeiro surto epidêmico e forneceu uma grande colaboração para a implantação de medidas de prevenção e controle da doença no país. A LV é uma antropozoonose crônica causada por protozoários pertencentes ao gênero Leishmania. Inúmeros casos foram registrados em áreas do Mediterrâneo, Meio- Leste, Ásia e América Latina (DESJEUX, 2001, GRAMICCIA, 2011). As principais espécies causadoras da doença são Leishmania donovani, no Velho Mundo e Leishmania infantum chagasi nas Américas. A transmissão do parasito ocorre através da picada de insetos dípteros fêmeas, da família Psychodidae, gênero Phlebotomus e Lutzomyia (GONTIJO e MELO, 2004). Diversas espécies de vertebrados são consideradas como hospedeiros reservatórios da LV, incluindo animais domésticos e selvagens. Embora o homem também possa atuar como reservatório do agente e tenha participação no ciclo de transmissão, o cão doméstico é apontado como o principal responsável pela manutenção

em longo prazo da cadeia epidemiológica urbana da doença (DESJEUX, 2002, RIBEIRO, 2007). A leishmaniose visceral canina (LVC) é caracterizada por diferentes manifestações clínicas, variando de uma forma assintomática e subclínica a casos severos e sintomáticos, que levam o cão à morte (BRASIL, 2006). Estes diferentes quadros podem estar diretamente associados à resposta imunológica do animal (SILVA, 2007), que podem desencadear uma série de distúrbios fisiológicos, com alterações hematológicas e bioquímicas séricas, aumento na produção imunoglobulinas com formação de complexos imunes solúveis, além de alterações histológicas de órgãos linfóides (IKEDA et al., 2003, REIS et al., 2006, MIRANDA et al., 2007, CORBETT et al., 1992). No Brasil, muitos estudos vêm sendo realizados sobre os aspectos laboratoriais e imunológicos da infecção natural causada por Leishmania chagasi. Contudo, no Ceará, ainda não existem relatos que abordem esses aspectos, sendo o presente trabalho pioneiro na avaliação dos parâmetros imunológicos de cães naturalmente infectados. Desta forma, este estudo fornecerá uma importante contribuição científica, com abordagem nos aspectos laboratoriais e imunológicos da leishmaniose visceral canina, gerando subsídios para estudos futuros, além de auxiliar na implementação de medidas de prevenção e controle da doença no município de Fortaleza, Ceará.

Revisão de Literatura

REVISÃO DE LITERATURA Leishmania spp são organismos digenéticos, que variam entre a forma promastigota metacíclica no trato digestivo do inseto vetor e a forma amastigota intracelular no hospedeiro mamífero (ALEXANDER et al., 1999), pertencentes ao reino Protista, subreino Protozoa, classe Zoomastigophorea, ordem Kinetoplastida, família Trypanosomatidae e gênero Leishmania, com dois subgêneros, Viannia e Leishmania (BRASIL, 2006). São conhecidos como agentes etiológicos da LV, L. infantum chagasi nas Américas, no Sul da Europa, Norte da África e subcontinente indiano, e L. donovani no resto da Europa e África (TESH, 1995). No Ceará, foi relatado que o principal agente etiológico, causador da infecção na população canina, de acordo com estudos realizados na década de 50 do século passado, é L. chagasi (ALENCAR, 1959). Os principais vetores da LV no Velho e Novo Mundo são insetos flebotomíneos pertencentes aos gêneros Phlebotomus e Lutzomyia, respectivamente. Eles apresentam hábitos crepusculares e noturnos, tendo as fêmeas adultas de Lutzomyia longipalpis atividade durante todo o ano (BRASIL, 2006). LV é uma das zoonoses de maior importância em todo o mundo devido à morbimortalidade a ela associada e em virtude de sua rápida expansão (PARANHOS- SILVA et al., 1996; FRANKE e STAUBACH, 2002). Em estudos realizados em São Paulo foi demonstrada uma prevalência da LV de 20 a 40% da população canina (IKEDA et al., 2003). Já em trabalho realizado na Espanha, onde foram avaliados cães assintomáticos pela técnica de PCR de amostras de linfonodos, a prevalência foi de 67% (CHITIMIA et al., 2011). No Ceará, FREITAS et al. (2010), através de estudos realizados no município de Fortaleza, detectaram um maior número de casos na população canina na Regional V (SER V), situada na zona periférica da cidade, contudo sem diferenças significativas em relação a outras regiões do município. Isto demonstra não haver variação do número de casos em função da área, o que torna a população uma importante fonte de informação. Além do cão doméstico, existe a possibilidade da participação de outros reservatórios no ciclo da LV e muito embora a leishmaniose felina ainda seja considerada um achado raro, vários casos tanto da forma visceral como tegumentar da doença em gatos já foram registrados em várias partes do mundo (GRAMICCIA e

