UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FFCLRP DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENTOMOLOGIA

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FFCLRP DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENTOMOLOGIA Comportamento de fêmeas de Centris (Heterocentris) analis (Hymenoptera:Apidae:Centridini) quando parasitadas por Physocephala sp. (Diptera:Conopidae). Ricardo Marques Couto Tese apresentada a Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo como parte das exigências para a obtenção do título de Doutor em Ciências, Área: Entomologia Ribeirão Preto 2008

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FFCLRP DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENTOMOLOGIA Comportamento de fêmeas de Centris (Heterocentris) analis (Hymenoptera:Apidae:Centridini) quando parasitadas por Physocephala sp. (Diptera:Conopidae). Ricardo Marques Couto Orientador: Prof. Dr. Evandro Camillo Tese apresentada a Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo como parte das exigências para a obtenção do título de Doutor em Ciências, Área: Entomologia Ribeirão Preto 2008

Vigie seus pensamentos; eles se tornam palavras Vigie suas palavras; elas se tornam ações Vigie suas ações; elas se tornam hábitos Vigie seus hábitos; eles formam seu caráter Vigie seu caráter, ele se torna seu destino Frank Outlaw Em relação a todos os atos de iniciativa e de criação, existe uma verdade fundamental cujo desconhecimento mata inúmeras idéias e planos esplêndidos: a de que no momento em que nos comprometemos definitivamente, a providência move-se também. Toda uma corrente de acontecimentos brota da decisão, fazendo surgir a nosso favor toda sorte de incidentes, encontros e assistência material que nenhum homem sonharia que viesse em sua direção. O que quer que você possa fazer ou sonhe que possa, faça. Coragem contém genialidade, poder e magia. Comece agora... Goethe Aos meus pais Evaldo Freitas Couto (in memorian) e Vera Maria Marques Couto. Dedico.

Agradecimentos Meus sinceros agradecimentos a todas as pessoas que contribuíram para a realização deste trabalho: À Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo pela opurtunidade. Ao Departamento de Biologia e ao Programa de Pós-Graduação em Entomologia. Ao Prof. Dr. Evandro Camillo pela oportunidade e por tudo que me ensinou, contribuindo para o meu crescimento científico, sempre demonstrando compreensão e profissionalismo. Ao Prof. Dr. Carlos Alberto Garófalo por seu profissionalismo, justiça e pelas sugestões dadas durante o período de estudos. Ao Sr. José Carlos Serrano, técnico do Departamento de Biologia da FFCLRP-USP, pelo apoio técnico. À Renata Andrade, por toda sua ajuda e profissionalismo. À amiga Juliana Duarte de Souza Alonso pela ajuda, apoio e companheirismo. À amiga Janaina Fernandes Silva pela ajuda, apoio e companheirismo. A todos os colegas: Evandson, Alex, Elynton, Giovana, Ana Luzia, Sebastião, Cidinha, Leo, André, Alessandra, Estevão, pela convivência e amizade. Aos meus pais, meu irmão e a todos aqueles que contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste trabalho.

ÍNDICE 1. Introdução Geral...2 1.1- Mudanças de comportamento hospedeiro...2 1.2- Evolução do comportamento hospedeiro...5 1.3- Distribuição, sazonalidade e coleta de óleo em Centris...8 2. Biologia de Centris (Heterocentris) analis...12 3. Objetivos...14 4. Referências Bibliográficas...15 CAPÍTULO 1 Mudanças comportamentais apresentadas pelas fêmeas de Centris (Heterocentris) analis (Hymenoptera:Apidae:Centridini) parasitadas por Physocephala sp. (Diptera:Conopidae) Resumo...31 Abstract...32 1. Introdução...33 2. Material e Métodos...35 2.1- Local de estudos...35 2.2- Ninhos-armadilha...35 3. Resultados...38 3.1- Número de fêmeas nidificantes e de ninhos...38 3.2- Comportamentos de deposição extra de substância oleosa por fêmeas de Centris analis parasitadas...38 3.3- Parasitismo intraespecífico (usurpação)...39 3.4- Mortalidade de imaturos, razão sexual e taxa de oviposição/dia...39 3.5- Comportamentos de deposição de óleo apresentados por fêmeas de Centris analis que não morreram no interior dos ninhos-armadilha...44 3.6- Parasitismo intraespecífico (usurpação)...44 3.7- Mortalidade de imaturos e razão sexual apresentada pelos descendentes das fêmeas que não morreram no local de nidificação...48

3.8- Fêmeas não parasitadas...48 4. Discussão...51 5. Referências Bibliográficas...56 CAPÍTULO 2 Relação entre os comportamentos de deposição de substância oleosa apresentados por fêmeas de Centris (Heterocentris) analis (Hymenoptera:Apidae:Centridini) parasitadas e os ataques de Leucospis cayennensis Westwood (Hymenoptera:Leucospidae) Resumo...64 Abstract...65 1. Introdução...66 2. Material e Métodos...68 2.1- Local de estudos...68 2.2- Ninhos-armadilha...68 3. Resultados...71 3.1-Números de ninhos de Centris analis...71 3.2-Fêmeas parasitadas e deposições de substância oleosa...72 3.3-Número de ninhos atacados por Leucospis cayennensis...75 4. Discussão...78 5. Referências Bibliográficas...81

1 Comportamento de fêmeas de Centris (Heterocentris) analis (Hymenoptera:Apidae:Centridini) quando parasitadas por Physocephala sp. (Diptera:Conopidae).

2 1 Introdução Geral 1.1- Mudanças de comportamento do hospedeiro Estudos sobre manipulações comportamentais em hospedeiros lançaram novas bases conceituais em relação ao comportamento, ecologia e evolução dos mesmos, demonstrando que a grande variação fenotípica observada é determinada pelos parasitas (Poulin & Thomas 1999, Moore 2002). Parasitas são organismos que vivem em associação com o hospedeiro do qual são retirados os meios para a sua sobrevivência, normalmente debilitando o organismo hospedeiro, um processo conhecido por parasitismo. Parasitas têm um significativo impacto sobre a atividade do hospedeiro e sobre a preferência de habitat (Poulin 1994, Klein 2003). Segundo Thomas et al. (2002), a manipulação do gafanhoto terrestre Meconema thalassinum (DeGeer) (Tettigoniidae) pelo verme nemátoda Spinochordodes tellinii (Camerano) (Chordodidae), causa no inseto parasitado uma drástica mudança comportamental, fazendo com que o gafanhoto se atire na água para que o parasita possa emergir e se reproduzir. Parasitóides são organismos que para completarem seu desenvolvimento necessitam de um hospedeiro o qual é morto durante o processo. Tais parasitóides são geralmente utilizados como agentes de controle biológico (Michener 2000). Os parasitóides também provocam alterações comportamentais em seus hospedeiros (Horton & Moore 1993), como observado em Platyprepia virginalis Bvd. (Lepidoptera: Arctiidae) quando parasitado pelas moscas Thelaira americana Brooks (Diptera: Tachinidae), as quais alteram sua distribuição e preferência pela planta hospedeira. Parasitóides ocorrem em 06 ordens de insetos Holometábolos: Hymenoptera, Diptera, Coleoptera, Lepidoptera, Trichoptera e Neuroptera (Godfray 1994, Quicke 1997). As larvas de parasitóides podem ser classificadas quanto aos diferentes modos de desenvolvimento: parasitóide koinobionte (endoparasita), cujo hospedeiro continua a se alimentar e a

3 crescer, mesmo após o parasitismo ter se instalado; e parasitóide idiobionte (ectoparasita), cujo hospedeiro é paralisado ou morto. Estudos sobre os imaturos parasitóides (koinobiontes) indicam que as larvas, durante o desenvolvimento, não causam danos significativos nos tecidos e órgãos do hospedeiro (Quicke 1997). Algumas larvas, principalmente de Braconidae, que se alimentam da hemolinfa do hospedeiro, emergem e sofrem pupação fora do hospedeiro. Outras, principalmente de Ichneumonidae, alimentam-se inicialmente de hemolinfa e depois de tecidos, sofrendo pupação dentro do hospedeiro. Parasitóides têm desenvolvido vários mecanismos para manterem seus hospedeiros em condições apropriadas, não apenas durante o desenvolvimento larval, mas também durante a pupação. A larva de Cotesia glomerata (Linnaeus) (Braconidae) não consome mais que 50-60% do alimento assimilado pelo hospedeiro (Slansky 1978). Mudanças na distribuição e nas atividades dos hospedeiros são os comportamentos mais comuns manipulados pelos parasitóides (Horton & Moore 1993). Brodeur & McNeil (1989, 1992) observaram que o pulgão da batata Macrosiphum euphorbiae (Thomas) (Hemiptera:Aphididae), quando parasitado por Aphidius nigripes (Ashmead) (Hymenoptera:Aphidiidae), altera a localização da colônia de afídeos, transportando-a da face inferior da folha para a face superior, onde as taxas de hiperparasitismo são menores. Segundo Reitz & Nettles (1994), o parasitóide Eucelatoria bryani Sabrosky (Tachinidae:Diptera) regula o comportamento da larva de seu hospedeiro Helicoverpa zea (Boddie) (Lepidoptera: Noctuidae), a qual normalmente penetra no solo para se pupar. Hospedeiros parasitados se enterram no solo mais cedo que o hospedeiro não parasitado fazendo com que a larva do hospedeiro H. Zea se abrigue no solo, sendo então garantida a pupação em um ambiente com maior proteção, contra ataques de inimigos naturais e temperaturas letais. Hospedeiros parasitados apresentam alterações morfológicas, reprodutivas e comportamentais em função de modificações bioquímicas, fisiológicas e ecológicas (Vinson 1975, Vinson & Iwantsch 1980). Alterações nos padrões fisiológicos e ecológicos em hospedeiros parasitados poderão ser adaptativas ou refletir mudanças patológicas que são seletivamente neutras

4 (Minchella 1985, Holmes & Zohar 1990). Segundo Dawkins (1982), a relação hospedeiro-parasitóide estabelece um conceito no qual o hospedeiro representa uma extensão do fenótipo do parasitóide. Da mesma maneira, Vinson (1975) considera que ninhos parasitados já não são mais membros da espécie hospedeira, uma vez que o destino do mesmo é permanentemente modificado pelo parasitóide. Em relação às abelhas, mudanças nas atividades foram observadas em operárias de Bombus terrestris (Linnaeus) (Apidae) quando parasitadas por conopídeos. As mudanças comportamentais observadas foram: redução da atividade de forrageio, alteração no padrão de coleta de pólen, mudança na preferência por flores para o forrageamento (Schmid- Hempel & Schmid-Hempel 1990). Estas abelhas quando parasitadas tiveram preferência por temperaturas mais frias (Müller & Schmid-Hempel 1993), e também apresentaram uma tendência em abandonar a colônia (Schmid- Hempel & Müller 1991, Müller & Schmid-Hempel 1993). De acordo com Schmid-Hempel (1991) as abelhas do gênero Bombus quando estão perto da morte, os indivíduos parasitados se enterram no solo mais freqüentemente que indivíduos não parasitados, diminuindo as chances e a probabilidade de seus corpos serem encontrados pelos predadores. Este comportamento beneficia o parasitóide e não confere nenhum valor adaptativo ao hospedeiro. Himenópteros solitários e pré-sociais (Apoidea:Vespoidea) são frequentemente hospedeiros de muitas famílias de moscas parasitas (Diptera), tais como Anthomyliidae, Conopidae, Phoridae, e Sarcophagidae (Bohart & Menke 1976, Coville & Griswold 1983, 1984, Wcislo 1990, Paxton et al. 1996, Andrietti et al. 1997, Polidori et al. 2001). Provavelmente as moscas da família Conopidae são os mais importantes dípteros parasitóides de abelhas, as quais são atacadas quando estão forrageando nas flores. Vários são os registros de associações entre Physocephala com vários gêneros de abelhas, tais como Anthidium, Anthophora, Eucera, Megachile, Halictus, Apis, Xylocopa, Bombus, Eulaema (Linsley 1958, Hurd 1978, Katayama & Maeta 1998, Schmid-Hempel 2001, Otterstatter et al. 2002, Rasmussen & Cameron 2004). Recentemente, Physocephala bipunctata (Macquart) (Conopidae) e Physocephala inhabilis (Walker) (Conopidae), foram observadas em associação com Epicharis bicolor

