UNIDADES DE TRANSCRIÇÃO PROCARIOTOS X EUCARIOTOS Adaptado de Lodish et al. (2000) Molecular Cell Biology, 4 nd edition, Freeman and Company, New York. (Fig 9.1)
RNA Polimerase Eucariótica 3 RNA polimerases que podem ser diferenciadas pela sensibilidade à α - amanitina.. Cada uma transcreve um tipo de RNA. Enzima Localização Produto Atividade Relativa Sensibilidade à α -amanitina RNA pol I Nucléolo rrna 50-70% Insensível RNA pol II Nucleoplasma mrna 20-40% Sensível RNA pol III Nucleoplasma trna; rrna 5S e pequenos RNAs nucleares ~10% Pouco sensível
Visão geral de um gene eucariótico transcrito pela RNA Polimerase II Adaptado de Lewin, B. (2000) Genes VII/Benjamin Lewin; trad. Henriue Ferreira... [et al.]. - Porto Alegre: Artmed Editora, 2001.
A RNA Polimerase eucariótica possui mais de 10 subunidades Adaptado de Lewin, B. (2000) Genes VII/Benjamin Lewin; trad. Henriue Ferreira... [et al.]. - Porto Alegre: Artmed Editora, 2001.
Adaptado de Nelson, D. and Cox, M., M. (2000). Lehninger Principles of Biochemistry, 3 nd edition, Worth Publishers.
Sequências comuns em Promotores reconhecidos pela RNA Polimerase II de eucariotos Py 2 CAPy 5 Adaptado de Nelson, D. and Cox, M., M. (2000). Lehninger Principles of Biochemistry, 3 nd edition, Worth Publishers. A maioria dos promotores possui a sequência TATA box a cerca de 25 pb a montante do sítio de início da transcrição (geralmente A) sequência curta, bem definida e com localização relativamente fixa com respeito ao sítio de início da transcrição ão; encontrada na grande maioria dos promotores dos eucariotos
TATA box é o sítio de interação da TBP (TATA binding protein) define o início da transcrição na maioria dos genes dependentes da RNA polimerase II. T 82 A 97 T 93 A 85 TATA box +1 85 A 63 (T 37 )A 88 88 21 a 29 pb A 50 região codante Além m do promotor básico, b os promotores eucariótiocos contêm ainda elementos de seqüência que são reconhecidos por fatores de transcrição que ativam ou reprimem a ação a destes promotores. Estes elementos podem ser divididos em dois grupos - Elementos proximais: encontrados logo acima (entre -200 e -100pb) - Elementos distais: encontrados a grande distância dos promotores (até -50 kpb) ) e podem ser localizados antes do promotor, após s o cistron ou mesmo em introns internos.
Todas as RNA polimerases têm em comun a TBP (TATA Binding Protein) ) que serve de elemento guia para os demais fatores gerais de transcrição. TBP liga-se ao DNA pela cavidade menor (virtualmente todas as proteínas que se ligam ao DNA o fazem pela cavidade maior). Forma uma cela curvando o DNA: o TATA box é curvado em direção à cavidade maior esta mudança na organização espacial do DNA parece gerar uma interação mais íntima entre os demais FTs e RNA Pol II com o DNA
As RNAs Polimerases eucarióticas são posicionadas em todos os Promotores por um fator que contém TBP Adaptado de Lewin, B. (2000) Genes VII/Benjamin Lewin; trad. Henriue Ferreira... [et al.]. - Porto Alegre: Artmed Editora, 2001.
O complexo de Transcrição é montado pela adição seqüencial encial de fatores basais. Montagem do complexo de iniciação: entrada orquestrada de vários fatores gerais de transcrição (fatores basais da transcrição) ão). A TBP está associada aos TAF (TBP Associated Factor) que dependendo da polimerase pode ser TAFI, TAFII ou TAFIII. A transcrição a partir da RNA pol II depende ainda de fatores específicos diversidade fenotípica encontrada nos diversos tipos celulares. Adaptado de Nelson, D. and Cox, M., M. (2000). Lehninger Principles of Biochemistry, 3 nd edition, Worth Publishers.