GRADONI, 2005; HATAM et al., 2010; ROUGERON et al., 2011). Vale ressaltar que, em todos os estudos realizados, os gatos infectados foram encontrados em regiões endêmicas para a LVC. Contudo, a evidência da transmissibilidade de parasitos felinos através de um vetor foi comprovada recentemente no Brasil (DA SILVA et al., 2010), sugerindo a participação dos gatos como hospedeiros secundários. O ciclo biológico da Leishmania chagasi é heteroxeno e digenético, desenvolvendo-se no aparelho digestivo do flebotomíneo fêmea, no qual atravessa estágios morfológicos de diferenciação até se tornar na forma promastigota metacíclica infectante (BRASIL, 2006). Através da picada do inseto, o parasito é inserido dentro do hospedeiro mamífero, ultrapassando as barreiras físicas, continuando seu desenvolvimento em uma célula, podendo ser fagocitado por macrófagos, células dendriticas e neutrófilos. Com a internalização da forma promastigota na célula o parasito transforma-se de sua forma promastigota para amastigota no fagolisossomo, escapando dos mecanismos de defesa celular, persistindo e proliferando no interior de algumas células do sistema imunológico (GREENE, 2006, REILING et al, 2010; KAYE e SCOTT, 2011). Imediatamente após a infecção, as primeiras células a serem recrutadas para o local são os neutrófilos, seguidos pelos monócitos/macrófagos dois ou três dias depois, caracterizando a resposta imunológica inata (AGA et al., 2002). Estas células participam ativamente na defesa inicial contra a infecção, porém elas também podem participar como elementos de evasão do protozoário, conferindo-lhes diversos mecanismos de proteção (LAUFS et al., 2002; PETERS et al., 2008; RITTER et al., 2009; CHARMOY et al., 2010). Além disso, postula-se a hipótese de que os neutrófilos infectados são responsáveis pela entrada silenciosa e sobrevivência do parasito no interior de macrófagos (LASKAY et al., 2003; LASKAY et al., 2008; RITTER et al., 2009). O estabelecimento da infecção implica que o parasito tenha de ser internalizado por células do sistema fagocítico, como os macrófagos residentes, as células dendríticas e os neutrófilos e, uma vez no interior da célula, resistir à ação microbicida (RITTIG e BOGDAN, 2000). Após a fagocitose, os parasitos têm a capacidade de desenvolver mecanismos intrínsecos de escape, conferindo-lhes resistência à ação das enzimas hidrolíticas e espécies reativas ao oxigênio, resultantes da ação das enzimas dependentes de oxigênio, capacitando-os a se multiplicarem no interior das células (ASSCHE et al., 2011).

