MÉTODOS DE INOCULAÇÃO E TRASMISSIVIDADE DE ANTRACNOSE EM PLÂNTULAS DE FEIJÃO 1 SERAFINI, Pablo Tuzi 2 ; RAMOS, Juliano Perlin de 3 ; MARQUES, Leandro Nascimento 3 ; EBONE, André 2 ; CEZAR, Heraldo Skrebsky 4 ; PINTO, Felipe Frigo 2 ; UEBEL, Juliano Daniel 2 ; BALARDIN, Ricardo Silveiro 5 1 Trabalho de Iniciação Científica _ UFSM 2 Curso de Agronomia da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), RS, Brasil 3 Programa de Pós Graduação em Agronomia, PPGAgro, UFSM, Santa Maria, RS, Brasil 4 Programa de Pós Graduação em Engenharia Agrícola, PPGEA, UFSM, Santa Maria, RS, Brasil 5 Professor de Fitopatologia do Departamento de Defesa Fitossanitária, UFSM, Santa Maria, RS, Brasil E-mail: ptserafini@gmail.com RESUMO A antracnose causada pelo fungo Colletotrichum lindemuthianum, destaca-se como uma das principais doenças na cultura do feijão (Phaseolus vulgaris), resultando em grandes perdas na lavoura, caso esta não seja controlada. O presente trabalho teve por objetivo avaliar as possíveis diferenças na taxa de transmissão entre duas raças de C.lindemuthianum isoladas de sementes de feijão da cultivar Uirapuru. Sendo utilizadas as raças 8 e 321, com duas formas de inoculação. Na primeira as sementes foram colocadas em contato direto com cada uma das raças do patógeno, na segunda utilizou-se uma suspensão de conídios aspergidos sobre as sementes distribuídas em caixas gerbox. Para a análise do experimento avaliou-se germinação, índice de velocidade de emergência, volume de raiz, peso seco de raiz e de parte aérea e os níveis de incidência da doença sobre as plântulas. As plântulas infectadas apresentaram menor volume de raiz, menor peso seco e menor altura de plântula. Palavras-chave: Phaseolus vulgaris, Colletotrichum lindemuthianum, Raças, Transmissão semente planta. 1. INTRODUÇÃO A cultura do feijão (P.vulgaris) está sujeita ao ataque de diversos patógenos, dentre eles o C.lindemuthianum, agente etiológico da antracnose, uma das mais graves doenças do feijoeiro, tendo ampla distribuição no Brasil. A antracnose pode causar perdas totais nas lavouras, principalmente se forem utilizadas sementes já infectadas. Esta situação se agrava pelo fato de grande parte dos agricultores utilizarem suas próprias sementes, que muitas vezes além da baixa qualidade fisiológica, possuem graus variáveis de infestação não só por C.lindemuthianum, mas também por outros patógenos. Garcia et al. (2007) constataram a ocorrência de 1
antracnose em várias épocas de semeadura. A presença do patógeno nas sementes funciona como fonte de inóculo primário, podendo causar uma epidemia na fase inicial da cultura e resultar em menor população de plantas e menor produção de grãos ( SANTOS et al., 1996). Segundo Rey et al. (2009) a ocorrência de antracnose é favorecida por temperaturas moderadas a frias e com alta umidade relativa. Estudos de Pria, (2003) constataram que, a temperatura ótima para o desenvolvimento da doença é de 17ºC e que em temperaturas abaixo de 6ºC ou acima de 33ºC não foram observados sintomas do patógeno. Este mesmo autor relatou ainda que o período mínimo de molhamento foliar para ocorrência da infecção é de 6 horas. Nas sementes de feijão os sintomas são manchas deprimidas e de coloração parda. As lesões na haste são escuras e formam depressões, já na folha os sintomas apresentam-se como manchas escuras presentes nas nervuras. A semente é de suma importância para a sobrevivência do fungo, sendo também um dos meios mais eficientes para a disseminação do agente a longas distâncias. Desta forma a análise das sementes torna-se importante, pois fornece informações sobre a qualidade fisiológica e quanto à presença de microrganismos fitopatogênicos como C.lindemuthianum, servindo de orientação no planejamento das medidas de controle da doença. Além da transmissão por sementes, os esporos de C.lindemuthianum são facilmente dispersos pelo vento e respingos de água da chuva para lavouras vizinhas (COSTA, 2002), caso não haja um controle adequado da doença. O uso de cultivares resistentes à doença torna-se uma das alternativas mais eficientes e econômicas para o controle da mesma, porém isso