5 (Smith) (Apidae) e Centris vittata Lepeletier (Apidae), respectivamente (Vilhena & Rocha-Filho inf. pes.). As primeiras observações da associação entre Centris (Heterocentris) analis (Fabricius), com espécies de Physocephala (Diptera:Conopidae) foram realizadas no Campus da Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP. De uma amostra de 26 fêmeas e 9 machos da espécie hospedeira encontrados mortos dentro de ninhos-armadilha vazios emergiram 35 parasitóides pertencentes a nove espécies de Physocephala (Santos et al. 2008). 1.2- Evolução do comportamento hospedeiro Para compreendermos a evolução da manipulação do hospedeiro é necessário entendermos o mecanismo responsável pelas alterações comportamentais. Parasitóides podem alterar o comportamento do hospedeiro interagindo diretamente com os sistemas nervoso e muscular ou secretar substâncias neuroativas que alterem o comportamento do hospedeiro (Thomas et al. 2005). Estudos sobre a manipulação do comportamento do hospedeiro identificaram a presença de neurotransmissores e hormônios os quais estão diretamente relacionados com as mudanças comportamentais (Thompson & Kavaliers 1994, Kavaliers et al. 1999, Adamo 2002, Klein 2003). Segundo Adamo (2002) Cotesia congreta (Say) (Hymenoptera:Braconidae) inibe a alimentação do hospedeiro devido à estimulação da síntese de octopamina (neurotransmissor) na hemolinfa do hospedeiro. Mecanismos recentemente revelados em vertebrados mostram que nos hospedeiros ocorrem mudanças metabólicas que influenciam o sistema neural e imune, como as produções de citocinas (proteínas que atuam como mensageiras no sistema imune) e opióides (neutrotransmissor). Esses compostos estão presentes também em hospedeiros invertebrados (insetos e moluscos) (Ottaviani & Franceschi 1998, Cooper 2003). Para uma melhor compreensão da evolução e resistência do hospedeiro, o estudo de caracteres, sob o controle de vários locos gênicos (QTLs), pode revelar informações genéticas dos hospedeiros parasitados

6 quanto ao número, efeito e localização dos loci gênicos envolvidos. A abelha B. terrestris tem sido intensamente estudada como um modelo de interações hospedeiro-parasita (Baer & Schmid-Hempel 1999, Schmid-Hempel 2001) e de imunidade ecológica (Moret & Schmid-Hempel 2000). Interpretando estas observações é reconhecido que a coevolução hospedeiro-parasita seja baseada nas interações entre os genótipos envolvidos (Thompson & Burdon 1992, Wakelin & Walliker 1996, Little & Ebert 2001, Schmid-Hempel 2003, Schmid-Hempel & Ebert 2003). Segundo Schmid-Hempel et al. (2005), para analisar a associação do parasita Crithidia bombi (Protozoa) (Trypanosomatidae) com o hospedeiro B. terrestris é fundamental uma investigação sobre a composição genética das populações de parasitóides. Os resultados obtidos por Schmid-Hempel et al. (2005) dependeram dos números de loci gênicos e alelos presentes nas populações do parasita, isto é, 2 loci com 7 e 3 alelos em cada um, possibilitando a formação de 168 genótipos diferentes. Desses, apenas 11 foram identificados nas 12 colônias de hospedeiro. Esse trabalho representou um modelo de estudo que determinou o grau de diversidade genotípica do parasitóide (11 genótipos) em relação ao hospedeiro (12 colônias). Entretanto, o fenótipo de um organismo não está linearmente relacionado com seu genótipo. Thomas et al. (2005) sugerem que o proteoma, ou seja, o estudo de todas as proteínas produzidas pelas células e tecidos, é um bom caminho para se compreender as alterações moleculares durante o processo manipulativo. Utilizando ferramentas úteis para o estudo do proteoma, tais como: eletroforese em gel de duas dimensões (2-DE) e espectrometria de massa (MS), foram obtidas modificações protéicas no hospedeiro (fosforilação, acetilação, metilação e glicosilação) em conseqüência do processo manipulativo (Barrett et al., 2000; Patton, 2000; Asthon et al., 2001). Muitos estudos sobre manipulação do comportamento hospedeiro têm sido realizados sem considerar o contexto ecológico nos quais ocorrem (Thomas et al. 2005). Por exemplo, a maioria dos experimentos não leva em conta que, em condições naturais, outros predadores se beneficiarão da manipulação (Mouritsen & Poulin, 2003). O contexto ecológico é relevante para

7 se compreender os custos e benefícios da manipulação do parasita (Thomas et al. 2005). Outra importante característica referente aos estudos sobre a evolução da manipulação é o fato que este fenômeno ocorre em um contexto metapopulacional (Tompkins et al., 2004). Como a maioria das espécies animais, os hospedeiros e parasitóides exibem uma estrutura metapopulacional a qual se distribui em habitats fragmentados e heterogêneos no espaço e no tempo. Conclusões sobre o valor adaptativo das mudanças do hospedeiro, induzidas pelo parasitóide, devem ser discutidas com cautela. Os parasitóides não alteram somente o comportamento individual do hospedeiro, mas também podem modificar as interações entre os indivíduos da população. Zuk et al (1993, 1995, 1996) compararam o comportamento de corte do grilo Teleogryllus oceanicus (Le Guillou) (Gryllidae) em populações nativas do Pacífico Sul, onde está aparentemente livre do parasitóide Ormia ochracea (Bigot) (Diptera), com populações localizadas no Hawaii as quais receberam ataques do parasitóide e observaram que as populações do Hawaii apresentaram períodos mais curtos de corte e alterações no canto (duração e intervalo entre os pulsos). A interação entre hospedeiro e parasitóide poderá também afetar a organização das comunidades ecológicas (Lawton 1986). Recentes estudos sugerem que parasitóides da família Phoridae podem mediar interações competitivas entre espécies de formiga (Feener 1981,1992, Orr et al. 1995, Porter et al. 1995). Fêmeas destes parasitóides depositam seus ovos em formigas operárias, as quais desenvolveram comportamentos de defesa contra o parasitóide. A ativação destes comportamentos de defesa freqüentemente interfere na habilidade da operária de obter alimento e guardar ou guardá-los contra espécies competidoras. Atualmente, vários são os fatores que são estudados na relação parasitóide-hospedeiro e, dentre eles podemos destacar as estratégias desenvolvidas pelas abelhas com o intuito de defenderem seus ninhos. Uma destas estratégias é a colocação de substância oleosa na parede de fechamento dos ninhos o que, seguramente, dificulta a ação dos parasitóides.

8 1.3- Distribuição, sazonalidade e coleta de substância oleosa em Centris Centris (Fabricius) é um gênero primariamente tropical cujas espécies estão divididas em 12 subgêneros: Acritocentris Snelling; Centris Fabricius; Exallocentris Snelling; Hemisiella Moure; Heterocentris Cockerell; Melanocentris Friese; Paracentris Cameron; Ptilocentris Snelling; Trachina Klug; Wagenknechtia Moure; Xanthemisia Moure; Xerocentris Snelling (Coville et al. 1983, Snelling 1984). Abelhas do gênero Centris são encontradas do sudoeste dos Estados Unidos até o Brasil com ocorrências nas regiões xéricas da Argentina e Chile, apresentando comportamento solitário onde cada fêmea constrói seu próprio ninho, providencia alimento para seus filhos e usualmente morre ou abandona o ninho antes da emergência de sua prole (Michener 2000). No Brasil, espécies deste gênero foram encontradas em diversos ecossistemas, dentre os quais destacamos as dunas e restingas (Silva & Martins 1999, Silva et al. 2001, Vianna & Alves-dos-Santos 2002, Vianna et al. 2005), caatinga (Martins 1994, Zanella 2000, Aguiar & Almeida 2002, Aguiar et al. 2003), e cerrado onde é observada uma maior diversidade (Silveira & Campos 1995; Albuquerque & Mendonça 1996, Gaglianone 2003). Obviamente, algumas destas espécies podem ocorrer em mais de um dos ecossistemas citados. Tendências sazonais foram observadas em Centris por Pedro (1992) quando coletou indivíduos nas flores, em Cajuru, SP, somente em uma estação do ano, ou seja, na primavera. Segundo esta mesma autora, a abundância destas abelhas logo após as primeiras chuvas sugere que os altos índices de precipitação e umidade relativa não são fatores limitantes para elas. Em contrapartida, próximo aos trópicos úmidos, muitas dessas abelhas, apresentam atividade de forrageio durante o período seco e quente, sendo praticamente ausentes durante a estação chuvosa (Heithaus 1979, Frankie et al. 1983, Albuquerque & Rêgo 1989). Temperaturas baixas parecem interferir, consideravelmente, nas atividades dessas abelhas, o que foi indicado pela ausência de forrageamento durante o inverno (Pedro 1992). Frankie et al. (1988) estudaram populações de C. analis, Centris bicornuta Mocsary, Centris vittata Lepeletier, Centris trigonoides Lepeletier e

9 Centris nitida Smith, quando nidificaram em ninhos-armadilha em uma floresta seca na Costa Rica e, constataram que, em relação à preferência por habitat, a maior parte dos ninhos foi fundada em locais sombreados. Nestes mesmos locais, em razão da queda das folhas das árvores, houve um aumento da temperatura onde os ninhos-armadilha foram instalados, o que resultou em uma diminuição na taxa de fundação de ninhos. Este fato mostra que naquela região, a preferência observada ocorreu em relação aos habitats sombreados. É possível também, que temperaturas altas possam ser limitantes à atividade de nidificação das fêmeas e ao desenvolvimento larval de espécies de Centris que nidificam em cavidades preexistentes em madeira (Frankie et al. 1988). No entanto, Couto & Camillo (2007) reportaram que a taxa de mortalidade de imaturos de C. analis em nidificações (ninhos-armadilha) localizadas em uma área sombreada não mostrou diferença significativa em relação às nidificações em ninhos-armadilha expostos ao sol. Segundo Frankie et al. (1993), C. nítida e Centris lutea Friese podem suportar habitats abertos e ensolarados, onde as temperaturas diárias são mais altas que nos habitats sombreados. Em um levantamento de himenópteros que nidificam em ninhos-armadilha, em um remanescente de Mata Atlântica, Pérez-Maluf & Campos (1993) constataram que Centris tarsata Smith, fundou mais ninhos em locais abertos ocupados por vegetação secundária. Morato et al. (1999), reportaram que C. analis, Centris terminata Smith, Centris dichrootricha (Moure), C. bicornuta, mostraram diferentes preferências, em relação ao tipo de ambiente utilizado para nidificação: matas contínuas, fragmentos e áreas desmatadas, respectivamente. Para C. terminata o número de fundações foi maior em clareiras criadas pela queda natural das árvores do que em áreas de mata contínua, mostrando que essa espécie pode preferir ambientes mais iluminados e abertos que o sub-bosque da mata adjacente. Entretanto, o número de ninhos fundados em áreas desmatadas foi muito pequeno. C. dichrootricha fundou mais ninhos em locais desmatados e em pequenos fragmentos de mata. Isto sugere que C. terminata possa ser mais sensível aos processos de fragmentação de floresta do que C. dichrootricha. Já C. analis e C. bicornuta apresentaram poucas nidificações nos ambientes considerados (Morato et al. 1999).