Depois de se multiplicarem dentro dos fagócitos, no local da infecção, os parasitos podem deixar a pele e se disseminarem para fagócitos mononucleares do sistema reticuloendotelial, incluindo os que estão localizados no baço, fígado e medula óssea, podendo causar uma doença crônica e, às vezes, fatal (GOTO e PRIANTI, 2009). Já a eliminação do material fagocitado pode ocorrer por mecanismos oxidativos e não-oxidativos. O mecanismo oxidativo é gerado através de processos que utilizam um elevado consumo de oxigênio plasmático (explosão respiratória), sendo produzido quando um complexo enzimático, NADPH oxidase (NOX), na membrana dos fagócitos é formado, resultando na geração de produtos microbicidas, como espécies reativas ao oxigênio, ao nitrogênio e hipoaletos produzidos pela mieloperoxidase (SEGAL, 2005). Contudo, o acúmulo dos produtos microbicidas tem como contrapartida a lesão de biomoléculas e, se não controlado pelo sistema antioxidante, estes produtos tornamse excessivos, com desenvolvimento do estresse oxidativo, característico nos animais com LV (BILDIK et al., 2004; BRITTI et al., 2008). A disseminação e localização estável do parasito no organismo do hospedeiro é um requisito prévio para a progressão do processo infeccioso e, conseqüente, a manifestação clínica da doença. Desta forma, o elemento patogênico primário na LVC é a infecção, sobrevivência e multiplicação do parasito no interior das células do sistema mononuclear fagocitário (MARQUES, 2008). A sintomatologia da LVC tem forte correlação com as alterações imunológicas associadas às células T. Estas alterações incluem a ausência de hipersensibilidade cutânea retardada (DTH) aos antígenos da L. chagasi, decréscimo de células T no sangue periférico, ausência de produção de interferon gama (IFN-γ) e de Interleucina-2 (IL-2) pelas células mononucleares do sangue periférico in vitro (BARBIÉRI, 2006, MARQUES, 2008). Na LVC, as células T CD4+ auxiliares, ativadas por IL-12 produzidas pelos fagócitos mononucleares, podem se diferenciar em subpopulações de células efetoras, que produzem distintos padrões de citocinas e são denominadas de Th0, Th1, Th2,Th17 e T regulatórias (Treg) (BELKAID et al., 2002; BARBIERI, 2006; KORN et al., 2009). A diferenciação dessas subpopulações celulares está relacionada a três fatores: citocinas presentes no ambiente da estimulação, o tipo de célula apresentadora de antígeno e a natureza e quantidade do antígeno (HAILU et al., 2005). Na LV, INF-γ, IL-2 e TNF-α são as citocinas características de Th1; IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13 as citocinas de Th2, IL-10 caracteriza a resposta de Treg (BELKAID et

al., 2002; BARBIERI, 2006), enquanto IL-17, IL-21, IL-22, IL-6 e TGF-β formam o perfil da resposta de Th17 que tem função desconhecida na L. chagasi (KORN et al., 2009) O INF-γ secretado pelas células Th1 promove a diferenciação de Th1 e inibe a proliferação das células Th2, com posterior ativação de linfócitos B e produção de IgG2 (BARBIERI, 2006). De outro modo, a IL-4 produzida pelas células Th2 promove a diferenciação das próprias células Th2 e, juntamente com IL-10, inibe a ativação das células Th1, aumentando a produção de IgG1, IgA e IgE (BELKAID et al., 2002). As células Th17 têm uma importante função na eliminação de patógenos durante as reações de defesa do hospedeiro e na indução da resposta inflamatória tecidual (KORN et al., 2009). Na LVC tem sido reportado que altos títulos de anticorpos anti-leishmania, principalmente IgG e IgM, são detectados em animais sintomáticos (BARBIÉRI, 2006, MARQUES, 2008), contudo, não fornecem imunoproteção. Esse perfil de imunoglobulinas elevado, conseqüentemente leva a formação de complexos imunes solúveis no sangue, que são depositados em vários órgãos e tecidos como os rins, vasos sanguíneos, dentre outros, favorecendo o aparecimento de vários sintomas com epistaxe, poliúria e polidipsia, uveíte, conjuntivite e episclerite, úlceras de pele, hiperqueratose e poliartrite, hepatoesplenomegalia, perda acentuada de peso, febre e onicogrifose, dentre outros (CIARAMELLA e CORONA, 2003, BRACHELENTE et al., 2005, BARBIERI, 2006, CARDOSO et al., 2007, REIS et al., 2010,). O depósito de complexos imunes sobre o endotélio vascular desencadeia uma reação de hipersensibilidade do tipo III (MARQUES, 2008). O elemento patogênico secundário está diretamente relacionado com o tipo de resposta imunológica desenvolvida pelo hospedeiro mamífero, sendo responsáveis pelas manifestações clínicas características (CIARAMELLA e CORONA, 2003). A LVC, de acordo com o aparecimento da sintomatologia, pode ser classificada como animais assintomáticos, oligossintomáticos e sintomáticos (IKEDA et al., 2003; BRACHELENTE et al., 2005; REIS et al., 2006; CARDOSO et al., 2007). Contudo, outra classificação vem sendo proposta de acordo com os sinais clínicos, as alterações laboratoriais características e a confirmação do parasito L. chagasi,em doença clínica ou subclínica (SOLANO-GALLEGO et al., 2009). Na LVC a anemia é um dos principais achados laboratoriais em cães naturalmente infectados, entretanto sua patogênese é muito complexa e pouco conhecida, podendo ser ocasionada por hemorragia, falha renal, aplasia medular, dentre

