GENÉTICA É a ciência que estuda a hereditariedade Estuda os gens, como eles transportam informações, são replicados e passados para as gerações subseqüentes de células ou transmitidos entre organismos Estuda como a expressão da informação dentro de um organismo determina as características particulares daquele organismo Cromossomos são estruturas celulares que transportam fisicamente a informação hereditária, é onde se encontram os genes Genes são segmentos de DNA DNA é uma macromolécula composta de unidades repetidas denominadas nucleotídeos Nucleotídeos consistem de uma base nitrogenada (adenina, timina, citosina ou guanina), uma desoxirribose (1 açúcar pentose) e um grupo fosfato As duas fitas são mantidas juntas por pontes de hidrogênio entre as bases nitrogenadas. Os pares de bases são sempre específicos, as fitas de DNA são complementares. O código genético, determinado por uma seqüência de nucleotídeos, é convertida em uma seqüência de aminoácidos de uma proteína DNA TRANSCRIÇÃO MRNA TRADUÇÃO AMINOÁCIDOS PROTEÍNAS 1
Pares CG - três pontes de hidrogênio Pares AT - duas pontes de hidrogênio Uma típica célula animal tem cerca de 3x10 9 pares de bases - Livro com mais de 500000 páginas! E. coli - 5x10 6 bp 2
1869 - DNA = Ácido desoxiribonúcleico 3
DNA - Ácido doxirribonucléico - Dupla hélice, com as bases no centro da molécula e as unidades de deoxiribose e fosfato no exterior. - Cadeias complementares - C e T Pirimidinas (1 anel) - A e G Purinas (2 aneis) - DNA tem que permitir a transmissão de informação para as células filhas de forma estável e fiável. - Tem que ser passível de replicação - Tem que ser capaz de mutar -1953 - Francis Crick, James Watson, Rosalind Franklin e Maurice Wilkens, Difração de raios X: [A]=[T]; [G]=[C], independentemente do organismo GENES: segmentos de DNA. 4
Replicação do DNA 1. Replicação Conservativa Produção de molécula de DNA inteiramente nova. 2. Replicação Semiconservativa uma das cadeias do DNA provem da molécula original e a outra nova. As cadeias originais servem de modelo para a síntese das novas cadeias. 5
3. Replicação Dispersiva Envolve a quebra da molécula de DNA original e a reconstrução de novas moléculas a partir destes fragmentos. Experiência de Meselson-Stahl: Crescimento de E. coli em meio contendo 15 N (a substituir 14 N). As bactérias resultantes apresentaram 50% do DNA com 15 N e 50% com 14 N. A replicação do DNA é semi-conservativa. Células procariotas - Uma RNA polimerase Céluas eucariotas - Três RNA polimerases 6
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Células procariotas - Uma RNA polimerase Céluas eucariotas - Três RNA polimerases RNA polimerase I - Transcreve os rrna's de elevado peso molecular (18s, 28s e 45s) RNA polimerase II - Transcreve os mrna's RNA polimerase III - Transcreve os rrna's de baixo peso molecular (5S) e trna's 8
CÓDIGO GENÉTICO O código genético é redundante = "degenerado" 9
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Porque é que o DNA teria sido selecionado como material genético? É mais estável que o RNA Mais fácil de replicar Permite a ação de mecanismos de reparação que usa a cadeia intacta como modelo. 13
Natureza das mutações Transformação química Erros de replicação Erros na divisão celular Integração de elementos genéticos móveis. A taxa de mutação numa célula Em células eucarióticas - 10-9. Um gene com 10 3 nucleótidos codificantes sofre uma mutação em cada 10 6 gerações celulares. Em células procariotas - Muito variável. Pode ir até 10-3 14
Engenharia genética - Capacidade de manipular ácidos nucléicos de forma bem definida e controlada. As ferramentas que o permitem são as enzimas capazes de atuarem sobre ácidos nucléicos. Enzimas de restrição (endonucleases) - Reconhecem pequenas sequências de DNA e "cortam" DNA de dupla cadeia nos locais ou próximos dos locais de reconhecimento. Aplicações Estabelecimento de mapas de restrição Fragmentação de DNA para posterior análise noutras técnicas Geração de fragmentos passíveis de serem clonados em vetores apropriados Produção de fragmentos de DNA para serem usados como sondas em diferentes técnicas Enzimas de restrição Tipo I - Enzimas com capacidade de corte e metilação. Têm sequências de reconhecimento específicas, mas cortam de forma inespecífica dentro da sequência de reconhecimento. Tipo II - Apenas possuem capacidade de corte. A metilação é feita por proteínas diferentes. Cortam sequências específicas de forma também específica. Tipo III - Enzimas com capacidade de corte e metilação. Cortam sequências específicas de forma também específica. Enzimas tipo II - As mais utilizadas em biologia molecular. GGATCC CCTAGG 15