10 No Brasil, C. analis é encontrada nos Estados do Amazonas (AM), Bahia (BA), Ceará (CE), Paraíba (PB), São Paulo (SP) e Minas Gerais (MG) (Silveira et al. 2002). Camillo et al. (1995), observaram em Cajuru SP, utilizando ninhos-armadilha, diferentes abundâncias de ninhos de C. analis e outras abelhas solitárias, quando comparados os resultados obtidos em três diferentes habitats. Naquele onde os ninhos estavam em contato com paredes de casas abandonadas, ocorreram as maiores abundâncias enquanto que, o Cerrado, com os ninhos sob uma cobertura no seu interior, foi o habitat menos abundante. Abundância intermediária foi observada no terceiro habitat e deve ter sido resultante da colocação de parte dos ninhos sob uma cobertura a uma certa distância das construções e parte em contato com paredes de casas abandonadas. Esses resultados mostram que C. analis e algumas espécies de abelhas que nidificam em cavidades preexistentes estão mais concentradas em habitats modificados pelo homem, o que, seguramente, proporciona uma maior quantidade de sítios de nidificação. Assim, comprovadamente, a utilização da técnica de ninhosarmadilha, permitiu e permite descrever e comparar comunidades de abelhas, provendo uma medida quantitativa do número de espécies presentes em uma área e suas respectivas abundâncias, além de fornecer informações acerca do comportamento de nidificação, das preferências por habitat e das mudanças na freqüência através do tempo (Krombein 1967, Vinson & Frankie 1991, Frankie et al. 1998, Morato & Campos 2000). Admite-se uma longa história de interações evolutivas entre Centridini e planta produtoras de óleo, principalmente Malpighiaceae (Anderson 1979, Vogel 1990). Levantamentos em biomas tropicais de terras baixas no Brasil sugerem que os Centridini apresentam alta diversidade alfa (é a diversidade local, correspondente ao número de espécies numa pequena área de habitat homogêneo) nas comunidades de cerrados (Carvalho 1990, Pedro 1994, Silveira & Campos 1995), onde Malpighiaceae também está bem representada (Rizzini 1997). As fêmeas da tribo Centridini são dotadas de estruturas especializadas nas pernas ou esterno para coletarem, manipularem e transportarem o óleo. Estas estruturas normalmente são relacionadas aos diferentes tipos de elaióforos (as glândulas secretoras de óleo) quer estejam

11 localizados na epiderme (epitelial) ou em tricomas específicos (Vogel 1988; Buchmann 1987). O óleo coletado é utilizado por esta abelhas, como alimentação própria ou larval, juntamente com o pólen (Vinson et al. 1997, Camillo 2005), e também na construção de células de cria (Hiller & Wittmann 1994, Camillo 2005). Segundo Neff & Simpson (1981), Buchmann (1987), Simpson (1989), Pereira et al. (1999), Aguiar & Garófalo (2004) o óleo floral é adicionado ao material de construção (areia, solo, serragem, fragmentos vegetais) para a confecção das células em diversas espécies de Centris; as quatro espécies de Tetrapedia estudadas por Camillo (2005) também associaram o óleo coletado com areia para a construção de seus ninhos. O aspecto transparente e viscoso da substância observada nas células de cria de C. trigonoides (Simpson et al. 1977) sugere que óleo floral pode ser também utilizado por esta espécie para revestir internamente a célula como tem sido observado ocorrer pelo menos em C. analis (Jesus & Garófalo 2000), C. vittata (Pereira et al. 1999) e C. tarsata (Aguiar & Garófalo 2004). Vários autores têm sugerido que o revestimento do fechamento do ninho com óleo, confere proteção contra parasitas que atacam ninhos já completados (Pereira et al. 1999; Jesus & Garófalo 2000, Gazola & Garófalo 2003) ou contra a usurpação de ninhos por fêmeas co-específicas (Vinson & Frankie 2000). Gazola & Garófalo (2003) observaram que, em varias ocasiões, Leucospis cayennensis Westwood, não obteve sucesso em romper a parede de fechamento do ninho de C. analis, provavelmente devido ao endurecimento proporcionado pelo material oleoso ali depositado. Simpson et al. (1977) e Seigler et al. (1978) identificaram na substância oleosa obtida em espécies do gênero Krameria (Krameriaceae) a presença de β-acetato os quais apresentando cadeias variando de 16 a 20 carbonos; estes autores não encontraram ácidos graxos. Vogel (1974, 1976a,b) identificou em espécies de Calceolaria (Calceolariaceae) a presença de ácido acético e ácido palmítico. Cane et al. (1983) identificaram em Lysimachia ciliata (Linnaeus) (Primulaceae) componentes análogos às secreções da glândula de Dufour de Macropis nuda (Provancher) (Hymenoptera: Melittidae); dentre estes componentes foram observados o ácido palmítico, aldeídos com cadeias de

12 carbono com 14 e 16 carbonos (C14 e C16), acetatos (C18-C22), alcanos (C23, C25, C27 e C29), alcenos (C25 e C27), assim como vários ésteres. Vinson et al. (1996) identificaram na Costa Rica, 16 espécies de Centris visitando Byrosonima crassifolia (Linnaeus) (Malpighiaceae) cujo óleo apresentou uma mistura de mono, di (80-85%), tri-glicerídeos (10%) e ácidos graxos (5%). 2- Biologia de Centris (Heterocentris) analis Coville et al. (1983) realizaram uma revisão dos hábitos de nidificação do gênero Centris, e mostraram que muitas espécies constroem ninhos no solo (Alcock et al. 1976, Batra & Schuster 1977, Coville et al. 1983, Camillo et al. 1993, Vinson et al. 1993, Aguiar & Gaglianone 2003), outras podem estabelecer seus ninhos em termiteiros (Vesey-Fitzgerald 1939, Bennet 1964, Gaglianone 2001), em cavidades preexistentes, como aquelas que ocorrem em troncos de árvores (Michener & Lange 1958, Frankie et al. 1993, Vinson et al. 1993) e em ninhos-armadilha (Camillo et al. 1995, Morato et al. 1999, Jesus & Garófalo 2000, Gazola & Garófalo 2003, Aguiar & Garófalo 2004). C. analis é uma espécie bastante comum, ocorrendo desde o México até o Brasil (Moure 1960). Semelhante a outras espécies de Heterocentris, assim como aquelas dos subgêneros Hemisiella e Xanthemisia, C. analis nidifica em cavidades preexistentes (Linsley et al. 1980, Coville et al. 1983, Frankie et al. 1993, Garófalo et al. 1989, Roubik 1989, Camillo et al. 1995, Jesus 1995, Jesus & Garófalo 2000, Aguiar & Almeida 2002). No Brasil, alguns pesquisadores obtiveram ninhos de C. analis, em várias localidades e habitas, utilizando a técnica dos ninhos-armadilha o que facilitou a realização de estudos mais detalhados sobre a biologia da espécie (Garófalo et al. 1989 e Camillo et al. 1995 em Cajuru, SP; Jesus 1995 em Ribeirão Preto, SP; Aguiar & Almeida 2002 em Ipirá e Baixa Grande, BA; Gazola & Garófalo 2003 em Patricínio Paulista e Paulo de Faria, SP).

13 Estudos sobre comportamento de nidificação de C. analis foram realizados por Jesus (1995), sendo observado que as fêmeas nidificaram em ninhos-armadilha confeccionados com cartolina preta, os quais eram introduzidos em orifícios feitos em placas de madeira que foram colocadas em prateleiras sob duas coberturas construídas no local de estudo. A fêmea inspecionava vários locais próprios para a nidificação até decidir por um deles. Após escolhido o local, a fêmea rapidamente, iniciava a coleta de substância oleosa a ser utilizada para revestir, internamente, a cavidade onde seria construído o ninho. Terminada essa atividade, a fêmea coletou material vegetal para construir a parede do fundo do ninho e delimitar o tamanho da primeira célula. Essa delimitação foi feita com o início da construção da primeira partição celular a qual apresentava a forma de um pequeno anel que circundava todo o interior do ninho-armadilha. Após o término da construção da parede do fundo do ninho e do anel que delimitava a célula, a fêmea iniciou as atividades de aprovisionamento da mesma. De quatro a onze viagens de coleta de pólen foram realizadas para aprovisionar uma célula. Nas células onde foram criadas as fêmeas, o aprovisionamento foi feito com as fundadoras realizando um número maior de vôos para coleta de pólen do que aquele para as células dos machos. Depois de todo o pólen ter sido depositado na célula, a fêmea coletou material vegetal e adicionou-o ao anel da célula sem fechá-la. Em seguida a fêmea realizou de duas a oito coletas de néctar para terminar o aprovisionamento da célula. Células de ambos os sexos receberam néctar proveniente de um número similar de coletas. Terminada a deposição de néctar, a fêmea ovipositou e imediatamente fechou a célula finalizando a construção da partição celular com o material vegetal previamente colocado no anel da célula. O numero de células de cria em cada ninho variou de 1 a 4, quase sempre seguidas por uma célula vestibular. O tempo necessário para completar uma célula variou de 1 a 5 dias, embora a maioria delas tenha sido completada em um dia. O número máximo de ninhos construídos por uma fêmea foi 3 é o número máximo de células foi 9. O ninho foi fechado com uma parede construída com o mesmo material usado nas partições celulares e revestida, externamente, com

14 substância oleosa. As fêmeas foram produzidas nas primeiras células e os machos nas últimas de cada ninho. Leucospis cayennensis Westwood (Hymenoptera, Leucospidae), Coelioxys sp. (Hymenoptera, Megachilidae) e Mesocheira bicolor (Fabricius) (Hymenoptera:Apidae:Ericrocini) foram os parasitóides que atacaram os ninhos de C. analis, com o primeiro sendo o mais freqüente e o último o mais raro. 3 Objetivos O presente trabalho teve como objetivo estudar alguns comportamentos apresentados pelas fêmeas de C. analis quando parasitadas pelas moscas Physocephala sp., durante o processo de construção de seus ninhos e após o término destas atividades. Durante este período, além destas observações, serão realizadas comparações entre as fêmeas normais e aquelas parasitadas em relação a: razão sexual de seus descendentes, a mortalidade dos imaturos produzidos e a taxa de oviposição/dia.