outros motivos (KOUTINAS et al. 1999, CIARAMELLA e CORONA, 2003, REIS et al., 2006, DANESHVAR et al., 2009). Com relação à contagem de células brancas, as principais alterações relatadas são leucocitose e neutropenia (FREITAS et al., 2011), leucopenia com eosinopenia, linfopenia e monocitopenia (REIS et al., 2006; PALUDO et al., 2007). Na avaliação bioquímica, comumente é observado aumento nos valores de uréia (ABREU-SILVA et al., 2008), proteínas totais e globulinas (REIS et al., 2006, ABREU- SILVA et al., 2008). A uremia está diretamente relacionada com a falha da função renal (CIARAMELLA e CORONA, 2003). Já a hiperproteinemia com hiperglobulinemia está associada com o aumento na produção de anticorpos anti-leishmania (CIARAMELLA e CORONA, 2003). Os parâmetros hematológicos e bioquímicos séricos, embora sejam limitados no diagnóstico da LVC, são de grande utilidade na avaliação do estado clínico do animal e da extensão das lesões em órgãos e tecidos, podendo dar indicações sobre o prognóstico do animal (IKEDA et al., 2003, REIS et al., 2006). Apesar de a LVC ser caracterizada como uma severa doença sistêmica e causar diversas alterações macroscópicas, poucos estudos foram realizados, descrevendo as principais alterações histopatológicas encontradas nos diversos órgãos do hospedeiro afetado pelo parasito (GIUNCHETTI et al., 2008). As principais alterações histológicas observadas são congestão intensa e hipoplasia de polpa vermelha e polpa branca, no baço (TAFURI et al., 2001; TASCA et al., 2009); infiltrado inflamatório na região portal e formação de granulomas intralobulares no fígado (MURRAY et al., 2001; SANCHEZ et al., 2004) e hipertrofia/hiperplasia de cortical, medular e folículos em linfonodos (LIMA et al., 2004; KRAUSPENHAR, 2007). O diagnóstico de certeza para a LVC pode ser obtido através de pesquisa direta ou indireta do parasito. O exame mais simples é a pesquisa direta das formas amastigotas em material obtido das lesões por escarificação, aspiração ou biópsia, enquanto que os métodos indiretos seriam o cultivo in vitro, o xenodiagnóstico, a inoculação em meios de cultura ou em animais de laboratório (GONTIJO e CARVALHO, 2003; GRADONI e GRAMICCIA, 2008). Os métodos imunológicos mais utilizados para o diagnóstico da LVC são a Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI), Ensaio Imunoenzimático (ELISA e suas variações), a Técnica de Aglutinação Direta (DAT) e a Intradermoreação de Montenegro (IDRM). IDRM consiste na reação intradérmica da inoculação de antígenos

