ALINE BRITO VAZ CARACTERIZAÇÃO BIOLÓGICA E FILOGENÉTICA DO AGENTE ETIOLÓGICO DA FUSARIOSE DA PIMENTA-DO-REINO NO BRASIL

ALINE BRITO VAZ CARACTERIZAÇÃO BIOLÓGICA E FILOGENÉTICA DO AGENTE ETIOLÓGICO DA FUSARIOSE DA PIMENTA-DO-REINO NO BRASIL LAVRAS - MG 2013

ALINE BRITO VAZ CARACTERIZAÇÃO BIOLÓGICA E FILOGENÉTICA DO AGENTE ETIOLÓGICO DA FUSARIOSE DA PIMENTA-DO-REINO NO BRASIL Tese apresentada à Universidade Federal de Lavras, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Agronomia/Fitopatologia, área de concentração em Fitopatologia, para a obtenção do título de Doutor. Orientador Dr. Ludwig H. Pfenning Coorientação Dra. Sarah da Silva Costa Guimarães LAVRAS - MG 2013

Ficha Catalográfica Elaborada pela Divisão de Processos Técnicos da Biblioteca da UFLA Vaz, Aline Brito. Caracterização biológica e filogenética do agente etiológico da fusariose da pimenta-do-reino no Brasil / Aline Brito Vaz. Lavras : UFLA, 2013. 62 p. : il. Tese (doutorado) Universidade Federal de Lavras, 2013. Orientador: Ludwig Heinrich Pfenning. Bibliografia. 1. Fusarium solani species complex. 2. Piper nigrum. 3. Espécie filogenética. 4. Espécie biológica. 5. Mating population. 6. Filogenia molecular. 7. Doenças. I. Universidade Federal de Lavras. II. Título. CDD 632.43

ALINE BRITO VAZ CARACTERIZAÇÃO BIOLÓGICA E FILOGENÉTICA DO AGENTE ETIOLÓGICO DA FUSARIOSE DA PIMENTA-DO-REINO NO BRASIL Tese apresentada à Universidade Federal de Lavras, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Agronomia/Fitopatologia, área de concentração em Fitopatologia, para a obtenção do título de Doutor. APROVADA em 25 de fevereiro 2013. Dr. José Aires Ventura Dr. Dauri José Tessmann Dra. Maria Alves Ferreira Dra. Sandra Marisa Mathioni INCAPER UEM UFLA UFLA Dr. Ludwig H. Pfenning Orientador LAVRAS - MG 2013

Aos meus pais e irmãs, que são a fonte de inspiração da minha vida, DEDICO

os meus queridos sobrinhos, pelo carinho, OFEREÇO

AGRADECIMENTOS À Universidade Federal de Lavras (UFLA), por meio do Departamento de Fitopatologia, pela oportunidade de realização do doutorado; À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes), pela concessão da bolsa de estudos durante o doutorado; Ao Prof. Ludwig H. Pfenning, pela orientação e disponibilidade; A José Aires Ventura, Dauri José Tessmann, Maria Alves Ferreira e Sandra Marisa Mathioni, por comporem a banca avaliadora; Ao pesquisador, José Aires Ventura, um agradecimento especial, pelos ensinamentos repassados no teste de patogenicidade. À Dra. Sarah da Silva Costa Guimarães, pela valiosa coorientação, conhecimentos, dedicação e amizade; Ao Dr. Lucas M. Abreu, pelos ensinamentos repassados; Aos meus queridos amigos do Laboratório de Sistemática e Ecologia dos Fungos, pela convivência, especialmente Virgínia Elizei, Simone Ribeiro, Gláucia Moreira e Edson Luis Rezende; Aos pesquisadores; Luis Poltronieri (Embrapa), Inobert de Melo (Incaper), Ana Cristina Souza dos Santos (EBDA) e Alexandre Luis Jordão (IEPA) pelo apoio nas coletas; Aos queridos amigos da CEPLAC/CEPEC, especialmente à Dra. Edna Dora Luz Newman, pelo carinho, e Glória Paixão, pelo acompanhamento; A todos os professores e funcionários do Departamento de Fitopatologia; A Deus, por ter me proporcionado sabedoria para superar mais esta etapa; Aos meus pais, minhas irmãs, sobrinhos e Rhonan Moreira Neto por acreditarem em mim e sempre incentivarem meus projetos;

RESUMO O Brasil se destaca como um dos maiores produtores da pimenta-doreino (Piper nigrum L.) em todo o mundo. A fusariose, causada por Fusarium solani f.sp. piperis, é considerada a principal doença e promove podridão das raízes e secamento dos ramos. Neste trabalho foi investigado, se essa forma specialis corresponde a uma espécie filogenética e biológica dentro do Complexo de espécies de Fusarium solani FSSC. Foi obtida uma coleção de 104 isolados dos estados produtores Espírito Santo, Bahia, Pará e Amapá. Os isolados foram submetidos a análises de filogenia molecular de três regiões gênicas (TEF, RPB2, ITS-LSU rdna), testes de patogenicidade e avaliação dos marcadores morfológicos. Para verificar a existência de barreira reprodutiva entre isolados, isolados de mating types opostos foram cruzados para indução da fase sexuada. Na análise filogenética de Máxima Parcimônia, os isolados patogênicos formaram um clado único, distinto das demais espécies e formas, com alto suporte bootstrap nas três regiões analisadas. Na análise combinada das três regiões, o suporte para o clado de F. solani f.sp. piperis foi de 100%. Isolados patogênicos formaram peritécios férteis quando cruzados entre si, mas não com outros isolados. Isolados com alta fertilidade de ambos os mating types foram selecionados como testadores. Na avaliação dos caracteres morfológicos, não foi possível identificar um marcador específico para essa espécie. De acordo com os resultados obtidos, a população conhecida como F. solani f.sp. piperis representa uma espécie filogenética e biológica heterotálica no FSSC, com especificidade à pimenta-do-reino. Outras formas homotálicas e heterotálicas também ocorrem em associação com essa planta, entretanto não causam doença. Palavras-chave: Fusarium solani species complex. Piper nigrum. Espécie filogenética. Espécie biológica. Mating Population. Filogenia molecular. Doença de planta.

ABSTRACT The main disease of Piper nigrum in Brazil is caused by Fusarium solani f.sp. piperis. Disease symptoms include leaf chlorosis, blight of stems, root and foot decay. The objectives of this study were to investigate whether this form corresponds to a biological and phylogenetic species within the Fusarium solani Species Complex - FSSC. One hundred and four isolates with characteristics of F. solani were obtained from diseased plants collected in the main producing areas and characterized by means of laboratory crosses, phylogenetic analyses, and pathogenicity tests. Tests for homothallism and crossings of isolates of opposite mating types identified 10 homothallic isolates and a set of 25 heterothallic intercrossing strains. In phylogenetic analyses conducted with 44 isolates using partial sequences of the genes TEF, RPB2 and ITS-LSU rdna, the sexually compatible isolates formed a single clade (100% bootstrap support) together with a reference strain of F. solani f.sp. piperis, and distinct from other species and forms in the FSSC. Remaining isolates were grouped in 10 different lineages in a phylogenetic tree based on TEF sequences. In pathogenicity tests repeated twice with 35 isolates, only isolates of F. solani f.sp. piperis induced disease symptoms on inoculated plants. According to our results, the pathogen represents a phylogenetic and biological species in the FSSC. Other homothallic and heterothallic isolates of F. solani occur in association with black pepper, but do not cause disease. Key words: Fusarium solani species complex. Piper nigrum. Phylogenetic species. Biological species. Mating population. Molecular phylogeny. Plant disease.