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30 CAPÍTULO 1 Mudanças comportamentais apresentadas pelas fêmeas de Centris (Heterocentris) analis (Hymenoptera:Apidae:Centridini) parasitadas por Physocephala sp. (Diptera:Conopidae)

31 Resumo O comportamento das fêmeas de Centris (Heterocentris) analis (Hymenoptera:Apidae) foi estudado no Campus da Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP, de fevereiro de 2005 a dezembro de 2006. As fêmeas de C. analis nidificaram em ninhos-armadilha, confeccionados com cartolina preta, apresentando 0,6cm de diâmetro interno e 5,5cm de comprimento, introduzidos em orifícios feitos em placas de madeira colocadas em prateleiras sob duas coberturas construídas no local de estudo. Foram obtidos 94 ninhos durante o período de estudos. Um total de 39 fêmeas foram previamente marcadas, das quais 11 foram encontradas mortas em seus próprios ninhos ou em outros ninhos-armadilha ainda não utilizados; estas fêmeas foram coletadas e transferidas para frascos individuais. Estes foram levados para o laboratório, mantidos a temperatura ambiente e vistoriados diariamente para a verificação de possíveis emergências de parasitóides. Quando da emergência de um parasitóide, ele era deixado em um frasco e em seguida morto sob vapor de acetato de etila, alfinetado e preparado para identificação. Das 11 fêmeas de C. analis encontradas mortas emergiram indivíduos de 8 espécies de parasitóides Physocephala sp. Os resultados mostram que essas fêmeas construíram 36 ninhos e apresentaram comportamentos envolvendo deposição de substância oleosa, tais como: colocação extra de substância oleosa sobre o fechamento dos ninhos (seus ou de outras fêmeas), colocação de substância oleosa sobre o fechamento da última célula de cria, construção de fechamento em NA não utilizados (vazios), localizados próximos ou não daqueles por ela construídos e usurpações de ninhos. Outras fêmeas marcadas (n=18) também construíram ninhos (n=48) na área e apresentaram os mesmos comportamentos envolvendo deposição de substância oleosa. As fêmeas restantes (n=10) não apresentaram nenhum dos comportamentos citados anteriormente. Os comportamentos apresentados pelas fêmeas de C. analis parasitadas pelo conopídeo são considerados atípicos neste trabalho, visto que apenas as fêmeas parasitadas apresentaram tais comportamentos.

32 Abstract The behaviour of Centris (Heterocentris) analis was studied on the Campus of the University of São Paulo, Brazil, Ribeirão Preto, Brazil, from February to May 2005, from January to July 2006 and from November to December 2006. The bees constructed nests in trap-nests made with black cardboard having 5.5 cm in length and 0.6 cm of internal diameter. The trapnests were introduced into holes previously made in wood plates which were placed on the shelves of two shelters built at the study site. A total of 94 nests were obtained and 39 marked females nested in the study period. Of the 39 female, 11 were dead in the trap-nests. During the study period the traps were inspected with an otoscope and information was recorded. Dead females (n=11) were taken to the laboratory and placed in a transparent glass tube which were kept at the room and observed daily until the parasite emerged. Of the 11 dead females in the trap-nests, emerged Physocephala sp. (8 species). The data shows that these females constructed 36 nests and presented behavior of oil substance deposition, such as: deposition of oil substance on the last brood cells, extra deposition of oil substance on nest closure, construction of closure in empty nests and nest usurpation. Other marked females (n=18) that constructed nests in the area show the behavior of oil substance deposition too. The remaining females (n=10) have no behavior of oil substance deposition and probably they are not parasitized. Therefore, the results show that parasitized females presented variant behavior.

33 1- Introdução Hospedeiros quando parasitados apresentam alterações comportamentais, físicas e fisiológicas as quais, são utilizadas para escaparem de seus predadores (Edmunds 1974, Curio 1976, Endler 1986, De Jong-Brink et al. 1997, Combes 2001, Moore 2002, Thomas et al. 2005). A predação é um importante fator que afeta a dinâmica populacional e a história de vida dos animais (Lees 1981, Reznick & Endler 1982, Reznick et al. 1990, Ohsaki & Sato 1994). Alguns parasitóides controlam o comportamento de seus hospedeiros para evitar ataques de predadores, sendo que mudanças na distribuição e nas atividades dos hospedeiros são os comportamentos mais comuns manipulados pelos parasitóides (Horton & Moore 1993). Brodeur & McNeil (1989, 1992) observaram que o pulgão da batata Macrosiphum euphorbiae (Thomas) (Hemiptera:Aphididae), quando parasitado por Aphidius nigripes (Ashmead) (Hymenoptera:Aphidiidae), altera a localização da colônia de afídeos, transportando-a da face inferior da folha para a face superior, onde as taxas de hiperparasitismo são menores. Segundo Reitz & Nettles (1994), o parasitóide Eucelatoria bryani Sabrosky (Tachinidae:Diptera) regula o comportamento da larva de seu hospedeiro Helicoverpa zea (Boddie) (Lepidoptera: Noctuidae), a qual normalmente penetra no solo para se pupar. Hospedeiros parasitados se enterram no solo mais cedo que o hospedeiro não parasitado fazendo com que a larva do hospedeiro H. Zea se abrigue mais rapidamente no solo, sendo então garantida a pupação em um ambiente com maior proteção, contra ataques de inimigos naturais e temperaturas letais. Himenópteros solitários e pré-sociais (Apoidea, Vespoidea) são freqüentemente hospedeiros de muitas famílias de moscas parasitas (Diptera), tais como Anthomyliidae, Conopidae, Phoridae, e Sarcophagidae (Bohart & Menke 1976, Coville & Griswold 1983, 1984, Wcislo 1990, Paxton et al. 1996, Andrietti et al. 1997, Polidori et al. 2001). Provavelmente as moscas da família Conopidae são os mais importantes dípteros parasitóides de abelhas, as quais são atacadas quando estão forrageando nas flores. O desenvolvimento larval ocorre devido ao consumo da hemolinfa e dos tecidos internos do hospedeiro

34 (Pouvreau 1974, Muller et al. 1996), o qual é completado dentro de 10-12 dias após a oviposição quando então, a larva transforma-se em pupa, ocorrendo a morte do hospedeiro (Pouvreau 1974, Smith 1966). Vários são os registros de associações entre Physocephala e inúmeros gêneros de abelhas, tais como Anthidium, Anthophora, Eucera, Megachile, Halictus, Apis, Xylocopa, Bombus, Eulaema (Linsley 1958, Hurd 1978, Katayama & Maeta 1998, Schmid-Hempel 2001, Otterstatter et al. 2002, Rasmussen & Cameron 2004). Recentemente, Physocephala bipunctata (Macquart) (Conopidae) e Physocephala inhabilis (Walker) (Conopidae), foram também observadas em associação com Epicharis bicolor (Smith) (Apidae) e Centris vittata Lepeletier (Apidae), respectivamente (Vilhena & Rocha-Filho inf. pes.). Em Bombus terrestris (Linnaeus) (Apidae) essa associação parasítica tem sido estudada respeitando vários parâmetros e os resultados mostram um aumento na mortalidade das abelhas operárias (Schmid-Hempel & Schmid-Hempel 1990), alterações do comportamento de forrageamento (Heinrich & Heinrich 1983, Muller & Schmid-Hempel 1993) e redução do tamanho das colônias (Muller & Schmid-Hempel 1992, MacFarlane et al. 1995). A associação entre Centris (Heterocentris) analis (Fabricius), com espécies de Physocephala (Diptera:Conopidae) foi observada, pela primeira vez, no Campus da Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP. De uma amostra de 26 fêmeas e 9 machos da espécie hospedeira encontrados mortos dentro de ninhos-aramadilha vazios, emergiram 35 parasitóides pertencentes a nove espécies de Physocephala (Santos et al. 2008). O objetivo deste trabalho foi o de observar e quantificar as alterações comportamentais de fêmeas de C. analis quando parasitadas por Physocephala sp, no Campus da USP de Ribeirão Preto.

35 2 Material e Métodos 2.1 Local de estudos O estudo foi realizado no Campus da Universidade de São Paulo, situado no município de Ribeirão Preto, SP, entre as coordenadas 21 05`- 21 15` S e 47 50` 47 55` W. O relevo apresenta altitudes que variam de 530 a 675 m, em uma área de, aproximadamente, 573 ha. O solo é caracterizado como latossolo roxo eutrófico, com textura argilosa ou muito argilosa. A vegetação era de mata tropical subcaducifolia, mas a região foi intensamente explorada, inicialmente para a cultura do café e mais recentemente para cultura da cana de açúcar, que juntamente com o capim colonião formam a cobertura atual (Oliveira & Prado 1987). As observações foram realizadas de fevereiro de 2005 a dezembro de 2006. 2.2- Ninhos-armadilha Seguindo a metodologia apresentada por Serrano & Garófalo (1978), foram utilizados ninhos-armadilha confeccionados com cartolina preta, na forma de pequenos tubos, com uma das extremidades fechada com o mesmo material, apresentando 0,6 cm de diâmetro e 5,5 cm de comprimento. Estes NA foram introduzidos em orifícios feitos em placas (n=08) de madeira (55 NA cada) de 5,0 cm de largura, 30,0 cm de comprimento e 12,0 cm de altura. As placas foram colocadas em prateleiras, sob coberturas (distantes 5 metros) construídas ao lado do laboratório de Ecologia do Departamento de Biologia da Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto-USP (Figuras 1 e 2). Durante os estudos, fêmeas de C. analis foram marcadas com tinta no tórax e as atividades de nidificação, de cada uma delas, foram registradas diariamente. Quando as atividades estavam restritas ao interior dos ninhos, as mesmas eram registradas com o auxílio de um otoscópio. As fêmeas de C. analis encontradas mortas em seus próprios ninhos ou em outros NA ainda não utilizados, foram coletadas e transferidas para frascos individuais. Os frascos eram levados para o laboratório, mantidos

36 a temperatura ambiente e vistoriados diariamente para a verificação de possíveis emergências de parasitóides. Quando da emergência de um parasitóide, ele era deixado no mesmo frasco e em seguida morto sob vapor de acetato de etila, alfinetado e preparado para identificação. Os ninhos-armadilha completados foram retirados das placas, e introduzidos em tubos de ensaio, os quais eram fechados e mantidos no laboratório em temperatura ambiente. Após a emergência dos indivíduos estes ninhos eram abertos e seu conteúdo analisado, observando-se então a razão sexual e os imaturos mortos. Os ataques dos parasitóides foram acompanhados utilizando-se observações diretas. Os adultos de C. analis após a identificação, foram liberados para o campo. Para a análise estatística dos dados foi utilizado os testes de Qui- Quadrado e Regressão Múltipla constantes do programa Statistica 6 e disponibilizado pelo laboratório de Ecologia do Departamento de Biologia da Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto-USP. Figura 1- Local de estudo, mostrando as placas de madeira colocadas em prateleira no Campus da USP, Ribeirão Preto-SP.

37 Figura 2- Local de estudo, mostrando os ninhos-armadilha introduzidos em placas de madeira colocadas em prateleiras no Campus da USP, Ribeirão Preto-SP.