de cultura de L. chagasi, com o objetivo de se detectar uma reação de hipersensibilidade tardia (BRASIL, 2006). Vale ressaltar que a IDRM é uma técnica pouco utilizada para o diagnóstico da LVC, havendo relatos apenas em estudos experimentais. RIFI é o método sorológico indicado pela OMS para inquéritos sorológicos, entretanto pode apresentar com facilidade reações-cruzadas, além de não diferenciar as formas visceral e tegumentar (BRASIL, 2006). Já o teste imunoenzimático ELISA vem sendo bastante utilizado. Bio-Manguinhos desenvolveu um ensaio imunoenzimático que apresenta sensibilidade e especificidade elevadas (72% e 87,5%, respectivamente) para o diagnóstico da LVC, sendo sugerida a substituição da RIFI (LIRA et al., 2006; SILVA et al., 2006; FERREIRA et al., 2007). Testes rápidos vêm sendo elaborados destacandose os imunocromatográficos. A necessidade de testes mais sensíveis e específicos aumentaram os estudos e novos kits em que aprimoram o ELISA-padrão, como as variações: DOT-ELISA, FML -ELISA, BSM-ELISA, Fast-ELISA, micro ELISA, entre outras (CABRERA et al., 1999; CHATTERJEE et al., 1999). A utilização de antígenos recombinantes ou purificados como as glicoproteínas de membranas gp63, gp72, gp70 e rk39 específicas do gênero Leishmania, melhoram a sensibilidade e a especificidade da técnica (OZENZOY, 1998). O teste de aglutinação direta (DAT), apresenta uma grande vantagem por ser de execução simples e de baixo custo, quando comparado aos outros. Para o diagnóstico molecular, desenvolveu-se a técnica de PCR (reação em cadeia polimerase), que é a mais específica e sensível para o diagnóstico da LVC (ALVES e BEVILÁCQUA, 2004). Infelizmente, suas limitações para uso em inquéritos epidemiológicos se baseiam no custo, disponibilidade de reagentes, equipamentos e pouca adaptabilidade do método ao campo (ALVES e BEVILÁCQUA, 2004). Diferentes técnicas foram demonstradas para o diagnóstico da LVC e muitos avanços têm ocorrido nos últimos anos, mas a despeito do grande número de testes disponíveis para o diagnóstico, nenhum apresenta 100% de especificidade e sensibilidade (PALATNICK DE SOUZA et al., 2001). Vale ressaltar que, o diagnóstico da LVC não pode ser realizado, em hipótese alguma, observando-se a sintomatologia e sinais clínicos, devido ao grande número de cães que são assintomáticos ou oligossintomáticos, devendo-se então associar ao histórico do animal a sua área domiciliar. Caso seja proveniente de área endêmica, pode-se chegar a uma suspeita clínica forte utilizando-se a partir daí outros métodos de diagnóstico (BRASIL, 2006; PALTRINIERI et al., 2010).

Portanto, tendo em vista a complexidade que envolve a infecção causada por L. chagasi e a escassez de dados ainda mais aprofundados, mais estudos são necessários para avaliar os mecanismos envolvidos na resposta imunitária inata e adquirida, a resistência e susceptibilidade ao parasito.

Justificativa

JUSTIFICATIVA O município de Fortaleza é apontado como um dos principais centros urbanos do país e nos últimos anos vem apresentando uma elevada incidência de casos humanos e caninos da leishmaniose visceral, inclusive com um grande número de óbitos. Sendo o cão doméstico apontado como o principal responsável pela manutenção do ciclo da doença na região peridomiciliar, um grande número de animais soropositivos vem sendo eutanaziados como medidas de controle. Contudo, essa medida causa um impacto social negativo com os proprietários e criadores, além de não ter se verificado redução do número de casos humanos. A leishmaniose visceral canina apresenta diferentes manifestações clínicas, com relatos de alterações hematológicas, bioquímicas, sorológicas e histológicas, e o aparecimento desses sinais envolve uma série de fatores que estão associados ao parasitismo medular e à resposta imunológica do animal. Para dar subsídios ao estudo da leishmaniose visceral canina, faz-se necessária a junção dos dados clínicos característicos com a avaliação das alterações hematológicos, bioquímicos, imunológicas dos cães infectados. Estes dados contribuirão para o estudo da doença no Ceará e podem ser utilizados como ferramentas importantes para o diagnóstico e a conduta clínica da população canina. Além disso, o presente trabalho é pioneiro no estudo da resposta imunológica a Leishmania chagasi em cães naturalmente infectados no estado do Ceará.