Corte no eixo de simetria - "blunt ends" Corte "em escada" - "sticky ends" "Isoschizomers" - Enzimas que reconhecem a mesma sequência de DNA. Terminações compatíveis - Terminações idênticas de DNA produzidas por enzimas diferentes. Fragmentos de DNA com terminações compatíveis podem ser ligados entre si. Enzimas de restrição - Têm origem em células procarióticas, onde são usadas para degradar DNA exógeno (especialmente DNA bacteriófago). Os organismos que produzem enzimas de restrição protegem o seu próprio DNA por metilação das sequências de reconhecimento das enzimas. 16
Projeto do Genoma Humano Objetivo Clonagem e caracterização molecular de genomas de diferentes espécies seqüência completa do genoma. Tarefa fácil? - Genoma humano 3x10 9 bp - Nº de genes estimado 200 000 Qual o interesse? 1- Os clones e marcadores genéticos obtidos proporcionam excelentes ferramentas de manipulação e diagnóstico genético. 2- O genoma é o cerne de qualquer organismo e contém toda a informação necessária para a sua sobrevivência e organização. 3- O conhecimento da sua estrutura e sequência providenciarão a base do conhecimento para perguntas como: Porque um organismo é diferente de outro? 4- O conhecimento do genoma humano permitirá caracterizar e talvez tratar, extensivamente todas as doenças de origem genética. 17
1. Classificação do DNA eucariótico. Ferramentas 1- Mapeamento genético Permite determinar a localização relativa de marcadores genéticos específicos ao longo de um cromossoma. 2- Mapeamento físico Permite determinar a localização física de marcadores genéticos no genoma. 3- Sequenciação de DNA. 18
Biotecnologia - Mecanismos genéticos básicos - Manipulação enzimática de ácidos nucléicos - Extração de ácidos nucleícos - Vetores de clonagem - Técnicas de análise de DNA e RNA - Bibliotecas de DNA Manipulação de sequências conhecidas de DNA. - Mapeamento e sequenciação de genomas de diferentes organismos Manipulação da totalidade do genoma 19
Expressão de genes recombinantes e organismos transgênicos Expressão de transgenes eucarióticos em bactérias Produção de factor VII (factor de coagulação do sangue humano) Hemofilia 20
Produção de insulina humana Diabetes 21
Produção do hormônio de crescimento humano Nanismo Início da tradução protéica em eucariotes Seqüência Kozak 5 -ACCAUGG Início da tradução proteica em procariotas Sequência Shine-Delgarno 5 -UAAGGAGG 3 a 9 nt AUG. 22
Expressão de transgenes em eucariotas Utilização do plasmídeo Ti em Plantas Plasmídeo Ti - Ocorre naturalmente numa bactéria do solo Agrobacterium tumefaciens 23
- O T-DNA do plasmídeo Ti é responsável pela doença Crown gall - O plasmídeo Ti aumenta a proliferação das células que infecta (tumor) e utiliza-as para produzir opinas que a bactéria é capaz de metabolizar. - É o único vector usado rotineiramente para produzir Plantas transgénicas. 24
Características: - Resistência a herbicidas (sementes de soja). - Resistência a Insetos (milho, algodão e batata). - Agricultura molecular Plantas produtoras de proteínas com aplicação médica (vacinas, fármacos). 25
Produção de Activador de plasminogénio tecidular (anti-coagulante) em Animais Doenças vasculares. 26
Por que exprimir transgenes em sistemas eucariotas? - Uma grande parte das proteínas eucariotas (especialmente de secreção e membranares) expressas em bactérias adota conformações incorretas e ineficientes para a sua função biológica. Terapia genética somática - Retrovírus desativados Integrados no genoma ao acaso e apenas infectam células com proliferação ativa (Ex: células sanguíneas). Usados com sucesso em alguns tratamentos - Doença SCID (Severe combined immunodeficiency disease) que resulta da mutação do gene ADA (Adenosina deaminase). - Mutação do gene LDLR (Low-density-lipoprotein receptor) que aumenta o risco de arteriosclerose e doença coronária. - Adenovírus Normalmente infecta epitélio respiratório. Persiste na forma epissomal e também infecta células em G 0. Estão em curso ensaios de tratamento da fibrose cística com este vetor. - HAC (Human artificial cromossomes) Construídos através da junção de DNA telomérico, genómico e -satélite). Provavelmente, e após optimização da tecnologia, constituirão os vectores de eleição para terapia genética. 27
Knock-out genético em mamíferos 28
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Terapia genética 31
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