LISTA DE FIGURAS Figura 1 Sintomatologia da fusariose no campo... 18 Figura 2 Procedimento do teste de patogenicidade... 26 Figura 3 Árvore filogenética de Máxima Parcimônia para o gene TEF-1α de espécies do complexo Fusarium solani, incluindo os isolados de fusariose de Piper nigrum... 39 Figura 4 Árvore filogenética de Máxima Parcimônia para o gene RPB2, de espécies do complexo Fusarium solani, incluindo os isolados de fusariose de Piper nigrum... 40 Figura 5 Árvore filogenética de Máxima Parcimônia para o gene ITS-LSU rdna, de espécies do complexo Fusarium solani, incluindo os isolados de fusariose de Piper nigrum... 41 Figura 6 Árvore filogenética de Máxima Parcimônia de sequências combinadas de TEF, RPB2 e ITS-LSU rdna e de espécies do complexo Fusarium solani, incluindo os isolados de fusariose de Piper nigrum... 42 Figura 7 Fases da sintomatologia da fusariose... 46 Figura 8 Níveis de agressividade dos isolados, de acordo com a escala de notas (Tab. 1, p. 27)... 47 Figura 9 Testes de patogenicidade com plantas de ervilha, melão, soja e maracujá... 48 Figura 10 Marcadores morfológicos do anamorfo e teleomorfo de F. solani f.sp. piperis... 52

LISTA DE TABELAS Tabela 1 Escala de notas para identificação e avaliação da patogenicidade de isolados a Piper nigrum... 27 Tabela 2 Isolados de Fusarium solani analisados neste estudo... 31 Tabela 3 Isolados utilizados no teste de patogenicidade... 44 Tabela 4 Isolados que geraram cruzamentos férteis... 50

SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO... 12 2 REVISÃO DE LITERATURA... 14 2.1 Importância da fusariose na pimenta-do-reino... 14 2.2 Etiologia... 15 2.3 Sintomatologia... 16 2.4 Epidemiologia... 19 2.5 Diversidade de espécies do complexo Fusarium solani... 19 3 MATERIAL E MÉTODOS... 22 3.1 Obtenção dos isolados... 22 3.2 Extração de DNA e amplificação por PCR... 22 3.3 Sequenciamento e análises filogenéticas... 23 3.4 Testes de patogenicidade... 24 3.5 Teste de homotalismo... 27 3.6 Determinação de mating type e indução da fase sexuada... 28 3.7 Análise morfológica da fase anamorfa e teleomorfa F. solani f.sp. piperis... 29 4 RESULTADOS... 30 4.1 Obtenção de isolados... 30 4.2 Análise filogenética... 37 4.3 Verificação da patogenicidade do isolados... 43 4.4 Teste de homotalismo... 49 4.5 Determinação de mating type e indução da fase sexuada... 49 4.6 Marcadores morfológicos da fase anamorfa e teleomorfa de F. solani f.sp. piperis... 50 5 DISCUSSÃO... 53 6 CONCLUSÕES... 57 REFERÊNCIAS... 58

12 1 INTRODUÇÃO Pimenta-do-reino (Piper nigrum L.), planta nativa da Índia, é considerada uma das especiarias mais apreciadas do mundo. O Brasil ocupa lugar de destaque no cenário mundial no que se refere à produção da pimentado-reino, sendo o terceiro maior produtor, atrás apenas de Vietnã e Indonésia. Os Estados do Pará e do Espírito Santo são os maiores produtores nacionais, respondendo, respectivamente, por 75,3 e 14,3% da produção nacional, de 44.610 mil toneladas (FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONS - FAO, 2011). A planta foi introduzida no Brasil no século XVII e a sua exploração comercial ocorreu a partir de 1933, no estado do Pará. Com o monocultivo intensivo da cultura, surgiram diversas doenças, sendo a principal delas a fusariose, conhecida também como podridão do pé, que promove apodrecimento das raízes e secamento dos ramos. Esta doença é de ocorrência restrita ao Brasil e foi observada pela primeira vez em 1957. Em 1976, o agente etiológico foi identificado como Fusarium solani f.sp. piperis, teleomorfo Nectria haematococca f.sp. piperis (ALBUQUERQUE; DUARTE, 1991; ALBUQUERQUE; FERRAZ, 1976). Acreditava-se que o cultivo de áreas extensas com uma única cultivar de P. nigrum tivesse exercido pressão de seleção na população nativa de Fusarium solani, originando uma forma specialis. Entretanto, em 1994 foi isolado Nectria haematococca f.sp. piperis, infectando ramos de P. aducum, pimenta nativa da região amazônica, que cresce em áreas de capoeira e em locais sombreados e úmidos, podendo servir de fonte de inóculo para disseminação da fusariose em P. nigrum. Alguns trabalhos relatam a resistência de espécies nativas da região amazônica à doença (ALBUQUERQUE et al., 2001).

13 Com base em análises filogenéticas das regiões gênicas TEF, 28S rdna e ITS ficou evidente que isolados com características gerais de Fusarium solani formam um complexo de diferentes espécies filogenéticas e biológicas, agrupadas em três clados principais (O DONNELL, 2000). Um isolado de Fusarium solani f.sp. piperis, incluído nesse estudo, agrupou no Clado 3, como subclado irmão de F. solani f.sp. cucurbitae Mating Population MP-I. O Clado 3 recebe a maioria de patógenos de plantas, e também patógenos oportunistas do homem (O DONNELL et al., 2008). Encontram-se nesse Clado 3 também representantes das espécies biológicas descritas por Matuo e Snyder (1973), espécies homotálicas e outras formas cuja fase sexuada ainda não foi relatada. A fase sexuada das espécies do Complexo de espécies de Fusarium solani - FSSC caracteriza-se por peritécios rugosos, de cor avermelhada, contendo ascos com oito ascósporos, geralmente septados, e com ornamentação estriada. Essa fase sexuada pode ser encontrada no Brasil com relativa frequência, inclusive em associação com a pimenta-do-reino, onde tem sido de forma geral associada o nome Nectria haematococca f.sp. piperis ao agente etiológico da fusariose da pimenta-do-reino (P. nigrum) (ALBUQUERQUE; FERRAZ, 1976; VENTURA; GAVASSONI; ZAMBOLIM, 1986). A esse gênero do teleomorfo aplica-se o nome Haematonectria ou Neocosmospora (NALIM et al., 2011; ROSSMAN; SAMUELS, 1999). O objetivo desse trabalho foi investigar se a população associada à pimenta-do-reino corresponde a uma espécie filogenética e biológica dentro do complexo de espécies de Fusarium solani - FSSC. Os objetivos específicos foram: i. coletar material vegetal com sintomas da fusariose nas principais regiões produtoras de pimenta-do-reino e obter isolados de F. solani; ii. testar a patogenicidade dos isolados e verificar sua especificidade; iii. induzir a fase sexuada por meio de cruzamentos em laboratório; iv. avaliar a posição filogenética dos isolados por meio de análises de sequências parciais dos genes

14 TEF, RPB2 e ITS-LSU rdna; v. avaliar os marcadores morfológicos da fase anamorfa e teleomorfa. 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Importância da fusariose na pimenta-do-reino Dados levantados nos anos de 2007 e 2008 apontam que foram colhidas mais de 35 mil toneladas de pimenta-do-reino no Brasil, sendo a grande parte, 33 mil toneladas (IKEDA, 2010), exportada para países como Estados Unidos, Holanda, Argentina, Alemanha, Espanha, México e França. Para efeito comparativo, enquanto a Índia, maior produtor mundial de pimenta-do-reino, consome 50% da sua produção, os brasileiros consomem apenas 10% do seu total produzido (BARBOSA, 1998). Em relação à produção nacional da especiaria, o estado do Pará contribui com 80% do total cultivado, ficando o segundo lugar com o estado do Espírito Santo, respondendo por cerca de 10% do total nacional. Outros estados produtores, em menor escala, são Bahia, Maranhão, Ceará, Paraíba e Amapá (EMPRESA BRASILEIRA DE PESQUISA AGROPECUÁRIA - EMBRAPA, 2010). Considerando o potencial econômico da especiaria, os produtores de pimenta praticaram monocultura intensiva e contínua do cultivo, resultando em um surto de podridão radicular causada por Fusarium solani f.sp. piperis. A fusariose encontra-se amplamente disseminada, não só no Pará, mas também no Amazonas, Mato Grosso, Paraíba, Espírito Santo e Bahia. Não existem relatos da ocorrência da doença em outros países produtores de pimenta-do-reino (ANDO et al., 1996; BENCHIMOL et al., 2000; DUARTE; ALBUQUERQUE, 1980).