Hipóteses Científicas

HIPÓTESES CIENTÍFICAS A infecção causada por Leishmania chagasi pode apresentar diversas anormalidades clínico-patológicas, dentre elas alterações hematológicas e bioquímicas. As diferentes classes e subclasses de imunoglobulinas envolvidas na resposta imunológica a Leishmania chagasi estão diretamente relacionadas com o aparecimento dos sinais clínicos característicos da leishmaniose visceral canina. A resposta imunológica a Leishmania chagasi, com o aumento da produção de anticorpos específicos, provoca danos teciduais em órgãos linfóides, os quais estão implicados no aparecimento de alterações histopatológicas com manifestações clínicas.

Objetivos

OBJETIVOS OBJETIVO GERAL Avaliar os parâmetros laboratoriais, sorológicos, parasitológicos e histológicos relacionados à leishmaniose visceral em cães soropositivos da cidade de Fortaleza. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 1- Avaliar os parâmetros clínicos, hematológicos e bioquímicos de cães naturalmente infectados por Leishmania chagasi; 4- Avaliar o perfil de anticorpos anti-leishmania em diferentes formas clínicas da leishmaniose canina, com ênfase na correlação com os sinais clínicos; 5- Avaliar as alterações histológicas do baço, fígado, linfonodo e pele, nas diferentes formas clínicas de cães naturalmente infectados por Leishmania chagasi.

Capítulos

CAPÍTULO 1 Alterações clínicas e laboratoriais em cães naturalmente infectados por Leishmania chagasi Clinical and laboratory alterations in dogs naturally infected by Leishmania chagasi Periódico: Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical (Submetido em Fevereiro de 2011 e Aceito em Outubro de 2011).

ARTICLE (on line) 929-48824 Clinical and laboratory alterations in dogs naturally infected by Leishmania chagasi Alterations in dogs infected by Leishmania chagasi. José Cláudio Carneiro de Freitas 1, Diana Célia Sousa Nunes-Pinheiro 1, Belarmino Eugênio Lopes Neto 1, Glauco Jonas Lemos Santos 1, Cyntia Rafaelle Amaral de Abreu 1, Roberta Rocha Braga 2, Rafael de Morais Campos 3 and Ligene Fernandes de Oliveira 4 1. Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Faculdade de Veterinária, Universidade Estadual do Ceará, Fortaleza, CE. 2. Núcleo Regional de Ofiologia, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, CE. 3. Laboratório de Fisiofarmacologia Cardio-Renal, Instituto Superior de Ciências Biomédicas, Universidade Estadual do Ceará, Fortaleza, CE. 4. Centro de Controle de Zoonoses de Fortaleza, Fortaleza, CE. Address to: Dr José Claudio Carneiro de Freitas. Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias/FAVET/UECE. Av. Paranjana 1700, Campus do Itaperi, Serrinha, 60740-000, Fortaleza, CE, Brasil. Phone: 55 85 31019840 e-mail: claudiofavet@bol.com.br ABSTRACT Introduction: Canine visceral leishmaniasis (CVL) is a zoonotic disease with different clinical manifestations. Parasitism often occurs in bone marrow, but changes have been observed in peripheral blood and serum biochemical parameters. The aim of this study was to evaluate the hematological and biochemical parameters in dogs naturally infected by Leishmania chagasi. Methods: Eighty-five adult dogs of both sexes and various weights and ages from the Zoonosis Control Center of Fortaleza (CCZ) were used, selected by immunofluorescence assay (IFA) and considered positive with IFA titers greater than 1:40 and by visualizing amastigotes of Leishmania chagasi in smears