é dificultado pela ampla variabilidade patogênica de C.lindemuthianum (COSTA, 2002), o que torna pouco duradoura a reação contra o patógeno. Já foram identificadas mais de trinta raças do fungo, destacando-se as raças 65, 81 e 321, que são as de ocorrência mais frequente e de ampla distribuição no país (BONET et al., 2008). Neste contexto, o conhecimento sobre a trasmissividade do patógeno presente nas sementes é de extrema importância, com a finalidade de prever desenvolvimento da doença no campo. Para isso ainda há necessidade de estudos sobre a relação entre presença de diferentes estruturas de C.lindemuthianum nas sementes e a ocorrência de antracnose nas plântulas de feijão. Experimentos conduzidos por Rey et al. (2009) mostraram que, sementes inoculadas tiveram uma taxa de transmissão variando de 70 a 80%, apesar de as sementes terem ficado por pouco tempo em contato com o fungo. Resultados parecidos foram encontrados por dos Santos et al. (1996) em que a transmissão chegou a 100%. 2
Assim, o objetivo deste trabalho foi estudar a transmissão semente-plântula das raças 8 e 321 de C. lindemuthianum, utilizando dois métodos de inoculação (placa colonizada e solução de esporos), bem como avaliar os efeitos desta sobre a germinação e o desenvolvimento inicial de plântulas de feijão. 2. METODOLOGIA O experimento foi realizado com delineamento de blocos ao a caso, em casa de vegetação na Estação Experimental do Instituto Phytus no município de Itaara, RS. A parcela principal constou de duas formas de inoculação mais uma testemunha sem inoculação e as subparcelas de duas raças do patógeno, compondo um delineamento em esquema bifatorial 3x2, totalizando cinco tratamentos, com quatro repetições por tratamento. Foram utilizadas as raças 8 e 321 de C. lindemuthianum, sendo estas previamente desinfectadas com álcool e hipoclorito (1%) durante um minuto. A avaliação da sanidade inicial das sementes foi realizada pelo método do papel-filtro ou blotter-test para todos os fungos, com exceção de C. lindemuthianum, na qual foi utilizado o método do rolo de papel, onde as sementes são envolvidas por duas folhas de germitest e embebidas em água destilada estéril. As duas raças do fungo foram cultivadas em meio BDA, disposto em placas de petri de nove cm de diâmetro. Logo após o desenvolvimento do fungo, as placas foram distribuídas para as formas de inoculação em cada uma das raças de C. lindemuthianun. Para realizar a inoculação foram utilizadas duas metodologias. Na primeira, logo após o desenvolvimento do fungo, as sementes foram colocadas em contato direto com cada uma das raças de C. lindemuthianun. Na segunda, utilizou-se uma suspensão de conídios aspergidos sobre as sementes distribuídas em caixas gerbox. Como substrato cada caixa gerbox recebeu 3 folhas de papel germitest, esterilizado e umedecido em meio BDA + restritor. A suspensão conidial foi obtida através de leitura em câmara de Neubauer e ajustada para 10 5 conídios/ml e aspergida sobre o meio ajustado com restritor contendo as sementes, seguindo a metodologia utilizada por (PEDROSO et al.,2010). Para inibir a germinação de sementes na placa e possibilitar o crescimento micelial do fungo, foi utilizado meio BDA com o restritor KCl foi ajustado para a pressão de -0,9 Mpa, seguindo resultados encontrados por (MACAHADO et al., 2003). O mesmo meio foi utilizado nos dois métodos testados e na testemunha, esta as sementes foram previamente desinfectadas e não receberam inoculação. 3
As placas com o fungo e as sementes sobre ele foram incubadas usando uma temperatura base de 21º C, sob fotoperíodo de 12 horas. As sementes foram incubadas ficando em contato com o fungo até que o primeiro sinal de germinação (emissão de radícula) fosse observado. Logo após, as sementes passaram por uma assepsia com hipoclorito de sódio 1%, durante 1 minuto e lavadas por três vezes com água destilada estéril. Depois da lavagem, as sementes foram secas por três dias em temperatura ambiente. Primeiramente, parte das sementes foi distribuída sobre papel germitest, pela metodologia proposta pelas Regras para Análise de Sementes (BRASIL, 1992) para teste de