15 Pesquisas realizadas em áreas de ocorrência da doença no estado do Pará detectaram que, a partir do terceiro ano, as cultivares plantadas (Cingapura, Bragantina e Guajarina) desenvolveu a doença e, ao sexto ano, apresentaram incidência de até 100% (ALBUQUERQUE; DUARTE, 1991). As medidas que vem sendo adotadas para o controle da fusariose, como práticas culturais, erradicação e queima de plantas doentes, uso de tutores desinfetados e aplicação de fungicidas a base de carbendazim e thiabendazole têm-se mostrado pouco eficientes (SERRANO; LIMA; MARTINS, 2006). O conhecimento mais detalhado sobre a biologia do patógeno poderá trazer informações importantes para o combate à doença e consequente ganho na rentabilidade da cultura. 2.2 Etiologia Albuquerque (1961) identificou um fungo da espécie Fusarium solani em plantas doentes de pimenta-do-reino, confirmando a patogenicidade deste e atribuindo o nome de fusariose à doença. Posteriormente, Albuquerque e Ferraz (1976) descreveram o patógeno por meio de caracterização morfológica e biológica. Neste trabalho, os pesquisadores testaram a patogenicidade dos isolados em mais quatro espécies de plantas (Phaseolus vulgaris, Pisum sativum, Cucumis melo e Solanum tuberosum), verificando sua especificidade e atribuindo a ele a denominação de Fusarium solani f.sp. piperis. O patógeno produz esporodóquio com grande quantidade de macroconídios (36-61 x 4-6 µm), com 3 a 6 septos; pouca ou nenhuma presença de microconídios; os peritécios (120-230 µm) são irregulares, globosos, vermelhos, com parede externa rugosa; os ascos (63-72 x 7-10 µm) são cilíndricos, que se tornam clavados e possuem ápice arredondado, com um poro; e os ascósporos (11-15 x 5-7 µm), originalmente são monósticos e tornam-se dísticos, elipsóides para

16 ovoide, hialinos no início, depois adquirem coloração ligeiramente parda, apresentam constrições à altura do único septo transversal, localizado próximo ou na parte central do esporo (ALBUQUERQUE; FERRAZ, 1976). Estudos de compatibilidade sexual permitiram a indução da fase sexuada F. solani f.sp. piperis, que foi identificada como Nectria haematococca f.sp. piperis (ALBUQUERQUE et al., 2001). Porém, o teleomorfo não foi caracterizado ou formalmente descrito, pois existem outras espécies que pertencentes ao complexo Fusarium solani que também possuem peritécios rugosos de cor avermelhada e podem ser encontrados no Brasil com relativa frequência. Dessa maneira, a caracterização de populações, baseada apenas em marcadores morfológicos, seja ocorrendo naturalmente, seja induzida em laboratório, torna-se difícil para a definição dessa espécie. Para caracterização de uma espécie o ideal além dos marcadores morfológicos é necessário realizar análises de filogenia molecular e testes de patogenicidade, pois corroboram com conceito e permitem a determinação objetiva de agentes etiológicos (COVERT et al., 2007; VAN ETTEN, 1978). 2.3 Sintomatologia Quando as raízes de uma planta são infectadas por F. solani f.sp. piperis, observa-se ausência de radicelas e apodrecimento das raízes mais grossas, que avança até 30 cm acima do nível do solo. Ao se cortar o caule acima da área afetada, verifica-se, facilmente o escurecimento dos vasos. Além disso, as folhas amarelecem e murcham, ocorrendo sua queda, resultando em folhagem esparsa e rompimento dos internódios. Com o progresso da doença, a planta fica totalmente desprovida de folhas e morre. Outra forma de manifestação da doença é quando o apodrecimento atinge todo o sistema radicular. Nesses casos, a planta morre subitamente e as folhas ficam presas aos ramos. Nos tecidos

17 internos, pode-se observar o escurecimento dos vasos condutores, devido à obstrução causada pela ação do fungo. Nas épocas mais úmidas, ocorre nos tecidos mortos à fase teleomórfica do fungo, os peritécios no seu interior formam os ascósporos, que são disseminados de forma aérea (FIGURA 1). Quando a doença inicia pela parte aérea, em plantas bem vigorosas, observa-se entre a folhagem verde escura, um ramo plagiotrópico amarelado. Examinandose o ramo até o ponto de inserção no ramo ortotópico observa-se uma lesão escura na região do nó. Com o progresso da doença, essa lesão se estende para cima e para baixo do ramo principal causando o secamento de vários ramos (VENTURA; COSTA, 2004).

18 B C D E Figura 1 Sintomatologia da fusariose no campo. Nota: Plantas de pimenta-do-reino com sintomas de fusariose (A-B) Início da infecção as folhas amareladas, as raízes ficam apodrecidas, com o avanço da doença a planta fica desprovida das folhas e morre. O sintoma ocorre em reboleiras; (C-D) Planta morre subitamente as folhas ficam presas aos ramos plagiotrópicos e (E) planta com peritécios.

19 2.4 Epidemiologia A infecção radicular ocorre especialmente no período chuvoso nas áreas produtoras (de janeiro a maio), quando a umidade relativa do solo é alta. Em soja a maior dispersão da doença tem ocorrido em solos mal drenados. Temperaturas em torno de 22 a 24 ºC favorecem o desenvolvimento de sintomas na raiz e na parte aérea (SCHERM; YANG, 1996). Essas condições também favorecem o patossistema Fusarium x P. nigrum. Porém, os sintomas característicos do patógeno aparecem durante todo o ano. Além da umidade do solo, outros fatores que favorecem a doença são excesso de nitrogênio, além de estresse hídrico. Algumas lavouras mais velhas constituem importantes focos de disseminação do patógeno, ocasionando infecções nas novas plantações. A doença geralmente inicia-se em pequenas reboleiras, que posteriormente evoluem, tornando o pimental economicamente inviável (VENTURA; COSTA, 2004). O modo de penetração do fungo nas raízes ainda não foi completamente determinado. Provavelmente acontece de forma direta, isto é, a penetração ocorre durante a germinação de clamidósporos ou de macroconídios, que entram em contato com o sistema radicular das plantas como acontece no patossistema Fusarium x Glycine max (XING; WESTPHAL, 2006). 2.5 Diversidade de espécies do complexo Fusarium solani O complexo de espécies de Fusarium solani - FSSC (teleomorfo Haematonectria, Hypocreales, Ascomycota) compreende diversas espécies de patógenos associados a várias plantas cultivadas, além de patógenos de humanos e animais. Existem, ainda, espécies produtoras de toxinas, endófitas e saprófitas (ZHANG et al., 2006). A diversidade das populações é evidenciada pela

20 quantidade de formae speciales, patogenicidade específica a determinada planta (SNYDER; HANSEN, 1941). O conceito de espécie biológica empregado por Matuo e Snyder (1973) é muito importante para uma definição mais acurada para classificação de espécies, pois morfologia e formae speciales podem não refletir a real diversidade de espécies e populações no FSSC, já que os marcadores morfológicos são escassos, tanto para o anamorfo quanto para o teleomorfo. Além disso, pode omitir as verdadeiras relações filogenéticas, distribuição geográfica e variedade de hospedeiro desses patógenos. Dentro do complexo Fusarium solani - FSSC, as sete espécies biológicas, ou Mating Populations (MPs), descritas por Matuo e Snyder (1973) foram confirmadas como espécies filogenéticas distintas (O DONNELL, 2000). Além disso, Fusarium tucumaniae, um dos agentes etiológicos da Síndrome da Morte Súbita da Soja (SDS), é a oitava Mating Population do FSSC (COVERT et al., 2007). Análises filogenéticas de sequências de DNA confirmaram que o Fusarium solani é um complexo composto por, pelo menos, 47 espécies filogeneticamente distintas, anteriormente desconhecidas, devido à semelhança morfológica entre elas (O DONNELL, 2000; O DONNELL et al., 2008). Estudos baseados em filogenia evidenciam que as populações do FSSC são distribuídas em três clados distintos: no clado 1 estão F. illudens, e F. plagianthi, ambos da Nova Zelândia; o clado 2 é composto por isolados associados à PVR na Glycine max e à podridão radicular seca no Phaseolus vulgaris; no clado 3, agrupam-se patógenos de outras plantas e espécies de importância clínica dentro do FSSC (O DONNELL, 2000; O DONNELL et al., 2008).

21 Com este trabalho se propôs a investigar se a população associada à pimenta-do-reino corresponde a uma espécie filogenética e biológica dentro do complexo de espécies de Fusarium solani - FSSC.