38 3 Resultados 3.1 Número de fêmeas nidificantes e de ninhos Durante os estudos, 39 fêmeas, previamente marcadas, foram observadas construindo ninhos. Destas, 11 (28,2%) estavam parasitadas e foram encontradas mortas no interior dos NA. Estas fêmeas construíram 36 ninhos e durante esta atividade apresentaram os seguintes comportamentos: deposição extra de substância oleosa sobre o fechamento de ninhos já fechados anteriormente e deposição de substância oleosa sobre a última partição celular (Tabela 1). Outras fêmeas marcadas (n=18) também construíram ninhos (n=48) na área e apresentaram os mesmos comportamentos de deposição extra de substância oleosa, porém não foram encontradas mortas no local de nidificação; por terem apresentado comportamentos semelhantes podem ser consideradas como parasitadas. As fêmeas restantes (n=10) não apresentaram nenhum dos comportamentos de deposição de substância oleosa semelhantes aos citados anteriormente e, sendo assim, supostamente não estavam parasitadas. Estas fêmeas construíram 10 ninhos e após o fechamento dos mesmos deixaram o local. 3.2 Comportamentos de deposição extra de substância oleosa por fêmeas de Centris analis parasitadas Comportamentos envolvendo deposições extras de substância oleosa foram observados nas 11 fêmeas parasitadas, encontradas mortas no interior dos NA as quais, construíram 36 ninhos. Em 17 deles (47,2%), a fêmea parasitada, após o fechamento da última célula de cria (geralmente a terceira), com a construção da partição celular, depositou substância oleosa sobre a mesma de maneira semelhante àquela realizada no fechamento do ninho (Tabela 1, Figura 3). Este comportamento não foi observado nas fêmeas que supostamente não estavam parasitadas. Todos os ninhos de C. analis receberam sobre seu fechamento, a colocação de substância oleosa, realizada pela fêmea nidificante, entretanto,

39 fêmeas parasitadas (n=11) retornaram por várias vezes aos ninhos já completados e colocaram novamente substância oleosa sobre os fechamentos. Estas deposições (n=35) foram realizadas em ninhos (n=23, 63,8%) construídos pelas próprias fêmeas e também naqueles construídos por outras fêmeas (n= 49, 74 colocações) (Tabela 1 e 2), perfazendo um total de 109 deposições. Convém salientar que uma mesma fêmea pode ter colocado substância oleosa tanto na última partição celular como também no fechamento de seu ninho ou de outro qualquer (Tabela 1, Figura 4). Substância oleosa foi também depositada sobre ninhos (n=29), nos quais as fêmeas (n=6) parasitadas, apenas construíram o fechamento dos mesmos, e portanto não apresentavam conteúdo algum (vazios) (Tabela 1). Estes ninhos estavam localizados próximos ou não daqueles ninhos verdadeiramente construídos pela fêmea. 3.3- Parasitismo intraespecífico (usurpação) Outro comportamento observado nas fêmeas parasitadas (n=11) foi a usurpação de ninhos (parasitismo intraespecífico). Dos 5 ninhos usurpados, em 3 deles, as fêmeas romperam o fechamento, entraram nos ninhos, retiraram todo material existente no seu interior (pólen e larvas) e nidificaram nos mesmos. Nos outros 2 ninhos houve disputa física entre fêmeas e a usurpação ocorreu quando a fêmea do ninho foi desalojada pela outra fêmea. 3.4- Mortalidade de imaturos, razão sexual e taxa de oviposição/dia Os ninhos construídos pelas 11 fêmeas de C. analis apresentaram 114 células de cria, das quais emergiram 43 (37,7%) indivíduos sendo 26 fêmeas (22,8% das células e 60,4% das emergências) e 17 machos (14,9% das células e 39,5% das emergências). A razão sexual foi de 1,5 fêmeas para cada macho a qual foi significantemente semelhante a 1:1 (X 2 = 1,88; p>0,05). Os imaturos mortos representaram 62,3% (n=71) do total de células aprovisionadas, evidenciando uma taxa de mortalidade de 28% no estágio de ovo (n=32), 7% nos estágios de larva (n=8) e pupa (n=8) e de 20,2%

40 proporcionada pelo parasitismo (n=23). Estes resultados mostram que o estágio de ovo foi aquele que apresentou uma maior taxa de mortalidade quando comparada com aquelas observadas nas larvas e pupas. Os ninhos de C. analis foram atacados pelo parasitóide Leucospis cayennensis (n=18) e pelo cleptoparasita Coelioxys sp. (n=05) (Tabela 3). Tabela 1 Número de ninhos construídos e quantificação dos comportamentos apresentados pelas fêmeas de Centris analis parasitadas pelo parasitóide. SO= Substância oleosa Identificação das abelhas parasitadas Nº de ninhos construídos Nº de ninhos com colocação de SO no SO no SO na última fechamento e na fechamento (n) partição última partição Nº de NA vazios e fechados 2005 10 08 05 (7) 04 02 05 22 02 02 (4) - - 09 23 02 01 (1) - - 09 24 06 03 (4) - - 01 2006 33 04 03 (6) - - 34 02 01 (1) 02 01 35 03 02 (2) 02 01 03 36 03-03 - 37 02 02 (2) 02 02 38 03 03 (7) 03 03 39 01 01 (1) 01 01 02 Total 36 23 (35) 17 10 29

41 Tabela 2 Número de deposições de substância oleosa após o fechamento dos ninhos observados nas 11 fêmeas de Centris analis parasitadas. Identificação das abelhas Colocação de óleo sobre o fechamento de ninhos Total (n) parasitadas Construídos pela própria fêmea (n) Construídos por outras fêmeas (n) 2005 10 05 (7) 13 (21) 18 (28) 22 02 (4) 01 (1) 03 (5) 23 01 (1) 16 (20) 17 (21) 24 03 (4) - 03 (4) 2006 33 03 (6) 04 (7) 07 (13) 34 01 (1) - 01 (1) 35 02 (2) 02 (2) 36 - - 37 02 (2) - 02 (2) 38 03 (7) 03 (4) 06 (11) 39 01 (1) 12 (21) 13 (22) Total 23 (35) 49 (74) 72 (109) O tempo de atividade de nidificação das fêmeas (n=11) de C. analis no local de estudo variou de 03 até 18 dias ( =7,6 ± 4,0 dias); o número de ovos depositados pelas fêmeas variou de 03 até 26 ovos ( =10,4 ± 6,7 ovos). Podemos observar assim, que quanto maior o tempo de atividade, maior o número de posturas por cada fêmea (R=0,97, p>0,05). A taxa de oviposição por dia variou de 01 a 1,66 ovos/dia; no total, a taxa de oviposição foi de 1,35 ovos/dia (Tabela 4).

42 Parede de fechamento 2,1 cm Deposição de óleo 1 mm Figura 3 Ninho de Centris analis contendo três células de cria (A, B, C) e uma célula vestibular (D) com substância oleosa depositada no fechamento da última célula de cria. 1,0cm Figura 4 Observação da substância oleosa depositada sobre a última partição celular (A e C) de maneira semelhante àquela depositada no fechamento do ninho (B ed).

43 Tabela 3 Número de machos e fêmeas emergidos, mortalidade de imaturos e ataques de parasitas (Leucospis cayennensis e Coelioxys sp) obtidos em ninhos construídos pelas fêmeas de Centris analis parasitadas que morreram no local de nidificação. Identificação Descendentes Mortalidade de imaturos Nº de das abelhas células Nº de Nº de 2005 Ovo Larva Pupa parasitadas fêmeas machos 10 07 03 09 00 00 3L*, 4C** 22 01 01 02 00 01 01L 23-03 00 01 01 02L, 1C 24 07 03 04 00 02 0 2006 33 04 02 03 01 02 04L 34 01-00 00 01 03L 35 02 01 04 00 00 03L 36 01 01 04 04 00 0 37 01-03 00 00 01L 38 01 02 02 02 01 01L 39 01 01 01 00 00 0 Total 26 17 32 08 08 18L, 5C * L ataques realizados por Leucospis cayennensis ** C ataques realizados por Coelioxys sp.

44 Tabela 4 Número de ovos colocados durante os dias de atividade das fêmeas de Centris analis parasitadas pelo conopídeo. Identificação das abelhas Nº de ovos depositados Nº de dias em atividade Taxa de oviposição/dia 2005 10 26 18 1,44 22 06 06 1,0 23 08 06 1,33 24 16 10 1,60 2006 33 16 10 1,60 34 05 05 1,0 35 10 07 1,42 36 10 06 1,66 37 05 05 1,0 38 09 08 1,12 39 03 03 1,0 Total 114 84 1,35 3.5 Comportamentos de deposição de óleo apresentados por fêmeas de Centris analis que não morreram no interior dos ninhos-armadilha Os mesmos comportamentos envolvendo colocação de substância oleosa sobre o fechamento da última célula de cria (n=22), colocações extras sobre o fechamento do ninho (n=79) e também a construção de fechamento em NA vazios (n=16) foram observados em fêmeas (n=18) de C. analis que nidificaram no local de estudo, porém não foram encontradas mortas no interior dos NA, e que provavelmente estavam parasitadas (Tabela 5 e 6). 3.6- Parasitismo intraespecífico (usurpação) Outro comportamento observado nas 18 fêmeas que estavam possivelmente parasitadas foi a usurpação de ninhos (parasitismo intraespecífico). Nos 02 ninhos usurpados, as fêmeas romperam o fechamento, entraram nos ninhos, retiraram todo material existente no seu interior (pólen e larvas) e nidificaram nos mesmos.