Reconhecimento de um promotor contendo TATA box: primeiras etapas 1) Ligação de TFIID em uma região que se estende a montante do TATA box; 2) TFIID ( cerca de 800 kda): TBP + TAFs (TAF II 00); 3) TFIIDs contendo diferentes TAFs podem reconhecer diferentes promotores alguns TAFs são tecido-espec específicos; 4) Os TAF II s podem ser encontrados em outros complexos: remodelamento da cromatina antes do início da transcrição ão; 5) TFIID é ubíquo mas não é único
Aspectos gerais da iniciação da transcrição eucariótica (RNA PolII) 1- TFIID se liga ao promotor (core) 2- TFIIA estabiliza o complexo TFIID/promotor 3- TFIIB se liga ao complexo TFIID/TFIIA e recruta a pol II para o promotor Watson, J.D et al (2008), Molecular Biology of the Gene, 6th edition, Pearson Benjamin Cummings
4- TFIIE e só depois TFIIH se ligam ao complexo polimerase/promotor 5- TFIIH participa de duas formas: -com sua atividade ATPásica desenrola a hélice do DNA (girase) - sua atividade de proteína quinase fosforila o CTD Watson, J.D et al (2008), Molecular Biology of the Gene, 6th edition, Pearson Benjamin Cummings
Elementos que regulam a transcrição pela RNA Polimerase II Elementos que agem em cis seqüências regulatórias rias Elementos que agem em trans Fatores de transcrição que se ligam aos elementos cis RNAs Regulatórios
Os promotores de metazoários são mais complexos
Promotores eucarióticos da RNA pol II: grande diversidade de sequências curtas eficiência e regulação da transcrição Adaptado de Lewin, B. (2000) Genes VII/Benjamin Lewin; trad. Henriue Ferreira... [et al.]. - Porto Alegre: Artmed Editora, 2001.
Os promotores normalmente respondem a múltiplos m sinais Ex: promotor de metalotioneína: proteção contra metais pesados Adaptado de Lewin, B. (2000) Genes VII/Benjamin Lewin; trad. Henriue Ferreira... [et al.]. - Porto Alegre: Artmed Editora, 2001.
Diversidade de elementos que agem em cis elementos basais elementos regulatórios Diversidade de fatores que agem em trans fatores da maquinaria basal natureza bimodular dos fatores de transcrição ativadores e repressores montagem sequencial e ordenada do complexo de iniciação da transcrição
Fatores de transcrição A transcrição pela RNA pol II é normalmente modulada por FTs que ao se ligarem aos elementos proximais ou distais ativam ou mesmo silenciam o promotor. Estes fatores são normalmente modulares ou seja, podem ser dissociados em domínios de ligação ao DNA (DBD: DNA Binding Domain) e domínios reguladores da transcrição ão.
Reguladores globais da expressão gênica natureza bimodular dos fatores de transcrição Ativadores bimodulares Domínios de ligação ao DNA Domínios de ativação Watson, J.D et al (2008), Molecular Biology of the Gene, 6th edition, Pearson Benjamin Cummings
Os Fatores de Transcrição são proteínas modulares Explique o resultado da figura ao lado (a e b) Os domínios são independentes Papel do domínio de ativação Watson, J.D et al (2008), Molecular Biology of the Gene, 6th edition, Pearson Benjamin Cummings
Adaptado de Lodish et al. (2000) Molecular Cell Biology, 4 nd edition, Freeman and Company, New York. Diagrma esquemático ilustrando a estrutura modular de ativadores da transcrição de eucariotos. Gal4 e GCN4 são ativadores da transcrição em levedura. GR é o receptor de glicocorticóide. SP1 liga-se a elementos ricos em G-C (G-C rich elements) no promotor de um grande número de genes de mamíferos.