obtained by bone marrow aspiration. The dogs (n = 85) were grouped according to clinical signs: negative (CN = 7), subclinical (CS = 10), and clinical (CC = 68). Blood samples were collected for determination of hematological and biochemical serum values. The experimental protocol was approved by the CEUA/UECE. Results: The most frequent clinical signs were cachexia (77.9%), keratitis (61.8%), and lymphadenopathy (55.9%), and 86.8% of the animals showed more than one clinical sign characteristic of CVL. In CC were observed reductions in red blood cells (63%), hematocrit (72%), and hemoglobin (62%), as well as leukocytosis (33%), neutropenia (28%), thrombocytopenia (50%), uremia (45%), hyperproteinemia (53%, p<0.05), hypergammaglobulinemia (62%, p<0.01), and hypoalbuminemia (58%). Conclusions: Animals with the clinical form of the disease demonstrate hematological and biochemical changes consistent with anemia, uremia, hyperproteinemia, and hyperglobulinemia, which present themselves as strong clinical markers of visceral leishmaniasis associated with the signs previously reported. Keywords: Dogs. Canine visceral leishmanisis. Biomarkers. Anemia. Uremia. Hyperglobulinemia. INTRODUCTION Visceral leishmaniasis is a zoonosis that affects humans when they come into contact with the transmission cycle of the parasite 1. It is one of the most relevant emerging diseases worldwide, and Brazil is among the countries of Latin America that present the greatest number of human cases, about 90% of annual cases 2. Although humans can also act as reservoirs of the agent and play a role in the transmission cycle, the dog is considered one of the most important links in the epidemiological chain of leishmaniasis 3. Canine visceral leishmaniasis (CVL) is transmitted through the bite of insects known as sand flies, mainly the species Lutzomyia longipalpis and L. cruzi, which convey the infective promastigotes. The main agent of visceral leishmaniasis in Brazil is Leishmania (Leishmania) chagasi 1,4. The pathogenesis of CVL involves several factors, and a decisive factor in the disease progression is associated with the immune response that the animal develops against the parasite 5-7. In this case, the antibodies, rather than having a protective function, become highly harmful, participating in inflammatory processes and being responsible for most of the clinical signs associated with CVL 6,8,9.

The infection may present itself in clinical form (clinical dogs), in which dogs show clinical signs and/or typical clinical and laboratory changes with confirmation of Leishmania chagasi, or in subclinical form (subclinical dogs), in which dogs show no clinical and laboratory changes, but the presence of Leishmania chagasi is confirmed by routine diagnostic tests 10. The hematological and serum biochemical parameters, although limited in the diagnosis of CVL, are very useful in evaluating the clinical status of the animal and the extent of lesions and might give indications on the animal prognosis 11,12. However, there is little information on these parameters and on biomarkers of leishmaniasis. Considering the relevance of the disease and the scarcity of information about the clinical parameters and biomarkers of CVL, we carried out this study to evaluate the hematological and biochemical aspects of dogs naturally infected by Leishmania chagasi. METHODS Animals Adult dogs (n = 85), varying in age and weight and of no defined breeds, were used. The dogs were from the Zoonosis Control Center of Fortaleza (CCZ), collected through the program SOS Cão. Immunofluorescence assay for selection of animals Animals suspected of being infected by Leishmania chagasi were selected by the immunofluorescence assay (IFA) technique, with those having IFA titers greater than 1:40 considered seropositive. The serological diagnosis of CVL was performed in the CCZ of Fortaleza using standardized kits supplied by Bio-Manguinhos. The principle of the test used consists of the reaction of sera eluted with antigens from Leishmania chagasi set on microscope slides. Subsequently, we used a fluorescent conjugate to elucidate the reaction, considering the sera that showed fluorescence as reactive and the sera that showed no fluorescence as nonreactive. These were used as positive and negative reference controls, respectively. Parasitological diagnosis