45 Tabela 5 Quantificação dos comportamentos apresentados pelas fêmeas de Centris analis não encontradas mortas dentro de ninhos-armadilha. SO= Substância oleosa Identificação das abelhas parasitadas Nº de ninhos construídos Nº de ninhos com colocação de SO no SO na última SO no fechamento partição fechamento e na última (n) partição Nº de NA vazios e fechados 2005 01 05 01 (3) 02 02-02 03 03 (5) 02 06 05 01 01 (1) - 06 02-01 11 02-01 12 03-01 13 01 01 (5) - 15 02 02 (3) 01 01-16 05-04 03 17 01-01 20 05 03 (6) 01 01-21 03 02 (3) 01 01-26 01-01 01 28 03-01 03 29 01-01 2006 30 03 03 (6) 01 01 02 31 06-02 01 32 01-01 Total 48 16 (32) 22 06 16

46 Tabela 6 Número de deposições de substância oleosa no fechamento dos ninhos. Identificação das abelhas Deposição de óleo sobre o fechamento de ninhos Total (n) parasitadas Construídos pela própria fêmea (n) Fechados por outras fêmeas (n) 2005 01 01 (3) 10 (12) 11 (15) 02 03 (5) 11 (13) 14 (18) 05 01 (1) - 01 (1) 06 - - - 11 - - - 12 - - - 13 01 (5) - 01 (5) 15 02 (3) - 02 (3) 16-08 (9) 08 (9) 17 - - - 20 03 (6) 03 (5) 06 (11) 21 02 (3) - 02 (2) 26 - - - 28 - - - 29 - - - 2006 30 03 (6) 04 (8) 07 (14) 31 - - - 32 - - - Total 16 (32) 36 (47) 52 (79)

47 O tempo de atividade de nidificação dessas fêmeas (n=18) de C. analis no local de estudo variou de 01 até 21 dias ( =7,3 ± 5,7 dias); o número de ovos depositados pelas fêmeas variou de 02 até 19 ovos ( =8,2 ± 5,4 ovos). Podemos observar assim, que quanto maior o tempo de atividade, maior o número de posturas por cada fêmea (R=0,94, p>0,05). A taxa de oviposição diária variou de 0,75 a 1,40 ovos/dia. No total, a taxa de oviposição foi de 1,12 ovos/dia. (Tabela 7). Tabela 7 Número de ovos colocados durante os dias de atividade das fêmeas de Centris analis supostamente parasitadas pelo conopídeo. Identificação das abelhas Nº de ovos depositados Nº de dias em atividade Taxa de oviposição/dia 01 19 15 1,26 02 07 05 1,40 05 02 01 2,0 06 05 04 1,25 11 08 06 1,33 12 09 08 1,12 13 04 03 1,33 15 06 05 1,20 16 12 16 0,75 17 04 02 2,0 20 13 12 1,08 21 12 09 1,33 26 02 02 1,0 28 10 10 1,0 29 02 02 1,0 30 11 08 1,37 31 19 21 0,90 32 02 02 1,0 Total 147 131 1,12

48 3.7-Mortalidade de imaturos e razão sexual apresentada pelos descendentes das fêmeas que não morreram no local de nidificação Os ninhos construídos pelas 18 fêmeas de C. analis apresentaram 147 células de cria, das quais emergiram 56 (38,1%) indivíduos sendo em 21 fêmeas (14,3% das células e 37,5% das emergências) e 35 machos (23,8% das células e 62,5% das emergências). A razão sexual foi de 0,6 fêmeas para cada macho a qual foi significantemente semelhante a 1:1 (X 2 = 3,5; p>0,05). Os imaturos mortos representaram 57,8% (n=85) do total de células aprovisionadas, evidenciando uma taxa de mortalidade de 29,9% no estágio de ovo (n=44), 4,1% no estágio de larva (n=06), 7,5% no estágio de pupa (n=11) e de 16,3% proporcionada pelo parasitismo (n=24). Estes resultados são semelhantes aqueles já apresentados, ou seja, a maior taxa de mortalidade foi observada ocorrer no estágio de ovo. Estes ninhos também foram atacados pelo parasitóide Leucospis cayennensis (n=13) e pelo cleptoparasita Coelioxys sp. (n=11) (Tabela 8). 3.8- Fêmeas não parasitadas Foram observadas 10 fêmeas de C. analis nidificando no local de estudo, as quais pelos comportamentos apresentados não aparentavam estar parasitadas pelo conopídeo. Estas fêmeas construíram 10 ninhos os quais apresentaram 29 células de onde emergiram 03 fêmeas (10,3% das células e 33,3% das emergências) e 06 machos (20,7% das células e 66,6% das emergências). A razão sexual foi de 01 fêmea para 02 machos a qual foi significantemente semelhante a 1:1 (x 2 =1,0, p>0,05). A taxa de mortalidade de imaturos foi de 41,4%, no estágio de ovo e de 27,6% ocasionada pelo parasitismo (Tabela 9). Os ninhos foram atacados pelo parasitóide L. cayennensis (n=06) e pelo cleptoparasita Coelioxys sp. (n=2). O número de ovos por fêmea variou de 01 a 04 ovos ( =2,8 ± 0,98 ovos); o tempo de atividade variou de 01 a 04 ( =2,5 ± 0,97 dias). A taxa de oviposição diária variou de 01 a 02 ovos/dia e a taxa de oviposição total foi de 1,16 ovos/dia (Tabela 10), a qual foi estatisticamente semelhante (X 2 =0,26, p>0,05) à taxa de oviposição das fêmeas que estavam parasitadas (1,35

49 ovo/dia) e semelhante também (X 2 =0,01, p>0,05) à taxa das fêmeas que estavam supostamente parasitadas (1,12 ovo/dia). Tabela 8 Número de machos e fêmeas emergidos em ninhos de Centris analis construídos por fêmeas parasitadas que não morreram no local de nidificação. Identificação Descendentes Mortalidade de imaturos das abelhas Nº de células Nº de Nº de parasitadas Ovo Larva Pupa fêmeas machos 2005 01 01 04 04 00 05 2L*,3C** 02-02 04 00 00 1C 05 01-1 - - - 06-1 3-1 - 11 02 1 3-1 1C 12 2-5 1 1L 13 1 2 1 - - - 15 01-1 - - 3L,1C 16 03 03 05 00 00 1C 17 01-01 01-1L 20-03 04 01 00 2L,3C 21 02 04 04 00 00 2L 26 01 1L 28 01 01 03 01 02 1C,1L 29 - - 01 01 - - 2006 30 02 05 02 01 00 31 04 06 05 01 01 32-02 - - - - Total 21 35 44 06 11 13L,11C * L ataques realizados por Leucospis cayennensis ** C ataques realizados por Coelioxys sp.

50 Tabela 9 Número de machos e fêmeas emergidos em ninhos construídos por fêmeas não parasitadas pelo conopídeo. Identificação das Mortalidade de Descendentes abelhas imaturos Nº de células 2005 Nº de Nº de parasitadas Ovo Larva Pupa fêmeas machos 3 1 2 - - - - 4-2 1 - - - 7 - - 1 - - 1C** 8 1-1 - - 2L* 9 - - 1 - - - 14 - - 3 - - - 18 - - 2 - - 1L 19 1 1 1 1L 25-1 1 - - 2L 27 - - 1 - - 1C Total 3 6 12 - - 6L,2C * L ataques realizados por Leucospis cayennensis ** C ataques realizados por Coelioxys sp. Tabela 10- Número de ovos colocados durante os dias de atividade das fêmeas de Centris analis não parasitadas pelo conopídeo. Identificação das abelhas 2005 Nº de ovos depositados Nº de dias em atividade Taxa de oviposição/dia 3 03 03 1,0 4 03 03 1,0 7 02 01 2,0 8 04 04 1,0 9 01 01 1,0 14 03 03 1,0 18 03 02 1,5 19 04 03 1,33 25 04 03 1,33 27 02 02 1,0 Total 29 25 1,16

51 4 Discussão Conopídeos (Diptera) são endoparasitóides que atacam o hospedeiro nos locais de forrageamento, depositando um ovo dentro do abdômen de seu hospedeiro. A larva desenvolve-se rapidamente, matando o hospedeiro dentro de 10 a 12 dias, antes de sofrer pupação (Pouvreau 1974). Devido ao ciclo de vida dos conopídeos, a larva tem que pupar e hibernar dentro do hospedeiro para completar seu desenvolvimento, sendo crucial para a sobrevivência da pupa do parasitóide um lugar seguro para suportar extremos de temperatura, desidratação, umidade, predadores e hiperparasitismo (Brodeur & Boivin 2004). Muller (1994) sugere que abelhas parasitadas devem se mover para locais seguros antes de morrerem. No presente trabalho, fêmeas de C. analis (n=11), parasitadas pelo conopídeo, foram encontradas mortas no local de nidificação (no interior de ninhos-armadilha alocados em placas perfuradas colocadas sob cobertura abrigadas do sol e chuva), sugerindo que essas fêmeas parasitadas se moveram para um lugar seguro antes de morrerem. Estas fêmeas de C. analis, antes de morrerem, apresentaram os seguintes comportamentos: fechamento de ninhos sem provisão (vazios), deposições extras de substância oleosa sobre o fechamento dos próprios ninhos e/ou naqueles de ninhos construídos por outras fêmeas, como também sobre a partição da última célula de cria. As colocações de substância oleosa sobre o fechamento do ninho foram mais comuns (n=109) que as colocações sobre o fechamento da última partição celular (n=17). Comportamentos envolvendo deposição de substância oleosa e fechamento de ninhos vazios também foram observados em fêmeas (n=18) de C. analis que supostamente estavam parasitadas e não morreram dentro de ninhos-armadilha. Mais uma vez, as colocações extras de substância oleosa sobre o fechamento do ninho também foram mais comuns (n=79) que as colocações sobre o fechamento da última partição celular (n=22). Pode-se sugerir que os ninhos de C. analis que recebem substância oleosa no fechamento e ao mesmo tempo na última partição podem estar mais protegidos dos ataques do parasitóide L. cayennensis porque, a

52 célula estaria duplamente protegida com aquelas superfícies que receberam tal substância. Segundo Gazola & Garófalo (2003), este parasitóide apresenta duas táticas de ataques na entrada do ninho: a) o parasitóide introduz seu ovipositor através do plug de fechamento do ninho, até atingir a última partição celular. Nestes casos, ele consegue mais facilmente atingir o interior da última célula, pois só o fechamento apresentaria substância oleosa; b) o parasita rompe o plug de fechamento, entra no ninho, e caminha até atingir a parede da última partição celular. Se ela estiver revestida com óleo as dificuldades para o parasitóide serão maiores. Abelhas da tribo Centridini coletam e utilizam óleo floral de diversas maneiras: algumas utilizam as secreções de lipídios com ou em lugar do néctar, para o desenvolvimento larval; outras utilizam o óleo não somente como alimento larval, mas também para revestir a célula, impermeabilizando-a (Buchmann 1987). Vários autores têm sugerido que a colocação de substância oleosa sobre o fechamento do ninho confere proteção contra parasitas que atacam ninhos já completados (Pereira et al. 1999; Jesus & Garófalo 2000, Gazola & Garófalo 2003) ou contra a usurpação de ninhos por fêmeas coespecíficas (Vinson & Frankie 2000). Em várias ocasiões, Gazola & Garófalo (2003) observaram que L. cayennensis, não obteve sucesso em romper a parede de fechamento do ninho de C. analis, provavelmente devido ao endurecimento proporcionado pelo material oleoso ali depositado. Vinson & Frankie (2000) reportaram que ninhos de C. bicornuta, que não receberam óleo sobre a superfície de fechamento, foram usurpados, chegando à conclusão então, que a presença de substância oleosa é muito importante para reduzir a ação de co-específicos em ninhos já completados. Em estudos realizados na Costa Rica com espécies de Centris, Vinson et al. (2006) sugeriram que a substância oleosa coletada pelas fêmeas não fora utilizada apenas para o aprovisionamento do ninho, mas também para a proteção do mesmo. Segudo estes autores, o óleo coletado de Byrsonima crassifolia apresentou ácido levulínico, o qual é considerado um importante fungicida. Da mesma maneira que a substância oleosa protege o ninho de ataques de parasitas (Gazola & Garófalo 2003), células vazias também contribuem para a redução da taxa de parasitismo (Sakagami & Laroca 1971,

