Regulação Gênica em Eucariotos.

Transcrição

1 Regulação Gênica em Eucariotos. As últimas estimativas são que uma célula humana, uma célula eucariótica, contenha aproximadamente genes. Alguns destes genes são expressos na célula todo o tempo. Eles são chamados genes constitutivos ( housekeeping ): que são responsáveis pelas funções metabólicas de rotina, como por exemplo a respiração, que é comum à todas as células. Alguns são expressos quando a célula entra em um padrão de diferenciação particular.

2 Alguns são expressos todo o tempo nestas células que tem um padrão de diferenciação particular. Exemplo: células do plasma expressam continuamente o gene para a síntese de anticorpo. Alguns são expressos somente quando as condições ao redor ou no interior da célula muda. Exemplo: a chegada de um hormônio pode ligar ou desligar certos genes numa determinada célula. (genes induzíveis)

3 A ênfase maior da regulação gênica em organismos multicelulares está n especificidade, na forma e função das célula em cada tecido. Genes eucariotos não são encontrados n forma de operons, Cada Gene tem sequências regulatórias específicas que são essenciais no controle da transcrição; Genes induzíveis: estes genes respondem a ameaças ou estímulos ambientais, tais como: ingestão de metais pesados, infecção viral, etc.

4 Como a expressão do gene é regulada? Há vários métodos usados pelos eucariotos: Alterando a taxa de transcrição de um gene. Esta é a estratégia mais importante e a mais amplamente utilizada (nós iremos examinar com mais detalhes). Entretanto, eucariotos possui vários outros métodos além da regulação a nível transcricional:

5 Alterando a taxa de processamento do RNA transcrito, enquanto ainda dentro do núcleo. (aula de processamento de RNA) Alterando a estabilidade da molécula de mrna, ou seja, a taxa na qual elas são degradadas. Alterando a eficiência na qual os ribossomos traduzem o mrna em um poli-peptídeo.

6 Genes que codificam proteínas possuem: Exons: sequências que codificam os poli-peptídeos; Introns: que serão removidos do mrna antes de sua tradução; O sítio de início da transcrição; Um promotor O promotor basal ou fundamental (core) localizado cerca de 40bp do sítio de iniciação; O promotor secundário (usptream), o qual pode estar localizado a mais que 200bp distante e anterior ao promotor principal; Acentuadores (enhancers) silenciadores

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8 Sítio de início da transcrição: Este é o local onde a molécula de RNA polimerase II (pol II) se liga. A pol II é um complexo de algumas proteínas diferentes (mostrada na figura em amarelo com pequenos círculos coloridos superpostos. O sítio de início é onde a transcrição do gene começa em mrna.

9 Fatores de transcrição Seqüência DNA-específicos TBP Proteína de ligação TATA

10 O promotor principal (core promotor): O promotor principal contêm a seqüência de 7 bases (TATAAAA) chamada de TATA box. Esta seqüência é reconhecida por fatores de transcrição IID (TFIID) o qual forma um complexo com mais de 10 proteínas diferentes incluindo a proteína de ligação TATA (TBP), a qual reconhece e se liga na TATA box.

11 O promotor principal é encontrado em todos os genes que codificam proteínas. Ao contrário do promotor secundário (upstream). Sua estrutua e fatores de ligação associados difere de gene para gene. Muitos genes diferentes e muitos tipos diferentes de células compartilham os mesmos fatores de transcrição não somente aqueles que se ligam no promotor principal, mas também alguns que se ligam nos secundários. O que liga um gene específico em uma determinada célula é provavelmente a combinação única dos sítio promotores e os fatores de transcrição que são escolhidos.

12 Uma analogia: As fileiras de caixas de segurança num banco: Para abrir uma caixa em particular na sala, são requeridas duas chaves: Sua chave, cujo padrão serve somente na fechadura da caixa reservada para você (= o promotor secundário), mas Essa chave sozinha não consegue destrancar a caixa sem a chave carregada pelo empregado do banco, que pode ativar o mecanismo de destrave de qualquer caixa (= o promotor principal), mas ela sozinha não abre nenhuma caixa.