22 3 MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Obtenção dos isolados Os 104 isolados de Fusarium solani utilizados no presente estudo foram obtidos de pimenta-do-reino (Piper nigrum), provenientes dos estados Bahia, Amapá, Espírito Santo e Pará. Culturas monospóricas dos isolados foram preservadas utilizando 3 métodos: Microtubos com discos esporulados; Castellani utilizando água destilada esterilizada, ambos os métodos foram armazenados a 10 o C, no escuro e crio preservadas, suspensão de esporos em 15% glicerol a -80 o C, na Coleção Micológica de Lavras (CML), Laboratório de Sistemática e Ecologia de Fungos, Departamento de Fitopatologia, Universidade Federal de Lavras (UFLA). Além destes, foram incluídos no estudo os isolados CML 46, CML 860, CML 2173, CML 1833 e os representantes das mating populations de FSSC e F. solani f.sp. piperis, cedidos pelo Serviço de Coleção de Cultura de Pesquisa Agrícola dos Estados Unidos, Agriculture Research Service Culture Collection - NRRL. 3.2 Extração de DNA e amplificação por PCR Os isolados foram cultivados em meio líquido à base de extrato de malte 2% por três dias, em temperatura ambiente e sob agitação de 100 rpm. A extração de DNA foi realizada utilizando o tampão CTAB (LESLIE; SUMMERELL, 2006). A amplificação do fragmento com 640pb do gene TEF dos isolados foi realizada utilizando os primers:

23 Ef - 1 (forward; 5 - ATGGGTAAGGAGGACAAGAC - 3 ) e Ef - 2 (reverse; 5 - GGAAGTACCAGTGATCATGTT-3 ) (O DONNELL; CIGELNIK; NIRENBERG, 1998). Para a amplificação do fragmento com 651pb da segunda maior subunidade da RNA polimerase (RPB2), foram utilizados os primers 5F2 (feverseorward; 5 -GGGGWGAYCAGAAGAAGGC-3 ) e 7cR (reverse; 5 - CCCATRGCTTGYTTRCCCAT-3 ) (O DONNELL et al., 2008). Para rdna foram amplificados 915pb utilizando os primers ITS5 (forward; 5 - GGAAGTAAAAGTCGTAACAAG G- 3 ) e NL4 (reverse; 5 -GGT CCG TGT TTC AAG ACG G- 3 ) (WHITE et al., 1990). As reações de PCR foram realizadas no termociclador My Cycler TM (BIO-RAD). As condições de ciclo para TEF-1 foram: 94 C, por 1 minuto; 34 ciclos: 94 C, por 30 segundos, 62 ºC, por 45 segundos, 72 C, por 1 minuto; 72 C, por 5 minutos (O DONNELL; CIGELNIK; NIRENBERG, 1998). Para RPB2, o programa de ciclos foi: 94 C, por 90 segundos; 40 ciclos: 94 C, por 30 segundos; 55 C, por 90 segundos e 1 ciclo 68 C, por 2 minutos; 68 C por 5 minutos (O DONNELL et al., 2008). Para ITS+28 rdna as condições de ciclo foram: 95 C, por 5 minuto; 35 ciclos: 94 C, por 40 segundos; 55 ºC, por 55 segundos; 72 C, por 5 minuto e 72 C, por 2 minutos. Os produtos da PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1% corado com GelRed (Biotium ), com posterior visualização realizada em um transluminador. Os fragmentos amplificados foram purificados utilizando-se o kit GenElute PCR Clean-up Kit (Sigma-Aldrich) para, posteriormente, serem sequenciados. 3.3 Sequenciamento e análises filogenéticas Os fragmentos gênicos foram sequenciados, nas direções senso e antisenso, em um sequenciador automático MEGA BACE, no Laboratório de

24 Genômica da Universidade Federal de Viçosa (UFV). Os eletroferogramas gerados foram analisados visualmente com o auxílio do programa SeqAssem (HEPPERLE, 2011) e as sequências editadas foram comparadas com a base de dados GenBank, do National Center for Biotechnological Information - NCBI (2012), por meio da ferramenta BLAST. Alinhamentos múltiplos das sequências de nucleotídeos foram gerados utilizando-se a ferramenta CLUSTALW (THOMPSON; HIGGINS; GIBSON, 1994), implementada pelo programa MEGA 5. Os alinhamentos foram corrigidos manualmente. A análise filogenética foi realizada pelo método de máxima parcimônia por meio do programa MEGA 5 (TAMURA et al., 2011). Sequências de referência correspondentes aos genes TEF; RPB2 e ITS-LSU rdna, previamente depositadas no GenBank, também foram acrescentadas às análises. 3.4 Testes de patogenicidade Com base nos resultados da análise filogenética, foram selecionados 35 isolados para serem avaliados quanto à sua capacidade de causar doença em mudas de Piper nigrum. O inóculo foi cultivado em placas de Petri de 9 cm, contendo meio BDA, e mantidas por sete dias sob uma temperatura de 25 C no escuro. Posteriormente, discos de micélio com aproximadamente 6 mm foram retirados de colônias desenvolvidas e introduzidos na posição do entrenó do caule (FIGURA 1) (ALBUQUERQUE; FERRAZ, 1976). As testemunhas receberam apenas discos do meio BDA sem o fungo. Para os experimentos, os tratamentos (isolados) foram arranjados em delineamento inteiramente casualizado com 4 repetições. O postulado de Koch foi completado por meio do reisolamento dos isolados inoculados no caule das plantas. O teste de patogenicidade foi realizado 2 vezes em períodos diferentes. As avaliações

25 foram realizadas de acordo com uma escala de notas (José Aires Ventura, 2010, não publicado) (TABELA 1), após período de 7 e 14 dias da inoculação de P. nigrum. Os dados foram analisados utilizando-se um pacote estatístico Sistema de Análise de Variância para Dados Balanceados Sisvar (FERREIRA, 2000) e as médias foram comparadas pelo teste de Tukey. Para testar a especificidade dos isolados patogênicos a P. nigrum fez-se inoculação cruzada para isso, foi utilizado o método de infestação do substrato com sementes de sorgo inoculadas com F. solani. O inóculo foi cultivado em placas de Petri de 9 cm, contendo meio BDA, por 7 dias, sob temperatura de 25 C, no escuro. Um disco de micélio, com aproximadamente 6 mm, foi retirado de colônias desenvolvidas e transferido para tubos de ensaio, contendo 3 g de grãos de sorgo, previamente autoclavados (60 minutos, a 121 C). Os tubos foram incubados à temperatura de 25 C, no escuro, por 15 dias. Para a inoculação, adotou-se o seguinte procedimento: foram preparados copos plásticos de 500 ml com substrato Plantimax. As covas de semeadura foram feitas com 4 cm de profundidade e foram adicionados grãos de sorgo colonizados, sendo, então, cobertos com uma camada de 2 cm de substrato. Em seguida, foram semeadas, separadamente, Glycine max, Pisum sativum, Cucumis melo e Passiflora edulis, sobre estas, outra camada do substrato, com aproximadamente 2 cm, para cobrir as sementes. Os copos foram mantidos em casa de vegetação, a temperatura de 25±3 ºC por 5 semanas. As testemunhas foram preparadas com sementes de sorgo não inoculadas (HARTMAN et al., 1997). Para os experimentos, os tratamentos (isolados) foram arranjados em delineamento inteiramente casualizado com 5 repetições. Para avaliação, foi realizada análise descritiva da presença ou da ausência de sintomas. O postulado de Koch foi completado por meio do reisolamento dos isolados inoculados em

26 raízes das plantas. O teste de patogenicidade foi realizado 2 vezes em períodos diferentes. Figura 2 Procedimento do teste de patogenicidade Nota: (A) Ferimento no caule; (B) Inserção do disco de micélio no caule da planta; (C) Câmara úmida - algodão com água destilada estéril envolto em fita; (D) Avaliação da testemunha após 14 dias - sem sintomas; (E) Avaliação do isolado não patogênico após 14 dias (CML 2222); (F) Avaliação do isolado patogênico após 14 dias (CML 2220).