A maquinaria basal interage com os vários v elementos ativadores
Os promotores do tipo II apresentam inúmeros elementos regulatórios rios que podem ser tecido específico ou estágio específico A transcrição do gene TTR (transthyretine) requer uma forte cooperatividade entre fatores regulatórios durante a montagem do complexo de iniciação. Nos hepatócitos, a transcrição do gene TTR é controlada por pelo menos 5 diferentes ativadores transcricionais específicos
Fatores de Transcrição Classificação em famílias Domínios: de ligação ao DNA de trans-ativa ativação (ou( repressão) de interação proteína na-proteína
3 importantes famílias de fatores de transcrição são descritas quanto ao tipo de domínio de ligação ao DNA 1) Hélice-Volta-Hélicelice 2) Dedos de Zinco 3) Leucine Zipper Ver nos slides disponibilizados no site de aulas as características gerais destas famílias de proteínas como uma curiosidade
Regulação Gênica em Eucariotos linfócito Neurônio
Diferentes níveis n de regulação da expressão gênica em eucariotos Remodelagem da cromatina Controle transcricional Controle pós-transcricional Controle do transporte do mrna Controle traducional Controle pós-traducional
Controle da expressão acontece principalmente em nível n de transcrição Acessibilidade à cromatina Iniciação da transcrição Processamento do RNA Tradução
Representação do core de Histonas de um nucleossomo Além das histonas, outras proteínas fazem parte da cromatina - HMGs (High Mobility Group): também muito abundantes; - Fatores de transcrição; - Proteínas associadas com a replicação
Organização dos nucleossomos Acessibilidade aos FTs e RNA Polimerase??
Controlando a Acessibilidade da cromatina aos FTs e à RNA Polimerase O grau de condensação da cromatina é regulado quimicamente diversas modificações químicas Acetilação ão: ação geralmente relaxante Histona acetil-transferases transferases (HATs) Histona desacetilases (HDACs) Metilação ão: : geralmente condensadora Fosforilação
Estrutura de cromatina e expressão gênica Nos organismos eucarióticos a estrutura da cromatina tem papel crucial na regulação da expressão gênica. O N-terminal das histonas projetado na superfície do nucleossomo é rico em resíduos de aminoácidos de LISINA (carregados positivamente interação forte com o fosfato do DNA) podem ser modificados reversivelmente por acetilação, metilação e fosforilação. As funções das modificações das histonas por acetilação/desacetilação são as mais bem conhecidas Controle da expressão gênica durante a intérfase Os ativadores e os repressores transcricionais regulam mudanças na estrutura da cromatina por acetilação/desacetilação do N-terminal das histonas alteração na acessibilidade da cromatina (ligação ao promotor) aos fatores gerais de transcrição
Ativadores direcionam alterações locais na estrutura da cromatina ativador recruta HAT promotor inacessível dentro da cromatina ativador recruta remodelador de nucleossomo promotor acessível Watson, J.D et al (2008), Molecular Biology of the Gene, 6th edition, Pearson Benjamin Cummings
Papel da desacetilação e hiperacetilação da cauda N-terminal de histonas no controle da transcrição em S. cerevisiae As desacetilases (HDACs) repressão da expressão de genes proteínas repressoras (UME6) FTs recrutam acetilases (histona acetilases - HATs) para o complexo de iniciação da transcrição proteínas ativadoras (GCN4) Adaptado de Lodish et al. (2000) Molecular Cell Biology, 4 nd edition, Freeman and Company, New York.