germinação. Cada tratamento contou com quatro repetições (parcelas) de 50 sementes infectadas pelas 2 raças do fungo e uma testemunha não inoculada. A segunda parte das sementes foram semeadas em bandejas de plástico, sendo 25 sementes por bandeja, cada tratamento contou com quatro repetições de 25 sementes inoculadas pelas 2 raças do fungo e uma testemunha sem inoculação. Para a análise da qualidade fisiológica foi avaliada germinação. Os testes realizados em casa de vegetação foram emergência, índice de velocidade de emergência, altura de plântula, comprimento e volume de raiz e massa seca de parte aérea e raiz. Para determinar o percentual de emergência foi utilizando bandejas plásticas contendo substrato comercial Plantmax. A avaliação ocorreu aos 7 dias após a emergência (DAE). A altura de plântulas e o comprimento de raiz foi realizado utilizando réguas graduadas em milímetros sendo medidas 10 plantas por repetição. O volume de raiz foi medido com uma proveta graduada em ml e transformado para cm 3. Para massa seca de raiz e parte aérea as plantas foram condicionadas em estufa a temperatura de 60ºC até atingirem o peso constante, utilizando-se 10 plantas por repetição. Os resultados obtidos foram submetidos à análise de variância e a interação entre os fatores bem como suas médias, foram comparadas através do teste de Tukey a 5% de probabilidade de erro, com a utilização do pacote estatístico Assistat versão 7.5 beta (SILVA & AZEVEDO, 2002). 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO Nas sementes condicionadas em rolo de papel, a inoculação via placa colonizada apresentou diferenças para percentual de emergência e sementes mortas, diferindo estatisticamente em relação à solução de esporos e a testemunha. No teste de germinação os resultados apresentaram mesmo comportamento, sendo que, a placa colonizada apresentou maior número de sementes mortas SM e menor número de plantas normais PN. 4
Considerando também a média das raças, percebe-se que quando inoculada através de placa colonizada, a raça 8 apresentou maior mortalidade de sementes e menor número de plantas anormais (Tabela 1). Já em solução de esporos, a mesma raça produziu menor número de SM e maior emergência de plantas. Estes resultados corroboram com os de casa de vegetação onde a solução de esporos proporcionou o maior estande de plantas, não diferindo da testemunha (Tabela 2), enquanto que a inoculação em placa colonizada resultou em um estande de plantas significativamente inferior aos demais tratamentos. Na raça 321, a variável SM seguiu a mesma tendência da raça 8. Para PA, em ambos os métodos as raças diferiram estatisticamente, respondendo de forma diferente aos dois métodos de inoculação, sendo maior quando utilizada a raça 8 em solução de esporos, na raça 321 esta variável foi superior quando em placa colonizada. Tabela 1 Porcentagem de plantas normais, anormais e sementes mortas 10 dias depois de condicionadas em rolo de papel. Método de Inoculação Plantas Normais (%) Plantas Anormais (%) Sementes Mortas (%) #321 #8 #321 #8 #321 #8 Testemunha 66,0 aa 66,0 aa 23,5 ba 23,5 ba 4,0 aa 4,0 ba Placa Colonizada 47,0 ba 45,0 ba 41,0 aa 33,0 bb 11,5 aa 18,0 aa Solução de esporos 56,5 aba 52,0 ba 36,0 ab 44,0 aa 6,0 aa 5,5 ba CV% 11,69 8,59 20,5 1 As médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si pelo Teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade. As letras maiúsculas comparam as médias na linha. Letras minúsculas comparam as médias nas colunas. Tabela 2 Percentual de emergência, incidência de Antracnose e altura de plântulas de Feijão aos sete dias após a emergência (7 DAE) Método de Inoculação Emergência (%) Incidência Altura (cm) #321 #8 #321 #8 #321 #8 Testemunha 98,0 aa 98,0 aa 2,75 ca 2,75 ba 8,30 aa 8,30 aa Placa Colonizada 88,0 ba 88,0 ba 8,75 bb 12,25 aa 6,57 ba 6,22 ba Solução de esporos 97,0 aa 99,0 aa 16,75 aa 13,5 ab 7,25 abb 8,32 aa CV% 6,26 21,55 8,22 1 As médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si pelo Teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade. As letras maiúsculas comparam as médias na linha. Letras minúsculas comparam as médias nas colunas. A avaliação de incidência de antracnose revelou que as duas raças do fungo responderam de forma semelhante aos dois métodos de inoculação e que a solução de esporos acarretou em maior número de plantas com doença (Tabela 3). Na raça 321 a inoculação com esporos proporcionou maior número de plantas infectadas. A raça 8 mostrou alta taxa de infecção para as duas metodologias sendo maior para solução de esporos. Em ambos os casos as raças diferiram estatisticamente, contudo, os dois métodos de inoculação apresentaram diferenças significativas apenas quando utilizada a raça 321. 5