27 Tabela 1 Escala de notas para identificação e avaliação da patogenicidade de isolados a Piper nigrum Nota Descrição 1 Sem sintomas perceptíveis 2 Sintomas muito leves no ponto de inoculação (lesão <5 mm) 3 Algumas folhas cloróticas, lesões nos entrenós (5-15 mm) 4 Folhas com clorose (lesão 15-20 mm) 5 Plantas com sintoma de murcha e clorose (lesão 20-25 mm) Clorose e murcha das folhas e ramos podem ocorrer que dos 6 entrenós (lesão 25-30 mm) Clorose, murcha e necrose limitada em cerca de 50% das folhas 7 e queda dos entrenós (lesão 30-35 mm) Sintomas severos ocorrem à queda dos entrenós (lesão >35 8 mm) Sintomas de desfolha severa, clorose e murcha em 75% das 9 folhas ou mais. Plantas mortas Fonte: José Aires Ventura, 2010, não publicado. 3.5 Teste de homotalismo Para evitar resultados positivos falsos nos cruzamentos, foram feitos testes de homotalismo. Foram realizados dois protocolos para verificar qual o melhor procedimento. No primeiro protocolo, isolados monoconidiais foram cultivados em placas de Petri de poliestireno (60 x 15 mm), contendo o meio de cultura CA e incubados a 25 ºC no escuro por 7 dias. Após o período de incubação, foram transferidos 2 ml de solução de Tween 80 a 2,5% (v/v) na superfície da colônia e espalhados utilizando uma alça de Drigalsky, para promover estresse nos isolados. As culturas foram incubadas a 22-23 ºC sob luz

28 constante por mais de 30 dias (COVERT et al., 2007). O segundo protocolo consistiu em transferir os isolados para tubos e placas contendo o meio SNA (synthetic nutrient-poor agar) e tubos contendo meio completo (MC), incubados a temperatura ambiente e a 20 ºC com fotoperíodo, por mais de 30 dias. Os testes foram repetidos por duas vezes, para a confirmação dos resultados (LESLIE; SUMMERELL, 2006). 3.6 Determinação de mating type e indução da fase sexuada Os mating types foram determinados pela amplificação do idiomorfo MAT1, utilizando os primers fusalphafor (CGCCCTCTKAAYGSCTTCATG) e fusalpharev (GGARTARAC YTTAGCAATYAGGGC), gerando um fragmento de 200 pb e do MAT2, utilizando os primers fushmgfor (CGACCTCCCAAYGCYTACAT) e fushmgrev (TGGGCGGTACTGGTARTCRGG) gerando um fragmento de 260 pb. Os primers e as condições da PCR seguiram de acordo com Kerényi et al. (2004). O produto da PCR foi submetido à eletroforese em gel de agarose a 1% para a visualização dos resultados. O comprimento dos fragmentos amplificados foi comparado com um marcador de comprimento de fragmentos 1 Kb. Foram realizados cruzamentos entre os isolados de Fusarium solani encontrados em P. nigrum, isolados representantes das sete mating populations e isolados de F. solani (COSTA, 2011), espécie biológica que induz sintomas de PVR em Glycine max no Brasil (TABELA 2). Os isolados de um determinado mating type, testados como parentais masculinos foram cultivados em tubo de ensaio contendo meio completo e mantidos a 20 C, sob fotoperíodo 12 h por sete dias. Os isolados do mating type oposto testados como parentais femininos, foram cultivados em placas de Petri de poliestireno (60 x 15 mm), em meio de CA, e mantidos a 25 C no escuro por

29 7 dias. Após o período de incubação, foi preparada uma suspensão de esporos no tubo de ensaio pela adição de 2 ml de solução Tween 80 a 2,5% (v/v), utilizando uma pipeta de Pasteur. Em seguida, a suspensão foi transferida para uma placa contendo o isolado de mating type oposto e, com o auxílio de uma alça de Drigalski, foi espalhada de modo a umedecer completamente o micélio. Os cruzamentos foram mantidos a 22-23 C, com luz branca fluorescente constante, por um período de até 6 semanas (COVERT et al., 2007; KLITTICH; LESLIE, 1988; LESLIE; SUMMERELL, 2006). As avaliações foram realizadas semanalmente e os cruzamentos foram considerados férteis quando os peritécios produzidos exsudavam ascósporos. Os cruzamentos foram repetidos 3 vezes, para confirmação dos resultados. 3.7 Análise morfológica da fase anamorfa e teleomorfa Os isolados foram cultivados em meio BDA para observação da taxa de crescimento, pigmentação da colônia e formação do micélio aéreo, após quatro dias de incubação a 25 C no escuro. Em SNA, após 10 a 14 dias de incubação a 20 C, com fotoperíodo de 12 horas, luz branca fluorescente, foram observadas as características micromorfológicas, como a presença ou não de esporodóquios e coloração; frequência, tamanho, formato e origem de microconídios e macroconídios; tipos de fiálides e de clamidósporos (AOKI et al., 2003). As estruturas da fase sexuada foram caracterizadas, realizando medição do diâmetro do peritécio, comprimento e largura dos ascos e de ascósporos e verificação do número de septos. Foram realizadas 20 medidas de cada estrutura, as quais serviram para a comparação com as outras espécies biológicas de F. solani, já descritas na literatura (COVERT et al., 2007; ROSSMAN; SAMUELS, 1999).

30 4 RESULTADOS 4.1 Obtenção de isolados Foi obtido um total de 104 isolados de F. solani, destes, 102 foram oriundos de P. nigrum com sintomas de fusariose; um isolado oriundo de P. tuberculatum e um isolado de P. arboreum. Cinco isolados foram obtidos de material do estado do Amapá. Além destes, foram incluídos no estudo isolados de Fusarium solani CML 46, CML 860, CML 2173, CML 1833 e os representantes das mating populations de FSSC e F. solani f.sp. piperis, cedidos pelo Serviço de Coleção de Cultura de Pesquisa Agrícola dos Estados Unidos, Agriculture Research Service Culture Collection NRRL (TABELA 2).

31 Tabela 2 Isolados de Fusarium solani analisados neste estudo CML a Outro código cde Espécie Origem geográfica Substrato 2193 AV1 F. solani Nilo Peçanha, BA P. nigrum 2 2194 b AV2 F. solani Nilo Peçanha, BA P. nigrum Nd 2195 b AV3 F. solani Ituberá, BA P. nigrum Nd 2196 AV4 F. solani Ituberá, BA P. nigrum 2 2197 AV5 F. solani Ituberá, BA P. nigrum 2 2198 b AV6 F. solani Ituberá, BA P. nigrum Nd 2199 b AV7 F. solani Ituberá, BA P. nigrum Nd 2200 AV8 F. solani Ituberá, BA P. nigrum 1 2201 AV9 F. solani f.sp.piperis Ituberá, BA P. nigrum 1 2202 AV11 F. solani Ituberá, BA P. nigrum 1 2203 b AV12 F. solani Ituberá, BA P. nigrum Nd 2204 AV13 F. solani Ituberá, BA P. nigrum 1 2205 AV14 F. solani f.sp.piperis Ituberá, BA P. nigrum 1 2186 AV15 F. solani f.sp.piperis Valença, BA P. nigrum 2 X 2206 AV16 F. solani Valença, BA P. nigrum 1 X 2187 AV17 F. solani f.sp.piperis Valença, BA P. nigrum 1 X 2188 AV18 F. solani f.sp.piperis Valença, BA P. nigrum 1 X 2189 AV19 F. solani f.sp.piperis Valença, BA P. nigrum 1 X 2190 AV22 F. solani f.sp.piperis Valença, BA P. nigrum 2 X 2207 AV25 F. solani f.sp.piperis Taperoá, BA P. nigrum 2 2208 AV26 F. solani Taperoá, BA P. nigrum 2 Mating type f Peritécio campo