Controle da expressão acontece principalmente em nível n de transcrição Acessibilidade à cromatina Iniciação da transcrição Aparato basal de transcrição fatores de transcrição gerais e RNA pol Elementos de Resposta no DNA Promotor, Enhancer, Silencers, outras sequências Fatores de transcrição e proteínas acessórias Processamento do RNA Estabilidade do transcrito
Recrutamento dos fatores gerais de transcrição O promotor só garante um nível n basal de transcrição Genes constitutivos Ativadores e repressores controlam o recrutamento diferencial do aparato basal de transcrição O complexo Mediador Superfícies múltiplas m de interação
Ativação da iniciação da transcrição em eucariotos pelo recrutamento da maquinaria de transcrição Watson, J.D et al (2008), Molecular Biology of the Gene, 6th edition, Pearson Benjamin Cummings
Montagem do complexo de pre-iniciação na presença do Mediador, modificadores e remodeladores de nucleossomos e ativadores transcricionais Em adição aos fatores basais, ativadores recrutam outros complexos facilitação da montagem do complexo de pré-iniciação Watson, J.D et al (2008), Molecular Biology of the Gene, 6th edition, Pearson Benjamin Cummings
Diferentes modos de ação a de Repressores transcricionais Muito comuns em procariotos Em eucariotos,, mais comumente por remodelação da cromatina Como no caso de ativadores, pode haver resposta a um sinal molecular (presença a ou ausência de metabólitos litos) Watson, J.D et al (2008), Molecular Biology of the Gene, 6th edition, Pearson Benjamin Cummings
Repressão do gene gal1 em leveduras Mig1 Repressor transcricional específico (CreA, CreB outros organismos) Tup1 Repressor transcricional geral 1) + glicose: Mig liga-se a um sítio entre UASG e o promotor 2) Mig recruta o complexo repressor Tup1 3) Tup1 recruta desacetilase Watson, J.D et al (2008), Molecular Biology of the Gene, 6th edition, Pearson Benjamin Cummings
Insuladores bloqueiam a ativação por enhancers c) O ativador pode ativar outro promotor d) O promotor original pode ser ativado por outro enhancer ajusante Watson, J.D et al (2008), Molecular Biology of the Gene, 6th edition, Pearson Benjamin Cummings
Elementos importantes para a regulação da transcrição pela RNA Polimerase II Diversidade de elementos de sequência (elementos em cis) Diversidade de Fatores de Transcrição (elementos em trans) Modulação da atividade dos FTs (diversos mecanismos) Quem regula o regulador? síntese protéica do FT modificação covalente do FT interação de uma molécula ligante ao FT ligação do FT a um inibidor
Quem regula o regulador?
Adaptado de Lewin, B. (2000) Genes VII/Benjamin Lewin; trad. Henriue Ferreira... [et al.]. - Porto Alegre: Artmed Editora, 2001.
A expressão de muitos genes responde a estímulos extracelulares Os hormônios esteróides entram nas células e seus receptores transitam entre o citoplasma (na forma livre) e o núcleo (na forma ligada) Adaptado de Lewin, B. (2000) Genes VII/Benjamin Lewin; trad. Henriue Ferreira... [et al.]. - Porto Alegre: Artmed Editora, 2001.
Muitos promotores respondem a estímulos extra-celulares Alguns fatores de transcrição respondem a presença de hormônios como a corticóides, tiroxina ou ácido retinóico Hormônios esteróides entram na célula Estes receptores hormonais transitam entre o citoplasma (na forma livre) e o núcleo (forma ligada)
Estes fatores são relacionados estruturalmente
Outros estímulos sinalizam a partir do meio extracelular (Vias de Transdução de Sinais) Hormônios protéicos NÃO entram na célula Hormônios polipeptídicos não são internalizados e reconhecem receptores específicos na membrana citoplasmática, desencadeando uma cascata de eventos que levam a mensagem ao núcleo
Fator de Transcrição NFκB Regulação da Expressão Gênica em resposta a um sinal ambiental Sinal Externo Via Transdução de Sinal Ativação de um fator de Transcrição Tranporte para o núcleon Ativação da Transcrição de genes alvo (em resposta ao sinal extracelular)
Após a transcrição é gerado o pré-mrna núcleo síntese e maturação do pré-mrna mrna maduro citoplasma mrna maduro síntese de proteínas mrna maduro AUG UAA Cauda poli-a 5 3 CAP 5 UTR 3 UTR região codante UTR (untranslated region) - região 5 não traduzida
O processo de maturação do pré-mrna e os mecanismos de regulação deste processo: regulação do splicing