With the animal anesthetized, a puncture was made in the bone marrow to obtain smears, which were placed on microscope slides set in methanol and stained with fast dye using the principle of eosin. The smears were observed under an optical microscope under immersion oil (1,000x magnification), and samples that showed the presence of amastigotes of Leishmania chagasi in bone marrow were considered positive. Experimental groups All dogs were examined by observing the typical clinical signs of CVL, such as onychogryphosis, apathy, keratoconjunctivitis, hepatosplenomegaly, cachexia, lymphadenopathy, skin ulcers, fever, alopecia, mucosal ulceration, peeling, eczema, vomiting, and rectal bleeding and edema formation. The dogs were divided into three groups according to Solano-Gallego et al. 10 : negative dogs (ND = 7), which did not show clinical and laboratory alterations (hematology and biochemistry) and were negative for leishmaniasis by serology and parasitology; subclinical dogs (SD = 10), which did not show clinical and laboratory alterations but were positive for Leishmania chagasi infection; and clinical dogs (CC = 68), which showed clinical and laboratory alterations in routine testing and had infection confirmed by serological and parasitological diagnosis. Collection of blood samples Blood (10mL) was collected from dogs in the different groups by jugular venipuncture with a sterile syringe; 5ml of blood was placed into a tube containing anticoagulant EDTA (ethylenediamine tetraacetic acid) for hematological evaluation, and another 5mL into a tube containing separation gel, without anticoagulant, for serum biochemistry evaluation. Sera were obtained by centrifugation, aliquoted, and stored at - 20 C until biochemical analysis. Hematological assessment The blood samples in EDTA were mixed and subjected to an automated blood analyzer (Cell Dyn 3600) for complete blood count. The hematological parameters evaluated were white blood cells (in x10 3 /dl), including total leukocytes (TL) and differential leukocytes, neutrophils (Neu), eosinophils (Eos), monocytes (Mon), basophils (Bas), and lymphocytes (Lym); red blood cells; erythrocytes (RBC, in x10 6 /dl); hemoglobin (Hb, in g/dl); hematocrit (Ht, in %); and total platelets (Plt, in

x10 3 /mm 3 ). The results of the blood tests were compared to the reference values for canine species according to Meyer et al. 13. Biochemical evaluation In the serum samples from dogs, the levels of urea (U, in mg/dl), creatinine (Crea, in mg/dl), total protein (TP, in g/dl), albumin (Alb, in g/dl), and globulin (Glob, in g/dl); and the enzyme activity of glutamic oxaloacetic transaminase (GOT, in U/L) and glutamic pyruvic transaminase (GPT, in U/L) were determined. For total protein, the albumin/globulin (A/G) ratio was used. The serum dosage was determined by an automated system (Konelab 60i) using specific commercial kits (Wiener Lab ), according to the manufacturer's methodology. The biochemical evaluation results obtained were compared to the reference values for canine species according to Kaneko et al. 14. Statistical analysis The results were expressed as means and standard deviations. For comparison between groups, an analysis of variance (ANOVA) for parametric data was performed. Tukey's test was used to determine differences between groups (p < 0.05). The results on the A/G ratio were compared between groups using the Kruskal-Wallis test and Dunn's test (p < 0.05). Ethical considerations The experimental protocol was approved by the Ethics Committee for Animal Use of the State University of Ceará (CEUA/UECE), protocol SPU 08622833-1. RESULTS Clinical signs of dogs positive for Leishmania chagasi The results of the evaluation of typical clinical signs of CVL were expressed in percentages (%) and are shown in Table 1. The more frequent clinical signs were cachexia (77.9%), keratoconjunctivitis (61.8%), and lymphadenopathy (55.9%), and 86.8% of the animals showed more than one typical clinical sign of CVL. Hematological changes in dogs positive for Leishmania chagasi