32 Tabela 2, continuação CML a Outro código cde Espécie Origem geográfica Substrato 2209 AV27 F. solani f.sp.piperis Taperoá, BA P. nigrum 1 2210 AV28 F. solani f.sp.piperis Taperoá, BA P. nigrum 1 2211 AV29 F. solani f.sp.piperis Taperoá, BA P. nigrum 1 2212 AV30 F. solani Taperoá, BA P. nigrum 1 2191 AV31 F. solani f.sp.piperis Taperoá, BA P. nigrum 2 X 2213 AV33 F. solani Taperoá, BA P. nigrum 1 2214 AV34 F. solani Taperoá, BA P. nigrum 2 2215 AV35 F. solani Taperoá, BA P. nigrum 1 2216 AV36 F. solani Taperoá, BA P. nigrum 1 2217 AV37 F. solani Taperoá, BA P. nigrum 1 2218 AV38 F. solani Taperoá, BA P. nigrum 1 2219 AV40 F. solani Taperoá, BA P. nigrum 2 2220 AV50C F. solani f.sp. piperis Porto Grande, AP P. nigrum 1 2221 AV50F F. solani Porto Grande, AP P. nigrum 1 2222 AV51 F. solani Porto Grande, AP P. nigrum 2 2223 AV52 F. solani Porto Grande, AP P. nigrum 2 2224 AV54 F. solani Porto Grande, AP P. nigrum 1 2281 AV62 F. solani São Mateus, ES P. nigrum 2 2282 AV63 F. solani São Mateus, ES P. nigrum 2 2283 AV64 F. solani Jaguaré, ES P. nigrum 1 2284 AV65 F. solani Jaguaré, ES P. nigrum 2 2285 AV66 F. solani Jaguaré, ES P. nigrum 2 2286 AV67 F. solani Jaguaré, ES P. nigrum 1 Mating type f Peritécio campo

33 Tabela 2, continuação CML a Outro código cde Espécie Origem geográfica Substrato 2287 AV68 F. solani Jaguaré, ES P. nigrum 1 2288 AV69 F. solani Jaguaré, ES P. nigrum 2 2289 AV70 F. solani Sooretama, ES P. nigrum 2 2290 AV71 F. solani Sooretama, ES P. nigrum 1 2291 AV72 F. solani Sooretama, ES P. nigrum 1 2292 AV73 F. solani Sooretama, ES P. nigrum 1 2293 AV74 F. solani Sooretama, ES P. nigrum 1 2294 AV75 F. solani Sooretama, ES P. nigrum 1 2295 AV76 F. solani Sooretama, ES P. nigrum 1 2296 AV77 F. solani Sooretama, ES P. nigrum 2 2297 AV78 F. solani Sooretama, ES P. nigrum 1 2298 AV80 F. solani Sooretama, ES P. nigrum 1 2299 AV81 F. solani Sooretama, ES P. nigrum 1 2300 AV82 F. solani Sooretama, ES P. nigrum 1 2301 AV83 F. solani Sooretama, ES P. nigrum 1 2302 AV84 F. solani Sooretama, ES P. nigrum 1 2308 AV89 F. solani Sooretama, ES P. nigrum 1 2303 AV96 F. solani Jaguaré, ES P. nigrum 1 2304 AV97 F. solani Jaguaré, ES P. nigrum 1 2305 AV108 F. solani Jaguaré, ES P. nigrum 1 2306 AV61 F. solani São Mateus, ES P. nigrum 2 2307 AV60 F. solani São Mateus, ES P. nigrum 1 2465 AV412 F. solani f.sp.piperis Jaguaré, ES P. nigrum 2 Mating type f Peritécio campo

34 Tabela 2, continuação CML a Outro código cde Espécie Origem geográfica Substrato 2466 AV413 F. solani f.sp.piperis Jaguaré, ES P. nigrum 2 2467 AV415 F. solani Jaguaré, ES P. nigrum 2 2468 AV420 F. solani Linhares, ES P.nigrum 2 2464 E-628 F. solani f.sp. piperis Linhares, ES P. nigrum 2 2489 AV414 F. solani Jaguaré, ES P. nigrum 2 2490 AV408 F. solani Linhares, ES P. nigrum 2 2491 AV 411 F. solani Jaguaré, ES P. nigrum 2 2488 AV416 F. solani Linhares, ES P. nigrum 2 2340 AV201 F. solani Castanhal, PA P. nigrum 2 X 2341 AV203 F. solani Tomé-Açú, PA P. nigrum 2 2342 b AV204 F. solani Castanhal, PA P. nigrum Nd 2343 AV205 F. solani Tomé-Açú, PA P. nigrum 2 X 2344 AV206 F. solani Tomé-Açú, PA P. nigrum 2 X 2345 AV207 F. solani Castanhal, PA P. nigrum 2 X 2346 AV210 F. solani Tomé-Açú, PA P. nigrum 2 2347 AV211 F. solani Castanhal, PA P. nigrum 2 X 2348 AV213 F. solani Tomé-Açú, PA P. nigrum 2 2349 b AV214 F. solani Castanhal, PA P. nigrum Nd X 2350 AV221 F. solani Tomé-Açú, PA P. nigrum 1 X 2351 AV223 F. solani f.sp. piperis Tomé-Açú, PA P. nigrum 2 2352 AV224 F. solani Castanhal, PA P. nigrum 2 X 2353 AV225 F. solani f.sp. piperis Castanhal, PA P. nigrum 1 2354 AV226 F. solani Tomé-Açú, PA P. nigrum 2 X Mating type f Peritécio campo

35 Tabela 2, continuação CML a Outro código cde Espécie Origem geográfica Substrato 2355 AV227 F. solani Tomé-Açú, PA P. nigrum 2 X 2356 AV228 F. solani Tomé-Açú, PA P. nigrum 2 2357 AV230 F. solani f.sp. piperis Castanhal, PA P. nigrum 1 X 2358 b AV233 F. solani Castanhal, PA P. nigrum Nd X 2359 b AV234 F. solani Castanhal, PA P. nigrum Nd X 2360 AV235 F. solani Tomé-Açú, PA P. nigrum 2 2361 AV236 F. solani Tomé-Açú, PA P. nigrum 2 2362 b AV237 F. solani Tomé-Açú, PA P. nigrum Nd X 2363 AV238 F. solani Tomé-Açú, PA P. nigrum 2 X 2366 AV240 F. solani Tomé-Açú, PA P. nigrum 2 2365 CMM3617 F. solani f. sp.piperis Baião, PA P. nigrum 1 2364 CMM3618 F. solani f.sp. piperis Baião, PA P. nigrum 1 2463 AV301 F. solani Belém, PA P. arboreum 2 2462 AV302 F. solani Belém, PA P. tuberculatum 2 1833 Fusarium sp. Cristalina, GO Glycine max 1 860 Fusarium sp. Distrito Federal Glycine max 2 46 F. striatumi S. Rita de Caldas, MG Solanum tuberosum Nd 2173 F. solani Sebast. Laranjeira, BA Passiflora edulis 1888 b NRRL22570 F. solani f.sp. piperis Brasil P. nigrum 2 1889 NRRL22098 F. solani f.sp. cucurbitae MP-I EUA Cucurbita sp. 2 1894 NRRL22400 F.solani f.sp. batatas MP-II EUA Ipomoea batatas 1 2167 NRRL22157 F. solani f.sp. mori MP-III Japão Morus alba 1 Mating type f Peritécio campo

36 Tabela 2, conclusão CML a Outro código cde Espécie Origem geográfica Substrato 1884 NRRL22163 F.solani f.sp. xanthoxyli MP-IV Japão Xanthoxylum piperitum 2 1895 NRRL22141 F. solani f.sp. cucurbitae MP-V Nova Zelândia Cucurbita sp. 1 2169 NRRL22278 F. solani f.sp. pisi MP-VI EUA Pisum sativum 2 1885 NRRL22586 F. solani f.sp. robiniae MP-VII EUA Robinea pseudoacacia 2 Mating type f Peritécio campo a CML = Coleção Micológica de Lavras, Departamento de Fitopatologia, Universidade Federal de Lavras, Lavras, Minas Gerais, Brasil; b Homotálico; c AV = Aline Vaz coleção; d CMM = Coleção de Culturas de Fungos Fitopatogênicos "Prof. Maria Menezes"; e NRRL = Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois, EUA; f MAT - Mating type dos isolados identificados por PCR. MAT-1 = 1; MAT-2 = 2; nd = não determinado