53 Wcislo & Orozco 1993). No presente trabalho, 45 ninhos-armadilha foram apenas fechados, sendo 29 pelas fêmeas parasitadas que morreram no local e 16 pelas fêmeas supostamente parasitadas que não morreram no local. Todos os comportamentos envolvendo deposições de substâncias oleosas e fechamento de ninhos (vazios) observados em fêmeas de C. analis são considerados atípicos, visto que fêmeas não parasitadas (n=10) não apresentaram nenhum destes comportamentos. Outro comportamento apresentado por fêmeas de C. analis, considerado atípico, foi aquele de ovipositar em ninhos co-específicos. O comportamento de oviposição em ninhos de mesma espécie recebe o nome de parasitismo intraespecífico (usurpação) (Field 1989). Em seu trabalho de revisão a respeito da ocorrência de parasitismo intraespecifico, Field (1992) definiu 6 tipos deles, os quais podem ser encontrados entre espécies de abelhas e vespas nidificando solitariamente ou comunalmente: 1-Parasitismo de cria, quando o parasita substitui o ovo do hospedeiro pelo seu próprio, 2-Roubo de provisões do ninho do hospedeiro, 3-Retirada de provisões do ninho do hospedeiro, mas abandonando-as em seguida, 4-Roubo de provisões do hospedeiro antes de serem levados para o interior do ninho, 5-Posse das estruturas do ninho do hospedeiro, 6- Posse das estruturas do ninho do hospedeiro, após remover as células dele. O parasitismo intra-específico observado neste trabalho, pelas fêmeas parasitadas pelo Conopídeo, enquandra-se nos tipo 3. Já, o parasitismo observado por Jesus (1995), em trabalho realizado no Campus da USP de Ribeirão Preto, enquadra-se apenas no primeiro tipo definido por Field (1992). Os dados aqui reportados sugerem que o comportamento de retirada de provisões do ninho do hospedeiro e abandonando-as em seguida é um comportamento atípico apresentado pelas fêmeas de C. analis. Pequena disponibilidade de alimentos e pequena disponibilidade de locais de nidificação, duas das possíveis condições que podem favorecer o aparecimento do

54 comportamento parasítico (Field 1992), não foram observadas durante o período de estudo e, portanto podem ser descartadas. Na maioria das populações panmíticas espera-se investimentos igualitários em ambos os sexos e razão sexual próxima de 1:1. Os dados deste trabalho mostram que os descendentes de fêmeas parasitadas pelo conopídeo e que morreram dentro dos NA, apresentaram uma razão sexual de 1,5:1, emergindo mais fêmeas que machos. Essas fêmeas apresentaram uma taxa de oviposição de 1,35 ovo/dia, superior à taxa apresentada pelas fêmeas (1,16 ovo/dia) não parasitadas pelo conopídeo. Já, nas fêmeas (n=18) supostamente parasitadas, a razão sexual foi de 0,6:1, ou seja, emergiram 21 fêmeas e 35 machos, e a taxa de oviposição/dia foi de 1,12 ovo/dia. As taxas de oviposição obtidas pelas fêmeas parasitadas (1,35 ovo/dia) e supostamente parasitadas (1,12 ovo/dia) foram estatisticamente semelhantes à taxa das fêmeas de C. analis que não estavam parasitadas pelo conopídeo (1,16 ovo/dia). Esses resultados mostram que os parasitóides (Conopidae:Physocephala) não interferiram na postura do hospedeiro. Numa tentativa de entendermos o que pode ter ocorrido quanto à razão sexual e a taxa de oviposição/dia, novos estudos serão propostos futuramente. Porém, segundo Carver et al. (1999) alterações morfológicas, fisiológicas e comportamentais em hospedeiros podem influenciar a produção de ovos. Como exemplo, podemos citar que no besouro Tenebrio molitor (Linnaeus) (Tenebrionidae) infectado pelo verme Hymenolepis diminuta (Rudolphi) ocorre alterações qualitativas e quantitativas no desenvolvimento dos oócitos (fecundidade) e postura dos ovos (fertilidade) (Hurd & Arme 1986). A produção de ovos é retardada devido à redução na síntese de vitelogenina (Webb & Hurd 1996, Hurd & Arme 1986) e deficiência protéica no ovário (Hurd & Arme 1986). Embora a performance do ovário seja regulada por fatores oriundos do hospedeiro (Major et al. 1997), a queda na produção de vitelogenina no corpo gorduroso é influenciada por fatores de origem parasítica (Webb & Hurd 1996). Hospedeiros parasitados apresentam alterações morfológicas, reprodutivas e comportamentais em função de modificações bioquímicas, fisiológicas e ecológicas (Vinson 1975, Vinson & Iwantsch 1980). Alterações nos padrões fisiológicos e ecológicos em hospedeiros parasitados poderão ser

55 adaptativas ou refletir mudanças patológicas que são seletivamente neutras (Holmes & Zohar 1990, Minchella 1985). Segundo Dawkins (1982), a relação hospedeiro-parasitóide estabelece um conceito no qual o hospedeiro representa uma extensão do fenótipo do parasitóide. Da mesma maneira, Vinson (1975) considera que ninhos parasitados já não são mais membros da espécie hospedeira, uma vez que o destino do mesmo é permanentemente modificado pelo parasitóide.

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63 CAPÍTULO 2 Relação entre os comportamentos de deposição de substância oleosa apresentados por fêmeas de Centris (Heterocentris) analis (Hymenoptera:Apidae:Centridini) parasitadas e os ataques de Leucospis cayennensis Westwood (Hymenoptera:Leucospidae)

64 Resumo Os estudos foram realizados no Campus da Universidade de São Paulo - Ribeirão Preto, de fevereiro de 2005 a dezembro de 2006. As fêmeas de C. analis nidificaram em ninhos-armadilha, confeccionados com cartolina preta, apresentando 0,6cm de diâmetro interno e 5,5cm de comprimento, introduzidos em orifícios feitos em placas de madeira colocadas em prateleiras sob duas coberturas construídas no local de estudo. Foram obtidos 94 ninhos durante o período de estudos e um total de 39 fêmeas foram previamente marcadas. Fêmeas de C. analis, parasitadas por moscas Physocephala sp., apresentaram comportamentos atípicos envolvendo deposições de substâncias oleosas, tais como: deposições de substância oleosa sobre a última célula de cria e colocações extras de substância oleosa sobre o fechamento dos ninhos. Outras fêmeas marcadas (n=18) também construíram ninhos (n=48) na área e apresentaram os mesmos comportamentos envolvendo deposição de substância oleosa. As fêmeas restantes (n=10) não apresentaram nenhum dos comportamentos citados anteriormente. Os dados aqui reportados sugerem que esses comportamentos atípicos influenciaram os ataques de Leucospis cayennensis. Dos 13 ataques de L. cayennensis em ninhos com 03 células de cria, em 07 o parasita não conseguiu introduzir seu ovipositor passando pela parede de fechamento, visto que, nesses ninhos observou-se uma quantidade de substância oleosa semelhante aquela do fechamento do ninho. Já, nos outros 06 ninhos que não receberam substância oleosa sobre a parede de fechamento da última célula de cria, a fêmea de L. cayennensis conseguiu introduzir seu ovipositor com sucesso. No presente estudo, os dados mostram que as deposições de substância oleosa pelas fêmeas parasitadas pelo conopideo, aumentam as dificuldades para o sucesso de parasita (L. cayennensis).

65 Abstract The study was conducted on the Campus of the University of São Paulo São Paulo, Brazil, from February to May 2005, from January to July 2006 and from November to December 2006. In accordance with Garófalo et al. (1989), trap nests used in this study consisted of tubes made with black cardboard, with the posterior end closed with the same material. Nests of C. analis received attacks of Leucospis cayennensis (26.1%) and Coelioxys sp. (26.8%). The occurrence of Leucospis sp. and Coelioxys sp. parasitizing nests of C. analis had already been reported by Roubik (1989) from observations made in Panama, similar to those reported by Jesus & Garófalo (2000). Females of Centris (Heterocentris) analis parasited by Physocephala sp. shows atipic behavior using oil substance, such as: oil deposition on the nest entrance and oil deposition on the last brood cell. Other marked females (n=18) that constructed nests in the area show the behavior of oil substance deposition too. The remaining females (n=10) have no behavior of oil substance deposition and probably they are not parasitized. Therefore, the results show that parasitized females presented variance behavior. L. cayennensis have no success in nests with 3 brood cells that had oil substance depositions on the last brood cell (n= 7) because the parasite was not able to introduce her ovipositor on the last brood cell. However, in nests which have no oil substance depositions on the last brood cell (n= 6), the parasite was able to introduce her ovipositor. Therefore, the results show that nests whose oil substance was deposited on the last brood cell, females of Leucospis have no success.

66 1 - Introdução Em abelhas, vários mecanismos têm sido desenvolvidos para a proteção de seus descendentes contra os parasitas dentre os quais, estão incluídos o comportamento agressivo e também algumas características na arquitetura dos ninhos (Krombein 1967, Sakagami & Laroca 1971, Tepedino et al. 1979, Wcislo & Orozco 1993). Um comportamento agressivo foi reportado por Kapil & Dhaliwal (1968), quando observaram que fêmeas de Xylocopa fenestrata (Fabricius) (Apidae) fornecem proteção para seus descendentes aplicando uma substância repelente na entrada do próprio ninho, quando molestadas por agentes externos. Algumas abelhas solitárias, especialmente aquelas que não nidificam em agregações, estabelecem a entrada do ninho em locais escondidos e discretos. Além disso, os ninhos construídos podem apresentar células vazias situadas entre as células provisionadas (Sakagami & Laroca 1971, Wcislo & Orozco 1993) as quais teoricamente reduziriam a taxa de parasitismo. Pereira et al. (1999), Jesus & Garófalo (2000), Gazola & Garófalo (2003) têm sugerido que o revestimento da parede externa do fechamento dos ninhos de Centris, com substância oleosa, confere uma maior proteção contra parasitas e predadores que atacam ninhos já completados. Gazola & Garófalo (2003) observaram que, em várias ocasiões o parasita, L. cayennensis não obteve sucesso em romper a parede de fechamento do ninho de C. analis, provavelmente devido à substância oleosa ali depositada. Segundo Evans (1966), Medler (1958), a presença da célula vestibular (estrutura geralmente presente nos ninhos de C. analis que antecede a parede de fechamento) também diminui o sucesso dos ataques de L. cayennensis. Mecanismos de proteção do ninho são observados também em hospedeiros cujo comportamento é modificado por parasitóides, alterando sua distribuição e preferência de habitats (Horton & Moore 1993). Nestes casos, o hospedeiro é encontrado em microhabitats difíceis de serem atingidos, reduzindo assim, o risco de predação e hiperparasitismo (Brodeur & McNeil 1989, 1992). Segundo Brodeur (1994), Jones (1987), os hospedeiros em

67 muitas ocasiões apresentam adaptações que evitam inimigos naturais, as quais podem ser exploradas por imaturos parasitóides para promover a própria sobrevivência. Mudanças de comportamento nos hospedeiros são mais prováveis beneficiar o parasitóide porque o hospedeiro parasitado não apresenta qualquer futuro reprodutivo. Parasitóides dependem do hospedeiro não apenas para satisfazer suas necessidades nutricionais e metabólicas, mas também, para reduzir os riscos de uma morte prematura pela predação. A sobrevivência dos imaturos parasitóides depende da performance do hospedeiro, em particular a habilidade de evitar inimigos naturais, até que o parasitóide possa atingir o seu pleno desenvolvimento. Portanto, qualquer alteração no hospedeiro parasitado que aumente o risco de predação deveria ser evitado até o parasitóide completar seu desenvolvimento (Thomas et al. 2005). O objetivo deste trabalho foi o de observar os comportamentos atípicos, apresentados por fêmeas de C. analis quando parasitadas pelas moscas Physocephala sp., relacionando-os com o sucesso dos ataques do parasita L. cayennensis.