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14 DNA Empacotamento, metilação, rearranjos, amplificação, Heterocromatina, Inativação-X, organização do DNA Nuclear Transcrição em RNA Promotores, acentuadores, fator de transcrição, proteínas de liga repressores RNA Funcional Pré-tradução Adição de CAP, cauda Poli A, splicin Splicing alternativo Degradação do mrna Citoplasma Tradução Proteína Proteína ativa Ligação no ribossomo, Regulação do produto final Quebras, dobras, fosforilação

15 Hormônios funcionam como fatores de transcrição Os hormônios exercem muitos de seus efeitos pela formação de fatores de transcrição. Os complexos de hormônios com seus receptores representam uma classe de fatores de transcrição elementos de reposta hormonal cujo complexo se liga nos sítios dos promotores.

16 Acentuadores (enhancers) Acentuadores: são sítios de reconhecimento de proteínas ativadoras. Essas proteínas estimulam a transcrição pela interação física com a RNA polimerase e outros fatores transcricionais que se ligam ao promotor. -são localizados longe dos seus promotores (milhares d bases distantes, -podem estar anteriores ou posteriores aos promotores que controlam, - a interação requer a formação de DNA looping.

17 Acentuadores

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22 Silenciadores Silenciadores são regiões de controle do DNA, que como os acentuadores, podem estar localizados milhares de bp longe do gene que eles controlam. No entanto, quando os fatores de transcrição se ligam à eles, a expressão do gene que eles controlam é reprimida.

23 Isoladores (insulators): Problema: Nós vimos que os acentuadores podem se ligar nos promotores dos genes localizados milhares de bp distantes. O que impede um acentuador de se ligar inapropriadamente e ativar o promotor de algum outro gene na mesma região do cromossomo? Resposta: um isolador

24 Genes adjacentes (genes codificando RNA e aqueles codificando proteínas) são geralmente separados por um isolador (insulator). A função do isolador é impedir a atuação desordenada entre os seus promotores e acentuadores (e/ou silenciadores)

25 Isoladores são: Segmentos de DNA (~ 42bp) Localizados entre: acentuadores e promotores e ou silenciadores e promotores de genes adjacentes. Sua função é impedir um gene de ser influenciado pela ativação ou repressão dos seus vizinhos.

26 Exemplo: O acentuador para o promotor do gene para a cadeia delta do receptor de célula T gamma/delta está localizado próximo do promotor para a cadeia alfa do receptor alfa/beta no cromossomo 14 humano. Há um isolador entre o promotor do gene alfa e o promotor do gene delta que garante que a ativação de um não se espalhe sobre o outro

27 Todos os isoladores descobertos até o momento em vertebrados, funcionam somente quando ligados por uma proteína chamada CTCF (fator de ligação CCCTC). Denominada pela sequência de nucleotídeos encontrada em todos os isoladores. CTCF tem 11 zinc fingers.

28 (Adapted from N. Pavletich and C. Pabo, Science252: , the AAAS

29 Controle Transcricional : Inativação de Genes O DNA é empacotado numa forma bastante compacta. A estrutura dos cromossomos determina se os genes podem ser ativamente transcritos. Heterocromatina e eucromatina: hetorocromatina é em grande parte inativa como molde para a síntese de RNA.

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31 Os Puffs em cromossomos politênicos: eucromatina. Eucromatina: a porção mais ativa do genoma dentro do núcleo da célula.

32 Corpúsculos de Barr: cromossomo X condensado, inativo em células somáticas femininas. Metilação do DNA. Rearranjos do DNA

33 Demonstração da inativação do cromossomo X Num estágio precoce do desenvolvimento embrionário em indivíduos com mais de um cromossomo X por célula, o cromossomo X extra se condensa, tornando-se heterocromático, e os seus genes não são mais transcritos.