37 4.2 Análise filogenética Primeiramente foi realizada a análise de Máxima Parcimônia com sequências parciais do gene TEF utilizando 47 sequências de F. solani associados a P. nigrum e P. arboreum. Foi gerada uma árvore cuja topologia mostrou com base nas sequências dos isolados de P. nigrum, que estes ficam separados em 10 linhagens filogenéticas distintas, agrupadas no clado 3 do Complexo de espécies Fusarium solani (FIGURA 3). O clado principal incluiu um isolado de referência NRRL22570 de F. solani f.sp. piperis, utilizado no trabalho de O Donnell (2000), com suporte de 100% bootstrap. Uma outra linhagem, composta por sequências de isolados homotálicos, agrupou com Haematonectria ipomoeae (NRRL 22147). As demais linhagens foram compostas por isolados heterotálicos. O isolado CML 2360 agrupou com a f.sp. batatas MPII com 84% de boostrap, o isolado CML 2206 agrupou com F. ensiforme com 86% de boostrap e o isolado CML 2223 agrupou com F. pseudoensiforme com 97% de boostrap. As cinco linhagens heterotálicas restantes tiveram em seus agrupamentos somente sequências de isolados oriundos de P. nigrum. Duas delas tiveram como grupo irmão a espécie biológica que causa PVR na soja no Brasil o Fusarium sp. Entretanto, nenhuma das 9 linhagens foram patogênicas a P. nigrum como comprovado no teste de patogenicidade. Com base nos agrupamentos de TEF foram geradas árvores filogenéticas de Máxima Parcimônia para cada região genômica em separado foram selecionadas 21 sequências de F. solani associados a P. nigrum e P. arboreum para RPB2 (FIGURA 4) e 29 sequências de F. solani associados a P. nigrum e P. arboreum para as regiões ITS-LSU rdna (FIGURA 5). Estas análises geraram topologias congruentes a de TEF, em que formou se um grupo monofilético com isolados de oriundos de P. nigrum patogênicos e o isolado

38 NRRL22570 de F. solani f.sp. piperis com 95% bootstrap para RPB2 e 93% bootstrap para ITS-LSU rdna. Baseado nestes resultados, foi realizada uma análise combinada das sequencias destas três regiões gênicas (FIGURA 6) cuja topologia gerada confirma as topologias anteriores em que os isolados de oriundos de P. nigrum patogênicos e o isolado NRRL22570 de F. solani f.sp. piperis agruparam-se juntos formando um grupo monofilético suporte de 99% bootstrap.

39 Figura 3 Árvore filogenética de Máxima Parcimônia para o gene TEF-1α de espécies do complexo Fusarium solani, incluindo os isolados de fusariose de Piper nigrum (Clado em negrito) Nota: Um ponto negro ao lado do número do isolado indica que são homotálicos. Os valores de bootstrap (1000 repetições) são indicados em percentagem acima dos internódios. Esta árvore tem como raiz F. plagianthi NRRL22632 e F. iludens NRRL22090. MP= Mating populations. CML= Coleção Micológica de Lavras; NRRL= Northern Regional Research Laboratory e GJS= Collection of Gary J. Samuels. MAFF = Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries, Tsukuba, Ibaraki, Japão.

40 Figura 4 Árvore filogenética de Máxima Parcimônia para o gene RPB2, de espécies do complexo Fusarium solani, incluindo os isolados de fusariose de Piper nigrum (Clado em negrito) Nota: Os valores de bootstrap (1000 repetições) são indicados em percentagem acima dos internódios. Esta árvore tem como raiz F. plagianthi NRRL22632 e F. iludens NRRL22090. MP= Mating populations. CML= Coleção Micológica de Lavras; NRRL= Northern Regional Research Laboratory e BBA: Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft, Braunschweig, Germany.

41 Figura 5 Árvore filogenética de Máxima Parcimônia para o gene ITS-LSU rdna, de espécies do complexo Fusarium solani, incluindo os isolados de fusariose de Piper nigrum (Clado em negrito) Nota: Os valores de bootstrap (1000 repetições) são indicados em percentagem acima dos internódios. Esta árvore tem como raiz F. plagianthi NRRL22632 e F. iludens NRRL22090. MP= Mating populations. CML= Coleção Micológica de Lavras; NRRL= Northern Regional Research Laboratory e GJS= Collection of Gary J. Samuels.

42 Figura 6 Árvore filogenética de Máxima Parcimônia de sequências combinadas de TEF, RPB2 e ITS-LSU rdna e de espécies do complexo Fusarium solani, incluindo os isolados de fusariose de Piper nigrum (negrito) Nota: Os valores de bootstrap (1000 repetições) são indicados em percentagem acima dos internódios. Esta árvore tem como raiz F. plagianthi NRRL22632 e F. iludens NRRL22090. MP= Mating populations. CML= Coleção Micológica de Lavras; NRRL= Northern Regional Research Laboratory.

43 4.3 Verificação da patogenicidade do isolados De acordo com os resultados da análise filogenética de sequencias de TEF, foram selecionados 16 isolados de F. solani f.sp. piperis, que formaram um grupo monofilético junto ao isolado NRRL22570 utilizado no trabalho de O Donnell (2000). Também foram selecionados quatro isolados homotálicos de F. solani oriundos de P. nigrum e seis isolados heterotálicos também oriundos de P. nigrum, que ficaram espalhados pelo clado 3, além de cinco isolados provenientes de outras culturas. Todos esses isolados foram testados pelo método de disco de micélio com ferimento no caule, sob as mesmas condições de temperatura, luminosidade e irrigação (TABELA 3). Para verificação da patogenicidade foram utilizadas 140 plantas sendo que 76 foram inoculadas com F. solani f.sp. piperis obtendo um total de 89% de plantas com sintoma de fusariose. No local da inoculação foi evidenciada uma lesão escura que, com o progresso da doença, se estendeu para cima e para baixo do ramo principal, causando o secamento (FIGURA 7 e 8). As 64 plantas inoculadas com outros isolados não desenvolveram sintomas. Nenhuma das plantas testemunhas apresentou sintomas. Os isolados patogênicos recuperados das plantas apresentaram culturas típicas dos isolados inoculados, completando os postulados de Koch. No teste de especificidade de hospedeiro foi utilizado o método de infestação do substrato com sementes de sorgo inoculadas. Os dois isolados patogênicos a P. nigrum (CML 2201 e CML 2220) do experimento anterior, não induziram sintomas de fusariose em plantas de melão, ervilha, maracujá e soja. Entretanto, o isolado CML 860 foi patogênico a Glycine max e o isolado CML 2173 patogênico a Passiflora edulis (TABELA 3; FIGURA 9).

44 Tabela 3 Isolados utilizados no teste de patogenicidade Código a Origem Espécie Substrato Notas g Patogênico geográfica CML 2186 b F. solani f.sp. piperis Valença, BA Piper nigrum 6,00 Sim CML 2187 b F. solani f.sp. piperis Valença, BA Piper nigrum 6,75 Sim CML 2353 F. solani f.sp. piperis Castanhal, PA Piper nigrum 9,00 Sim CML 2364 F. solani f.sp. piperis Baião, PA Piper nigrum 6,75 Sim CML 2351 F. solani f.sp. piperis Tomé-Açú, PA Piper nigrum 1,25 Não CML 2357 b F. solani f.sp. piperis Castanhal, PA Piper nigrum 7,25 Sim CML 2189 b F. solani f.sp. piperis Valença, BA Piper nigrum 1,00 Não CML 2190 b F. solani f.sp. piperis Valença, BA Piper nigrum 6,25 Sim CML 2201 F. solani f.sp. piperis Ituberá, BA Piper nigrum 4,00 Sim CML 2205 F. solani f.sp. piperis Ituberá, BA Piper nigrum 9,00 Sim CML 2209 F. solani f.sp. piperis Taperoá, BA Piper nigrum 8,25 Sim CML 2220 F. solani f.sp. piperis Porto Grande, AP Piper nigrum 4,25 Sim CML 2210 F. solani f.sp. piperis Taperoá, BA Piper nigrum 7,75 Sim NRRL22570 F. solani f.sp. piperis - Piper nigrum 7,25 Sim CML 2464 F. solani f.sp. piperis Linhares, ES Piper nigrum 8,50 Sim CML 2466 F. solani f.sp. piperis Jaguaré, ES Piper nigrum 9,00 Sim CML 2465 F. solani f.sp. piperis Jaguaré, ES Piper nigrum 8,00 Sim CML 2467 F. solani Jaguaré, ES Piper nigrum 1,00 Não CML 2468 F. solani Linhares, ES Piper nigrum 1,00 Não CML 2198 d F. solani Ituberá, BA Piper nigrum 1,00 Não CML 2195 d F. solani Ituberá, BA Piper nigrum 1,00 Não CML 2349 bd F. solani Castanhal, PA Piper nigrum 1,00 Não CML 2199 d F. solani Ituberá, BA Piper nigrum 1,00 Não CML 2203 d F. solani Ituberá, BA Piper nigrum 1,00 Não CML 46 d Santa Rita de Solanum F. striatum 1,00 Não Caldas, MG tuberosum CML 2206 F. solani Valença, BA Piper nigrum 1,00 Não CML 2219 F. solani Taperoá, BA Piper nigrum 1,00 Não CML 2222 F. solani Porto Grande, AP Piper nigrum 1,00 Não CML 2282 F. solani São Mateus, ES Piper nigrum 1,00 Não CML 2223 F. solani Porto Grande, AP Piper nigrum 1,00 Não CML 2173 f Sebastião Passiflora F. solani 1,00 Não Laranjeira, BA edulis CML 2355 b F. solani Tomé-Açú, PA Piper nigrum 2,50 Não CML 860 e Fusarium sp. Distrito Federal Glycine max 1,00 Não