68 2 Material e Métodos 2.1 Local de estudos O estudo foi realizado no Campus da Universidade de São Paulo, situado no município de Ribeirão Preto, SP, entre as coordenadas 21 05`- 21 15` S e 47 50` 47 55` W. O relevo apresenta altitudes que variam de 530 a 675 m, em uma área de, aproximadamente, 573 ha. O solo é caracterizado como latossolo roxo eutrófico, com textura argilosa ou muito argilosa. A vegetação era de mata tropical subcaducifolia, mas a região foi intensamente explorada, inicialmente para a cultura do café e mais recentemente para cultura da cana de açúcar, que juntamente com o capim colonião formam a cobertura atual (Oliveira & Prado 1987). As observações foram realizadas de fevereiro de 2005 a dezembro de 2006. Na região ocorrem duas estações distintas: a estação seca que corresponde aos meses mais frios (maio a agosto) com temperatura média de 19ºC e a estação chuvosa que corresponde aos meses mais quentes (setembro a abril) com temperatura média de 25ºC. A precipitação média anual é de 1426,80 mm e a média anual da umidade relativa do ar é de 71% (WWW.ribeiraopreto.sp.gov.br). 2.2- Ninhos-armadilha Seguindo a metodologia apresentada por Serrano & Garófalo (1978), foram utilizados como ninhos-armadilha, pequenos tubos confeccionados com cartolina preta, com uma das extremidades fechada com o mesmo material, apresentando 0,6 cm de diâmetro e 5,5 cm de comprimento. Estes NA foram introduzidos em orifícios feitos em 10 placas (A, B, C, D, E, F, G, H, I e J) de madeira de 5,0 cm de largura, 30,0 cm de comprimento e 12,0 cm de altura, sendo que cada uma delas continha 55 orifícios. As placas foram colocadas em prateleiras, sob duas coberturas (distantes 5 metros) construídas ao lado do laboratório de Ecologia do Departamento de Biologia da Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto-USP (Figura 1 e 2).

69 Durante os estudos, fêmeas de C. analis foram marcadas com tinta no tórax e as atividades de nidificação, de cada uma delas, foram registradas diariamente. Quando as atividades estavam restritas ao interior dos ninhos, as mesmas eram registradas com o auxílio de um otoscópio. A partir do momento que as fêmeas iniciaram suas atividades de nidificação foram observados os comportamentos de colocação de substância oleosa, a quantidade de ninhos construídos pelas fêmeas de C. analis e a relação entre esses comportamentos de deposição e o sucesso dos ataques de L. cayennensis. A constatação de que as fêmeas estavam parasitadas foi realizada após suas mortes. Sendo assim, as fêmeas de C. analis encontradas mortas em seus próprios ninhos ou em outros NA ainda não utilizados, foram coletadas e transferidas para frascos individuais. Os frascos foram levados para o laboratório, mantidos a temperatura ambiente e vistoriados diariamente para a verificação de possíveis emergências de parasitóides. Quando da emergência de um parasitóide, ele era deixado no mesmo frasco e em seguida morto sob vapor de acetato de etila, alfinetado e preparado para identificação. A análise estatística dos dados obedeceu aos testes de Qui- Quadrado e Correlação de Spearman encontrados no Statistica 6 e disponibilizado pelo laboratório de Ecologia do Departamento de Biologia da Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto-USP. Figura 1- Local de estudo, mostrando as placas de madeira colocadas em prateleira no Campus da USP, Ribeirão Preto-SP.

70 Figura 2 - Local de estudo, mostrando os ninhos-armadilha introduzidos em placas de madeira colocadas em prateleiras no Campus da USP, Ribeirão Preto-SP.

71 3- Resultados 3.1 Números de ninhos de Centris analis As nidificações de C. analis ocorreram na estação quente e chuvosa de fevereiro a abril de 2005, janeiro a março de 2006 e novembro a dezembro de 2006, com a maior freqüência de ninhos ocorrendo em março de 2005 (Figura 3). Os ninhos obtidos (n=94) apresentaram de 1 a 5 células de cria com significativa diferença estatística na distribuição dos mesmos (X 2 = 49,9; p<0,001), visto que, do total de nidificações obtidas, 2 (2,1%) tiveram 5 células de cria, 28 (29,8%) 4 células de cria, 39 (41,5%) com 3 células, 19 (20,2%) com 2 células e 06 (6,4%) com 1 célula de cria. O número de fundações bem como, o número de células construídas por ninho podem ser observados na Figura 4. 45 40 35 Número de ninhos 30 25 20 15 10 5 0 F M A M J J A S O N D J F M A M J J A S O N D Meses Figura 3- Número de ninhos de Centris analis construídos na área de estudo.

72 45 40 Número de ninhos 35 30 25 20 15 10 5 0 1 2 3 4 5 Número de células de cria Figura 4- Números de células de cria e de ninhos de Centris analis construídos nos anos de 2005 e 2006. 3.2- Fêmeas parasitadas e deposições de substância oleosa Das 39 fêmeas de C. analis marcadas que se encontravam trabalhando no local de estudo, 29 estavam parasitadas por moscas parasitóides do gênero Physocephala (Conopidae:Diptera). Estas fêmeas apresentaram comportamentos envolvendo deposição extra de substância oleosa em dois locais distintos do ninho: sobre o fechamento da última célula de cria e sobre o próprio fechamento do ninho. As outras fêmeas (n=10), não apresentaram nenhum dos comportamentos citados anteriormente e supostamente não estavam parasitadas. Estas fêmeas construíram 10 ninhos (um ninho/fêmea) e não foram mais vistas no local. Dos 84 ninhos construídos pelas fêmeas parasitadas, 23 (27,4%) receberam deposição de substância oleosa apenas sobre o fechamento da célula de cria (Figura 5) e outros 23 ninhos (27,4%) receberam deposições apenas sobre o fechamento do ninho (Tabela 1). Convém salientar que o

73 revestimento da parede de fechamento dos ninhos de C. analis é um comportamento que as fêmeas sempre apresentam, ou seja, todos os ninhos desta espécie de Centris recebem deposição de substância oleosa em seus fechamentos. Nos casos em estudo (ninhos construídos por fêmeas parasitadas), o número de deposições extras (n=67) desta substância nos ninhos observados (n=23), foi muito maior quando comparado com aquelas observadas em ninhos construídos por fêmeas não parasitadas. 2,1 cm Deposição de óleo 1 mm Figura 5 - Ninho contendo três células de cria (A, B, C) e uma célula vestibular (D) com substância oleosa depositada no fechamento da última célula de cria.

74 Convém salientar que em 16 ninhos uma mesma fêmea pode ter colocado substância oleosa tanto na última partição celular como também no fechamento de seu ninho (Tabela 1). Dessa forma, dos 84 ninhos construídos pelas fêmeas parasitadas, 62 receberam algum tipo de deposição de substância oleosa, enquanto que em 22 ninhos, nenhuma deposição extra de substância oleosa foi observada. Fêmeas parasitadas apresentaram comportamentos envolvendo substância oleosa em ninhos de 01 a 05 células de cria, nos quais as deposições sobre a última célula de cria e sobre o fechamento do ninho mostraram correlação (R=0,9; p>0,05) (Tabela 1). Tabela 1- Quantificação da deposição de substância oleosa sobre a última partição celular e sobre o fechamento do ninho realizadas pelas fêmeas de Centris analis parasitadas pelo conopídeo. SO = Substância oleosa Nº de células/ninho Nº de ninhos Construídos Número de ninhos com colocação de SO no SO no SO na última fechamento e fechamento partição na última (%) (%) partição (%) 1 05 03 (60,0) 01 (20,0) - 2 17 04 (23,5) 05 (29,4) 03 (17,6) 3 35 11 (31,4) 08 (22,8) 08 (22,8) 4 25 05 (20,0) 07 (28,0) 05 (20,0) 5 02-02 (100,0) - Total 84 23 (27,4) 23 (27,4) 16 (19,0)

75 3.3 Número de ninhos atacados por Leucospis cayennensis Dos 94 ninhos obtidos, 40 receberam ataques do parasitóide Leucospis cayennensis, sendo 13 deles na região posterior do ninho e 27 pela região anterior (entrada) do mesmo. Destes 27 ataques, apenas 1 (3,7%) ocorreu em ninhos com 2 células de cria, 13 (48,1%) em ninhos com 3 células, 12 (44,5%) em ninhos com 4 células e 1 (3,7%) em ninho com 5 células de cria (Figura 6). Naqueles ataques ocorridos na região anterior dos ninhos, as fêmeas apresentaram dois procedimentos: a) nos ninhos com 4 células de cria, com reduzida célula vestibular, o parasita introduziu seu ovipositor através do plug de fechamento do ninho, passando pela última partição celular, atingindo o interior da célula de cria; b) nos ninhos com 2 e 3 células de cria, o parasita rompeu o plug de fechamento, entrou no ninho, e caminhou até atingir a parede da última partição celular quando então, introduziu seu ovipositor no interior da célula. O sucesso dos ataques de L. cayennensis foi maior nos ninhos com 4 células de cria, visto que em todos os ninhos atacados (n=12), emergiram parasitas. Já, nos ninhos com 3 células de cria o sucesso dos ataques foi de 46,1%, ou seja, dos 13 ninhos atacados, em 6 deles o parasita conseguiu introduzir seu ovipositor através da parede celular e parasitar o ninho (Tabela 2). Nos outros sete ninhos atacados, notou-se a presença de substância oleosa sobre o fechamento da última célula, dificultando a passagem do ovipositor pela parede de fechamento e, consequentemente, para que se concretizasse o parasitismo (Figura 7 e 8). Convém salientar que nos ninhos atacados por L. cayennensis, com 3 células de cria e que receberam substância oleosa sobre o fechamento da última célula de cria, emergiram 6 adultos e foi encontrada uma larva morta de C. analis. Isso é importante porque demonstra claramente que os ataques de L. cayennensis não tiveram sucesso.

76 45 40 35 ninhos construídos ninhos parasitados Número de ninhos 30 25 20 15 10 5 0 1 2 3 4 5 Número de células de cria Figura 6 Número de células e de ninhos construídos por Centris analis e parasitados por Leucospis cayennensis. Tabela 2 Porcentagem de sucesso de Leucospis cayennensis nos ninhos com 1, 2, 3, 4 e 5 células de cria nos anos de 2005 e 2006. Os resultados (%) do sucesso dos ataques seguidos por letras diferentes na mesma coluna diferem estatisticamente. Nº de Nº de Nº de Nº de (%) de ninhos ninhos sucessos células/ninho sucesso construídos parasitados dos ataques 1 06 00 - - 2 19 01 0 0a 3 39 13 6 46,1b 4 28 12 12 100c 5 02 01 1 100c Total 94 27 20 74,0

77 Deposição de óleo Figura 7 Fechamento da última partição celular com deposição de óleo. A B 1 mm 1 mm Figura 8 Última partição celular com deposição acentuada de óleo (A) e com um fino revestimento de óleo (B).