34 Em mamíferos, o cromossomo X que sofre o processo de inativação é escolhido ao acaso de célula para célula. Uma vez que um cromossomo X torna-se inativo, ele permanece inativo nas células filhas derivadas a partir da célula original. Isto resulta em um efeito mosaico no indivíduo e pode ser demonstrado em humanos e outros mamíferos.

35 Regulação pós-transcricional Splicing alternativo do transcrito primário do mrna: Um único gene pode codificar 2 ou mais proteínas diferentes. Frequentemente isto é o resultado de 1 ou mais introns não serem retirados do transcrito. Anticorpos são exemplos típicos.

36 Duas proteínas Kinases levemente diferentes são produzidas a partir do gene src porque a sequencia do exon A é incluída somente nas células nervosas. A forma neural desta proteína Src apresenta maior atividade. (After J.B. Levy et al., Mol. Cell Biol. 7: , 1987.)

37 Fatores que influenciam a Regulação á nível da tradução e pós-tradução: Fatores que influenciam a tradução: 3 fatores principais afetam a taxa de tradução de um mrna Localização do mrna na célula Taxa de tradução Estabilidade do mrna A cauda poli-a é importante para a estabilidade da molécula quanto maior, mais estável. O tempo de vida do mrna varia de 10min a > 24 horas.

38 Fatores que influenciam a pós-tradução: Outros fenômenos interessantes causam alterações na proteína (encurtamento): Alterações no mrna para produzir um stop codon. Iniciação da tradução AUG alternativa. Splicing (processamento) da proteína

39 Regulação da expressão gênica em Eucariotos: Alguns exemplos Transcricional Tecido/órgão específico Albumina de mamífero Resposta a metais pesados Gene metalothioneína Luz-induzível Gene rubisco Tradução Disponibilidade dependente de metal Ferritina de mamífero

40 Transcricional - Tecido/órgão específico Gene da Albumina de mamífero As células do fígado fazem muitas enzimas e secretam muitas proteínas que não são sintetizadas por outras células. A albumina (ALB), uma glicoproteína, é expressa somente no fígado de adultos. No útero a proteína é expressa no fígado e no intestino, com somente a expressão fígado-específica continuando até a vida adulta. O gene possui 20-22Kb de comprimento, com 15 exons,

41 A expressão apropriada da transcrição é devido a presença de: 6 elementos dentro dos 150bp upstream da +1 (Cada elemento é o sítio de ligação para um fator de transcrição específico) Estes elementos conferem a especificidade do fígado. Um acentuador a a acentuadores aproximadamente a dowstream

42 Luz-induzível Gene rubisco = ribulose-1, 5-bisfosfato carbaxilase. Rubisco (rbc5) é uma enzima crítica na fotossíntese. Rbc5 é uma família de 5 genes na maioria das plantas, com especificidades diferentes em cada tecido. Todos os genes rcb5 são induzíveis pela luz (controle transcricional) Transcrição: Baixo nível de transcrição é mediado pelas sequências localizadas dentro da região 90 do DNA. A máxima expressão na luz requer a ação das seqüências 975 a 90 do DNA. Os fatores de transcrição envolvidos ainda não estão identificados.

43 Tradução Disponibilidade dependente de metal Ferritina de mamífero A ferritina é uma proteína de estocagem intracelular para Fe A síntese da ferritina é regulada á nível da tradução, pela disponibilidade do Fe. Os Níveis de mrna são independentes do Fe. A extremidade 5 forma uma alça de 43bp(IRE = Iron responsive element) contêm uma seqüência repet Invertida. 5 mrna 3 O IRE bloqueia o acesso do ribossomo ao mrna quando o Fe é limitado; Quando o Fe é sufficiente, o loop IRE muda sua conformação, permitindo a tradução; O mrna da ferretina é altamente estável, permitindo uma resposta rápida à disponibilidade do Fe.

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