45 Tabela 3, conclusão Código a Espécie Origem geográfica CML 2463 F. solani Belém, PA CML 2462 F. solani Belém, PA a Substrato Notas g Patogênico Piper arboreum Piper tuberculatum 1,00 Não 1,00 Não Nota: CML = Coleção Micológica de Lavras, Departamento de Fitopatologia, Universidade Federal de Lavras, Lavras, Minas Gerais, Brasil; b Ascósporo do c substrato natural; Isolado depositado no Genbank (ALBUQUERQUE; FERRAZ, 1976); d Homotálicos; e Isolado que induz PVR em Glycine max; f Isolado patogênico Passiflora edulis; g Nível de patogenicidade do isolado (Escala de notas José Aires Ventura, 2010, não publicado).

46 Figura 7 Fases da sintomatologia da fusariose Nota: Teste de patogenicidade com isolado CML 2190 em casa de vegetação (A-F): (A) Testemunha; (B) Início da necrose; (C) Expansão do apodrecimento da base do caule; (D) Amarelecimento e apodrecimento do entrenó do caule; (E) Rompimento do entrenó; (F) Morte da planta.

47 Figura 8 Níveis de agressividade dos isolados, de acordo com a escala de notas (Tab. 1, p. 27) Nota: Teste Tukey 5% de probabilidade.

48 Figura 9 Testes de patogenicidade com plantas de ervilha, melão, soja e maracujá Nota: A-E: Inoculação em planta de ervilha; F-J: Inoculação em planta de melão; K-O: Inoculação em planta de soja; P-T: Inoculação em planta de maracujá; (A; F; K; P): Testemunhas; (B; G; L ; Q): CML 2201; (C; H; M; R): CML 2220; (D; I; N; S): CML 2173;( E; J; O; T): CML 860.

49 4.4 Teste de homotalismo Dos 104 isolados obtidos de P. nigrum, dez foram homotálicos (TABELA 2). Quatro destes isolados homotálicos foram provenientes de plantas com peritécios em campo, agruparam com Haematonectria ipomoeae (NRRL 22147) e não foram patogênicos. Em ambos os protocolos utilizados, no meio CA a incubação de 22-23 ºC e nos meios SNA e MC e temperatura de 20 ºC, uma semana após a inocubação, ocorreu a formação de peritécios, que exsudaram ascósporos após duas semanas. 4.5 Determinação de mating type e indução da fase sexuada Os 94 isolados heterotálicos tiveram seus mating types determinados. Destes, 46 isolados pertencem ao idiomorfo MAT-1 sendo que 14 foram de F. solani f.sp. piperis. Outros 46 isolados pertencem ao idiomorfo MAT-2, sendo que 9 foram de F. solani f.sp. piperis. Um isolado foi obtido de P. arboreum e um de P. tuberculatum. A partir dos mating types determinados foram realizados alguns cruzamentos apenas entre isolados de F. solani f.sp. piperis que permitiram a seleção de isolados com alta fertilidade para serem utilizados como testadores CML 2187 (MAT-1) e CML 2186 (MAT-2). Os demais isolados foram então cruzados com os testadores. Dos 1034 cruzamentos realizados entre isolados de mating types opostos, foi obtido um total de 35 cruzamentos férteis (TABELA 4). Os cruzamentos entre F. solani f.sp. piperis e as Mating Populations descritas por Matuo e Snyder (1973), bem como com os isolados CML 860 (MAT-2) e CML 1833 (MAT-1) que causa PVR em Glycine max no Brasil, não produziram peritécios.

50 Tabela 4 Isolados que geraram cruzamentos férteis a (MAT1) a (MAT2) b (MAT2) c (MAT1) d CML 2187 X CML 2186 g CML 2186 X CML 2187 g X CML 2190 g X CML 2188 g X CML 2191 g X CML 2189 g X CML 2351 X CML 2201 X CML 2468 X CML 2209 X CML 2466 X CML 2220 X CML 2464 X CML 2365 X CML 2465 X CML 2364 X CML 2488 X CML 2353 CML 2188 X CML 2186 g X CML 2357 X CML 2190 g X CML 2210 X CML 2191 g X CML 2205 CML 2189 X CML 2186 g CML 2190 X CML 2187 g X CML 2190 g X CML 2188 g X CML 2191 g X CML 2189 g CML 2364 X CML 2186 CML 2191 X CML 2187 g CML 2365 X CML 2186 X CML 2188 g X CML 2189 g (MAT1) indica os isolados do mating type MAT1 férteis como parental feminino b (MAT2) indica os isolados do mating type MAT2 férteis como parental masculino c (MAT2) indica os isolados do mating type MAT2 férteis como parental feminino d (MAT1) indica os isolados do mating type MAT1 férteis como parental masculino e Testador MAT1 f Testador MAT2 g Isolados ascospóricos 4.6 Marcadores morfológicos da fase anamorfa e teleomorfa de F. solani f.sp. piperis Foram avaliados 16 isolados patogênicos a P. nigrum que cruzaram obtendo peritécios férteis e agruparam formando um grupo monofilético com alto suporte de boostrap para as três regiões gênicas. O crescimento dos isolados foi moderado em BDA, atingindo 23-37 mm de diâmetro. A coloração do

51 reverso das colônias variou de rosa a púrpura. Em SNA 20 C, os isolados apresentaram fiálides longas simples (27,5-167,5 x 2,5-5 μm), ocasionalmente ramificadas. Microconídios do micélio aéreo apresentaram formato elipsoidaloblongo, medindo (7,5-17,5 x 1,25-2,5 μm) com 1 septo mediu (7,5-30 x 1,25-3,7 μm, ocasionalmente 2 septos (22,5- x 2,5-3,7 μm). Macroconídios do micélio aéreo e esporodóquio apresentaram-se falcados, possuindo célula pé distinta da célula apical. Célula apical é mais afilada do que a célula pé. Conídios continham 3 septos e mediram (22,5-50,0 x 2,5-5 μm), 4 septos (30,0-60,0 x 3,7 μm) e ocasionalmente 5 septos (42,5-65,0 x 2,5-3,7 μm). Foi observada a presença de clamidósporos rugosos, solitários ou em dupla. Teleomorfo: peritécios de coloração vermelha, solitários ou em grupos, de formato globosos, medindo 250-400 x 200-300 μm, não papilados. Os ascos eram unitunicados, medindo 50-72,5 x 7,5-10 μm contendo 8 ascósporos bicelulares. Os ascósporos eram hialinos de formato elípticos, oblongo para fusiforme, septado, apresentando estrias, medindo de 10-12,5 x 7,5-11,3 μm (FIGURA 10).

52 Figura 10 Marcadores morfológicos do anamorfo e teleomorfo de F. solani f.sp. piperis Nota: (A) Colônia em BDA; (B) Monofiálide longa; (C) Macroconídio formado no micélio aéreo e produzido em monofiálides longas; (D) Microconídio produzido em monofiálides; (E) Clamidósporo; (F) Abundantes peritécios na planta de Piper nigrum; (G) Peritécios exudados em placa; (H) Peritécio visto em microscópio de luz; (I) Corte de peritécio visto em microscópio eletrônico; (J) Ascos contendo ascósporos; (K) Ascósporo germinando