Tabela 3 Massa seca de Parte Aérea (g), Altura de Plântulas (cm) e Volume de raiz (cm 3 ) de feijão 7 DAE. Método de Inoculação Volume de raiz (cm 3 ) MS parte aérea (g) MS raiz (g) #321 #8 #321 #8 #321 #8 Testemunha 2,08 aa 2,08 aa 2,24 aa 2,24 aa 0,83 aa 0,83 aa Placa Colonizada 1,57 ba 1,78 aa 1,53 ba 1,54 ba 0,64 ba 0,55 ba Solução de esporos 1,43 ba 1,85 aa 1,79 aba 1,94 aba 0,76 aa 0,79 aa CV% 12,12 15,46 8,48 1 As médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si pelo Teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade. As letras maiúsculas comparam as médias na linha. Letras minúsculas comparam as médias nas colunas. A altura e a massa seca de parte aérea foram menores quando utilizada a placa colonizada apresentando diferença significativa em relação à testemunha. A massa seca de raiz foi significativamente inferior quando utilizada placa colonizada. O volume de raiz foi menor para a raça 321 nas duas metodologias testadas, mas não diferindo da raça 8. 4. CONCLUSÃO As duas metodologias de inoculação testadas foram eficazes na transmissão do patógeno para as plântulas de feijão. A metodologia da placa colonizada com micélio de C. lindemuthianum provocou redução no peso de raiz e menor emergência de plântulas de feijão. Com base na incidência de antracnose nas plantas, conclui-se que a metodologia de inoculação através da solução de esporos proporcionou maior transmissão do patógeno para as duas raças. 5. REFERÊNCIAS BRASIL. Ministério da Agricultura e Reforma Agrárial. Regras para análise de sementes. Brasília: SNDA/DNDV/CLAV DF, 1992. 365p. BONETT, L. P.; SCHEWE, I.; SILVA, L. I. da. Variabilidade de Colletotrichum lidemuthianum em feijoeiro cumum no Oeste do estado do Paraná. Scientia Agraria, Curitiba, v.9, n. 2, p. 207-210, 2008. COSTA, L. da S. Aplicação de fungicidas via tratamento de sementes para o controle de antracnose (Colletotrichum lindemuthianum) do feijoeiro (Phaseolus vulgaris), (Embrapa Tabuleiros Costeiros. Documentos, 36), Aracaju, 14p, 2002. PRIA, M. D.; AMORIM, L & BERGAMIN FILHO, A. Quantificação de componentes monocíclicos da antracnose do feijoeiro. Fitopatologia Brasileira, 28(4), p.401-407, jun ago, 2003. GARCIA, A.; SOUZA, P.E. de; POZZA, E.A.; SANTOS, F.S. Influência das variáveis ambientais no progresso da antracnose do feijoeiro e eficiência de tiofanato metílico + clorotalonil no controle da doença. Ciência Agrotécnica, Lavras, v.31, n. 6, p. 1709-1715, nov./dez., 2007. 6
MACHADO, J.da.C; OLIVEIRA, J.A. de; VIEIRA, M. das G.G.C; ALVES, M. de C. Controle de germinação em sementes de soja em testes de sanidade pelo uso de restrição hídrica. Revista Brasileira de Sementes, v.25, n.2, p.77-81, 2003. PEDROSO, D.C. Métodos de inoculação de Alternaria alternata e A. dauci em sementes de salsa e sua influência na qualidade fisiológica. Revista Brasileira de Sementes, v. 32, n. 3, p. 79-85, 2010. SANTOS, G.R. dos; COSTA, H.; PELÚZIO, J.M.; MIRANDA, G.V. Transporte, transmissibilidade e patogenicidade da micoflora associada às sementes de feijão (Phaseolus vulgaris L.). Revista Ceres, vol. XLIII, nº 249, 1996. SILVA, F. de A.S. e. & AZEVEDO, C.A.V. de. Versão do programa computacional Assistat para o sistema operacional Windows. Revista Brasileira de Produtos Agroindustriais, Campina Grande. v.4, n.1, p71-78,2002. REY, M.S.; LIMA, N.B.; SANTOS, J. dos; PIEROBOM, J.R. Transmissão semente-plântula de Colletotrichum lindemuthianum em feijão (Phaseolus vulgaris). Arquivos do Instituto Biológico, São Paulo, v.76, n.3, p.465-470, jul./set., 2009. 7